Este estudio fue apoyado por la Agence Nationale de la Recherche (proyecto ANR-2010-BLAN-1535) y por una beca de Région Ile-de-France (DIM-Malinf 110058).

1. Producción y Purificación de Proteínas <ol><li> MexA, MexB de Pseudomonas aeruginosa <ol><li> Transformar los plásmidos que albergan los genes MexA y MexB en una E. coli cepa de producción (por ejemplo, C43 DE3). Placa en LB agar suplementado con el antibiótico apropiado. Elija una sola colonia para inocular un cultivo previo de O / N. A la mañana siguiente, inocular el precultivo en 1 l de LB y crecer a 37 ° C con agitación (240 rpm). </li><li> Una vez que las células han alcanzado la fase exponencial (OD 600 = 0,6-0,8) inducen con IPTG 1 mM. Realizar la inducción durante 2-3 horas a 30 º C bajo agitación. </li><li> Centrifugar las células (9.000 xg durante 20 min) y se resuspende en 30 ml de Tris-HCl 20 mM, pH 8, NaCl 150 mM. </li><li> Interrumpir las células usando una prensa francesa (10.000 psi, 4 pasadas). Desechar las células sin romper y los cuerpos de inclusión por centrifugación a 9000 xg durante 20 min. </li><li> Membranas de pellets de 1 hora a 100.000 xg yresuspend cada sedimento en 30 ml de Bis-Tris 10 mM pH 7,4, glicerol al 20% (w / v), imidazol 10 mM, NaCl 500 mM. </li><li> Determinar la concentración total de proteínas de membrana utilizando el ensayo colorimétrico BCA y solubilizar las membranas o / n con 2% de dodecil maltósido (DDM) en un volumen final determinado de modo que el detergente: proteína es 1:1,5 (W / W). </li><li> Ultracentrífuga a 100.000 xg durante 1 hora para descartar material no solubilizado y agregada. </li><li> Incubar el sobrenadante durante 2 horas a 4 ° C con una resina de níquel (purificación MexA) o una resina de cobalto (purificación MexB) equilibrada con Bis-Tris 10 mM pH 7,4, glicerol al 5% (w / v), imidazol 10 mM, NaCl 500 mM, 0,2% de DDM. </li><li> Vierta la resina en una columna vacía. Recoger el flujo a través. </li><li> Lavar la resina con 50 ml de Bis-Tris 10 mM pH 7,4, glicerol al 20% (w / v), imidazol 10 mM, NaCl 500 mM, 0,2% de DDM, a continuación, con 25 ml de Bis-Tris 10 mM pH 6, glicerol 5% (w / v), imidazol 10 mM, NaCl 500 mM, 0,2% de DDM. </li><li> Eluir la protein con 20 ml de Bis-Tris 10 mM pH 7,4, glicerol al 5% (w / v), imidazol 300 mM, NaCl 500 mM, 0,2% de DDM. </li><li> Se concentra la proteína con un dispositivo de ultrafiltración a 3 ml y la carga sobre una columna de desalación equilibrada con un tampón de imidazol-libre. Justo antes de la reconstitución (ver más adelante), las proteínas solubilizadas ultracentrifugar (100.000 xg durante 20 minutos) para deshacerse de los lípidos y las proteínas no solubilizada. A continuación concentrar la proteína de nuevo a 0,3 ml. </li></ol></li><li> Bacteriorhodopsin de Halobacter Salinarium <ol><li> Se cultivan las células Salinarium Halobacter bajo iluminación a 37 ° C durante 10 días en un medio de crecimiento líquido que contiene NaCl 4 M, MgSO4 150 mM, citrato 10 mM, KCl 30 mM, extracto de levadura 5 g / l, y la peptona 5 g / L. </li><li> Interrumpir las células mediante diálisis frente a agua desionizada. </li><li> Purificar la membrana púrpura en un 30-40% (w / v) de sacarosa gradiente (100.000 xg durante 17 horas). </li><li> Solubilizar la suspensión de membrana con 2% octylglucósido durante 24 horas a 37 º C (volumen para la solubilización con el fin de resuspender la membrana a una 02:01 (w / w) de detergente: proteína). Calcule la concentración de BR solubilizado utilizando ε (570 nm) = 54.000 M -1 cm -1. Justo antes de la reconstitución (ver abajo), ultracentrifugar la BR solubilizado (100.000 xg durante 20 minutos) para deshacerse de los lípidos y las proteínas no solubilizada. Nota: Las membranas nativas se enriquecen de forma natural en BR así que no hay más purificación. </li></ol></li></ol> 2. Preparación de proteoliposomas <ol><li> Formación de liposomas: Poner 400 l de DOPC disueltos en cloroformo (25 mg / ml) en un vaso de precipitados de vidrio y añadir 1,5 mg de colesterol almacenado como un polvo. Seque justo antes de la