Este trabalho foi financiado pelos Institutos Nacionais de Saúde (Grant 08UDE017788-05). EBP também reconhece o apoio da Fundação Espanhola para a Ciência e Tecnologia (FECYT). Os autores agradecem a Shonda T. Gaylord e Pratyusha Mogalisetti para a leitura crítica do manuscrito.

<img alt="Figura 1" width="600px" fo:content-width="5.5in" src="/files/ftp_upload/50726/50726fig1.jpg" /> Figura 1. . Fluxo de trabalho para aplicar matriz anticorpo microesfera de fibra óptica para a saliva de perfis (1) As microesferas são internamente codificado com dois corantes fluorescentes, (2) as microesferas codificados são externamente modificada com anticorpos monoclonais específicos para a proteína, (3) as microesferas multiplexados são misturados, e (4) depositado aleatoriamente em micropoços gravado na extremidade proximal de um feixe de fibras ópticas, (5) as proteínas salivares são capturados por microesferas através de imunoensaio de sanduíche, e (6) quantificados por microscopia de fluorescência. 1. Microesferas Encoding <ol><li> Pesar európio de sódio (III) thenoyltrifluoroacetonate trihidrato (Eu-TTA, PM = 869,54 g / mol) num frasco de vidro âmbar e preparar uma solução de estoque 200 mM em tetra-hidrofurano (THF). Misture delicadamente por pipetagem; verificar visualmenteo corante esteja completamente dissolvido. </li><li> Pesar cumarina 30 (C30, PM = 347,41 g / mol) num frasco de vidro âmbar e preparar uma solução de estoque 12 mM em THF. Misturar suavemente por pipetagem; visualmente verificar o corante esteja completamente dissolvido. </li><li> Prepare a 700 ul de solução de trabalho para cada tipo de microesfera utilizando as soluções de reserva e de THF para atingir uma concentração final na Tabela 1. </li><li> Certifique-se de microsferas (10% w / v) são bem suspensas por vórtice, e depois transferir a suspensão de 60 mL para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. </li><li> Adicionar 600 mL PBS a suspensão de microesferas e misture pipetando 20x. Centrifuga-se o tubo a 10.000 rpm durante 3 min e remover cuidadosamente o sobrenadante. Repetir este processo mais 2x para lavar as microsferas. </li><li> Lava-se a pelete 3x com microesferas de THF utilizando um procedimento semelhante ao passo 1.5. </li><li> Centrifugar a suspensão de microsferas / THF a 10.000 rpm, durante 3 min, remover o sobrenadante, e re-suspender o sedimento em 600 ulSolução de trabalho de listados na Tabela 1. Transferir a mistura para um novo tubo de microcentrifugação de 1,5 ml. </li><li> Selar o tubo de microcentrífuga com Parafilm e colocá-lo em uma coqueteleira. Agite a 3.000 rpm e incubar por 24 horas, proteger da luz, cobrindo a instalação usando uma caixa coberta com papel alumínio. </li><li> Centrifugar a suspensão de microesferas a 10.000 rpm durante 3 minutos para formar uma pelete. </li><li> Remover a solução de corante sobrenadante, lavar as microesferas 6X com 600 ul de metanol e em seguida com 600 ul de PBS contendo 0,01% de Tween-20, um outro 6x, tal como descrito na etapa 1.5. </li><li> Armazenar as microesferas codificadas em 600 ul de PBS contendo 0,01% de Tween-20 a 4 ° C até à sua utilização, proteger da luz. </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> Nome do tipo de microesfera: </td><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> 6 </strong&gt; </td><td> 7 </td></tr><tr><td> Eu-TTA (mM) </td><td> 100 </td><td> 100 </td><td> 10 </td><td> 100 </td><td> 10 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> C30 (mM) </td><td></td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 6 </td><td> 6 </td><td> 1 </td><td> 6 </td></tr></tbody></table> Tabela 1. As concentrações de Eu-TTA e C30 soluções de trabalho. 2. Preparação de microesferas de captura de Proteína <ol><li> Preparar tampão MES [2 - (N-morfolino) etanossulfónico (MES) 0,1 M, NaCl a 0,9%, SDS a 0,01%, pH 5,7] e tampão PBS / SDS (fosfato de sódio 0,01 M, NaCl 0,154 M, SDS a 0,01%, pH 7,4) com antecedência à temperatura ambiente. </li><li> Adicionar 200 mL de suspensão de microesferas codificadas (contendo ~ 2 mg de microesferas) em um Safe-Lock 1,5 ml tubo de microcentrífuga. É importante a utilização deste tipo de tubo de microcentrífuga para evitar o derrame durante a incubação no passo 2.6. </li> &lt;li&gt; Lavar as microesferas com 600 ul de tampão MES 3x como descrito na etapa 1.5. Adicionar 700 ul de MES para o pellet de microsferas e misturar bem por pipetagem. </li><li> Prepare a 0,105 g / ml de 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil] carbodiimida (EDC, MW = 191,7 g / mol) e 0,163 g / ml de sulfo-N-hidroxissulf (sulfo-NHS, PM = 217,13 g / mol) soluções em tampão MES em tubos separados. </li><li> Adicionar 150 ul de solução recém-preparada de EDC, gota a gota, à suspensão de microesferas. O EDC hidrolisa muito rapidamente, pelo que é essencial para utilizar feita recentemente solução para assegurar a eficiência de imobilização. Imediatamente após a adição de EDC, adicionar 150 ul de solução de sulfo-NHS para as microesferas, misturar bem por pipetagem e verificar se a suspensão homogénea. </li><li> Tampe o tubo, selá-lo com Parafilm, e colocá-lo em uma coqueteleira. Agite a 1.500 rpm, durante 4 horas, proteger da luz usando uma caixa coberta com papel alumínio. </li><li> Centrifugar as suspens microesferasion a 10.000 rpm durante 3 minutos para formar uma pelete e remover o sobrenadante. Lave as microesferas com 500 ul de PBS / SDS 3x tampão como descrito no passo 1.5. </li><li> Adicionar 200 ul de tampão PBS / SDS ao precipitado, as microesferas misturar bem e transferir a solução para 300 ul de tampão PBS / SDS contendo 60 ug de anticorpos de captura. É importante para suspender o sedimento de microsferas primeiro e, em seguida, adicionar a suspensão de microesferas para a solução de anticorpo. </li><li> Incubar a mistura de anticorpos-microesferas agitando a 1.500 