Agradecemos a los ingenieros y estudiantes del Centro Fraunhofer para la Innovación en Fabricación. Por ayudar en el diseño, mecanizado y automatización del sistema experimental, agradecemos a Andreas Prinzen, Holger Wirz, Doug Foss, David Chargin y el Dr. Sudong Shu. Agradecemos a Julia Kuckartz, Melanie Zimmermann, Niko Kraetzmar, Tim Gumbel, Josh Villanueva, Minori Shimizu y Katarzyna Kuliga por su ayuda con las pruebas de protocolos experimentales y la recopilación de datos. Reconocemos a los Doctores Anne E. Carpenter y Mark-Anthony Bray de la Plataforma de Imágenes en el Broad Institute de Harvard y el MIT por su ayuda con el desarrollo de la rutina de análisis de imágenes en CellProfiler. El proyecto descrito fue apoyado en parte por los Premios R21AI079474 y 1R01AI101446 del Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente los puntos de vista oficiales del Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas o de los Institutos Nacionales de Salud. El proyecto también contó con el apoyo de Fraunhofer USA.

1. Hacer la capa PDMS (Figura 1)
<ol><li>Mezcle vigorosamente pdms y agente de curado en una proporción de 10:1. Para eliminar burbujas, desgasificar la mezcla viscosa en una cámara de vacío durante 1 hora a temperatura ambiente.</li>
	<li>En una escala, vierta el PDMS lentamente sobre el molde de aluminio. Verter desde el centro y mantener el molde nivelado. Asegúrese de dejar los pines al descubierto. Deje de verter una vez que se alcance el peso objetivo. Nuestro molde requiere 4 g de PDMS y 0,4 g de reactivo de curado.
</li>
	<li>Nivelar el molde dentro de un horno, y curar a 37 °C durante la noche. Los tiempos de curado alternativos son 2 horas a 60 °C o 1 hora a 90 °C.
</li>
	<li>Diseccione la capa pdms curada a lo largo del borde del molde y éguela cuidadosamente de la superficie del molde con un par de pórceps. Limpie la superficie del molde con etanol al 70% y una punta Q.</li>
</ol>2. Montar la celda de flujo de acuerdo con la figura 2
El montaje estándar de PDMS con portaobjetos de vidrio se realiza a través del tratamiento con plasma de oxígeno de ambas superficies, lo que garantiza una unión sin fugas entre el PDMS y el portaobjetos de vidrio del microscopio. En el protocolo presentado, el tratamiento con plasma destruiría el recubrimiento químico en el portaobjetos de vidrio. Por lo tanto, el portaobjetos está sellado a presión en lugar de tratarse con plasma.
<ol><li>Coloque la ventana de vidrio en el bolsillo de la celda de flujo.</li>
	<li>Coloque una diapositiva de vidrio recubierta sobre la ventana de vidrio dentro del bolsillo de la celda de flujo con el lado activo hacia arriba, y coloque la capa PDMS con canales hacia abajo en la parte superior de ella. Coloque la corredera PDMS de tal manera que las entradas del canal se alineen con los orificios pasante en la placa metálica. Empuje suavemente el aire de entre las capas.</li>
	<li>Voltee el conjunto de diapositivas pdms/glass para que el PDMS se enfrente a la ventana de vidrio. Superponga las entradas del canal PDMS con los orificios pasante en la placa metálica.</li>
	<li>Coloque la placa de presión en la parte superior y apriete los tornillos.</li>
	<li>Coloque la celda de flujo ensamblada bajo el microscopio. Ajuste la ampliación del microscopio a 60X y prealinee las posiciones del canal.</li>
</ol>3. Preparar bacterias de la fase de registro
<ol><li>Día antes del experimento: Inocular 50 ml de caldo Mueller Hinton que contenga 2% de NaCl (MH2) con una colonia bacteriana. Agitar a 250 rpm durante la noche a 37 °C. Una o dos cepas bacterianas se pueden estudiar en un experimento para la configuración descrita.
</li>
	<li>Antes del experimento: Mezcle 50 μl de cultivo de bacterias durante la noche en 50 ml de medios MH2. Agite a 250 rpm durante 3 horas a 37 °C para asegurarse de que las bacterias están en fase logarítmica.</li>
</ol>4. Caliente los componentes de la solución experimental al menos 10 minutos antes de que se necesiten
<ol><li>Descongelar el colorante fluorescente (5 mM) y la lisostaphin (10 μg/ml de stock) a temperatura ambiente.</li>
	<li>Caliente el polvo de oxacilina a temperatura ambiente.</li>
</ol>5. Preparar y cargar la suspensión bacteriana
<ol><li>Después del final del subcultivo de 3 horas: Tomar 10 ml de cultivo de bacterias y centrífuga a 1.650 x g durante 2 min.</li>
	<li>Retire las bacterias sobrenadantes y resuspentes en 1 ml de medios MH2 frescos.</li>
	<li>Coloque una longitud corta de tubo a una jeringa de bloqueo Luer de 1 ml. Enjuague el tubo de la jeringuilla con 1 ml de medios. Deje un poco de medios en el tubo para evitar burbujas de aire al dibujar en la suspensión bacteriana.</li>
	<li>Cargue 0,7 ml de bacterias tipo 1 en la jeringa. Llene dos canales de la célula de flujo con bacterias tipo 1. Esté atento a que el líquido aparezca al otro lado del canal después de ca. 150 μl. La transparencia del canal cambia a medida que se llena de bacterias.
</li>
	<li>Si experimenta con varios tipos de bacterias, repita el procedimiento de carga para las bacterias tipo 2 en los dos canales restantes de la célula de flujo.</li>
	<li>Coloque la celda de flujo dentro de la incubadora a 37 °C durante 45 min para permitir la sedimentación bacteriana y la fijación a la superficie del deslizamiento.</li>
</ol>6. Prepare y cargue las soluciones experimentales
<ol><li>Preparar 140 μl de solución de colorante fluorescente de 0,5 mM mezclando 14 μl de colorante fluorescente (5 mM) y 126 μl de soporte MH2.</li>
	<li>Diluir 10 mg de oxacilina en 40 ml de medios MH2 para obtener una concentración final de 250 μg/ml de oxacilina.</li>
	<li>Preparar 130 ml de solución control con concentraciones finales de 0,25 μM de colorante fluorescente y 0,7 ng/ml de lisostaphin. Para ello, mezcle 65 μl de colorante fluorescente (0,5 mM), 9,12 μl de lysostaphin (10 μg/ml) y 130 ml de soporte MH2.</li>
	<li>Preparar 130 ml de solución antibiótica con concentraciones finales de 0,25 μM de colorante fluorescente, 0,7 ng/ml de lisostaprina y 50 μg/ml de oxacilina. Para ello, mezcle 65 μl de colorante fluorescente (0,5 mM), 9,12 μl de lysostaphin (10 μg/ml), 26 ml de oxacilina (250 μg/ml) y 104 ml de medios MH2.</li>
	<li>Llene dos jeringas de 60 ml con solución de control y dos jeringas de 60 ml con solución antibiótica. Mantenga las soluciones envueltas en papel de aluminio para evitar la degradación inducida por la luz de los reactivos. Sobrellenar las jeringas para tener en cuenta la pérdida debido al enrojecimiento de la tubería.
</li>
	<li>Retire las burbujas de aire de las jeringas moviendo. Coloque y llene el tubo de entrada a la punta con la solución experimental.</li>
	<li>Monte jeringas en la bomba. Coloque primero la jeringa con el volumen más pequeño y, a continuación, bloquee la posición del émbolo. Coloque el resto de las jeringas en la bomba, exprimiendo sus émbolos según sea necesario.</li>
	<li>Ajuste la velocidad de la bomba a 1 ml/min y el volumen de la bomba a 60 ml. Haga un lavado con la bomba hasta que se vea un flujo constante de líquido de todas las jeringas.</li>
</ol>7. Configurar la célula de flujo bajo el microscopio
<ol><li>Retire la celda de flujo de la centrífuga y montarla en la etapa del microscopio (Figura 3).</li>
	<li>Conecte la tubería de entrada/salida a cada uno de los canales de celda de flujo (una entrada/una salida por canal). La recolección de la salida en cuatro contenedores diferentes permite la medición de volúmenes de salida de canal individuales.</li>
</ol>8. Ejecute el experimento de 60 minutos
<ol><li>Compruebe las posiciones prealineadas del paso 2.5. Si el campo de visión del microscopio no está centrado en el canal y/o está descentrado, ajuste la configuración y guarde las nuevas posiciones. El enfoque preciso puede no ser posible antes del inicio del flujo debido a la alta densidad de bacterias cargadas.