manipulación bajo una corriente de nitrógeno o vacío durante al menos 1 hora en un vaso de vidrio. El DOPC: relación molar de colesterol es 3,3:1. <ol><li> Después de que se hayan secado, hidratar los lípidos con 1 ml de HEPES 25 mM pH 7,K 2 SO 4 100 mM, MgCl2 2 mM, 2 mM piranina. La suspensión debería aparecer turbia en esta etapa. </li><li> Calentar la solución durante 10 min a 37 ° C. Someter a ultrasonidos durante 10 minutos a 40 W con 30 pulsos seg, 30 ciclos de pausa seg a TA. La suspensión debe ser transparente en esta etapa. </li><li> Para obtener una población de liposomas monodisperso, realizar dos ciclos de extrusión y para cada ciclo, pasar la suspensión de liposomas a través del filtro al menos 11x. Para el primer ciclo, utilizar un tamaño de poro de la membrana de 200 nm y para el segundo ciclo, utilizar un tamaño de poro de la membrana de 100 nm. Mediciones de dispersión dinámica de la luz se pueden realizar en este paso para comprobar la homogeneidad de la suspensión. </li></ol></li><li> Incorporación de proteínas Principio: Las proteínas de membrana se pueden reconstituir en liposomas gracias al efecto solubilizante de los detergentes. Liposomas solubilizados-detergente se incuban con la proteína de membrana solubilizada con detergente y la formación de la proteoliposomes se desencadena por la rápida eliminación del detergente con perlas de poliestireno 9. <ol><li> Añadir 28 mg de Triton X-100 (0,56% final) y se incuba O / N a 4 ° C (la temperatura de solubilización se puede adaptar a la proteína en estudio). </li><li> Añadir la proteína solubilizada con detergente (BR, MexB y MexA) a los liposomas solubilizados e incubar 15 min a 4 ° C. Añadir las proteínas de la suspensión de liposomas solubilizados en las siguientes proporciones (W / W): lípidos / MexB = 20, MexB / MexA = 2,5, y los lípidos / BR = 30. </li><li> Añadir perlas de poliestireno en un 30:1 cuentas: cociente detergente (w / w, teniendo en cuenta el peso total del detergente, incluyendo detergente añadido con las proteínas purificadas) e incubar 5 horas, en la oscuridad (por la BR) a TA en una suave agitación. Antes de este procedimiento, activar los BioBeads con metanol y la incubación etanol y ampliamente lavar con agua. </li><li> Se purifica la proteína proteoliposomas y sustratos libres utilizando un PD-10columna de desalación equilibrada con HEPES 25 mM pH 7, K 2 SO 4 100 mM y MgCl 2 2 mM. </li><li> Guarde las proteoliposomas a 18 ° C en la oscuridad durante un máximo de 2-3 semanas. </li></ol></li><li> Evaluación de la eficacia de la reconstitución en gradiente de sacarosa. Para comprobar que tanto el MexB y la BR han reconstituido en liposomas, purificar la suspensión proteoliposoma en un gradiente discontinuo de sacarosa. <ol><li> Asentarse suavemente los proteoliposomas en un gradiente de cinco capas de sacarosa (60%, 20%, 10%, 5%, y 2,5%, w / v). </li><li> Ultracentrífuga durante 17 horas a 100.000 xg (con aceleración mínima y deceleración). </li><li> Recoger cuidadosamente las diversas fracciones de gradiente (especialmente las interfaces entre cada capa de sacarosa) y analizarlas en SDS-PAGE (10%) mediante la tinción de Coomassie o transferencia Western. Agregados de proteínas se encuentran en la parte inferior del tubo, mientras que las proteínas no incorporado, solubilizada con detergente se encuentran en la parte superior deel tubo. Proteoliposomas y liposomas se encuentran en las interfaces de sacarosa que corresponden a su densidad intrínseca. Liposomas vacíos se recuperaron más arriba en el gradiente de las proteoliposomas. </li></ol></li></ol> 3. La fluorescencia de medición <ol><li> Realizar mediciones de fluorescencia a 25,0 º C usando un espectrofluorómetro permitiendo mediciones de doble longitud de onda (lámpara de Xe, 150 W). Períodos de iluminación alternativos (para activar BR con longitudes de onda de excitación / emisión de 550 nm / 550 nm) y mediciones de fluorescencia con las longitudes de onda de excitación / emisión de 455 nm / 509 nm durante 2 segundos para medir la fluorescencia de la