rpm, durante 4 horas em um shaker, proteger da luz usando uma caixa coberta com papel alumínio. </li><li> Centrifugar a suspensão de microesferas a 10.000 rpm durante 3 minutos para formar uma pelete e remover o sobrenadante. Lave as microesferas com 500 ul StartingBlock (TBS) bloqueando 3x tampão, como descrito no passo 1.5. </li><li> Misturar microesferas com 1 ml de TBS tampão de bloqueio e incubar microesferas a 1.500 rpm durante 1 hora, num agitador, proteger da luz usando um enseada caixavermelho com folha de alumínio. </li><li> Centrifugar a suspensão de microesferas a 7.000 rpm, durante 3 minutos, para formar um sedimento e remove-se o sobrenadante. Lava-se a pelete 3x com 500 ul de TBS tampão de bloqueio, como descrito no passo 1.5. </li><li> Centrifugar a solução de microesferas a 7.000 rpm, durante 3 minutos, para formar um sedimento e remove-se o sobrenadante. Adicionar 500 mL de TBS tampão de bloqueio e misture por pipetagem. </li><li> Armazenar a suspensão de microesferas modificadas a 4 ° C até à sua utilização, proteger da luz. </li><li> Repita este procedimento para fazer outros tipos de microesferas utilizando anticorpos correspondentes. </li></ol> 3. Assembléia Microarray de fibra óptica <ol><li> Misturar 50 ul de cada tipo de micro-esferas de captura de proteína para um novo tubo de microcentrifugação esterilizado. Centrifugue as microesferas imagens reunir a 7.000 rpm, durante 3 min, e remover o sobrenadante, de modo que o volume remanescente é de aproximadamente 100 ul. </li><li> Feixes de fibra óptica cortados à mão a cerca de 5 cm de comprimento esequencialmente polir ambas as extremidades de uma máquina de polimento, utilizando 30, 15, 9, 6, 3, 1, 0,5, e 0,05 mM de diamante de tamanho de polimento filmes. Sonicar o pacote polido em água deionizada por 2 min para remover quaisquer partículas. </li><li> Colocar uma pequena barra de agitação magnética para um tubo de microcentrífuga de 0,5 ml, adicionar 400 mL de PBS isento de proteína padrão e agite sobre uma placa de agitação magnética durante 30 min para remover as bolhas de ar. </li><li> Etch uma das extremidades do feixe de fibras polido em uma solução 0,025 N de HCl durante 150 segundos 10,16. Imediatamente submergir e sonicate final gravado em água deionizada por 1 min. Secam-se os feixes de fibras, com ar comprimido. </li><li> Montagem do feixe de fibras sobre um suporte de fibra e bloquear a extremidade gravadas no, tampão PBS livre de proteína livre de bolhas durante 1 hora. </li><li> Depósito 1 ul alíquota da suspensão de microesferas armazenado na extremidade entalhada do feixe de fibras ópticas. Proteja a instalação da luz com uma caixa com papel alumínio e aguarde 15 min. O volume da suspensão serádiminuir por evaporação e forçar as microesferas para os micropoços gravadas. Repetir esta etapa de carregamento mais uma vez. </li><li> Utilize um cotonete saturado com solução de amostra para remover microesferas que não estão presas nos micropoços. O microarray proteína já está pronto para usar. Vá imediatamente para o passo 4.1 para a análise de saliva. </li></ol> 4. Análise Saliva Amostra Utilizando Microesferas Microarray <ol><li> Adicionar solução de amostra de 200 ul (100 ul de sobrenadante de saliva diluída com igual volume de StartingBlock T20 (PBS), tampão de bloqueio. Do protocolo de recolha de saliva sobrenadante foi publicada previamente 10). para um tubo de microcentrífuga de 0,5 ml autoclavado. Mergulhar o microarray de proteína carregada sobre a fibra para dentro da solução e incubar num agitador a 600 rpm durante 2 h, protegido da luz utilizando uma caixa coberta com folha de alumínio. </li><li> Preparar 20 ml de tampão de lavagem através da adição de 200 ul de solução de BSA a 10% e 200 ul de 10% de Tween-20 em 19,6 ml de PBS, mix bem agitando suavemente. </li><li> Mergulhe o microarray de proteínas em um novo tubo de microcentrífuga autoclavada contendo 200 tampão de lavagem e agitar a 600 rpm por 2 min. Repita esta lavagem 3x. </li><li> Incubar o microarray em solução de 100 mL de um cocktail de anticorpos de detecção que contém 5 ug / ml de anti-VEGF, IP-10, IL-8, FEG, MMP-9, anticorpos de detecção de IL-1β biotinilados em StartingBlock T20 (PBS), tampão de bloqueio durante 30 min à temperatura ambiente no agitador a 600 rpm, proteger da luz usando uma caixa coberta com folha de alumínio. </li><li> Lavar 3x com tampão de lavagem de microarray, tal como descrito na etapa 4.3. </li><li> Incubar o microarray em 200 ul de ug / ml de conjugado de R-ficoeritrina estreptavidina (SAPE) solução a 20 em PBS, a 600 rpm no agitador durante 10 minutos, proteger da luz usando uma caixa coberta com folha de alumínio. </li><li> Lava-se a 5x com tampão de lavagem de microarray como descrito na etapa 4.3. </li><li> Limpar a extremidade distal da fibra (isto é, na extremidade opostaa partir das microesferas) junte com um cotonete saturado com etanol absoluto. </li><li> Seca-se ambas as extremidades da fibra com o ar comprimido. Montar a fibra num microscópio de epifluorescência e imagem através da extremidade distal da fibra. </li><li> Adquirir imagens de microesferas correspondentes ao Eu-TTA, C30 e Sapé intensidades de emissão de fluorescência. Filtros ópticos configuração e tempo de exposição para imagens de fluorescência de Eu-TTA, C30 e SAPE estão representados na Tabela 2. </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> Canal </td><td> Eu-TTA </td><td> C30 </td><td> SAPE </td></tr><tr><td> Excitador </td><td> 365/10x </td><td> 350/50x </td><td> 546/10x </td></tr><tr><td> Refletor </td><td> 525DCLP </td><td> 400DCLP </td><td> 560LP </td></tr><tr><td> Emitter </td><td> 620/60m </td><td> 460/50m </td><td> 580/30m </td></tr><tr><td> Tempo de exposição </td><td> 1 seg</td><td> 0,3 seg </td><td> 1 seg </td></tr></tbody></table> Tabela 2. Parâmetros para as três imagens fluorescentes de microarray.

