Este estudio fue apoyado por una beca de la Fundación Alemana de Ciencias (DFG, Ro2327 / 6-1) a CRR Los autores desean agradecer a S. Durry y C. Rodrigo de asistencia técnica de expertos, y M. Dubbert (Laboratorio de Electrónica, Instituto Zoológico , Universidad de Colonia, Alemania) para obtener ayuda en la aplicación del controlador de la célula Pockels y el interruptor de HF.

<ol>
	<li>Rose, C. R., Kovalchuk, Y., Eilers, J., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+Na++imaging+in+spines+and+fine+dendrites+of+central+neurons.">Two-photon Na+ imaging in spines and fine dendrites of central neurons.</a> Pflueg. Arch., Eur. J. Phy. 439, 201-207 (1999).</li><li>Rose, C. R., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMDA+receptor-mediated+Na++signals+in+spines+and+dendrites.">NMDA receptor-mediated Na+ signals in spines and dendrites.</a> J. Neurosci. 21, 4207-4214 (2001).</li><li>Meier, S. D., Kovalchuk, Y., Rose, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+the+new+fluorescent+Na++indicator+CoroNa+Green:+comparison+with+SBFI+and+confocal+Na++imaging.">Properties of the new fluorescent Na+ indicator CoroNa Green: comparison with SBFI and confocal Na+ imaging.</a> J. Neurosci. Meth. 155, 251-259 (2006).</li><li>Lamy, C., Chatton, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+probing+of+sodium+dynamics+in+neurons+and+astrocytes.">Optical probing of sodium dynamics in neurons and astrocytes.</a> NeuroImage. 58, 572-578 (2011).</li><li>Lasser-Ross, N., Ross, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+voltage+and+synaptically+activated+sodium+transients+in+cerebellar+Purkinje+cells.">Imaging voltage and synaptically activated sodium transients in cerebellar Purkinje cells.</a> Proc. Roy. Soc. B-Biol. Sci. 247, 35-39 (1992).</li><li>Bennay, M., Langer, J., Meier, S. D., Kafitz, K. W., Rose, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sodium+signals+in+cerebellar+Purkinje+neurons+and+Bergmann+glial+cells+evoked+by+glutamatergic+synaptic+transmission.">Sodium signals in cerebellar Purkinje neurons and Bergmann glial cells evoked by glutamatergic synaptic transmission.</a> Glia. 56, 1138-1149 (2008).</li><li>Baranauskas, G., David, Y., Fleidervish, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+mismatch+between+the+Na++flux+and+spike+initiation+in+axon+initial+segment.">Spatial mismatch between the Na+ flux and spike initiation in axon initial segment.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 110, 4051-4056 (2013).</li><li>Fleidervish, I., Lasser-Ross, N., Gutnick, M., Ross, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Na++imaging+reveals+little+difference+in+action+potential-evoked+Na++influx+between+axon+and+soma.">Na+ imaging reveals little difference in action potential-evoked Na+ influx between axon and soma.</a> Nat. Neurosci. , 852-860 (2010).</li><li>Denk, W., Piston, D., Webb, W., Pawley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of Biological Confocal Microscopy. , 445-458 (1995).</li><li>Jaffe, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spread+of+Na++spikes+determines+the+pattern+of+dendritic+Ca2++entry+into+hippocampal+neurons.">The spread of Na+ spikes determines the pattern of dendritic Ca2+ entry into hippocampal neurons.</a> Nature. 357, 244-246 (1992).</li><li>Boccaccio, A., Sagheddu, C., Menini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flash+photolysis+of+caged+compounds+in+the+cilia+of+olfactory+sensory+neurons.">Flash photolysis of caged compounds in the cilia of olfactory sensory neurons.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li><li>Ikrar, T., Olivas, N., Shi, Y., Xu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+inhibitory+neuronal+circuits+by+laser+scanning+photostimulation.">Mapping inhibitory neuronal circuits by laser scanning photostimulation.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li><li>Mathis, D. M., Furman, J. L., Norris, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+acute+hippocampal+slices+from+rats+and+transgenic+mice+for+the+study+of+synaptic+alterations+during+aging+and+amyloid.">Preparation of acute hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations during aging and amyloid.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li><li>Pannasch, U., Sibille, J., Rouach, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+electrophysiological+recordings+of+synaptically-evoked+astroglial+and+neuronal+responses+in+acute+hippocampal+slices.">Dual electrophysiological recordings of synaptically-evoked astroglial and neuronal responses in acute hippocampal slices.</a> J. Vis. Exp. , (2012).</li><li>Minta, A., Tsien, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+indicators+for+cytosolic+sodium.">Fluorescent indicators for cytosolic sodium.</a> J. Biol. Chem. 264, 19449-19457 (1989).</li><li>Kuruma, A., Inoue, T., Mikoshiba, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+Ca(2+)+and+Na(+)+in+the+dendrites+of+mouse+cerebellar+Purkinje+cells+evoked+by+parallel+fibre+stimulation.">Dynamics of Ca(2+) and Na(+) in the dendrites of mouse cerebellar Purkinje cells evoked by parallel fibre stimulation.</a> Eur. J. Neurosci. 18, 2677-2689 (2003).</li><li>Despa, S., Bers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Na/K+pump+current+and+[Na](i)+in+rabbit+ventricular+myocytes:+Local+[Na](i)+depletion+and+Na+buffering.">Na/K pump current and [Na](i) in rabbit ventricular myocytes: Local [Na](i) depletion and Na buffering.</a> Biophys. 84, 4157-4166 (2003).</li><li>Regehr, W., Tank, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+concentration+dynamics+produced+by+synaptic+activation+of+CA1+hippocampal+pyramidal+cells.">Calcium concentration dynamics produced by synaptic activation of CA1 hippocampal pyramidal cells.</a> J. Neurosci. 12, 4202-4223 (1992).</li><li>Kushmerick, M. J., Podolsky, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionic+mobility+in+muscle+cells.">Ionic mobility in muscle cells.</a> Science. 166, 1297-1298 (1969).</li><li>Palma-Cerda, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+caged+neurotransmitter+analogs+selective+for+glutamate+receptor+sub-types+based+on+methoxynitroindoline+and+nitrophenylethoxycarbonyl+caging+groups.">New caged neurotransmitter analogs selective for glutamate receptor sub-types based on methoxynitroindoline and nitrophenylethoxycarbonyl caging groups.</a> Neuropharmacology. 63, 624-634 (2012).</li><li>Trigo, F., Corrie, J., Ogden, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+photolysis+of+caged+compounds+at+405+nm:+photochemical+advantages,+localisation,+phototoxicity+and+methods+for+calibration.">Laser photolysis of caged compounds at 405 nm: photochemical advantages, localisation, phototoxicity and methods for calibration.</a> J. Neurosci. Meth. 180, 9-21 (2009).</li><li>Nikolenko, V., Peterka, D., Araya, R., Woodruff, A., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+light+modulator+microscopy.">Spatial light modulator microscopy.</a> Cold Spring Harbor protocols. , 1132-1141 (2013).</li></ol>