</li>
	<li>Establezca el tiempo de adquisición de contraste de fase en 10 milisegundos y el tiempo de adquisición de fluorescencia en 1.600 milisegundos.</li>
	<li>Obtenga imágenes de contraste de fase y fluorescencia para cada posición antes de iniciar el flujo. Esto da una estimación cualitativa de la densidad bacteriana cargada.
</li>
	<li>Inicie el flujo de líquido y compruebe inmediatamente que el microscopio está enfocado en la parte inferior de los canales.</li>
	<li>Tome imágenes de contraste de fase y fluorescencia de las áreas objetivo dentro del primer minuto de flujo.</li>
	<li>Adquiera imágenes cada 2 minutos después del primer conjunto de imágenes hasta que se haya producido 60 minutos de flujo. Reenfoque según sea necesario.</li>
</ol>9. Desinfectar la celda de flujo
<ol><li>Hacer una solución de lejía al 10% en un casto (100 ml). Llene 4 x 20 ml de jeringas con 10 ml de la mezcla. Desburbuje las jeringas y conéctelas a la célula de flujo. Tomará ~ 1-2 minutos para que los canales estén claros de bacterias.
</li>
	<li>Ajuste la velocidad de la bomba a 1 ml/min y el volumen de la bomba a 3 ml. Correr durante 3 min.</li>
	<li>Llene 4 x 60 ml de jeringas con 60 ml de agua DI. Desburbuje las jeringas y conéctelas a la célula de flujo.</li>
	<li>Ajuste la velocidad de la bomba a 1 ml/min y el volumen de la bomba a 30 ml. Correr durante 30 min.</li>
	<li>Monitoree la limpieza del canal bajo el microscopio.</li>
	<li>Desensamblar la celda de flujo. Deseche el portaobjetos epoxi usado. Remoje los componentes de la celda de flujo en agua DI durante 20 min. Seque al aire.</li>
</ol>10. Analizar imágenes y generar datos
<ol><li>Cuente el número de bacterias en cada imagen. El software de acceso abierto, CellProfiler, se utiliza para realizar el procesamiento de imágenes por lotes16. Un esquema de alto nivel de la rutina CellProfiler se resume en la tabla 1. El número de bacterias presentes en la imagen de contraste de fase (Np) da el recuento total de bacterias. El número de bacterias visibles en la imagen de fluorescencia (Nf) da el número de bacterias muertas.
</li>
	<li>Calcular el porcentaje de muerte celular bacteriana normalizada en función del tiempo.<ol>
<li>Importe Nf y Np para imágenes individuales en el software de análisis de datos.</li>
		<li>Calcular la fracción de bacterias muertas en cada canal en un punto de tiempo específico dado por la fracción (Nf/N p)en t = T.</li>
		<li>Restar la fracción de bacterias muertas presentes al inicio del experimento (t = 1 min) tanto para el control como para los canales experimentales.</li>
		<li>Restar la fracción de bacterias muertas presentes en el canal de control de la presente en el canal experimental en cada punto de tiempo con la siguiente ecuación: <img alt="Data Analysis Equation" fo:content-width="6in" height="217" src="/files/ftp_upload/50828/Data_analysis_equation.png" width="620">
</li>
		 <li>Graficar la norma DP frente a t para el curso del experimento. Tenga en cuenta que una muestra con un porcentaje de muerte celular superior al 1% se considera susceptible, mientras que menos del 0,5% de muerte es indicativo de resistencia. Los porcentajes que se encuentran entre estos dos puntos de corte se consideran indeterminados y la muestra debe ser analizada de nuevo.
</li>
		<li>Utilice una hoja de cálculo para resumir y analizar los resultados de diferentes experimentos.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Mairhofer, J., Roppert, K., Ertl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+systems+for+pathogen+sensing:+a+review.">Microfluidic systems for pathogen sensing: a review.</a> Sensors. 9, 4804-4823 (2009).</li><li>Yager, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+diagnostic+technologies+for+global+public+health.">Microfluidic diagnostic technologies for global public health.</a> Nature. 442, 412-418 (2006).</li><li>Boedicker, J. Q., Li, L., Kline, T. R., Ismagilov, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+bacteria+and+determining+their+susceptibility+to+antibiotics+by+stochastic+confinement+in+nanoliter+droplets+using+plug-based+microfluidics.">Detecting bacteria and determining their susceptibility to antibiotics by stochastic confinement in nanoliter droplets using plug-based microfluidics.</a> Lab Chip. 8, 1265-1272 (2008).</li><li>Cao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncovering+toxicological+complexity+by+multi-dimensional+screenings+in+microsegmented+flow:+modulation+of+antibiotic+interference+by+nanoparticles.">Uncovering toxicological complexity by multi-dimensional screenings in microsegmented flow: modulation of antibiotic interference by nanoparticles.</a> Lab Chip. 12, 474-484 (2012).</li><li>Chen, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial+susceptibility+testing+using+high+surface-to-volume+ratio+microchannels.">Antimicrobial susceptibility testing using high surface-to-volume ratio microchannels.</a> Anal. Chem. 82, 1012-1019 (2010).</li><li>Churski, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+screening+of+antibiotic+toxicity+in+an+automated+microdroplet+system.">Rapid screening of antibiotic toxicity in an automated microdroplet system.</a> Lab Chip. 12, 1629-1637 (2012).</li><li>Eun, Y. J., Utada, A. S., Copeland, M. F., Takeuchi, S., Weibel, D. 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F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+platform+for+rapid,+stress-induced+antibiotic+susceptibility+testing+of+Staphylococcus+aureus.">A microfluidic platform for rapid, stress-induced antibiotic susceptibility testing of Staphylococcus aureus.</a> Lab Chip. 12, 4523-4532 (2012).</li><li>McDonald, J. C., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poly(dimethylsiloxane)+as+a+material+for+fabricating+microfluidic+devices.">Poly(dimethylsiloxane) as a material for fabricating microfluidic devices.</a> Acc. Chem. Res. 35, 491-499 (2002).</li><li>Roth, B. L., Poot, M., Yue, S. T., Millard, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+viability+and+antibiotic+susceptibility+testing+with+SYTOX+green+nucleic+acid+stain.">Bacterial viability and antibiotic susceptibility testing with SYTOX green nucleic acid stain.</a> Appl. Environ. Microbiol. 63, 2421-2431 (1997).</li><li>Francius, G., Domenech, O., Mingeot-Leclercq, M. P., Dufrene, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+Staphylococcus+aureus+cell+wall+digestion+by+lysostaphin.">Direct observation of Staphylococcus aureus cell wall digestion by lysostaphin.</a> J. Bacteriol. 190, 7904-7909 (2008).</li><li>Jordan, S., Hutchings, M. I., Mascher, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+envelope+stress+response+in+Gram-positive+bacteria.">Cell envelope stress response in Gram-positive bacteria.</a> FEMS Microbiol. Rev. 32, 107-146 (2008).</li><li>Koch, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+wall+as+target+for+attack:+past,+present,+and+future+research.">Bacterial wall as target for attack: past, present, and future research.</a> Clin. Microbiol. Rev. 16, 673-687 (2003).</li><li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler:+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes.">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biol. 7, R100 (2006).</li><li>Kohanski, M. A., Dwyer, D. J., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+antibiotics+kill+bacteria:+from+targets+to+networks.">How antibiotics kill bacteria: from targets to networks.</a> Nat. Rev. Microbiol. 8, 423-435 (2010).</li><li>Kohanski, M. A., Dwyer, D. J., Hayete, B., Lawrence, C. A., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+common+mechanism+of+cellular+death+induced+by+bactericidal+antibiotics.">A common mechanism of cellular death induced by bactericidal antibiotics.</a> Cell. 130, 797-810 (2007).</li></ol>