piranina. Ajuste los anchos de banda de excitación y emisión de 5 nm. Llevar a cabo las mediciones en presencia de 50 nM valinomicina para evitar la formación de un potencial de membrana ΔΨ inversa. Nota: De hecho, debido a que el BR bombea protones, hay más cargas positivas en el interior del liposoma que en el exterior. Esta cargagradiente se puede descartar el uso de valinomicina, que es un ionóforo selectivo de K +. Una vez añadido a la valinomicina liposomas suspensión, como una molécula hidrofóbica, se inserte en la membrana del liposoma, transportar pasivamente K +, y por lo tanto disipar el potencial de membrana ΔΨ. </li></ol>

<ol>
	<li>Granseth, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+protein+structural+biology+-+How+far+can+the+bugs+take+us?+(Review).">Membrane protein structural biology - How far can the bugs take us? (Review).</a> Molecular Membrane Biology. 24 (5-6), 329 (2007).</li><li>Nikaido, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multidrug+resistance+in+bacteria.">Multidrug resistance in bacteria.</a> Annu Rev Biochem. 78, 119 (2009).</li><li>Pos, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+transport+mechanism+of+the+AcrB+efflux+pump.">Drug transport mechanism of the AcrB efflux pump.</a> Biochim Biophys Acta. 1794 (5), 782 (2009).</li><li>Murakami, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structures+of+a+multidrug+transporter+reveal+a+functionally+rotating+mechanism.">Crystal structures of a multidrug transporter reveal a functionally rotating mechanism.</a> Nature. 443 (7108), 173 (2006).</li><li>Seeger, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+Asymmetry+of+AcrB+Trimer+Suggests+a+Peristaltic+Pump+Mechanism.">Structural Asymmetry of AcrB Trimer Suggests a Peristaltic Pump Mechanism.</a> Science. 313 (5791), 1295 (2006).</li><li>Sennhauser, G., Bukowska, M. A., Briand, C., Grutter, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+multidrug+exporter+MexB+from+Pseudomonas+aeruginosa.">Crystal structure of the multidrug exporter MexB from Pseudomonas aeruginosa.</a> J Mol Biol. 389 (1), 134 (2009).</li><li>Su, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+CusBA+heavy-metal+efflux+complex+of+Escherichia+coli.">Crystal structure of the CusBA heavy-metal efflux complex of Escherichia coli.</a> Nature. 470 (7335), (2011).</li><li>Nikaido, H., Takatsuka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+RND+multidrug+efflux+pumps.">Mechanisms of RND multidrug efflux pumps.</a> Biochim Biophys Acta. 1794 (5), 769 (2009).</li><li>Rigaud, J. L., Levy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+membrane+proteins+into+liposomes.">Reconstitution of membrane proteins into liposomes.</a> Methods in enzymology. 372, 65 (2003).</li><li>Aires, J. R., Nikaido, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aminoglycosides+are+captured+from+both+periplasm+and+cytoplasm+by+the+AcrD+multidrug+efflux+transporter+of+Escherichia+coli.">Aminoglycosides are captured from both periplasm and cytoplasm by the AcrD multidrug efflux transporter of Escherichia coli.</a> J Bacteriol. 187 (6), 1923 (2005).</li><li>Picard, M., Verchere, A., Broutin, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+the+active+transport+of+efflux+pumps+after+their+reconstitution+into+proteoliposomes:+caveats+and+keys.">Monitoring the active transport of efflux pumps after their reconstitution into proteoliposomes: caveats and keys.</a> Anal Biochem. 420 (2), 194 (2012).</li><li>Verchere, A., Dezi, M., Broutin, I., Picard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Methods+in+Protein+Purification+and+Analysis,+edited+by+iConcept+Press.">Basic Methods in Protein Purification and Analysis, edited by iConcept Press.</a> , (2012).</li><li>Verchere, A., Broutin, I., Picard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photo-induced+proton+gradients+for+the+in+vitro+investigation+of+bacterial+efflux+pumps.">Photo-induced proton gradients for the in vitro investigation of bacterial efflux pumps.</a> Sci Rep. 2, 306 (2012).</li></ol>

No hay nada que revelar.