<ol>
	<li>Schena, M., Shalon, D., Davis, R. W., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+monitoring+of+gene-expression+patterns+with+a+complementary-DNA+microarray.">Quantitative monitoring of gene-expression patterns with a complementary-DNA microarray.</a> Science. 270, 467-470 (1995).</li><li>Schena, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Protein Microarray. , (2004).</li><li>Tam, S. W., Wiese, R., Lee, S., Gilmore, J., Kumble, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+analysis+of+eight+human+Th1/Th2+cytokines+using+microarrays.">Simultaneous analysis of eight human Th1/Th2 cytokines using microarrays.</a> J. Immunol. Methods. 261 (01), 157-165 (2002).</li><li>Wang, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Array-based+multiplexed+screening+and+quantitation+of+human+cytokines+and+chemokines.">Array-based multiplexed screening and quantitation of human cytokines and chemokines.</a> J. Proteome Res. 1, 337-343 (2002).</li><li>de Jager, W., Velthuis, t. e., Prakken, H., Kuis, B. J., W, G. T., Rijkers, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+detection+of+15+human+cytokines+in+a+single+sample+of+stimulated+peripheral+blood+mononuclear+cells.">Simultaneous detection of 15 human cytokines in a single sample of stimulated peripheral blood mononuclear cells.</a> Clin. Diagn. Lab. Immunol. 10, 133-139 (2003).</li><li>Lee, H. J., Nedelkov, D., Corn, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+plasmon+resonance+imaging+measurements+of+antibody+arrays+for+the+multiplexed+detection+of+low+molecular+weight+protein+biomarkers.">Surface plasmon resonance imaging measurements of antibody arrays for the multiplexed detection of low molecular weight protein biomarkers.</a> Anal. Chem. 78, 6504-6510 (2006).</li><li>Vignali, D. A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+particle-based+flow+cytometric+assays.">Multiplexed particle-based flow cytometric assays.</a> J. Immunol. Methods. 243 (00), 243-255 (2000).</li><li>Rissin, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+enzyme-linked+immunosorbent+assay+detects+serum+proteins+at+subfemtomolar+concentrations.">Single-molecule enzyme-linked immunosorbent assay detects serum proteins at subfemtomolar concentrations.</a> Nat. Biotechnol. 28, 595-599 (2010).</li><li>Zhang, H., Nie, S., Etson, C. M., Wang, R. M., Walt, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oil-sealed+femtoliter+fiber-optic+arrays+for+single+molecule+analysis.">Oil-sealed femtoliter fiber-optic arrays for single molecule analysis.</a> Lab Chip. 12, 2229-2239 (2012).</li><li>Blicharz, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiber-Optic+Microsphere-Based+Antibody+Array+for+the+Analysis+of+Inflammatory+Cytokines+in+Saliva.">Fiber-Optic Microsphere-Based Antibody Array for the Analysis of Inflammatory Cytokines in Saliva.</a> Anal. Chem. 81, 2106-2114 (2009).</li><li>Mukhopadhyay, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Devices+to+drool+for.">Devices to drool for.</a> Anal. Chem. 78, 4255-4259 (2006).</li><li>Wong, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salivary+diagnostics+powered+by+nanotechnologies,+proteomics+and+genomics.">Salivary diagnostics powered by nanotechnologies, proteomics and genomics.</a> J. Am. Dent. Assoc. 137, 313-321 (2006).</li><li>Segal, A., Wong, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salivary+diagnostics:+enhancing+disease+detection+and+making+medicine+better.">Salivary diagnostics: enhancing disease detection and making medicine better.</a> Eur. J. Dent. Educ. 12, 22-29 (2008).</li><li>St John, M. A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin+6+and+interleukin+8+as+potential+biomarkers+for+oral+cavity+and+oropharyngeal+squamous+cell+carcinoma.">Interleukin 6 and interleukin 8 as potential biomarkers for oral cavity and oropharyngeal squamous cell carcinoma.</a> Arch. Otolaryngol. Head Neck Surg. 130, 929-935 (2004).</li><li>Herr, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+immunoassays+as+rapid+saliva-based+clinical+diagnostics.">Microfluidic immunoassays as rapid saliva-based clinical diagnostics.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 5268-5273 (2007).</li><li>Pantano, P., Walt, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ordered+nanowell+arrays.">Ordered nanowell arrays.</a> Chem. Mater. 8, 2832-2835 (1996).</li><li>Schena, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Protein Microarrays. , (2005).</li></ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Os investigadores devem prestar atenção extra para os seguintes passos: para uma melhor precisão de decodificação, é necessário verificar as microesferas foram homogeneamente suspensa em todos incubação e lavagem etapas durante o processo de microesferas de codificação. Além disso, as microesferas codificados devem ser protegidos da luz durante todo o experimento. Após os procedimentos de codificação e armazenamento adequados, descobrimos que a precisão geral de decodificação foi acima de 99%. As micro...