El método microfluídico está pendiente de patente: Sauer-Budge A, Sharon A, Kalashnikov M, Wirz H, inventores; Método y dispositivo para la detección rápida de la resistencia a los antibióticos bacterianos / susceptibilidad patente PCT / US10/33523.

El protocolo presentado fue validado y optimizado en un conjunto de experimentos con cepas de Staphylococcus aureus sensibles a la meticilina y resistentes a la meticilina10. Por lo tanto, este protocolo sin modificación debe ser directamente aplicable a otras cepas de S. aureus y otros antibióticos con mecanismos de acción que afectan a la biosíntesis de la pared celular bacteriana. Los tipos de bacterias distintas de S. aureus pueden requerir variación en los parámetros de te...

El aumento de la resistencia bacteriana intensifica la necesidad de pruebas rápidas de susceptibilidad a los antibióticos basadas en fenotipos para salvaguardar nuestros medicamentos de último recurso. Las pruebas de susceptibilidad estándar se basan en la inhibición del crecimiento bacteriano en presencia de antibióticos que tardan varias (8-24) horas en completarse. Hemos desarrollado una nueva prueba de susceptibilidad a los antibióticos en una plataforma microfluídica que se basa en la activación del estrés de las vías biosintéticas para acelerar la acción de los antibióticos.
Las pruebas de susceptibilidad a los antibióticos a escala microfluídica tienen la ventaja de un uso eficaz de la muestra, ya que requieren un pequeño número de bacterias. Además, los dispositivos microfluídicos pueden ser multiplexados para probar múltiples muestras en múltiples condiciones1,2. Recientemente, se han reportado una serie de métodos microfluídicos para las pruebas de susceptibilidad a los antibióticos3-9. En estos métodos, las bacterias se cultivan dentro de las gotitas nano- y picolitro3,7,en el volumen completo del canal microfluídico4-6,8,o como bacterias individuales localizadas eléctricamente en la superficie inferior del canal9. Aunque estas pruebas se llevan a cabo en canales microfluídicos, todas ellas monitorizan el crecimiento microbiano en presencia y ausencia de antibióticos similares a los métodos tradicionales. Las mediciones de crecimiento se toman a través de densidad óptica, colorantes sensibles al pH o imágenes brillantes de contraste de campo /fase o fluorescencia. Aunque algunas de estas pruebas son más rápidas que los métodos tradicionales, cada una de ellas detecta pasivamente la resistencia a los antibióticos. En otras palabras, estos métodos todavía requieren que el usuario espere el crecimiento bacteriano como la lectura final.
Por el contrario, hemos desarrollado un método que utiliza una combinación de cizalladura y estrés enzimático para activar vías bioquímicas sensibles a los antibióticos10. Desafiar a las bacterias estresadas con esos antibióticos crea una prueba de susceptibilidad más rápida. Las bacterias que son resistentes al antibiótico son capaces de soportar las condiciones estresantes. Las bacterias susceptibles, por otro lado, son rápidamente asesinadas por las tensiones combinadas. El porcentaje de muerte celular después de una hora, medido por microscopía utilizando una mancha fluorescente de células muertas, define el fenotipo de las bacterias (resistentes frente a susceptibles).
Para la implementación exitosa de nuestro método, las bacterias deben ser inmovilizadas en la superficie inferior del canal microfluídico. De esta manera, las bacterias pueden ser sometidas a varias tensiones y simultáneamente fotovidas bajo un microscopio en un solo plano. Un portaobjetos de vidrio de microscopio recubierto se utiliza para la inmovilización de bacterias. El portaobjetos está precubierto por el fabricante con grupos epóxido para la unión a proteínas inespecíficas. La unión inespecífica de estos epóxidos a proteínas de superficie bacterianas une covalentemente las bacterias a la superficie del portaobjetos.
Las cepas se prueban en condiciones idénticas (cizalladura + estrés enzimático) en ausencia (control) y presencia (experimento) de antibiótico. Las imágenes del microscopio de contraste de fase y fluorescencia de cada canal se toman automáticamente cada dos minutos durante una hora. Las designaciones de resistencia se hacen comparando el porcentaje de bacterias muertas en el canal experimental con las presentes en el canal de control. Después de una hora, una muestra con un porcentaje de muerte celular superior al 1% se considera susceptible, mientras que menos del 0,5% de muerte es indicativa de resistencia. Los porcentajes que se encuentran entre estos dos puntos de corte se consideran indeterminados y la muestra debe ser analizada de nuevo.
Los canales microfluídicos se definen en pdms, que es un material de elección para dispositivos microfluídicos11. Pdms es ópticamente transparente en una amplia gama de longitudes de onda, biocompatible, inerte, permeable a los gases y tiene baja permeabilidad a los líquidos; por lo tanto, es muy adecuado para estos experimentos.
La tensión mecánica/de cizalladura es creada por el flujo de medios a temperatura ambiente sobre las bacterias inmovilizadas. (Nota: El calentamiento de los medios a 37 °C no tiene un efecto significativo en el resultado del ensayo). Las bombas de jeringa automatizadas fuerzan los medios (que contienen tinción de células muertas +/- antibiótico, así como estresores enzimáticos opcionales) a través de los canales microfluídicos (200 μm x 400 μm) a una velocidad de flujo de 1 ml/min para dar 6,25 kPa de fuerza de cizallamiento o una velocidad de cizallamiento de 6.000 seg-1. Esta tasa es igual o excede las tensiones de cizallamiento previamente estudiadas en los estafilococos.
La enzima, lysostaphin, fue seleccionada para experimentos preliminares porque causa daño directo a la pared celular del estafilococo. La concentración de lysostaphin (0,7 ng/ml) era suficiente causar daño bacteriano de la pared celular, pero no suficiente causar muerte celular bacteriana sin el antibiótico en el marco de tiempo del experimento. Lysostaphin no se requiere para la designación correcta de susceptibilidad bacteriana pero aumenta el resultado, llevando a la muerte celular creciente en tensiones susceptibles. Por el contrario, la tensión de cizalladura es crítica para la función del ensayo. Cuando las cepas de Staphylococcus aureus sensibles a la meticilina se tratan con lisoestaphin y oxacilina en ausencia de flujo, no se registra muerte celular en el transcurso del experimento.
La viabilidad celular se monitorea con una mancha fluorescente de células muertas12. La selección del tinte se basó en su capacidad para teñir selectivamente solo las células dañadas, su no toxicidad para las células vivas y su baja fluorescencia de fondo, lo que permitió su adición directa a los medios celulares sin pasos adicionales. La selección de una concentración de colorante fluorescente de 0,25 μM fue para lograr niveles aceptables de señal durante un tiempo de exposición de 1,6 segundos a la luz de excitación por fluorescencia.
El beta-lactámico, oxacilina, fue utilizado en nuestros estudios preliminares. Las especies de S. aureus resistentes a la meticilina (MRSA) son resistentes a la oxacilina y no mostrarán ninguna muerte celular apreciable en el marco de tiempo del experimento. La concentración de 50 μg/ml se determinó en los estudios preliminares. Las concentraciones más bajas de antibióticos dieron menos separación entre cepas resistentes y susceptibles, mientras que concentraciones más altas no causaron una diferencia apreciable en los resultados experimentales.
Hemos relatado previamente el desarrollo exitoso de una prueba que combina tensiones mecánicas y enzimáticas que afectan directamente a la pared celular bacteriana13 con un antibiótico que inhibe la biosíntesis de la pared celular14,15. Estos experimentos de prueba de principio se llevaron a cabo en un panel de SARM y S. aureus sensible a la meticilina (MSSA). Sin embargo, con la selección de parámetros experimentales adecuados, nuestro método debe ser aplicable a múltiples especies de bacterias y múltiples clases de antibióticos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="634">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:195px;">SYTOX Green</td>
			<td dir="LTR" style="width:129px;">Invitrogen Corporation</td>
			<td dir="LTR" style="width:136px;">S7020</td>
			<td dir="LTR" style="width:175px;">Dead cell fluorescence stain</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:195px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td dir="LTR" style="width:129px;">Sigma Aldrich, Inc</td>
			<td dir="LTR" style="width:136px;">A9418-5G</td>
			<td dir="LTR" style="width:175px;">Used for lysostaphin storage</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:195px;">Sodium Acetate</td>
			<td dir="LTR" style="width:129px;">Sigma Aldrich, Inc</td>
			<td dir="LTR" style="width:136px;">S8750-500G</td>
			<td dir="LTR" style="width:175px;">Used for lysostaphin storage</td>
		</tr>
		<tr height="98">
