Joseph W. Ndieyira fue apoyada por el Consejo de Ingeniería y Ciencias Físicas de Investigación (EPRSC), el Centro Interdisciplinario de Investigación en Nanotecnología (IRC), la Royal Society (RS) y consultoría Biano (BNC). Agradecemos, Alejandra Donoso Barrera, Dejian Zhou, Manuel Vögtli, Matthew Batchelor, Matthew A. Cooper, Torsten Strunz, Trevor Rayment y Gabriel Aeppli útil para los debates.

1. Preparación de Cantilevers <ol><li> Usando unas pinzas de teflón sumerja número seleccionado de fichas en voladizo (cantilever medir cada 500 m de largo, 100 m de ancho y 0,9 m de espesor) en una solución de pirañas recién preparada (en proporción 1:1 H 2 SO 4 y H 2 O 2) durante 20 min . </li><li> Después de aproximadamente 20 min eliminar las fichas en voladizo de la solución de pirañas y enjuague bien con agua desionizada y transferir inmediatamente en una solución recién preparada de pirañas. Repetir el paso por encima de 1,1 si los chips contienen manchas de suciedad proceder de otra manera con el paso siguiente. </li><li> Después de una limpieza a fondo en agua desionizada, enjuague con etanol puro y secar las patatas fritas en voladizo sobre una placa caliente a 75 ° C para eliminar cualquier rastro de agua. Inspeccionar ellos utilizando un microscopio óptico para confirmar su limpieza. </li><li> Transfiera los chips voladizo limpiados a una cámara de evaporación y la bomba de baja, apuntando a lograr un vacíopresión de 10 -7 mbar. </li><li> Una vez que se alcanza la presión de vacío requerido, la capa uno de los lados de cada matriz en voladizo con una de titanio 2 nm primero a actúa como una capa de adhesión antes de una capa adicional de oro de 20 nm de espesor. Para confirmar su grosor, el uso del monitor de cristal de cuarzo se coloca directamente sobre la fuente de destino. </li><li> Deja chips sensores cantilever recubiertos de oro en la cámara durante 1-2 horas para enfriar al vacío antes de abrir. </li><li> Transferencia de las patatas fritas recién evaporadas a un recipiente de almacenamiento vacío, lleno de argón para evitar cualquier forma de contaminación. </li></ol> 2. Cantilever chip funcionalización <ol><li> En primer lugar, disponer de micro-tubos capilares en una etapa de funcionalización 2 de acuerdo con el tamaño de paso voladizo de 250 micras. </li><li> A continuación, inyectar 2 mM soluciones tiol etanólicos de moléculas diana de superficie, es decir, mucopeptides bacterianas (D-Ala y D-Lac), y un &quot;inert &#39;alcanotiol termina en trietilenglicol (PEG) se sabe que resistir biomolecular adsorción. 16 Cada uno de los tubos capilares debe contener una variedad de moléculas de captura de superficie determinadas aleatoriamente para evitar el sesgo de usuario. </li><li> A continuación se incuba durante 20 min los voladizos de la microcapilares lleno de soluciones que contienen tiol moléculas de captura de superficie. Asegúrese de que las soluciones de las moléculas de captura de superficie se limitan a cada sensor en voladizo individuo para evitar o reducir al mínimo la contaminación cruzada. Si este proceso se emplea correctamente, se debe alterar sistemáticamente los voladizos recubiertos de oro recién preparados en sensores químicamente activos formados por lo que permite SAMs de objetivos mucopéptido bacterianas para formar en las superficies recubiertas de oro como receptores. </li></ol> 3. Preparaciones en disolución <ol><li> Disolver 0,1 sales de fosfato de sodio mono-y di-básicos M en agua ultrapura (18,2 mW · cm de resistividad) y la mezcla de la camiseta• Producción en un valor de pH de 7,4. </li><li> Añadir 0,002% de PS80 a las soluciones tamponadas para reducir al mínimo los efectos de agregación provocados por interacciones no específicas de las moléculas de fármaco a la cristalería. </li><li> Diluir medicamentos con soluciones recién buffer a las diferentes concentraciones deseadas que permitan el cálculo de K d. </li><li> Filtrar las soluciones de fármacos recién preparados utilizando filtros de 0,2 micras y someter a ultrasonidos durante 5 min a temperatura ambiente antes de purgar con argón. </li><li> Repita el procedimiento con la droga en el suero tamponada con suero completo. Vórtice suavemente durante 15 minutos con 5 minutos adicionales para asegurar la solubilidad completa. </li></ol> 4. Detección de estrés Superficie <ol><li> Cargar un chip sensor cantilever funcionalizado en una cámara de la celda de flujo líquido. </li><li> Alinear el punto de láser en el extremo libre de cada sensor y confirmar la alineación mediante el calentamiento de la cámara de líquido de 1 ° C. Los ocho conjuntos de sensores recubiertos de oro en voladizo deben someterse Compressive flexión hacia abajo debido al efecto bimetálico causada por las diferencias en las tasas de expansión de silicio y el oro. </li><li> Después de calentar durante aproximadamente 10 min, permiten que los voladizos que se enfríe durante 10 minutos más. </li><li> Calcular la variación de flexión en las señales de máximos de flexión en voladizo entre sensores individuales y si la desviación estándar relativa de las señales de flexión es ≤ 5%, entonces acepta la alineación como deseable repetir lo contrario el proceso. </li><li> A continuación, medir las frecuencias de resonancia de los ocho ménsulas para calcular sus constantes elásticas. Si la variación de la constante entre cada sensor en voladizo dentro de un chip de resorte es ≤ 1%, entonces aceptar el chip como teniendo propiedades mecánicas consistentes de lo contrario sustituir el chip sensor en voladizo. </li><li> A continuación, utilizar un sistema fluídico (Modelo Genie Plus) a través de una válvula de seis vías para lograr el intercambio de líquido dentro de la celda de flujo, mientras que la adquisición de datos puede hacerse utilizando un LabView automatizado por loftware. </li><li> Para supervisar el curvado en voladizo de datos, utilice los siguientes protocolos de medición: i) o bien inyectar solución tampón o suero sin fármaco para la medida de control que dura 5-30 min para establecer una línea de base, ii) inyectar solución de fármaco durante 30-60 min; iii) inyectar HCl 10 mM de lavado para 10-60 min para disociar complejo de fármaco unido; iv) finalmente inyectar otra etapa de lavado con solución tampón para otro 5-30 min para regenerar los péptidos de superficie y para restaurar la señal de línea de base. Siempre asegurarse de que todas las señales se adquieren bajo caudal de líquido constante de 30-180 l / min y a temperatura fija de 25 ° C en un armario de temperatura controlada. </li><li> Las señales de flexión absolutos de los ocho ménsulas deben ser controlados utilizando el tiempo serial multiplexados método de haz óptico con un solo detector sensible a la posición. </li><li> Para analizar las señales de flexión de cada concentración de fármaco, las curvaturas diferenciales resultantes se convierten en un stres diferencialess entre los lados superior e inferior del voladizo utilizando la ecuación de Stoney. </li></ol>