Desde o primeiro microarray relatado por Mark Schena e colegas de trabalho em meados de 1990, esta poderosa ferramenta tem sido utilizada em muitos campos da pesquisa biológica 1. Microarrays de anticorpo capaz de detectar simultaneamente várias proteínas em fluidos de diagnóstico, tais como o sangue, tem aplicações importantes no diagnóstico clínico e biomarcador rastreio 2-10. Saliva, que contém muitos dos mesmos analitos como sangue, tem sido considerada como uma alternativa preferível ao sangue porque recolha de saliva é seguro, não invasivo, e pode ser levada a cabo por pessoal médico minimamente treinados 11-13. Actualmente, a análise da proteína multiplexado utilizando amostras de saliva é limitada por vários factores importantes, incluindo a baixa concentração do analito alvo 14 e o largo intervalo de concentração de diferentes biomarcadores 15. . Aqui, nós demonstramos a análise de seis proteínas: fator de crescimento endotelial vascular humano (VEGF), proteína induzida por interferão gama, 10 (IP-10), interleucina-8 (IL-8), factor de crescimento epidérmico (EGF), metalopeptidase matriz 9 (MMP-9), e interleucina-1 beta (IL-1β) . O desempenho do método foi inicialmente verificado utilizando soluções padrão constituindo proteínas recombinantes de analitos e tampão de bloqueio. Amostras de saliva reais coletadas de pacientes de diferentes doenças respiratórias crônicas, bem como controles saudáveis ​​também foram testados com desempenho satisfatório. O protocolo deve ser aplicável a outros analitos de proteína e outros ensaios baseados em microesferas. Esta plataforma oferece vantagens consideráveis ​​para o campo Analytical Chemistry, uma vez que permite a análise simultânea rápido, preciso e reprodutível de baixas concentrações de várias proteínas com uma gama ampla dinâmica, as interações não-específicas mínimas, reduziu o consumo de amostra, e de baixo custo em comparação com um análogo Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA).