			<td dir="LTR" height="98" style="height:98px;width:195px;">Lysostaphin&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:129px;">Cell Sciences</td>
			<td dir="LTR" style="width:136px;">CRL309A</td>
			<td dir="LTR" style="width:175px;">Arrives as 1 mg solid. For storage: Dissolve in 20 mM sodium acetate. Mix with BSA solution to final concentration of 1% BSA and 100 &#181;g/ml &#160;lysostaphin for storage&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:195px;">Oxacillin salt</td>
			<td dir="LTR" style="width:129px;">Sigma Aldrich, Inc</td>
			<td dir="LTR" style="width:136px;">28221-1G</td>
			<td dir="LTR" style="width:175px;">Antibiotic</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:195px;">Mueller Hinton Broth</td>
			<td dir="LTR" style="width:129px;">Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:136px;">DF0757-17-6</td>
			<td dir="LTR" style="width:175px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td dir="LTR" height="34" style="height:34px;width:195px;">Sodium chloride</td>
			<td dir="LTR" style="width:129px;">Sigma Aldrixh</td>
			<td dir="LTR" style="width:136px;">S3014-500G</td>
			<td dir="LTR" style="width:175px;">2% added to Mueller-Hilton broth prior to autoclaving</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td dir="LTR" height="34" style="height:34px;width:195px;">1 ml, Luer-lock syringe&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:129px;">BD (Beckton, Dickinson and Comp.)</td>
			<td dir="LTR" style="width:136px;">14-823-2F</td>
			<td dir="LTR" style="width:175px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td dir="LTR" height="34" style="height:34px;width:195px;">2 oz, Luer-lock syringe</td>
			<td dir="LTR" style="width:129px;">BD (Beckton, Dickinson and Comp.)</td>
			<td dir="LTR" style="width:136px;">309653 - 60 mL</td>
			<td dir="LTR" style="width:175px;">Overfill to ~65 ml</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:329px;">Microscope</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;"></td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;"></td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:329px;">Inverted Fluoresccence Microscope Olympus IX-70</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">Cambridge Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">9349</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:329px;">60X, Fluorescence/Phase contrast objective</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">Olympus Corp.</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">LCPlan F1 60x/0.70 Ph2</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:329px;">Retiga 12-bit monochrome CCD camera</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">QImaging</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">RET-4000R-F-M-12-C&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:329px;">Microscope automation</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;"></td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;"></td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:329px;">Shutters phase contrast/fluorescence</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">PRIOR Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">H204/H202</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:329px;">X/Y Stage&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">PRIOR Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">H107AENN</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:329px;">Focus motor</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">PRIOR Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">H122</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:329px;">Joystick for XYZ control</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">PRIOR Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">CS152EF</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:329px;">Proscan Controller</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">PRIOR Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">H3-XY2</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:329px;">Image Acquisition Software</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">Fraunhofer CMI</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;"></td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:329px;">Flow Cell Assembly and PDMS</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;"></td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;"></td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td dir="LTR" height="34" style="height:34px;width:329px;">Flow Cell</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">BU Scientific Instruments Facility/Fraunhofer CMI</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">3333-1044</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;">Engineering drawings were produced by Fraunhofer CMI</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td dir="LTR" height="33" style="height:33px;width:329px;">Glass window</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">Fraunhofer CMI</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">3333-1054</td>
			<td dir="LTR" rowspan="2" style="width:269px;">Glass window was cut to the proper size at Fraunhofer CMI</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td dir="LTR" height="33" style="height:33px;width:329px;">BOROFLOAT Window 50 mm x 50 mm</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">Edmund Optics Inc.</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">NT48-543</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td dir="LTR" height="50" style="height:50px;width:329px;">Sealing plate</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">BU Scientific Instruments Facility</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">3333-1045</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:329px;">Epoxide glass slide</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">Arrayit Corporation</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">SuperEpoxy 2</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td dir="LTR" height="45" style="height:45px;width:329px;">PDMS master</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">Fraunhofer CMI</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">3333-1053</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;">Master machined in aluminum or brass with UPM-0005 (ultrapresicion fly-cutting machine)</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td dir="LTR" height="34" style="height:34px;width:329px;">PDMS slide design</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">Fraunhofer CMI</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">3333-1053</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td dir="LTR" height="34" style="height:34px;width:329px;">Tubing</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;"></td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;"></td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td dir="LTR" height="50" style="height:50px;width:329px;">Nut, Super flangeless Tinytight, headless, 1/16 in, PEEK, green&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">IDEX Health &#38; Science</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">M-644-03</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;">Flow cell inputs/outputs are tapped for this ferrule</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td dir="LTR" height="34" style="height:34px;width:329px;">Ferrule, Tinytight, 1/16 in, 6-40, .030 in TH, PEEK w/ SS lock ring, black</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">IDEX Health &#38; Science</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">M-657</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td dir="LTR" height="34" style="height:34px;width:329px;">Nut, Super flangeless Tinytight, headless, 1/16-1/32 in, 1/4-28, PEEK, natural</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">IDEX Health &#38; Science</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">P-255</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td dir="LTR" height="34" style="height:34px;width:329px;">Ferrule, Super Falngeless, 1/16 in, Tefzel (ETFE), yellow</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">IDEX Health &#38; Science</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">P-259</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;">Fits Luer-lock adapter</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:329px;">Tubing, Teflon FEP, .030 in x 1/16 in x 20 ft, green&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">IDEX Health &#38; Science</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">1520G</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td dir="LTR" height="34" style="height:34px;width:329px;">Adapter, quick connect female Luer to female 1/4-28, PEEK, red&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">IDEX Health &#38; Science</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">P-658</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stress-induced antibiotic susceptibility testing on a chip