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	<li>Ndieyira, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanomechanical+detection+of+antibiotic-mucopeptide+binding+in+a+model+for+superbug+drug+resistance.">Nanomechanical detection of antibiotic-mucopeptide binding in a model for superbug drug resistance.</a> Nat. Nanotech. 3, 691-696 (2008).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+label-free+nanomechanical+detection+of+biomarker+transcripts+in+human+RNA.">Rapid and label-free nanomechanical detection of biomarker transcripts in human RNA.</a> Nat. Nanotech. 1, 214-220 (2006).</li><li>McKendry, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+label-free+biodetection+and+quantitative+DNA-binding+assays+on+a+nanomechanical+cantilever+array.">Multiple label-free biodetection and quantitative DNA-binding assays on a nanomechanical cantilever array.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 9783-9788 (2002).</li><li>Wu, G., Datar, R. H., Hansen, K. M., Thundat, T., Cote, R. J., Majumdar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioassay+of+prostate-specific+antigen+(PSA)+using+microcantilevers.">Bioassay of prostate-specific antigen (PSA) using microcantilevers.</a> Nat. 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H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+vancomycin+group+antibiotics+to+D-alanine+and+D-lactate+presenting+self-assembled+monolayers.">Binding of vancomycin group antibiotics to D-alanine and D-lactate presenting self-assembled monolayers.</a> Bioorg. Med. Chem. 8, 2609-2616 (2000).</li><li>Rao, J., Yan, L., Xu, B., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+surface+plasmon+resonance+to+study+the+binding+of+vancomycin+and+its+dimer+to+self-assembled+monolayers+presenting+D-Ala-D-Ala.">Using surface plasmon resonance to study the binding of vancomycin and its dimer to self-assembled monolayers presenting D-Ala-D-Ala.</a> J. Am. Chem. Soc. 121, 2629-2630 (1999).</li><li>MacBeath, G., Schreiber, S. 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Chem. 71, 777-790 (1999).</li><li>Nugaeva, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micromechanical+cantilever+array+sensors+for+selective+fungal+immobilization+and+fast+growth+detection.">Micromechanical cantilever array sensors for selective fungal immobilization and fast growth detection.</a> Biosens. Bioelectron. 21, 849-856 (2005).</li><li>Von Muhlen, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+biomarker+sensing+in+undiluted+serum+with+suspended+microchannel+resonators.">Label-free biomarker sensing in undiluted serum with suspended microchannel resonators.</a> Anal. Chem. 82, 1905-1910 (2010).</li><li>Godin, M., M, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+buoyant+mass+to+measure+the+growth+of+single+cells.">Using buoyant mass to measure the growth of single cells.</a> Nat. Methods. 7, 387-390 (2010).</li><li>Mertens, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+gas+trace+of+hydrofluoric+acid+using+microcantilever.">Detection of gas trace of hydrofluoric acid using microcantilever.</a> Sens. Actuators B Chem. 99, 58-65 (2004).</li><li>Porter, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+solidstate+sensor+platform+for+the+detection+of+hydrogen+cyanide+gas.">A solidstate sensor platform for the detection of hydrogen cyanide gas.</a> Sens. Actuator B Chem. 123, 313-317 (2007).</li></ol>