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eu-TTA dye</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC42319-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THF</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34865-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amber glass vial</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-339-23B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coumarin 30 dye</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>546127-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microspheres</td>
			<td>Bangslabs</td>
			<td>PC05N/6698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml microcentrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 10x concentrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5493-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W4502-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34860-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tw-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7949-100 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BupH MES buffered saline</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>28390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>05030-500ML-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SS256-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-lock microcentrifuge tube</td>
			<td>VWR labshop</td>
			<td>53511-997</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDC</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>22980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-NHS</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>24510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human VEGF capture antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB293</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human IP-10 capture antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human IL-8 capture antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human EGF capture antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human MMP-9 capture antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human IL-1&#946; capture antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG1 isotype control antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StartingBlock (TBS) buffer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>37542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl standard solution 1.0 N</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>318949-500 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 ml microcentrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein-free (PBS) buffer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>37572</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human VEGF 165</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>293-VE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human IP-10</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>266-IP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human IL-8</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>208-IL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human EGF</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>236-EG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human MMP-9</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>911-MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human IL-1&#946;</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>201-LB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StartingBlock T20 (PBS) buffer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>37539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocker BSA in PBS</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>37525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated VEGF detection antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>BAF293</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated IP-10 detection antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>BAF266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated IL-8 detection antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>BAF208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated EGF detection antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>BAF236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated MMP-9 detection antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>BAF911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated IL-1&#946; detection antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>BAF201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin, R-phycoerythrin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S-21388</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (200 proof)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7023-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multiplexed fluorescent microarray for human salivary protein analysis using polymer microspheres and fiber-optic bundles