Hemos desarrollado un método microfluídico rápido para la prueba de la susceptibilidad a los antibióticos en un ambiente basado en el estrés. El líquido se pasa a altas velocidades sobre las bacterias inmovilizadas en el fondo de un canal microfluídico. En presencia de estrés y antibióticos, las cepas susceptibles de bacterias mueren rápidamente. Sin embargo, las bacterias resistentes sobreviven a estas condiciones estresantes. La hipótesis detrás de este método es nueva: la activación de la tensión de los caminos bioquímicos, que son blancos de antibióticos, puede acelerar la prueba de la susceptibilidad antibiótico. En comparación con los métodos estándar de prueba de susceptibilidad a los antibióticos, el paso limitador de la velocidad -el crecimiento bacteriano- se omite durante la aplicación del antibiótico. La implementación técnica del método se realiza en una combinación de técnicas estándar y enfoques innovadores. Las partes estándar del método incluyen protocolos de cultivo bacteriano, definición de canales microfluídicos en polidimetilsiloxano (PDMS), monitoreo de viabilidad celular con fluorescencia y procesamiento de imágenes por lotes para el conteo de bacterias. Las partes innovadoras del método están en el uso del flujo de los medios de cultivo para la aplicación mecánica de la tensión, el uso de enzimas para dañar pero no para matar a las bacterias, y el uso de los substratos del microarray para el accesorio bacteriano. La plataforma desarrollada se puede utilizar en el desarrollo y las pruebas de fármacos antibióticos y no antibióticos relacionados. En comparación con los experimentos de suspensión bacteriana estándar, el efecto de la droga se puede activar y desactivar repetidamente durante períodos de tiempo controlados. La observación repetitiva de la misma población bacteriana es posible en el transcurso del mismo experimento.

Los datos presentados en la Figura 4 muestran la respuesta de una cepa susceptible de Staphylococcus aureus a lo largo del tiempo en un canal microfluídico que contiene antibióticos. Las imágenes de contraste de fase adquiridas a 1 min y al final del experimento de 1 hora se muestran en las Figuras 4A y B. Los datos analizados de 1 hora se muestran en la Figura 4C con las bacterias resaltadas en rojo (5.828 en total). Las imágenes ...

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Stress-induced Antibiotic Susceptibility Testing on a Chip

Hemos desarrollado una plataforma microfluídica para la prueba rápida de la susceptibilidad a los antibióticos. El líquido se pasa a altas velocidades sobre las bacterias inmovilizadas en el fondo de un canal microfluídico. En presencia de estrés y antibióticos, las cepas susceptibles de bacterias mueren rápidamente. Sin embargo, las bacterias resistentes pueden sobrevivir a estas condiciones estresantes.