Los autores declaran no tener conflictos de intereses. Los autores recibieron apoyo financiero que permite publicación de acceso abierto por Rapp optoelectrónicos (Wedel, Alemania), que produce un instrumento utilizado en el artículo de vídeo. La compañía no ha estado involucrada en los experimentos ni en el manejo de los datos ni en la escritura manuscrita.

El presente estudio muestra que SBFI es muy adecuado para formación de imágenes de dos fotones de los transitorios de sodio intracelulares en pequeños compartimentos celulares. Tiene que tenerse en cuenta, sin embargo, que la eficiencia cuántica de SBFI es más bien baja 15 y relativos cambios en la concentración de sodio son bastante pequeñas con actividad fisiológica. Por lo tanto, la medición de alta resolución de los transitorios de Na + en los procesos de finos es una tarea relativamente tedioso, y binning o promediación de varios ensayos puede ser necesario para obtener señales satisfactorios. Además, la cinética de los transitorios de sodio son sorprendentemente lenta, por lo que es obligatorio para grabar durante períodos de tiempo prolongados. Esta observación se corresponde con los de estudios anteriores, donde la caries monoexponencial de los transitorios de sodio en las dendritas neuronales y en los astrocitos se caracteriza por constantes de tiempo grandes descomposición en el intervalo de 10 segundos a temperatura ambiente 1,2,6. Por lo tanto los transitorios de sodio parecen ejercer un momento co mucho más lentourse y mucho más grandes constantes de tiempo de decaimiento, en comparación con los transitorios de calcio 16. Ponga a un lado estos inconvenientes, las imágenes de sodio ha demostrado ser una herramienta valiosa para la investigación de las propiedades fisiológicas de subdominios neuronales. Por ejemplo, las imágenes de sodio puede servir para controlar la actividad sináptica excitatoria en o cerca de las sinapsis activas. Debido esencialmente de sodio no está tamponada 8,17, transitorios de sodio inducida por la actividad están relacionadas linealmente a una amplia gama de la liberación de glutamato sináptico de glutamato o exógenamente aplicados. Ellos por lo tanto, representan indicadores directos e imparciales de la actividad glutamatérgica neuronal. Además, colorantes indicadores de sodio presentan una alta K d &#39;s (de SBFI K d está en el intervalo de 25 mM 1). Incluso en las concentraciones de colorante intracelulares relativamente altas usadas para lograr el brillo suficiente (generalmente 0,5-1 mM), el alto K d &#39;s implica que los propios tintes no actúan como amortiguadores para sodium. En consecuencia, no distorsionan el curso amplitud ni el tiempo de los transitorios de sodio, que es siempre una preocupación cuando tintes sensibles al calcio se introducen en las células 18. Por lo tanto, se puede suponer que las señales detectadas representan una buena medida de los cambios &quot;reales&quot; en sodio intracelular. Su evolución en el tiempo lento implica entonces que la velocidad para la difusión intracelular de sodio en las neuronas es mucho menor que anteriormente supone 19. Un requisito fundamental para la exitosa ejecución de los experimentos que abordan las propiedades de las vías de transmisión y de afluencia de sodio sinápticos excitatorios en espinas y dendritas es la inducción de una activación rápida y muy localizada de estructuras postsinápticas. Esto se puede conseguir mediante la aplicación rápida y local de glutamato o agonistas de glutamato en la vecindad directa de una columna o una dendrita por la fotolisis de flash de compuestos enjaulados. Fotólisis flash hace dama no mecánicamentege el tejido, está libre de artefactos de movimiento y está bien establecido para la investigación de cuestiones relacionadas (por ejemplo, la señalización de calcio local). El diámetro de la mancha uncaging fue de 1,5 micras en el plano xy. Uncaging cerca de una señal de sodio dendritas espinosas inducidas en las dos espinas y la dendrita padres. Considerando que las señales tendían a ser más grande en las espinas más cercanos al lugar uncaging, las amplitudes en la dendrita de los padres y espinas más lejos todavía eran bastante similares a aquellos en proximidad directa de la mancha uncaging. Uncaging se realizó durante 300 mseg durante el cual corrientes hacia el interior aumentaron en amplitud. Glutamato Uncaged podría haber difundido en el tejido durante el mismo período de tiempo, la activación de los receptores ionotrópicos de glutamato y la entrada de sodio en las regiones dendríticas y espinas más lejos del punto uncaging. Un problema intrínseco que se produce cuando se utiliza un láser UV para la fotólisis de compuestos enjaulados administrados a través de la solución de baño de célulases &#39;de filtrado interno&#39;. Debido a la alta tasa de absorción de la jaula, la luz UV se atenúa fuertemente a lo largo del camino desde el objetivo a la zona de estimulación 20,21. Una manera posible de evitar esto es la perfusión local con la jaula que se limita sólo a la zona de estimulación, lo que disminuye, además, la cantidad de compuesto necesaria enjaulado a un mínimo. En comparación con uncaging mediada por escaneo láser UV, cerca de infra-rojo de dos fotones uncaging 22 es espacialmente más precisa, principalmente debido a la precisión de la estimulación se incrementa en el eje z. Por otro lado, debido a la sección transversal pequeña de las jaulas comúnmente utilizados para longitudes de onda más largas como se emplea con excitación de dos fotones, ya sea una alta concentración del compuesto enjaulado o muy alta, se necesitan intensidades de luz potencialmente fototóxicas. Además, uncaging de dos fotones requiere una inversión mucho mayor en el equipo; entre otros, un láser IR adicional, más los componentes ópticos necesarios, se necesitan. Tanto SBFI y MNI-glutamato son excitables en el rango de longitud de onda idénticas. Esto puede conducir a una interdependencia involuntaria de láser UV uncaging y SBFI o láser de formación de imágenes IR y MNI-glutamato, lo que resulta en el blanqueo de SBFI por el flash uncaging y / o un uncaging continua de glutamato por el haz IR. Sin embargo, como se muestra en la Figura 6C, ni un destello UV por sí mismo ni la formación de imágenes de múltiples fotones causado tales efectos recíprocos en las condiciones experimentales. Sistemas UV en flash similar a la descrita aquí se utilizan de forma rutinaria en muchos otros laboratorios y pueden con relativa facilidad pueden incorporar en cualquier microscopio de imagen multi-fotón existente. Ofrece la ventaja de que el haz de láser para la fotólisis se puede colocar libremente en el campo de visión. Además, el sistema permite un reposicionamiento rápido y automatizado del haz de láser y el volumen de liberación, respectivamente, en el campo de visión durante un experimento. Our modificación simplifica y mejora el posicionamiento preciso del punto uncaging, de modo que los marcos de la formación de imágenes de software pueden servir para ajustar los marcos de imagen y uncaging congruentemente. Tomados en conjunto, de células enteras patch-clamp de sodio y de formación de imágenes multi-fotón en dendritas y espinas de las neuronas centrales, combinada con un procedimiento modificado para uncaging UV-inducida por la luz de glutamato, permite la activación fiable y focal de receptores de glutamato en el tejido. De este modo, puede servir para analizar las propiedades de la transmisión sináptica excitatoria y de señales de sodio en las neuronas postsinápticas en el tejido intacto.