Relata-se um protocolo para medir simultaneamente seis proteínas na saliva usando uma baseada em microesfera variedade de anticorpos de fibra óptica. A tecnologia de imuno-matriz empregada combina as vantagens de suspensão à base de fabrico de microesferas de matriz com a utilização de microscopia de fluorescência. Tal como descrito no protocolo de vídeo, microesferas de polímero 4,5 mM disponíveis comercialmente foram codificados em sete tipos diferentes, diferenciadas por a concentração de dois corantes fluorescentes aprisionados fisicamente dentro das microesferas. As microesferas codificados contendo grupos carboxilo de superfície foram modificados com anticorpos de captura monoclonais através de EDC / NHS acoplamento química. Para montar o microarray de proteínas, os diferentes tipos de microesferas codificados e funcionalizados foram misturadas e depositadas aleatoriamente em 4,5 mM microcavidades, que foram quimicamente gravado na extremidade proximal de um feixe de fibras ópticas. O feixe de fibras ópticas, foi usado como um portador para a imagem latente e o microspheres. Depois de montada, a micromatriz foi utilizado para capturar as proteínas no sobrenadante da saliva recolhida a partir da clínica. A detecção foi baseada num imunoensaio de sanduíche utilizando uma mistura de anticorpos de detecção de bioestanhados para diferentes analitos com uma sonda fluorescente de estreptavidina conjugada com R-ficoeritrina. O microarray foram visualizados por meio de microscopia de fluorescência, em três canais diferentes, dois para o registo de microesferas e um para o sinal de ensaio. As micrografias de fluorescência foram decodificados e analisados ​​por meio de um algoritmo de caseiro em MATLAB.

As imagens de fluorescência a partir de três canais, mostrando uma pequena parte do feixe de fibras ópticas, são mostrados nas Figuras 2A-C. Estas imagens foram analisadas utilizando um algoritmo escrito em Matlab (como descrito em mais detalhe na secção Discussão). A análise utiliza tanto a informação de codificação de imagem do Eu-ATT (Figura 2A) e da imagem de codificação C30 (Figura 2B) para descodificar as microesferas, e as intensidades de fluorescê...

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Multiplexed Fluorescent Microarray for Human Salivary Protein Analysis Using Polymer Microspheres and Fiber-optic Bundles

Nós descrevemos um procedimento para perfilar proteínas salivares usando multiplexados matrizes à base de microesferas de anticorpos. Os anticorpos monoclonais foram covalentemente ligados para 4,5 mM microesferas fluorescentes polímero codificado-dye usando química carbodiimida. As microesferas modificadas foram depositados em micropoços de fibra óptica para medir os níveis de proteína na saliva usando imunoensaios sanduíche de fluorescência.

Multiplexado fluorescente Microarray para análise de proteína salivar humana Usando Polymer Microesferas e Pacotes de fibra óptica

Herein, we describe a protocol for simultaneously measuring six proteins in saliva using a fiber-optic microsphere-based antibody array. The immuno-array ...

multiplexed-fluorescent-microarray-for-human-salivary-protein

Research

JoVE Journal

Chemistry

11.6K visualizações.  Tufts University.  Nós descrevemos um procedimento para perfilar proteínas salivares usando multiplexados matrizes à base de microesferas de anticorpos. Os anticorpos monoclonais foram covalentemente ligados para 4,5 mM microesferas fluorescentes polímero codificado-dye usando química carbodiimida. As microesferas modificadas foram depositados em micropoços de fibra óptica para medir os níveis de proteína na saliva usando imunoensaios sanduíche de fluorescência. 