No hay conflictos de interés se declara

El reconocimiento molecular paradigma sustenta grandes franjas de la biología y la medicina. En farmacología, por ejemplo, el objetivo es interferir con una vía patológica por dirigidas a un participante clave de un proceso bioquímico, tales como transglycoslyation o transpeptidación que cataliza la reticulación de los péptidos de la pared celular bacteriana. Por consiguiente, el diseño de fármacos se reduce a la definición de una molécula adecuada para dirigirse a un sitio específico de acoplamiento bacteriana para inducir un ajuste perfecto. Un ejemplo clásico emulando el éxito de este enfoque es la vancomicina (Van), que se dirige a la pared celular de peptidoglicano, una característica estructural conservada de una bacteria. En una naciente bacteria Gram-positiva, la matriz de peptidoglicano consiste en péptidos que terminan en la secuencia Lisina-D-alanina-D-alanina, atado a través de un enlazador 8-10 C55 lípidos aquí denominados D-Ala. Estos péptidos expuestos en los precursores de peptidoglicano son fundamentales para elprotección mecánica de las células bacterianas contra las fuerzas ambientales duras, y esto es importante, no se encuentra en las células humanas, lo que los objetivos ideales para fármacos antibióticos. Van se une específicamente al extremo C-terminal de los péptidos bacterianos de la pared celular que forman un moderadamente fuerte Van-péptido complejo como se muestra en la Figura 1. Esta interacción entre Van y los péptidos bloques expuestas las acciones de transpeptidases y transglycosylases, que catalizan la reticulación de las paredes de las células 1, detener efectivamente de reticulación y por lo tanto debilita nanomechanically la célula bacteriana que conduce a su muerte por ruptura 1,6, 7. La aparición de Enterococcus resistente a la vancomicina (VRE) es un problema cada vez mayor atención sanitaria 11 y debido a la resistencia bacteriana en enterococos surge debido al cambio sutil de una amida linKage a un enlace éster 8, este cambio estructural aparentemente simple en la superficie de la bacteria elimina un solo enlace de hidrógeno a partir de Van &#39;s sitio de acoplamiento con una modificación posterior del bolsillo de unión. Es importante destacar que este proceso altera el pentapéptido terminal de alanina presente en la vancomicina Enterococcus susceptibles (VSE) a una lisina-D-alanina-D-lactato 10,12, aquí denominado D-Lac, produciendo una reducción significativa en la afinidad de unión de Van-D-Lac por tres órdenes de magnitud prestación Van terapéuticamente eficaces contra las infecciones enterocócicas 1, el crecimiento alarmante de las bacterias resistentes a los antibióticos está conduciendo por lo tanto, el desarrollo de enfoques innovadores para acelerar y restaurar la actividad antibacteriana de los agentes antibacterianos o el descubrimiento de fármacos más potentes contra bacterias resistentes a múltiples fármacos infecciones. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Nuestros experimentos con voladizos exentas se inspira en los sistemas tales como las células que aprovechen la energía química en marcha. La capacidad de los sensores de cantilever para traducir la energía química en movimiento mecánico ellos sondas únicas con ventajas considerables para el seguimiento de las perturbaciones mecánicas de los objetivos de la pared celular bacteriana en tiempo real hace. Los sensores de cantilever requieren &#39;etiquetas&#39; no reportero y biomoléculas se detectan rápidamente en una reacción de un solo paso. Ellos pueden detectar múltiples fármacos en paralelo en ambientes fisiológicos tales como soluciones tampón y suero entero. Además, la tecnología de voladizo utiliza en el referenciado in situ para mediciones diferenciales que les permite detectar específicamente las interacciones fármaco-diana y, en virtud de su fabricación a través de las rutas de procesamiento de semiconductores estándar, que son susceptibles para la producción en masa y paralelización de cribado de alto rendimiento de miles de fármacos por hora. En partilares múltiples matrices de sensores en voladizo son herramientas útiles para el estudio de resistencia a los antibióticos a la vancomicina - porque la resistencia a la vancomicina es esencialmente un problema mecánico 1,6,7. Las reacciones entre un blanco modelo de pared de célula bacteriana y Van en solución pueden ser detectados mediante la supervisión de los cambios en la tensión inducida clínicamente relevante de interacciones de unión fármaco-diana. La tensión generada a partir de reacciones en la superficie que se manifiesta en una señal de flexión en voladizo se analiza ópticamente por los sensores de iluminación con un haz de láser. Además mediante la adaptación de la capa receptiva de bacterias moléculas diana de superficie en la parte superior del sensor en voladizo, cerca de un número ilimitado de analitos (Van), las interacciones bioquímicas específicas y la biomecánica del modelo de matriz de la pared celular bacteriana se controla en tiempo real. Aparte del evento de reconocimiento molecular, hay varios factores que pueden causar sensores de cantilever para deflect, que incluyen - las variaciones de temperatura, de unión no específica o cambios de índice de refracción de la solución. Para tener en cuenta para las señales no específicas, en las mediciones diferenciales in situ se realizan donde la curvatura de tanto la medición y voladizos de referencia se controlan continuamente para analizar las interacciones específicas. Por otra parte, la sensibilidad de detección de los sensores de cantilever que dependen de la química de la superficie y la geometría se pueden mejorar mediante el ajuste de la superficie de la densidad p (donde p se define como la proporción de la superficie ocupada por las moléculas de captura para toda el área de la superficie superior del voladizo cubierto por la población total de moléculas tal como se determina por espectroscopia de rayos X de fotoelectrones (XPS) 1. Aquí este protocolo detalles cómo vancomicina o cualquier otro antibiótico vinculante a los teléfonos análogos de precursores de la pared bacteriana (mucopeptides) a concentraciones clínicamente relevantes en una solución tampónND suero de la sangre puede ser detectado mediante el uso de la tecnología de etiqueta libre de voladizo. Superficies de oro frescas se utilizan porque monocapas auto-ensambladas (SAMs) tienden a formar fácilmente capas estables en el oro limpio 13,14. MCS se compone de moléculas cortas con un resto tiol unido covalentemente a la superficie de oro, mientras que se permite que la unidad de captura deseado en el otro extremo para interactuar libremente con los objetivos de analito en la solución. Los tioles forman un sistema flexible, en particular dado que muchos compuestos de tiol con diferentes grupos terminales químicos están disponibles comercialmente o se sintetizan fácilmente en un laboratorio. Sin embargo, se debe tener cuidado para asegurar que las moléculas con un resto tiol deben tener los grupos terminales correctos, por ejemplo, en una proteína o péptido de la conjugación, el grupo amino debe enfrentarse hacia el interior para la reacción con el grupo carboxílico del resto tiol atado en la la superficie que se produzca. Aquí, los tioles son directamente conjugado con miméticos tripéptido de lípidos bacteriana II de la bpared celular acterial objetivos sintetizado por metodología de fase sólida utilizando comercialmente disponible precargado Wang-D-Ala y resinas Wang-D-Lac y el estándar grupo protector de Fmoc química 15. Aunque esta descripción se enfoca a la vancomicina, es evidente que se puede extender a otros antibióticos y de hecho más estudios son invitados por investigadores de diferentes campos en particular en la bioquímica, la farmacología y la ciencia de los materiales para adoptar fácilmente este protocolo para sus propios experimentos.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Items</td>
			<td>Catalog Number </td>
			<td>Company</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scentris</td>
			<td></td>
			<td>Scentris, Veeco Instruments, Inc</td>
			<td>Not in production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Six-way valve</td>
			<td></td>
			<td>MVP, Hamilton, Reno, NV</td>
			<td>Enables multiple concentration injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EB Evaporator</td>
			<td></td>
			<td>BOC Edwards Auto 500, UK</td>
			<td>Electron beam is preferable because of deformation of cantilevers caused by thermal heating problems</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Storage vessel</td>
			<td></td>
			<td>Agar Scientific, UK</td>
			<td>Keeps gold coated films fresh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillary</td>
			<td></td>
			<td>King Precision Glass, Claremont, CA, USA</td>
			<td>For capillary functionalization of the cantilever arrays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump</td>
			<td></td>
			<td>Model Genie Plus, Kent Scientific, Torrington, CT, USA</td>
			<td>Good for controlled flow rate of liquid samples in microfluidic channels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2-4.5 &#956;m Filters</td>
			<td>1511940001</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>For sample filtering</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cantilever chips</td>
			<td></td>
			<td>London Centre for Nanotechnology (LCN)</td>
			<td>Highly sensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>10049-21-5</td>
			<td>Sigma-Aldrich, UK</td>
			<td>For making buffer solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>7558-79-4</td>
			<td>Sigma-Aldrich, UK</td>
			<td>For making buffer solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polysorbate 80 (PS80) or Tween 80</td>
			<td>9005-65-6</td>
			<td>Sigma-Aldrich, UK</td>
			<td>Used in buffer solutions to prevent nonspecific interactions on glassware</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DI water</td>
			<td></td>
			<td>Millipore Co., Billerica, MA, USA</td>
			<td>Used for making solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whole serum</td>
			<td>GEM-700-110-H</td>
			<td>Sera Laboratories International Ltd, UK</td>
			<td>Used in measurements that mimic physiological conditions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vancomycin (Van)</td>
			<td>1404-93-9</td>
			<td>Sigma-Aldrich, UK</td>
			<td>Drug used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric acid</td>
			<td>7664-93-9</td>
			<td>Sigma-Aldrich, UK</td>
			<td>Used for glassware cleaning procedures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide</td>
			<td>7722-84-1</td>
			<td>Sigma-Aldrich, UK</td>
			<td>Used for glassware cleaning procedures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Ala and D-Lac</td>
			<td></td>
			<td>London Centre for Nanotechnology (LCN)</td>
			<td>Surface receptors coated on the cantilever for detecting drug-target interactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabView</td>
			<td></td>
			<td>National Instruments Co., Austin, TX, USA</td>
			<td>Software used for instrumental interface to allow controlled measurements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nanomechanics of drug-target interactions and antibacterial resistance detection