Las recientes mejoras en técnicas microscópicas, tales como la microscopía de luz multi-fotón han permitido el estudio de parámetros morfológicos y fisiológicos de las células del cerebro en el tejido intacto con alta resolución espacial y temporal. Combinado con la electrofisiología, estas técnicas son ampliamente utilizados para analizar las señales eléctricas relacionadas con la actividad de las neuronas, así como las señales de calcio concomitantes en pequeños compartimentos subcelulares, es decir, en finas dendritas y espinas dendríticas. Además de los transitorios de calcio, la actividad sináptica también induce señales de sodio en las dendritas y espinas, las propiedades de las que son en gran parte inexplorado. Tales señales pueden ser analizados mediante formación de imágenes de dos fotones de sodio intracelular ([Na +] i), que permite la medición en línea de [Na +] i transitorios por períodos prolongados sin blanqueo tinte significativa o foto-daño 1,2. Para imágenes de i [Na +] </sub&gt;, sólo unos pocos colorantes indicadores químicos están disponibles, por ejemplo, Corona Verde o Asante Natrium Verde 3,4. La sonda fluorescente más comúnmente utilizado para obtener imágenes de Na + es isoftalato de benzofurano (SBFI) de unión de sodio. Es un radiométrica, colorante UV excitada similar a la conocida colorante sensible al calcio fura-2 y se ha empleado para formación de imágenes convencional Na + en muchos tipos de células (por ejemplo, 5,6). Hay diferentes posibilidades de excitar el colorante y la recogida de su fluorescencia. Si se requiere alta resolución temporal (es decir, una velocidad de fotogramas de imagen de alta) en combinación con la información espacial, SBFI puede ser excitado con una lámpara de arco de xenón o un diodo (LED) dispositivo emisor de luz de alta potencia y su emisión detectada con una carga de alta velocidad dispositivo-junto (CCD) 7,8 cámara. Para la resolución espacial máxima profundidad en el tejido, la microscopía de barrido láser multi-fotón es el método de elección 9. El efficie cuántica relativamente bajancy de SBFI requiere concentraciones relativamente altas de tinte (0,5-2 mM), y la carga directa de la forma de membrana impermeable de SBFI a través de un microelectrodo agudo 10 o parche pipeta 1. Usando SBFI, trabajo anterior realizado en cortes de tejido agudos de hipocampo de roedores demostró transitorios sodio relacionados con la actividad en las dendritas y espinas de las neuronas piramidales CA1 que son causadas principalmente por el influjo de sodio a través de receptores ionotrópicos NMDA 1,2. Para el estudio de las propiedades de dichas señales de sodio locales en más detalle, la activación específica de los receptores postsinápticos por aplicación de agonistas de los receptores es un método muy adecuado de elección. Para imitar la actividad presináptica y la liberación del transmisor, la aplicación debe ser relativamente breve y centrado para permitir la estimulación local. Esto, sin embargo, resulta ser bastante difícil en el tejido intacto. Aplicación de presión local de agonistas de los receptores utilizando una pipeta con punta fina permite ap muy focalplicatura, pero alberga el riesgo potencial para producir el movimiento de la estructura de interés (por ejemplo, como una dendrita o espinas dendríticas), y por lo tanto dificulta la proyección de imagen de alta resolución. La idoneidad de la iontoforesis de sustancias neuro-activo depende de sus propiedades eléctricas y las altas amplitudes de corriente puede producir artefactos celulares también. Una forma de soslayar estos obstáculos es el empleo de compuestos foto-activado y su fotólisis flash. Básicamente, dos principios diferentes se utilizan para la foto-activación de sustancias enjaulados: I) de campo amplio de flash fotólisis 11 y II) uncaging focal empleando módulos de análisis en combinación con el láser 12. Si bien en todo el campo de flash fotólisis se utiliza para activar las regiones más grandes de interés, por ejemplo, una célula entera, se emplea uncaging focal para estimular específicamente pequeños compartimentos celulares. En el presente estudio se demuestra un procedimiento para de células enteras patch-clamp y multi-pformación de imágenes de sodio Hoton en las dendritas y espinas de las neuronas centrales, combinada con un procedimiento modificado para uncaging inducida por luz UV de glutamato, que permite la activación fiable y focal de receptores de glutamato en el tejido.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1138">
	<tbody>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:239px;">Hadrware/Software Component</td>
			<td style="width:231px;">Manufacturer</td>
			<td style="width:183px;">Type</td>
			<td style="width:487px;">Comment</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Borosilicate-glass capillaries</td>
			<td>Hilgenberg</td>
			<td>1405059</td>
			<td>75 mm x 2 mm, wall thickness 0.3 mm</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Camera</td>
			<td>Jenoptik</td>
			<td>ProgRes MF</td>
			<td>IR-DIC compatible camera</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Deconvolution software</td>
			<td>SVI</td>
			<td>Huygens Pofessional X11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Fiber optic spectrometer</td>
			<td>Ocean Optics</td>
			<td>USB 4000</td>
			<td>Miniature fiber optic spectrometer</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Filter tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>cenrifugal filter, 0.2 &#181;m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Imaging software</td>
			<td>Olympus Europe</td>
			<td>Flowview Ver 5.0c, Tiempo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">IR beam power controller</td>
			<td>Custom built</td>
			<td></td>
			<td>Laser beam intensity control + fast switch to zero on flyback via pockels cell</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">IR laser</td>
			<td>SpectraPhysics</td>
			<td>Mai-Tai VF-N1S</td>
			<td>fs-pulsed Ti:Sa tunable laser (710-990 nm); CAUTION</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">IR power monitor</td>
			<td>Custom built</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Micromanipulator</td>
			<td>Burleigh</td>
			<td>PCS 5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Microscope/Imaging System</td>
			<td>Olympus Europe</td>
			<td>BX51WI/FV300</td>
			<td>Both, the microscope and the imaging systems were strongly modified</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">ND filter wheel</td>
			<td>Newport</td>
			<td>50Q04AV.2</td>
			<td>UV fused silica, optical density 0.05-2.0</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Objective</td>
			<td>Nikon Instruments Europe</td>
			<td>NIR Apo 60x/1.0w</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Patch clamp amplifier</td>
			<td>HEKA</td>
			<td>EPC-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Pipette puller</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>Model PP-830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Pneumatic drug ejection system</td>
			<td>NPI Electronic</td>
			<td>PDES-DXH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Pockels cell</td>
			<td>Conoptics</td>
			<td>350-80 LA-BK</td>
			<td>EOM, used as fast switch and for power adjustment</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Pockels cell driver</td>
			<td>Conoptics</td>
			<td>M302-RM</td>
			<td>High voltage differential amplifier</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Shutter</td>
			<td>Vincent Associates</td>
			<td>LS6ZM2</td>
			<td>ALMgF2-coated BeCu blades</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Shutter controller</td>
			<td>Custom built</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Shutter driver</td>
			<td>Vincent Associates</td>
			<td>Uniblitz VCM D1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Slicer / Vibratome</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Microm HM 650 V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Uncaging software</td>
			<td>Rapp OptoElectronic</td>
			<td>UGA40 1.1.2.6 + NetCam</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">UV laser&#160;</td>
			<td>Rapp OptoElectronic</td>
			<td>DL-355/10</td>
			<td>cw DPSSL Laser, 355 nm; 10 mW; CAUTION</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">UV laser scanning system</td>
			<td>Rapp OptoElectronic</td>
			<td>UGA 40</td>
			<td>Galvanometric scanning system</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Name of Compound</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td></td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">CNQX</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C-127</td>
			<td>AMPA receptor antagonist; CAUTION</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">DL-AP5</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J64210</td>
			<td>NMDA receptor antagonist; CAUTION</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">SBFI K+ Salt</td>
			<td>Teflabs</td>
			<td>OO32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">TTX</td>
			<td>Ascent Scientific</td>
			<td>Asc-055</td>
			<td>Inhibitor of voltage-dependent Na+ channels; CAUTION</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">NMI-caged-L-Glutamate</td>
			<td>Torcis</td>
			<td>1490</td>
			<td>Caged glutamatereleased upon UV absobtion</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multi-photon intracellular sodium imaging combined with uv-mediated focal uncaging of glutamate in ca1 pyramidal neurons