Pruebas de susceptibilidad a antibióticos inducidas por el estrés en un chip

We have developed a rapid microfluidic method for antibiotic susceptibility testing in a stress-based environment. Fluid is passed at high speeds over ...

stress-induced-antibiotic-susceptibility-testing-on-a-chip

Research

JoVE Journal

Bioengineering

6.3K vistas.  Fraunhofer USA Center for Manufacturing Innovation. Hemos desarrollado una plataforma microfluídica para la prueba rápida de la susceptibilidad a los antibióticos. El líquido se pasa a altas velocidades sobre las bacterias inmovilizadas en el fondo de un canal microfluídico. En presencia de estrés y antibióticos, las cepas susceptibles de bacterias mueren rápidamente. Sin embargo, las bacterias resistentes pueden sobrevivir a estas condiciones estresantes.

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Lensless Fluorescent Microscopy on a Chip

On-chip lensless imaging in general aims to replace bulky lens-based optical microscopes with simpler and more compact designs, especially for high-throughput screening applications. This emerging technology platform has the potential to eliminate the need for bulky and/or costly optical components through the help of novel theories and digital reconstruction algorithms. Along the same lines, here we demonstrate an on-chip fluorescent microscopy modality that can achieve e.g., &lt;4&mu;m spatial resolution over an ultra-wide field-of-view (FOV) of &gt;0.6-8 cm2 without the use of any lenses, mechanical-scanning or thin-film based interference filters. In this technique, fluorescent excitation is achieved through a prism or hemispherical-glass interface illuminated by an incoherent source. After interacting with the entire object volume, this excitation light is rejected by total-internal-reflection (TIR) process that is occurring at the bottom of the sample micro-fluidic chip. The fluorescent emission from the excited objects is then collected by a fiber-optic faceplate or a taper and is delivered to an optoelectronic sensor array such as a charge-coupled-device (CCD). By using a compressive-sampling based decoding algorithm, the acquired lensfree raw fluorescent images of the sample can be rapidly processed to yield e.g., &lt;4&mu;m resolution over an FOV of &gt;0.6-8 cm2. Moreover, vertically stacked micro-channels that are separated by e.g., 50-100 &mu;m can also be successfully imaged using the same lensfree on-chip microscopy platform, which further increases the overall throughput of this modality. This compact on-chip fluorescent imaging platform, with a rapid compressive decoder behind it, could be rather valuable for high-throughput cytometry, rare-cell research and microarray-analysis.

A lensless on-chip fluorescent microscopy platform is demonstrated that can image fluorescent objects over an ultra-wide field-of-view of e.g., &#62;0.6-8 cm2 with &#60;4&#956;m resolution using a compressive sampling based decoding algorithm. Such a compact and wide-field fluorescent on-chip imaging modality could be valuable for high-throughput cytometry, rare-cell research and microarray-analysis.

Microscopía fluorescente sin lentes en un chip

On-chip lensless imaging in general aims to replace bulky lens-based optical microscopes with simpler and more compact designs, especially for ...

Investigación

Bioingeniería

On-Chip Endothelial Inflammatory Phenotyping

Atherogenesis is potentiated by metabolic abnormalities that contribute to a heightened state of systemic inflammation resulting in endothelial dysfunction. However, early functional changes in endothelium that signify an individual's level of risk are not directly assessed clinically to help guide therapeutic strategy. Moreover, the regulation of inflammation by local hemodynamics contributes to the non-random spatial distribution of atherosclerosis, but the mechanisms are difficult to delineate in vivo. We describe a lab-on-a-chip based approach to quantitatively assay metabolic perturbation of inflammatory events in human endothelial cells (EC) and monocytes under precise flow conditions. Standard methods of soft lithography are used to microfabricate vascular mimetic microfluidic chambers (VMMC), which are bound directly to cultured EC monolayers.1 These devices have the advantage of using small volumes of reagents while providing a platform for directly imaging the inflammatory events at the membrane of EC exposed to a well-defined shear field. We have successfully applied these devices to investigate cytokine-,2 lipid-3, 4 and RAGE-induced5 inflammation in human aortic EC (HAEC). Here we document the use of the VMMC to assay monocytic cell (THP-1) rolling and arrest on HAEC monolayers that are conditioned under differential shear characteristics and activated by the inflammatory cytokine TNF-&alpha;. Studies such as these are providing mechanistic insight into atherosusceptibility under metabolic risk factors.

Microfluidic flow chambers etched by photolithography and fabricated from PDMS are applied to probe functional outcomes associated with EC dysfunction and inflammation. In a representative experiment, the ability of differential shear stress to modulate monocytic cell adhesion to cytokine activated EC monolayers is demonstrated.

On-Chip fenotipificación inflamatoria endotelial

Atherogenesis is potentiated by metabolic abnormalities that contribute to a heightened state of systemic inflammation resulting in endothelial ...

Procedure for the Development of Multi-depth Circular Cross-sectional Endothelialized Microchannels-on-a-chip

Efforts have been focused on developing in vitro assays for the study of microvessels because in vivo animal studies are more time-consuming, expensive, and observation and quantification are very challenging. However, conventional in vitro microvessel assays have limitations when representing in vivo microvessels with respect to three-dimensional (3D) geometry and providing continuous fluid flow. Using a combination of photolithographic reflowable photoresist technique, soft lithography, and microfluidics, we have developed a multi-depth circular cross-sectional endothelialized microchannels-on-a-chip, which mimics the 3D geometry of in vivo microvessels and runs under controlled continuous perfusion flow. A positive reflowable photoresist was used to fabricate a master mold with a semicircular cross-sectional microchannel network. By the alignment and bonding of the two polydimethylsiloxane (PDMS) microchannels replicated from the master mold, a cylindrical microchannel network was created. The diameters of the microchannels can be well controlled. In addition, primary human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) seeded inside the chip showed that the cells lined the inner surface of the microchannels under controlled perfusion lasting for a time period between 4 days to 2 weeks.

A microchannels-on-a-chip platform was developed by the combination of photolithographic reflowable photoresist technique, soft lithography, and microfluidics. The endothelialized microchannels platform mimics the three-dimensional (3D) geometry of in vivo microvessels, runs under controlled continuous perfusion flow, allows for high-quality and real-time imaging&#160;and can be applied for microvascular research.

Procedimiento para el Desarrollo de la Multi-profundidad Circular transversal endotelizado microcanales-on-a-chip

Efforts have been focused on developing in vitro assays for the study of microvessels because in vivo animal studies are more time-consuming, expensive, ...