El sensor en voladizo, que actúa como un transductor de reacciones entre el modelo de la pared bacteriana matriz de células inmovilizada en su superficie y fármacos antibióticos en solución, ha demostrado un potencial considerable en aplicaciones de detección bioquímicos con sensibilidad y especificidad 1-5 sin precedentes. Las interacciones fármaco-diana generan estrés superficie, haciendo que el voladizo se doble, y la señal se pueden analizar ópticamente cuando es iluminado por un láser. El cambio en la tensión superficial medida con precisión a escala nanométrica permite las interrupciones de la biomecánica del modelo de la pared celular bacteriana objetivos para ser rastreados en tiempo real. A pesar de ofrecer ventajas considerables, varios conjuntos de sensores cantilever nunca se han aplicado en la cuantificación de las interacciones de unión fármaco-diana. Aquí, se presenta en el uso de silicio varias matrices voladizo revestida con alcanotiol monocapas auto-ensambladas que imitan la matriz de la pared celular bacteriana a los estu cuantitativamenteinteracciones de unión antibióticos dy. Para entender el impacto de la vancomicina en la mecánica de las estructuras de la pared celular bacteriana 1,6,7. Hemos desarrollado un nuevo modelo 1 que propone que la flexión en voladizo puede ser descrita por dos factores independientes; i) a saber, un factor químico, que está dada por una isoterma de adsorción de Langmuir clásica, de la que se calcula el equilibrio termodinámico constante de disociación (Kd) y ii) un factor geométrico, esencialmente una medida de cómo los receptores de péptidos bacterianos se distribuyen en la superficie en voladizo. La distribución de la superficie de receptores de péptidos (p) se utiliza para investigar la dependencia de la geometría y la carga de ligando. Se muestra que un valor de umbral de p ~ 10% es crítica para aplicaciones de detección. Por debajo del cual no hay señal detectable de flexión, mientras que por encima de este valor, la señal de flexión aumenta casi linealmente, revelando que el estrés es un producto de una unión química local FACtor y un factor geométrico combinado con la conectividad mecánica de las regiones han reaccionado y proporciona un nuevo paradigma para el diseño de agentes poderosos para combatir infecciones superbacteria.