Microscopía de fluorescencia Multi-fotón ha permitido el análisis de parámetros morfológicos y fisiológicos de las células del cerebro en el tejido intacto con alta resolución espacial y temporal. Combinado con la electrofisiología, se utiliza ampliamente para estudiar las señales de calcio relacionados con la actividad en pequeños compartimentos subcelulares tales como dendritas y espinas dendríticas. Además de los transitorios de calcio, la actividad sináptica también induce señales de sodio postsinápticos, las propiedades de los cuales son sólo marginalmente entendidos. Aquí se describe un método para su conjunto de células patch-clamp combinado y de imagen de sodio multi-fotón en celulares dominios micro de las neuronas centrales. Además, se introduce un procedimiento modificado para la ultra-violeta (UV) uncaging inducida -light de glutamato, que permite la activación fiable y focal de receptores de glutamato en el tejido. Para este fin, las grabaciones de células enteras se realizaron en Cornu Ammonis subdivisión 1 (CA1) neuronas piramidales en cortes de tejido agudos de lahipocampo del ratón. Las neuronas se llenaron con el colorante fluorescente SBFI sensible al sodio a través del parche pipeta, y multi-fotón de excitación de SBFI permitieron la visualización de las dendritas y espinas adyacentes. Para establecer uncaging focal inducida por UV, varios parámetros, incluyendo la intensidad de luz, volumen afectado por el haz uncaging UV, el posicionamiento de la viga así como la concentración del compuesto enjaulado fueron probados y optimizados. Nuestros resultados muestran que la perfusión local con glutamato enjaulado (MNI-glutamato) y su focal resultado-UV uncaging en corrientes hacia el interior y los transitorios de sodio en las dendritas y espinas. Transcurso de tiempo y la amplitud de las dos corrientes de entrada y las señales de sodio se correlacionan con la duración del impulso de uncaging. Además, nuestros resultados muestran que las señales intracelulares de sodio están bloqueados en presencia de bloqueadores para los receptores de glutamato ionotrópicos, lo que demuestra que están mediadas por la entrada de sodio, aunque esta vía. En resumen, nuestro método proporciona una herramienta fiable para lainvestigación de señales intracelulares de sodio inducida por la activación del receptor en el tejido cerebral focal intacto.