PIP-on-a-chip: A Label-free Study of Protein-phosphoinositide Interactions

Numerous cellular proteins interact with membrane surfaces to affect essential cellular processes. These interactions can be directed towards a specific lipid component within a membrane, as in the case of phosphoinositides (PIPs), to ensure specific subcellular localization and/or activation. PIPs and cellular PIP-binding domains have been studied extensively to better understand their role in cellular physiology. We applied a pH modulation assay on supported lipid bilayers (SLBs) as a tool to study protein-PIP interactions. In these studies, pH sensitive ortho-Sulforhodamine B conjugated phosphatidylethanolamine is used to detect protein-PIP interactions. Upon binding of a protein to a PIP-containing membrane surface, the interfacial potential is modulated (i.e. change in local pH), shifting the protonation state of the probe. A case study of the successful usage of the pH modulation assay is presented by using phospholipase C delta1 Pleckstrin Homology (PLC-&#948;1 PH) domain and phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) interaction as an example. The apparent dissociation constant (Kd,app) for this interaction was 0.39 &#177; 0.05 &#181;M, similar to Kd,app values obtained by others. As previously observed, the PLC-&#948;1 PH domain is PI(4,5)P2 specific, shows weaker binding towards phosphatidylinositol 4-phosphate, and no binding to pure phosphatidylcholine SLBs. The PIP-on-a-chip assay is advantageous over traditional PIP-binding assays, including but not limited to low sample volume and no ligand/receptor labeling requirements, the ability to test high- and low-affinity membrane interactions with both small and large molecules, and improved signal to noise ratio. Accordingly, the usage of the PIP-on-a-chip approach will facilitate the elucidation of mechanisms of a wide range of membrane interactions. Furthermore, this method could potentially be used in identifying therapeutics that modulate protein&#39;s capacity to interact with membranes.

Here we present a supported lipid bilayer in the context of a microfluidic platform to study protein-phosphoinositide interactions using a label-free method based on pH modulation.

PIP-on-a-chip: un estudio sin etiquetas de las interacciones proteína-fosfoinositida

Numerous cellular proteins interact with membrane surfaces to affect essential cellular processes. These interactions can be directed towards a specific ...

Dry Film Photoresist-based Electrochemical Microfluidic Biosensor Platform: Device Fabrication, On-chip Assay Preparation, and System Operation

In recent years, biomarker diagnostics became an indispensable tool for the diagnosis of human disease, especially for the point-of-care diagnostics. An easy-to-use and low-cost sensor platform is highly desired to measure various types of analytes (e.g., biomarkers, hormones, and drugs) quantitatively and specifically. For this reason, dry film photoresist technology - enabling cheap, facile, and high-throughput fabrication - was used to manufacture the microfluidic biosensor presented here. Depending on the bioassay used afterwards, the versatile platform is capable of detecting various types of biomolecules. For the fabrication of the device, platinum electrodes are structured on a flexible polyimide (PI) foil in the only clean-room process step. The PI foil serves as a substrate for the electrodes, which are insulated with an epoxy-based photoresist. The microfluidic channel is subsequently generated by the development and lamination of dry film photoresist (DFR) foils onto the PI wafer. By using a hydrophobic stopping barrier in the channel, the channel is separated into two specific areas: an immobilization section for the enzyme-linked assay and an electrochemical measurement cell for the amperometric signal readout.
The on-chip bioassay immobilization is performed by the adsorption of the biomolecules to the channel surface. The glucose oxidase enzyme is used as a transducer for electrochemical signal generation. In the presence of the substrate, glucose, hydrogen peroxide is produced, which is detected at the platinum working electrode. The stop-flow technique is applied to obtain signal amplification along with rapid detection. Different biomolecules can quantitatively be measured by means of the introduced microfluidic system, giving an indication of different types of diseases, or, in regard to therapeutic drug monitoring, facilitating a personalized therapy.

A microfluidic biosensor platform was designed and fabricated using low-cost dry film photoresist technology for the rapid and sensitive quantification of various analytes. This single-use system allows for the electrochemical readout of on-chip-immobilized enzyme-linked assays by means of the stop-flow technique.

Seca de la película basada en la fotoresistencia el Biosensor electroquímico de microfluidos plataforma: Fabricación de dispositivo, preparación del análisis de la en-viruta y el funcionamiento del sistema

In recent years, biomarker diagnostics became an indispensable tool for the diagnosis of human disease, especially for the point-of-care diagnostics. An ...

Fabrication and Validation of an Organ-on-chip System with Integrated Electrodes to Directly Quantify Transendothelial Electrical Resistance

Organs-on-chips, in vitro models involving the culture of (human) tissues inside microfluidic devices, are rapidly emerging and promise to provide useful research tools for studying human health and disease. To characterize the barrier function of cell layers cultured inside organ-on-chip devices, often transendothelial or transepithelial electrical resistance (TEER) is measured. To this end, electrodes are usually integrated into the chip by micromachining methods to provide more stable measurements than is achieved with manual insertion of electrodes into the inlets of the chip. However, these electrodes frequently hamper visual inspection of the studied cell layer or require expensive cleanroom processes for fabrication. To overcome these limitations, the device described here contains four easily integrated electrodes that are placed and fixed outside of the culture area, making visual inspection possible. Using these four electrodes the resistance of six measurement paths can be quantified, from which the TEER can be directly isolated, independent of the resistance of culture medium-filled microchannels. The blood-brain barrier was replicated in this device and its TEER was monitored to show the device applicability. This chip, the integrated electrodes and the TEER determination method are generally applicable in organs-on-chips, both to mimic other organs or to be incorporated into existing organ-on-chip systems.

This publication describes the fabrication of an organ-on-chip device with integrated electrodes for direct quantification of transendothelial electrical resistance (TEER). For validation, the blood-brain barrier was mimicked inside this microfluidic device and its barrier function was monitored. The presented methods for electrode integration and direct TEER quantification are generally applicable.

Fabricación y validación de un sistema de órganos-en-viruta con electrodos integrados directamente cuantificar Transendothelial resistencia eléctrica

Organs-on-chips, in vitro models involving the culture of (human) tissues inside microfluidic devices, are rapidly emerging and promise to provide useful ...