El cambio de la tensión medida usando precisión nano-escala con una sensibilidad sin precedentes a una sola deleción enlace de H, es explotado para rastrear las interrupciones de modelo bacterianas biomecánica de la pared celular en tiempo real (figuras 2a-d). El límite de sensibilidad de detección de drogas para Van fue investigado por dilución en serie sus concentraciones en pasos de 1,000 mM a ≤ 10 nM, revelando 10 nM (~ 15 ng / ml) como la concentración más baja detectable dando lugar a un promedio de ~ -9 ± 2 nm como las señales diferenciales de flexión (Figura 2c). La capacidad de detectar antibióticos en el medio fisiológico se investigó más en el suero en un intervalo de concentración clínicamente relevante de 3-27 mM 17. Tras la inyección de 7 mM Van en el suero (90% de suero de ternera fetal más 10% de tampón de fosfato de sodio pH 7,4) a través de todos los voladizos en condiciones idénticas, la señal diferencial paraDAla en el suero fue 105 ± 4 nm, mientras que para voladizos recubiertos DLAC, no se observó la flexión (Figura 3). Las considerables señales de flexión observados para DAla recubierto (vancomicina susceptible) voladizos son causados ​​por las fuertes interacciones de unión de fármacos diana. Sin embargo, para DLAC recubierto (resistentes a la vancomicina) voladizos, la presencia de la repulsión del estado fundamental del oxígeno par solitario y la reducción de NH bonos en el bolsillo de unión vancomicina 10,12 contribuye al debilitamiento de las interacciones de unión fármaco-diana que se traduce en menos o ningún curvado en voladizo, particularmente para concentraciones de vancomicina más bajos (Figura 3). Sin embargo, por una alta concentración de vancomicina, observamos señales de flexión medibles para DLAC. Además, nuestro diseño experimental es importante que en el referenciado situ en todo cantilevers recubiertas con tanto DAla y DLAC están expuestos simultáneamente para el mismo analito en tiempo real. Para entender el papel preciso de la química y la geometría, se diseñó un modelo 1 que describe la correlación entre las interacciones de disolvente y la mecánica de superficie. Esto produce la tensión superficial: <img alt="Ecuación 1" src="/files/ftp_upload/50719/50719eq1.jpg" /> para p&gt; pc y cero en otro caso (1) El primer término de la ecuación (1) es la isoterma de adsorción Langmuir, que representan eventos de unión fármaco-diana y el segundo término es la forma de ley de potencia que describe las consecuencias mecánicas de gran escala de formación de redes estresado. La constante a corresponde a la tensión máxima de la superficie en que todos los sitios de unión accesibles están ocupados y K d es el equilibrio de disociación superficie constante en el voladizo. El análisis como se muestra en la Figura 4 es el resultado del ajuste global de la ecuación (1) superpuesta a señales de estrés diferencial medida que revelan; un ~ 29,7 ± 1,0 o 14,1 ± 3,0 mN / m y K d ~ 1,0 ± 0,3 800 ± o 310 mM de D-Ala o péptidos DLAC, donde A corresponde a una medida de la tensión superficial cuando todos los sitios de unión accesibles están ocupadas. El aumento de la sensibilidad de voladizo estaba sintonizada variando sistemáticamente la densidad de péptido p, mientras que el seguimiento de los datos de estrés como una función de p, mientras que concentraciones de antibióticos fijan en 10, 100, y 250 mM, respectivamente (Figura 5). El proceso se repitió con el estrés como una función de las concentraciones de Van mientras que las densidades de péptidos fijados en p ~ 100%. &lt;img alt = &quot;Figura 1&quot; fo: content-width = src &quot;5in&quot; = &quot;/ files/ftp_upload/50719/50719fig1.jpg&quot; /&gt; Figura 1. La detección de antibióticos en voladizo interacciones de unión superficiales. a) Representación esquemática de una matriz de sensores en voladizo y el modo por el cual se detectan las interacciones fármaco-diana nanomechanically. b) interacción de unión química entre una molécula de fármaco (Van) y el análogo mucopéptido bacteriana (D-Ala o D-Lac). c) El mecanismo por el cual una mutación bacterias susceptibles a la vancomicina (VSE) adquiere resistencia a la vancomicina mediante la supresión de un enlace de H solo en el bolsillo de unión. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50719/50719fig1large.jpg" target="_blank">Haz clic aquí para ver más grande la figura</a> . <img alt="La figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50719/50719fig2.jpg" /&gt; Figura 2. El seguimiento de las interrupciones de los modelo bacterianas biomecánica de la pared celular en tiempo real. a) Las señales de flexión absolutos de D-Ala, D-Lac y voladizos recubiertos de PEG en tampón fosfato y 250 mM vancomicina. Las señales de referencia de PEG diferenciales se muestran en líneas negras. B) señales diferenciales de flexión de D-Ala y voladizos recubiertos D-Lac en tampón de fosfato y 250 mM vancomicina. C) El diferencial de voladizo de deflexión de una señal dependiente de la dosis como una función de tiempo en la presencia de concentraciones de vancomicina en el orden de 10 nm (línea amarilla), 100 nm (línea roja) y 1.000 nM (línea de color rojo oscuro), respectivamente. d) Las señales de desviación voladizo diferenciales para tres D-Ala sensores de cantilever recubiertos como función del tiempo en la presencia de 10vancomicina nM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50719/50719fig2large.jpg" target="_blank">Haz clic aquí para ver más grande la figura</a> . <img alt="Figura 3" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50719/50719fig3.jpg" /> Figura 3. El seguimiento de las perturbaciones de los modelos de la biomecánica de la pared celular bacteriana en tiempo real para un D-Ala y voladizos recubiertos D-Lac en presencia de vancomicina 7 micras de suero fetal bovino. <img alt="Figura 4" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50719/50719fig4.jpg" /> La Figura 4. La investigación de los nanomecánica de las interacciones fármaco-diana. Gráfico que muestra la respuesta al estrés superficie diferencial medida para D-Ala (círculos negros) y D-Lac (círculos rojos) voladizos recubiertos como una función de la vancomicinaconcentración en solución [Van]. Los datos se describen por la ecuación (1) (líneas continuas). 1 <img alt="La figura 5" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50719/50719fig5.jpg" /> Figura 5. Optimización de la sensibilidad de detección nanomecánica de las interacciones receptor-ligando por la investigación de la dependencia de la carga del receptor y de la geometría a través de monocapas mixtas. Diferenciales respuestas de estrés superficial medida de sensores en voladizo como una función de D-Ala cobertura de la superficie, p en la presencia de concentraciones de vancomicina en fijos solución a 10 M (línea de color negro), 100 m (línea roja) y 250 m (línea verde).

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Nanomechanics of Drug-target Interactions and Antibacterial Resistance Detection

La resistencia adquirida a los antibióticos es un problema importante de salud pública y está clasificado actualmente por la OMS como una de las mayores amenazas para la vida humana. Aquí se describe el uso de la tecnología de voladizo para cuantificar la resistencia antibacteriana, crítica para el descubrimiento de nuevos agentes y potente contra bacterias resistentes a múltiples fármacos.