En el presente estudio, se demuestra un procedimiento para la microscopía de múltiples fotones de la dinámica de sodio celulares con el fluorescente SBFI colorante dependiente del sodio en las neuronas piramidales CA1 del ratón aguda cortes de tejido del hipocampo. Por otra parte, nos muestran cómo combinar esta técnica de imagen con uncaging basado escaneo láser de compuestos neuro-activa (por ejemplo, glutamato enjaulado) y su precisión extrema a la micro-dominios celulares. Cargando neuronas con SBFI a través de la pipeta patch-permitieron la visualización de toda la célula incluyendo finas dendritas y espinas adyacentes mediante el empleo de excitación multi-fotón (Figura 6A, B, D y la Figura 7a). <img alt="Figura 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52038/52038fig6highres.jpg" width="500" /> Figura 6. señales de sodio y corrientes sinápticas inducidas por el flash fotólisis de glutamato enjaulado. (A) Maximimagen de proyección al de una neurona piramidal CA1 cargado con SBFI a través de la pipeta de parche (PP). El cuadro indica el área que se muestra ampliada en B. LP indica la posición y orientación de la pipeta para perfusión local de glutamato enjaulado. (B) de alta potencia de proyección máxima de una pila de secciones ópticas de una dendrita con espinas dendríticas adyacentes. Las pilas de secciones ópticas se sometieron z-alineación y deconvolución. La cruz roja indica que la región de orientación del haz uncaging. La línea de puntos naranja delimita la región de interés de la que se registró la emisión de fluorescencia. El cuadro indica el área que se muestra ampliada en D. (C) A la izquierda: la señal de sodio (fila superior) y somática corriente de entrada (fila inferior) inducida por el flash fotólisis de glutamato enjaulado (indicado por el flash de color amarillo). La línea roja representa un ajuste de los datos experimentales. El área gris representa el período en el que el flash uncaging (300mseg) obstruyó la obtención de imágenes de fluorescencia SBFI Derecha:. Sin pre-perfusión con glutamato enjaulado, la misma UV-flash ni evocó un cambio en la emisión de SBFI, ni una corriente hacia el interior (D) Izquierda:. Imagen de alta potencia de la dendrita y adyacentes espinas según lo delineado en B. Junto, la misma imagen con valores de gris invertidos. Las líneas punteadas indican las regiones de interés en la que se registró la emisión de fluorescencia. La cruz roja indica la localización del haz de uncaging Derecha:. Transitorios de sodio inducida por la radiación UV-flash fotólisis de glutamato enjaulado. Azul traza: señales de sodio en la dendrita; trazo rojo: la respuesta de tres espinas adyacentes al lugar uncaging promedio; verde rastro: la respuesta de tres espinas distantes promedio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52038/52038fig6highres.jpg" target="_blank">Por favor haga clic aquí para una versión más grande de esta figura.</a> Después de la perfusión local con enjauladoglutamato, la aplicación de un UV-flash cerca de una dendrita resultó en una disminución transitoria en la emisión de fluorescencia de SBFI, lo que refleja un aumento en la concentración de sodio intracelular (Figura 6C, D y la Figura 7B). Al mismo tiempo, una corriente hacia el interior se registró en el soma (Figura 6C y la Figura 7B). El aumento de la duración del destello UV resultó en el aumento de las amplitudes tanto de la provocada corrientes hacia el interior y las señales de sodio (datos no mostrados), lo que indica que el sistema estaba dentro de su rango dinámico y que las respuestas ni uncaging ni celulares se saturaron. Aplicación de un UV-flash de idéntica duración o más para rebanadas que no habían sido pre-perfundido con glutamato enjaulado, nunca provocó cambios en la fluorescencia SBFI ni corrientes hacia el interior, lo que indica que estas señales se deben a la uncaging de glutamato (Figura 6C). Por otra parte, estos resultados muestran que u no se observa la interdependencia de los componentes Imaging- y uncagingnder nuestras condiciones experimentales. Señales de sodio también puede ser detectada en las espinas dendríticas (Figura 6D). Mientras que no trató de lograr la estimulación de una sola columna sólo con uncaging glutamato, amplitudes máximas tendían a ser ligeramente superior en las espinas cerca del lugar uncaging, mientras que las espinas mostraron más lejos cambios de fluorescencia prácticamente idénticas a la dendrita padres (Figura 6D). Finalmente, se estudió la vía para la entrada de sodio en dendritas y espinas en respuesta a uncaging de glutamato. Para este fin, empleamos CNQX y APV, que son bloqueadores selectivos para los receptores de glutamato de sodio-permeable, ionotrópicos de la AMPA- y NMDA-subtipo, respectivamente. Nuestros resultados muestran que las señales de sodio intracelular inducida por glutamato y las corrientes provocadas somáticas se omitieron en la presencia de estos bloqueadores (Figura 7B). Tras lavado de los bloqueadores, las señales se recuperaron. Esto demuestra That uncaging de glutamato activa los receptores de glutamato ionotrópicos en las neuronas piramidales de CA1, que median el flujo de sodio en las dendritas y espinas, lo que resulta en los transitorios de sodio intracelular y corrientes hacia el interior. <img alt="Figura 7" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52038/52038fig7highres.jpg" width="600" /> Figura 7. perfil farmacológico de señales de sodio evocados y corrientes hacia el interior. (A) SBFI lleno de CA1 neurona piramidal con parche pipeta (PP) unido a la soma (B) Izquierda:. Transitoria de sodio y la corriente somática inducida por la foto-activación de glutamato enjaulado en una dendrita y espinas adjuntos Centro:. Perfusión con el bloqueadores de los receptores de glutamato ionotrópicos CNQX y APV inhibe tanto la señal de sodio y la corriente hacia el interior inducida por uncaging Derecha:. Tras lavado de los bloqueadores, las señales se restauran. Los represen línea rojact que un ajuste de los datos experimentales. El área gris representa el período en el que el flash uncaging (300 ms) obstruyó la obtención de imágenes de fluorescencia SBFI. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52038/52038fig7highres.jpg" target="_blank">Por favor haga clic aquí para una versión más grande de esta figura.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Multi-photon Intracellular Sodium Imaging Combined with UV-mediated Focal Uncaging of Glutamate in CA1 Pyramidal Neurons at JoVE.com