A Lab-On-A-Chip Platform for Stimulating Osteocyte Mechanotransduction and Analyzing Functional Outcomes of Bone Remodeling

Bone remodeling is a tightly regulated process that is required for skeletal growth and repair as well as adapting to changes in the mechanical environment. During this process, mechanosensitive osteocytes regulate the opposing responses between the catabolic osteoclasts and anabolic osteoblasts. To better understand the highly intricate signaling pathways that regulate this process, our lab has developed a foundationary lab-on-a-chip (LOC) platform for analyzing functional outcomes (formation and resorption) of bone remodeling within a small scale system. As bone remodeling is a lengthy process that occurs on the order of weeks to months, we developed long-term cell culturing protocols within the system. Osteoblasts and osteoclasts were grown on functional activity substrates within the LOC and maintained for up to seven weeks. Afterward, chips were disassembled to allow for the quantification of bone formation and resorption. Additionally, we have designed a 3D printed mechanical loading device that pairs with the LOC platform and can be used to induce osteocyte mechanotransduction by deforming the cellular matrix. We have optimized cell culturing protocols for osteocytes, osteoblasts, and osteoclasts within the LOC platform and have addressed concerns of sterility and cytotoxicity. Here, we present the protocols for fabricating and sterilizing the LOC, seeding cells on functional substrates, inducing mechanical load, and disassembling the LOC to quantify endpoint results. We believe that these techniques lay the groundwork for developing a true organ-on-a-chip for bone remodeling.

Here, we present protocols for analyzing bone remodeling within a lab-on-a-chip platform. A 3D printed mechanical loading device can be paired with the platform to induce osteocyte mechanostransduction by deforming the cellular matrix. The platform can also be used to quantify bone remodeling functional outcomes from osteoclasts and osteoblasts (resorption/formation).

Una plataforma Lab-On-A-Chip para estimular la reconversión de mecanonoducción de osteocitos y analizar los resultados funcionales de la remodelación ósea

Bone remodeling is a tightly regulated process that is required for skeletal growth and repair as well as adapting to changes in the mechanical ...

3D Cell-Printed Hypoxic Cancer-on-a-Chip for Recapitulating Pathologic Progression of Solid Cancer

Cancer microenvironment has a significant impact on the progression of the disease. In particular, hypoxia is the key driver of cancer survival, invasion, and chemoresistance. Although several in vitro models have been developed to study hypoxia-related cancer pathology, the complex interplay of the cancer microenvironment observed&#160;in vivo has not been reproduced yet owing to the lack of precise spatial control. Instead, 3D biofabrication approaches have been proposed to create microphysiological systems for better emulation of cancer ecology and accurate anticancer treatment evaluation. Herein, we propose a 3D cell-printing approach to fabricate a hypoxic cancer-on-a-chip. The hypoxia-inducing components in the chip were determined based on a computer simulation of the oxygen distribution. Cancer-stroma concentric rings were printed using bioinks containing glioblastoma cells and endothelial cells to recapitulate a type of solid cancer. The resulting chip realized central hypoxia and aggravated malignancy in cancer with the formation of representative pathophysiological markers. Overall, the proposed approach for creating a solid-cancer-mimetic microphysiological system is expected to bridge the gap between in vivo and in vitro models for cancer research.

Hypoxia is a hallmark of tumor microenvironment and plays a crucial role in cancer progression. This article describes the fabrication process of a hypoxic cancer-on-a-chip based on 3D cell-printing technology to recapitulate a hypoxia-related pathology of cancer.

3D Cell-Printed Hypoxic Cancer-on-a-Chip Para Recapitular la Progresión Patológica Del Cáncer Sólido

Cancer microenvironment has a significant impact on the progression of the disease. In particular, hypoxia is the key driver of cancer survival, invasion, ...

Generation of a Simplified Three-Dimensional Skin-on-a-chip Model in a Micromachined Microfluidic Platform

This work presents a new, cost-effective, and reliable microfluidic platform with the potential to generate complex multilayered tissues. As a proof of concept, a simplified and undifferentiated human skin containing a dermal (stromal) and an epidermal (epithelial) compartment has been modelled. To accomplish this, a versatile and robust, vinyl-based device divided into two chambers has been developed, overcoming some of the drawbacks present in microfluidic devices based on polydimethylsiloxane (PDMS) for biomedical applications, such as the use of expensive and specialized equipment or the absorption of small, hydrophobic molecules and proteins. Moreover, a new method based on parallel flow was developed, enabling the in situ deposition of both the dermal and epidermal compartments. The skin construct consists of a fibrin matrix containing human primary fibroblasts and a monolayer of immortalized keratinocytes seeded on top, which is subsequently maintained under dynamic culture conditions. This new microfluidic platform opens the possibility to model human skin diseases and extrapolate the method to generate other complex tissues.

Here, we present a protocol to generate a three-dimensional simplified and undifferentiated skin model using a micromachined microfluidic platform. A parallel flow approach allows the in situ deposition of a dermal compartment for the seeding of epithelial cells on top, all controlled by syringe pumps.

Generación de un modelo tridimensional simplificado de piel en un chip en una plataforma microfluídica micromecanizado

This work presents a new, cost-effective, and reliable microfluidic platform with the potential to generate complex multilayered tissues. As a proof of ...

Creation of a Knee Joint-on-a-Chip for Modeling Joint Diseases and Testing Drugs

The high prevalence of debilitating joint diseases like osteoarthritis (OA) poses a high socioeconomic burden. Currently, the available drugs that target joint disorders are mostly palliative. The unmet need for effective disease-modifying OA drugs (DMOADs) has been primarily caused by the absence of appropriate models for studying the disease mechanisms and testing potential DMOADs. Herein, we describe the establishment of a miniature synovial joint-mimicking microphysiological system (miniJoint) comprising adipose, fibrous, and osteochondral tissue components derived from human mesenchymal stem cells (MSCs). To obtain the three-dimensional (3D) microtissues, MSCs were encapsulated in photocrosslinkable methacrylated gelatin before or following differentiation. The cell-laden tissue constructs were then integrated into a 3D-printed bioreactor, forming the miniJoint. Separate flows of osteogenic, fibrogenic, and adipogenic media were introduced to maintain the respective tissue phenotypes. A commonly shared stream was perfused through the cartilage, synovial, and adipose tissues to enable tissue crosstalk. This flow pattern allows the induction of perturbations in one or more of the tissue components for mechanistic studies. Furthermore, potential DMOADs can be tested via either &#34;systemic administration&#34; through all the medium streams or &#34;intraarticular administration&#34; by adding the drugs to only the shared &#34;synovial fluid&#34;-simulating flow. Thus, the miniJoint can serve as a versatile in vitro platform for efficiently studying disease mechanisms and testing drugs in personalized medicine.

We provide detailed methods for generating four types of tissues from human mesenchymal stem cells, which are used to recapitulate the cartilage, bone, fat pad, and synovium in the human knee joint. These four tissues are integrated into a customized bioreactor and connected through microfluidics, thus generating a knee joint-on-a-chip.

Creación de una articulación de rodilla en un chip para modelar enfermedades articulares y probar medicamentos

The high prevalence of debilitating joint diseases like osteoarthritis (OA) poses a high socioeconomic burden. Currently, the available drugs that target ...