Nanomecánica de Interacciones con Medicamentos objetivo y detección de resistencia a los antibacterianos

The cantilever sensor, which acts as a transducer of reactions between model bacterial cell wall matrix immobilized on its surface and antibiotic drugs in ...

nanomechanics-drug-target-interactions-antibacterial-resistance

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

14.1K vistas.  University College London. La resistencia adquirida a los antibióticos es un problema importante de salud pública y está clasificado actualmente por la OMS como una de las mayores amenazas para la vida humana. Aquí se describe el uso de la tecnología de voladizo para cuantificar la resistencia antibacteriana, crítica para el descubrimiento de nuevos agentes y potente contra bacterias resistentes a múltiples fármacos.

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Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in situ hybridization (FISH) for rapid culture-independent detection of Salmonella spp. Cell-charged tapes can also be placed face-down on selective agar for solid-phase enrichment prior to detection. Alternatively, low-volume liquid enrichments (liquid surface miniculture) can be performed on the surface of the tape in non-selective broth, followed by FISH and analysis via flow cytometry. To begin, sterile adhesive tape is brought into contact with fresh produce, gentle pressure is applied, and the tape is removed, physically extracting microbes present on these surfaces. Tapes are mounted sticky-side up onto glass microscope slides and the sampled cells are fixed with 10% formalin (30 min) and dehydrated using a graded ethanol series (50, 80, and 95%; 3 min each concentration). Next, cell-charged tapes are spotted with buffer containing a Salmonella-targeted DNA probe cocktail and hybridized for 15 - 30 min at 55&deg;C, followed by a brief rinse in a washing buffer to remove unbound probe. Adherent, FISH-labeled cells are then counterstained with the DNA dye 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) and results are viewed using fluorescence microscopy. For solid-phase enrichment, cell-charged tapes are placed face-down on a suitable selective agar surface and incubated to allow in situ growth of Salmonella microcolonies, followed by FISH and microscopy as described above. For liquid surface miniculture, cell-charged tapes are placed sticky side up and a silicone perfusion chamber is applied so that the tape and microscope slide form the bottom of a water-tight chamber into which a small volume (&le; 500 &mu;L) of Trypticase Soy Broth (TSB) is introduced. The inlet ports are sealed and the chambers are incubated at 35 - 37&deg;C, allowing growth-based amplification of tape-extracted microbes. Following incubation, inlet ports are unsealed, cells are detached and mixed with vigorous back and forth pipetting, harvested via centrifugation and fixed in 10% neutral buffered formalin. Finally, samples are hybridized and examined via flow cytometry to reveal the presence of Salmonella spp. As described here, our "tape-FISH" approach can provide simple and rapid sampling and detection of Salmonella on tomato surfaces. We have also used this approach for sampling other types of fresh produce, including spinach and jalape&ntilde;o peppers.

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple adhesive-tape-based approach for sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by rapid whole cell detection of Salmonella using fluorescence in situ hybridization (FISH).

Combinación de adhesivo basado en cinta de muestreo y de fluorescencia In situ La hibridación para la detección rápida de Salmonella En los productos frescos

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

Investigación

Inmunología e Infección

Amplifying and Quantifying HIV-1 RNA in HIV Infected Individuals with Viral Loads Below the Limit of Detection by Standard Clinical Assays

Amplifying viral genes and quantifying HIV-1 RNA in HIV-1 infected individuals with viral loads below the limit of detection by standard assays (below 50-75 copies/ml) is necessary to gain insight to viral dynamics and virus host interactions in patients who naturally control the infection and those who are on combination antiretroviral therapy (cART). 
Here we describe how to amplify viral genomes by single genome sequencing (the SGS protocol) 13, 19 and how to accurately quantify HIV-1 RNA in patients with low viral loads (the single-copy assay (SCA) protocol) 12, 20. 
The single-copy assay is a real-time PCR assay with sensitivity depending on the volume of plasma being assayed. If a single virus genome is detected in 7 ml of plasma, then the RNA copy number is reported to be 0.3 copies/ml. The assay has an internal control testing for the efficiency of RNA extraction, and controls for possible amplification from DNA or contamination. Patient samples are measured in triplicate.
The single-genome sequencing assay (SGS), now widely used and considered to be non-labor intensive 3, 7, 12, 14, 15,is a limiting dilution assay, in which endpoint diluted cDNA product is spread over a 96-well plate. According to a Poisson distribution, when less than 1/3 of the wells give product, there is an 80% chance of the PCR product being resultant of amplification from a single cDNA molecule. SGS has the advantage over cloning of not being subjected to resampling and not being biased by PCR-introduced recombination 19. However, the amplification success of SCA and SGS depend on primer design. Both assays were developed for HIV-1 subtype B, but can be adapted for other subtypes and other regions of the genome by changing primers, probes, and standards.

Quantifying levels of HIV-1 RNA in plasma and sequencing single HIV-1 genomes from individuals with viral loads below the limit of detection (50-75 copies/ml) is difficult. Here we describe how to extract and quantify plasma viral RNA using a real time PCR assay that reliably measures HIV-1 RNA down to 0.3 copies/ml and how to amplify viral genomes by single genome sequencing, from samples with very low viral loads.

Amplificación y cuantificación del ARN VIH-1 en individuos infectados por VIH con cargas virales por debajo del límite de detección por parte de Standard Ensayos Clínicos

Amplifying viral genes and quantifying HIV-1 RNA in HIV-1 infected individuals with viral loads below the limit of detection by standard assays (below ...