Multi-photon Intracellular Sodium Imaging Combined with UV-mediated Focal Uncaging of Glutamate in CA1 Pyramidal Neurons

Se describe la combinación de focal foto-activación inducida por UV de compuestos neuroactivos con células enteras patch-clamp y las imágenes de múltiples fotones de los transitorios de sodio intracelulares en dendritas y espinas de las neuronas del hipocampo en cortes de tejido agudas del cerebro de ratón.

Multi-fotón intracelular de sodio Imaging Combinado con Desembalado focal UV-mediada de glutamato en las neuronas CA1 Piramidal

Multi-photon fluorescence microscopy has enabled the analysis of morphological and physiological parameters of brain cells in the intact tissue with high ...

multi-photon-intracellular-sodium-imaging-combined-with-uv-mediated

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.9K vistas.  Heinrich Heine University Düsseldorf.  Se describe la combinación de focal foto-activación inducida por UV de compuestos neuroactivos con células enteras patch-clamp y las imágenes de múltiples fotones de los transitorios de sodio intracelulares en dendritas y espinas de las neuronas del hipocampo en cortes de tejido agudas del cerebro de ratón. 

Video: Multi-photon Intracellular Sodium Imaging Combined with UV-mediated Focal Uncaging of Glutamate in CA1 Pyramidal Neurons

Optical Imaging of Neurons in the Crab Stomatogastric Ganglion with Voltage-sensitive Dyes

Voltage-sensitive dye imaging of neurons is a key methodology for the understanding of how neuronal networks are organised and how the simultaneous activity of participating neurons leads to the emergence of the integral functionality of the network. Here we present the methodology of application of this technique to identified pattern generating neurons in the crab stomatogastric ganglion. We demonstrate the loading of these neurons with the fluorescent voltage-sensitive dye Di-8-ANEPPQ and we show how to image the activity of dye loaded neurons using the MiCAM02 high speed and high resolution CCD camera imaging system. We demonstrate the analysis of the recorded imaging data using the BVAna imaging software associated with the MiCAM02 imaging system. The simultaneous voltage-sensitive dye imaging of the detailed activity of multiple neurons in the crab stomatogastric ganglion applied together with traditional electrophysiology techniques (intracellular and extracellular recordings) opens radically new opportunities for the understanding of how central pattern generator neural networks work.

Here we present the methodology for fast and high resolution fluorescent voltage-sensitive dye imaging of detailed activity of neurons in the crab stomatogastric ganglion.

Imagen óptica de neuronas en el ganglio Cangrejo Stomatogastric con tintes sensibles al voltaje

Voltage-sensitive dye imaging of neurons is a key methodology for the understanding of how neuronal networks are organised and how the simultaneous ...

Investigación

Neurociencias

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

Optogenetic methods have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity underlying a diverse set of behaviors across a broad range of species. Optogenetic tools of microbial origin consist of light-sensitive membrane proteins that are able to activate (e.g., channelrhodopsin-2, ChR2) or silence (e.g., halorhodopsin, NpHR) neural activity ingenetically-defined cell types over behaviorally-relevant timescales. We first demonstrate a simple approach for adeno-associated virus-mediated delivery of ChR2 and NpHR transgenes to the dorsal subiculum and prelimbic region of the prefrontal cortex in rat. Because ChR2 and NpHR are genetically targetable, we describe the use of this technology to control the electrical activity of specific populations of neurons (i.e., pyramidal neurons) embedded in heterogeneous tissue with high temporal precision. We describe herein the hardware, custom software user interface, and procedures that allow for simultaneous light delivery and electrical recording from transduced pyramidal neurons in an anesthetized in vivo preparation. These light-responsive tools provide the opportunity for identifying the causal contributions of different cell types to information processing and behavior.

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

The recent development of neuroscience tools that combine genetics and optics, termed "optogenetics", enables control over neural circuit activity with an unprecedented level of spatial and temporal resolution. Here we provide a protocol for integrating in vivo recording with optogenetic manipulation of genetically-defined subsets of prefrontal cortical and subicular pyramidal neurons.

Un método para la alta fidelidad Optogenética control de un individuo neuronas piramidales<em&gt; En vivo</em

Optogenetic methods  have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity  underlying a diverse set of behaviors across a broad range ...

Intracellular Recording, Sensory Field Mapping, and Culturing Identified Neurons in the Leech, Hirudo medicinalis

The freshwater leech, Hirudo medicinalis, is a versatile model organism that has been used to address scientific questions in the fields of neurophysiology, neuroethology, and developmental biology. The goal of this report is to consolidate experimental techniques from the leech system into a single article that will be of use to physiologists with expertise in other nervous system preparations, or to biology students with little or no electrophysiology experience. We demonstrate how to dissect the leech for recording intracellularly from identified neural circuits in the ganglion. Next we show how individual cells of known function can be removed from the ganglion to be cultured in a Petri dish, and how to record from those neurons in culture. Then we demonstrate how to prepare a patch of innervated skin to be used for mapping sensory or motor fields. These leech preparations are still widely used to address basic electrical properties of neural networks, behavior, synaptogenesis, and development. They are also an appropriate training module for neuroscience or physiology teaching laboratories.

Intracellular Recording, Sensory Field Mapping, and Culturing Identified Neurons in the Leech, Hirudo medicinalis

This article describes three nervous system preparations using leeches: intracellular recording from neurons in ventral ganglia, culturing neurons from ventral ganglia, and recording from a patch of innervated skin to map sensory fields.

Intracelular de grabación, Sensorial Asignación de campos, y el cultivo de neuronas identificadas en el Leech, Hirudo medicinalis</i

The freshwater leech, Hirudo medicinalis, is a versatile model organism that has been used to address scientific questions in the fields of ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

Fast Micro-iontoforesis de glutamato y GABA: una herramienta útil para investigar la integración sináptica

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Deriving the Time Course of Glutamate Clearance with a Deconvolution Analysis of Astrocytic Transporter Currents

The highest density of glutamate transporters in the brain is found in astrocytes. Glutamate transporters couple the movement of glutamate across the membrane with the co-transport of 3 Na+ and 1 H+ and the counter-transport of 1 K+. The stoichiometric current generated by the transport process can be monitored with whole-cell patch-clamp recordings from astrocytes. The time course of the recorded current is shaped by the time course of the glutamate concentration profile to which astrocytes are exposed, the kinetics of glutamate transporters, and the passive electrotonic properties of astrocytic membranes. Here we describe the experimental and analytical methods that can be used to record glutamate transporter currents in astrocytes and isolate the time course of glutamate clearance from all other factors that shape the waveform of astrocytic transporter currents. The methods described here can be used to estimate the lifetime of flash-uncaged and synaptically-released glutamate at astrocytic membranes in any region of the central nervous system during health and disease.

We describe an analytical method to estimate the lifetime of glutamate at astrocytic membranes from electrophysiological recordings of glutamate transporter currents in astrocytes.

Derivado de la evolución temporal de la Liquidación glutamato con un análisis de deconvolución de Corrientes Transporter astrocíticos

The highest density of glutamate transporters in the brain is found in astrocytes. Glutamate transporters couple the movement of glutamate across the ...

Functional Interrogation of Adult Hypothalamic Neurogenesis with Focal Radiological Inhibition

The functional characterization of adult-born neurons remains a significant challenge. Approaches to inhibit adult neurogenesis via invasive viral delivery or transgenic animals have potential confounds that make interpretation of results from these studies difficult. New radiological tools are emerging, however, that allow one to noninvasively investigate the function of select groups of adult-born neurons through accurate and precise anatomical targeting in small animals. Focal ionizing radiation inhibits the birth and differentiation of new neurons, and allows targeting of specific neural progenitor regions. In order to illuminate the potential functional role that adult hypothalamic neurogenesis plays in the regulation of physiological processes, we developed a noninvasive focal irradiation technique to selectively inhibit the birth of adult-born neurons in the hypothalamic median eminence. We describe a method for Computer tomography-guided focal irradiation (CFIR) delivery to enable precise and accurate anatomical targeting in small animals. CFIR uses three-dimensional volumetric image guidance for localization and targeting of the radiation dose, minimizes radiation exposure to nontargeted brain regions, and allows for conformal dose distribution with sharp beam boundaries. This protocol allows one to ask questions regarding the function of adult-born neurons, but also opens areas to questions in areas of radiobiology, tumor biology, and immunology. These radiological tools will facilitate the translation of discoveries at the bench to the bedside.

The function of adult-born mammalian neurons remains an active area of investigation. Ionizing radiation inhibits the birth of new neurons. Using computer tomography-guided focal irradiation (CFIR), three-dimensional anatomical targeting of specific neural progenitor populations can now be used to assess the functional role of adult neurogenesis.

Interrogatorio funcional de adultos hipotalámica neurogénesis con focal Radiológica Inhibición

The functional characterization of adult-born neurons remains a significant challenge. Approaches to inhibit adult neurogenesis via invasive viral ...

Olfactory Neurons Obtained through Nasal Biopsy Combined with Laser-Capture Microdissection: A Potential Approach to Study Treatment Response in Mental Disorders

Bipolar disorder (BD) is a severe neuropsychiatric disorder with poorly understood pathophysiology and typically treated with the mood stabilizer, lithium carbonate. Animal studies as well as human genetic studies indicate that lithium affects molecular targets that are involved in neuronal growth, survival and maturation, and notably molecules involved in Wnt signaling. Given the ethical challenge to obtaining brain biopsies for investigating dynamic molecular changes associated with lithium-response in the central nervous system (CNS), one may consider the use of neurons obtained from olfactory tissues to achieve this goal.The olfactory epithelium contains olfactory receptor neurons at different stages of development and glial-like supporting cells. This provides a unique opportunity to study dynamic changes in the CNS of patients with neuropsychiatric diseases, using olfactory tissue safely obtained from nasal biopsies. To overcome the drawback posed by substantial contamination of biopsied olfactory tissue with non-neuronal cells, a novel approach to obtain enriched neuronal cell populations was developed by combining nasal biopsies with laser-capture microdissection. In this study, a system for investigating treatment-associated dynamic molecular changes in neuronal tissue was developed and validated, using a small pilot sample of BD patients recruited for the study of the molecular mechanisms of lithium treatment response.

In this study, a novel platform to investigate intraneuronal molecular signatures of treatment response in bipolar disorder (BD) was developed and validated. Olfactory epithelium from BD patients was obtained through nasal biopsies. Then laser-capture microdissection was combined with Real Time RT PCR to investigate the molecular signature of lithium response in BD.