One-day Workflow Scheme for Bacterial Pathogen Detection and Antimicrobial Resistance Testing from Blood Cultures

Bloodstream infections are associated with high mortality rates because of the probable manifestation of sepsis, severe sepsis and septic shock1. Therefore, rapid administration of adequate antibiotic therapy is of foremost importance in the treatment of bloodstream infections. The critical element in this process is timing, heavily dependent on the results of bacterial identification and antibiotic susceptibility testing. Both of these parameters are routinely obtained by culture-based testing, which is time-consuming and takes on average 24-48 hours2, 4. The aim of the study was to develop DNA-based assays for rapid identification of bloodstream infections, as well as rapid antimicrobial susceptibility testing. The first assay is a eubacterial 16S rDNA-based real-time PCR assay complemented with species- or genus-specific probes5. Using these probes, Gram-negative bacteria including Pseudomonas spp., Pseudomonas aeruginosa and Escherichia coli as well as Gram-positive bacteria including Staphylococcus spp., Staphylococcus aureus, Enterococcus spp., Streptococcus spp., and Streptococcus pneumoniae could be distinguished. Using this multiprobe assay, a first identification of the causative micro-organism was given after 2 h.
Secondly, we developed a semi-molecular assay for antibiotic susceptibility testing of S. aureus, Enterococcus spp. and (facultative) aerobe Gram-negative rods6. This assay was based on a study in which PCR was used to measure the growth of bacteria7. Bacteria harvested directly from blood cultures are incubated for 6 h with a selection of antibiotics, and following a Sybr Green-based real-time PCR assay determines inhibition of growth. The combination of these two methods could direct the choice of a suitable antibiotic therapy on the same day (Figure 1). In conclusion, molecular analysis of both identification and antibiotic susceptibility offers a faster alternative for pathogen detection and could improve the diagnosis of bloodstream infections.

The design of a straightforward one-day workflow scheme for bacterial pathogen diagnostics enables the rapid recognition of bloodstream infections. The inclusion of eight clinically relevant bacterial targets and their antibiotic resistance profiles offers the clinician an initial insight on the same day, which can lead to more adequate therapy.

Un día de flujo de trabajo Método de detección de patógenos bacterianos y pruebas de resistencia a los antimicrobianos de cultivos de sangre

Bloodstream infections are associated with high mortality rates because of the probable manifestation of sepsis, severe sepsis and septic shock1. ...

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable method of analysis by flow cytometry to study nanoparticle interaction with immune cells. Primary immune cells can be easily purified from human or mouse tissues by antibody-mediated magnetic isolation. In the first instance, the different cell populations running in a flow cytometer can be distinguished by the forward-scattered light (FSC), which is proportional to cell size, and the side-scattered light (SSC), related to cell internal complexity. Furthermore, fluorescently labeled antibodies against specific cell surface receptors permit the identification of several subpopulations within the same sample. Often, all these features vary when cells are boosted by external stimuli that change their physiological and morphological state. Here, 50 nm FITC-SiO2 nanoparticles are used as a model to identify the internalization of nanostructured materials in human blood immune cells. The cell fluorescence and side-scattered light increase after incubation with nanoparticles allowed us to define time and concentration dependence of nanoparticle-cell interaction. Moreover, such protocol can be extended to investigate Rhodamine-SiO2 nanoparticle interaction with primary microglia, the central nervous system resident immune cells, isolated from mutant mice that specifically express the Green Fluorescent Protein (GFP) in the monocyte/macrophage lineage. Finally, flow cytometry data related to nanoparticle internalization into the cells have been confirmed by confocal microscopy.

Analysis of nanoparticle interaction with defined subpopulations of immune cells by flow cytometry.

La detección de nanopartículas fluorescentes Interacciones con inmunodeficiencia primaria subpoblaciones celulares por citometría de flujo

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify new compounds that can inhibit infection by the common drug resistant HIV-1 strains with minimal toxicity. Here we describe an efficient assay that can be used to rapidly determine the cellular cytotoxicity and efficacy of a compound against WT and mutant viral strains.
The desired target cell line is seeded in a 96-well plate and, after a 24 hr incubation, serially dilutions of the compounds to be tested are added. No further manipulations are necessary for cellular cytotoxicity assays; for anti HIV assays a predetermined amount of either a WT or drug resistant HIV-1 vector that expresses luciferase is added to the cells. Cytotoxicity is measured by using an ATP dependent luminescence assay and the impact of the compounds on infectivity is measured by determining the amount of luciferase in the presence or the absence of the putative inhibitors.
This screening assay takes 4 days to complete and multiple compounds can be screened in parallel. Compounds are screened in triplicate and the data are normalized to the infectivity/ATP levels in absence of target compounds. This technique provides a quick and accurate measurement of the efficacy and toxicity of potential anti HIV compounds.

Here we describe cellular cytotoxicity and single round infectivity assays that allow for the rapid and accurate screening of compounds to determine their cellular cytotoxicity (CC50) and IC50 values against WT and drug resistant HIV-1.

Detección rápida de la transcriptasa inversa del VIH y inhibidores de la integrasa

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify ...

A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic cooperation, competition, or predation. The study of biofilms is important in many biological fields, including environmental science, food production, and medicine. However, few studies have focused on such bacterial biofilms, partially due to the difficulty of investigating them. Most of the methods for qualitative and quantitative biofilm analyses described in the literature are only suitable for biofilms forming on abiotic surfaces or on homogeneous and thin biotic surfaces, such as a monolayer of epithelial cells.
While laser scanning confocal microscopy (LSCM) is often used to analyze in situ and in vivo biofilms, this technology becomes very challenging when applied to bacterial biofilms on fungal hyphae, due to the thickness and the three dimensions of the hyphal networks. To overcome this shortcoming, we developed a protocol combining microscopy with a method to limit the accumulation of hyphal layers in fungal colonies. Using this method, we were able to investigate the development of bacterial biofilms on fungal hyphae at multiple scales using both LSCM and scanning electron microscopy (SEM). This report describes the protocol, including microorganism cultures, bacterial biofilm formation conditions, biofilm staining, and LSCM and SEM visualizations.

This protocol describes a new method to grow and qualitatively analyze bacterial biofilms on fungal hyphae by confocal and electron microscopy.

Un nuevo método para el análisis cualitativo multi-escala de biopelículas bacterianas en filamentosa fúngica Colonias Utilizando microscopía confocal y electrónica

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic ...