Las neuronas olfativas obtenidos por medio de biopsia nasal combinado con microdisección por láser captura: un enfoque potencial para el Estudio de la respuesta al tratamiento en los trastornos mentales

Bipolar disorder (BD) is a severe neuropsychiatric disorder with poorly understood pathophysiology and typically treated with the mood stabilizer, lithium ...

3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

Toxoplasma gondii is an obligate, intracellular parasite with a broad host range, including humans and rodents. In both humans and rodents, Toxoplasma establishes a lifelong persistent infection in the brain. While this brain infection is asymptomatic in most immunocompetent people, in the developing fetus or immunocompromised individuals such as acquired immune deficiency syndrome (AIDS) patients, this predilection for and persistence in the brain can lead to devastating neurologic disease. Thus, it is clear that the brain-Toxoplasma interaction is critical to the symptomatic disease produced by Toxoplasma, yet we have little understanding of the cellular or molecular interaction between cells of the central nervous system (CNS) and the parasite. In the mouse model of CNS toxoplasmosis it has been known for over 30 years that neurons are the cells in which the parasite persists, but little information is available about which part of the neuron is generally infected (soma, dendrite, axon) and if this cellular relationship changes between strains. In part, this lack is secondary to the difficulty of imaging and visualizing whole infected neurons from an animal. Such images would typically require serial sectioning and stitching of tissue imaged by electron microscopy or confocal microscopy after immunostaining. By combining several techniques, the method described here enables the use of thick sections (160 &#181;m) to identify and image whole cells that contain cysts, allowing three-dimensional visualization and analysis of individual, chronically infected neurons without the need for immunostaining, electron microscopy, or serial sectioning and stitching. Using this technique, we can begin to understand the cellular relationship between the parasite and the infected neuron.

3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

Using this protocol, we were able to image 160 &#181;m thick brain sections from mice infected with the parasite Toxoplasma gondii, which enables visualization and analysis of the spatial relationship between the encysting parasite and the infected neuron.

Imaging 3-D y Análisis de neuronas infectadas<em&gt; En Vivo</em&gt; Con<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Toxoplasma gondii is an obligate, intracellular parasite with a broad host range, including humans and rodents. In both humans and rodents, Toxoplasma ...

Combined Optogenetic and Freeze-fracture Replica Immunolabeling to Examine Input-specific Arrangement of Glutamate Receptors in the Mouse Amygdala

Freeze-fracture electron microscopy has been a major technique in ultrastructural research for over 40 years. However, the lack of effective means to study the molecular composition of membranes produced a significant decline in its use. Recently, there has been a major revival in freeze-fracture electron microscopy thanks to the development of effective ways to reveal integral membrane proteins by immunogold labeling. One of these methods is known as detergent-solubilized Freeze-fracture Replica Immunolabeling (FRIL).
The combination of the FRIL technique with optogenetics allows a correlated analysis of the structural and functional properties of central synapses. Using this approach it is possible to identify and characterize both pre- and postsynaptic neurons by their respective expression of a tagged channelrhodopsin and specific molecular markers. The distinctive appearance of the postsynaptic membrane specialization of glutamatergic synapses further allows, upon labeling of ionotropic glutamate receptors, to quantify and analyze the intrasynaptic distribution of these receptors. Here, we give a step-by-step description of the procedures required to prepare paired replicas and how to immunolabel them. We will also discuss the caveats and limitations of the FRIL technique, in particular those associated with potential sampling biases. The high reproducibility and versatility of the FRIL technique, when combined with optogenetics, offers a very powerful approach for the characterization of different aspects of synaptic transmission at identified neuronal microcircuits in the brain.
Here, we provide an example how this approach was used to gain insights into structure-function relationships of excitatory synapses at neurons of the intercalated cell masses of the mouse amygdala. In particular, we have investigated the expression of ionotropic glutamate receptors at identified inputs originated from the thalamic posterior intralaminar and medial geniculate nuclei. These synapses were shown to relay sensory information relevant for fear learning and to undergo plastic changes upon fear conditioning.

This article illustrates how the expression of neurotransmitter receptors can be quantified and the pattern analyzed at synapses with identified pre and postsynaptic elements using a combination of viral transduction of optogenetic tools and the freeze-fracture replica immunolabeling technique.

Combinados Optogenética y congelación-fractura Réplica Immunolabeling para Analizar Arreglo-entrada específica de glutamato receptores en el ratón amígdala

Freeze-fracture electron microscopy has been a major technique in ultrastructural research for over 40 years. However, the lack of effective means to ...

Ballistic Labeling of Pyramidal Neurons in Brain Slices and in Primary Cell Culture

It has been reported that the size and shape of dendritic spines is related to their structural plasticity. To identify the morphological structure of pyramidal neurons and dendritic spines, a ballistic labeling technique can be utilized. In the present protocol, pyramidal neurons are labeled with DilC18(3) dye and analyzed using neuronal reconstruction software to assess neuronal morphology and dendritic spines. To investigate neuronal structure, dendritic branching analysis and Sholl analysis are performed, allowing researchers to draw inferences about dendritic branching complexity and neuronal arbor complexity, respectively. The evaluation of dendritic spines is conducted using an automatic assisted classification algorithm integral to the reconstruction software, which classifies spines into four categories (i.e., thin, mushroom, stubby, filopodia). Furthermore, an additional three parameters (i.e., length, head diameter, and volume) are also chosen to assess alterations in dendritic spine morphology. To validate the potential of wide application of the ballistic labeling technique, pyramidal neurons from in vitro cell culture were successfully labeled. Overall, the ballistic labeling method is unique and useful for visualizing neurons in different brain regions in rats, which in combination with sophisticated reconstruction software, allows researchers to elucidate the possible mechanisms underlying neurocognitive dysfunction.

We present a protocol to label and analyze pyramidal neurons, which is critical for evaluating potential morphological alterations in neurons and dendritic spines that may underlie neurochemical and behavioral abnormalities.

Etiquetado balístico de las neuronas piramidales en las rebanadas cerebrales y en el cultivo celular primario

It has been reported that the size and shape of dendritic spines is related to their structural plasticity. To identify the morphological structure of ...