A Robust Pneumonia Model in Immunocompetent Rodents to Evaluate Antibacterial Efficacy against S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa or A. baumannii

Efficacy of candidate antibacterial treatments must be demonstrated in animal models of infection as part of the discovery and development process, preferably in models which mimic the intended clinical indication. A method for inducing robust lung infections in immunocompetent rats and mice is described which allows for the assessment of treatments in a model of serious pneumonia caused by S. pneumoniae, H. influenzae, P. aeruginosa, K. pneumoniae or A. baumannii. Animals are anesthetized, and an agar-based inoculum is deposited deep into the lung via nonsurgical intratracheal intubation. The resulting infection is consistent, reproducible, and stable for at least 48 h and up to 96 h for most isolates. Studies with marketed antibacterials have demonstrated good correlation between in vivo efficacy and in vitro susceptibility, and concordance between pharmacokinetic/pharmacodynamic targets determined in this model and clinically accepted targets has been observed. Although there is an initial time investment when learning the technique, it can be performed quickly and efficiently once proficiency is achieved. Benefits of the model include elimination of the neutropenic requirement, increased robustness and reproducibility, ability to study more pathogens and isolates, improved flexibility in study design and establishment of a challenging infection in an immunocompetent host.

A Robust Pneumonia Model in Immunocompetent Rodents to Evaluate Antibacterial Efficacy against S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa or  A. baumannii

A method for establishing lung infections in immunocompetent rodents is described. With proficiency, this method can be performed quickly and easily to induce stable infection with many isolates of S. pneumoniae, H. influenzae, P. aeruginosa, K. pneumoniae and A. baumannii.

Un modelo de neumonía en inmunocompetentes robusta roedores para evaluar Eficacia antibacteriana contra<i&gt; S. pneumoniae</i&gt;,<i&gt; H. influenzae</i&gt;,<i&gt; K. pneumoniae</i&gt;,<em&gt; P. aeruginosa</em&gt; o<em&gt; A. baumannii</em

Efficacy of candidate antibacterial treatments must be demonstrated in animal models of infection as part of the discovery and development process, ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella spp./Shigella spp. The gold standard method for the detection of Salmonella spp./Shigella spp. is direct culture but this is labor-intensive and time-consuming. Here, we describe a high-throughput platform for Salmonella spp./Shigella spp. screening, using real-time polymerase chain reaction (PCR) combined with guided culture. There are two major stages: real-time PCR and the guided culture. For the first stage (real-time PCR), we explain each step of the method: sample collection, pre-enrichment, DNA extraction and real-time PCR. If the real-time PCR result is positive, then the second stage (guided culture) is performed: selective culture, biochemical identification and serological characterization. We also illustrate representative results generated from it. The protocol described here would be a valuable platform for the rapid, specific, sensitive and high-throughput screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Salmonella spp./Shigella spp. are common pathogens attributed to diarrhea. Here, we describe a high-throughput platform for the screening of Salmonella spp./Shigella spp. using real-time PCR combined with guided culture.

Una plataforma de alto rendimiento para la detección de Salmonella spp. /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

Antibiotic Dereplication Using the Antibiotic Resistance Platform

One of the main challenges in the search for new antibiotics from natural product extracts is the re-discovery of common compounds. To address this challenge, dereplication, which is the process of identifying known compounds, is performed on samples of interest. Methods for dereplication such as analytical separation followed by mass spectrometry are time-consuming and resource-intensive. To improve the dereplication process, we have developed the antibiotic resistance platform (ARP). The ARP is a library of approximately 100 antibiotic resistance genes that have been individually cloned into Escherichia coli. This strain collection has many applications, including a cost-effective and facile method for antibiotic dereplication. The process involves the fermentation of antibiotic-producing microbes on the surface of rectangular Petri dishes containing solid medium, thereby allowing for the secretion and diffusion of secondary metabolites through the medium. After a 6 day fermentation period, the microbial biomass is removed, and a thin agar-overlay is added to the Petri dish to create a smooth surface and enable the growth of the E. coli indicator strains. Our collection of ARP strains is then pinned onto the surface of the antibiotic-containing Petri dish. The plate is next incubated overnight to allow for E. coli growth on the surface of the overlay. Only strains containing resistance to a specific antibiotic (or class) grow on this surface enabling rapid identification of the produced compound. This method has been successfully used for the identification of producers of known antibiotics and as a means to identify those producing novel compounds.

We describe a platform that utilizes a library of isogenic antibiotic resistant Escherichia coli for the dereplication of antibiotics. The identity of an antibiotic produced by bacteria or fungi can be deduced by the growth of E. coli expressing its respective resistance gene. This platform is economically effective and time-efficient.

Desreplicación de antibióticos utilizando la plataforma de resistencia a antibióticos

One of the main challenges in the search for new antibiotics from natural product extracts is the re-discovery of common compounds. To address this ...

Visualization of Bacterial Resistance using Fluorescent Antibiotic Probes

Fluorescent antibiotics are multipurpose research tools that are readily used for the study of antimicrobial resistance, due to their significant advantage over other methods. To prepare these probes, azide derivatives of antibiotics are synthesized, then coupled with alkyne-fluorophores using azide-alkyne dipolar cycloaddition by click chemistry. Following purification, the antibiotic activity of the fluorescent antibiotic is tested by minimum inhibitory concentration assessment. In order to study bacterial accumulation, either spectrophotometry or flow cytometry may be used, allowing for much simpler analysis than methods relying on radioactive antibiotic derivatives. Furthermore, confocal microscopy can be used to examine localization within the bacteria, affording valuable information about mode of action and changes that occur in resistant species. The use of fluorescent antibiotic probes in the study of antimicrobial resistance is a powerful method with much potential for future expansion.

Fluorescently tagged antibiotics are powerful tools that can be used to study multiple aspects of antimicrobial resistance. This article describes the preparation of fluorescently tagged antibiotics and their application to studying antibiotic resistance in bacteria. Probes can be used to study mechanisms of bacterial resistance (e.g., efflux) by spectrophotometry, flow cytometry, and microscopy.