Se describe un procedimiento de reconstitución diseñado para analizar el transporte de proteínas de membrana. Una vez establecido, el procedimiento de reconstitución de proteínas conduce a mediciones que son muy reproducibles. Sin embargo, las condiciones exactas para la reconstitución de la proteína variarán de una proteína a la otra. Gran parte se debe tener cuidado en la optimización de los parámetros siguientes: i) la calidad de la purificación (la pureza y la ausencia de material agregado), ii) eficacia de la etapa de solubilización de detergente (cuando sea posible, se debe preferir detergente de baja cmc porque son más fáciles de obtener deshacerse de), iii) la desorción del detergente (que es por ejemplo posible combinar el uso de perlas de poliestireno con una etapa de diálisis, pero esto puede afectar a la tasa de desorción, un parámetro crítico para la actividad subsiguiente de la proteína, ver ref [ 9]), iv) la reconstitución de lípidos (la naturaleza química de los lípidos, la relación de lípido a proteína, la presencia de amphiph adicionaliles son parámetros críticos que deben ser variadas y optimizadas). En adición la temperatura y el tiempo de incubación afecta a todas estas cuestiones. El control de calidad es por lo tanto primordial en cada paso del procedimiento de reconstitución. Desde este punto de vista, la dispersión de luz es una técnica muy conveniente, ya que es rápida, no destructiva, y que sólo requiere de 20 l de muestra a una concentración en el rango micromolar. Una vez formados los proteoliposomas, gradiente de sacarosa es también de gran ayuda, ya que abre el camino hacia la verificación sistemática de la reconstitución: cualitativa (es la proteína de hecho incrustado en la membrana de los liposomas) y cuantitativos (cuántas proteínas en un liposoma). Este último se abordarían mediante la medición precisa de la proteína y las concentraciones de lípidos. Nuestro ensayo no se basa en la valoración de la propia sustrato y esto evita consideraciones inquietas acerca de la posible difusión pasiva artefactual de<html> la molécula debido a la compartimentación del hidrófobo en las membranas. El ensayo explota las propiedades de piranina como una sonda fiable y cuantitativa de los cambios de monitoreo de pH. Nuestros resultados están de acuerdo con los resultados obtenidos con otro procedimiento en el que se realizó la formación de gradiente de protones utilizando valinomicina 10, pero permite un más robusto y reproducible gradiente de 11. Además, el gradiente de protones se puede ajustar con precisión, simplemente mediante la variación de la concentración del tampón (para más detalles ver Verchere et al. 12). En el procedimiento de una medición de control se lleva a cabo primero en ausencia de sustrato (esto le da acceso a la actividad pasiva de la proteína). La actividad real transportador de proteína de la membrana se mide a continuación, después de que el sustrato se ha añadido en la misma cubeta. Este es realmente un activo debido a que el experimento puede ser considerado como un resultado verdadero, no ambigua, inducido por el sustrato. ENT &quot;&gt; El protocolo se podría adaptar a medio-alto rendimiento (por ejemplo 96-pozos mediciones) automatización debido a la iluminación de la muestra desencadena la reacción. Automatización y paralelización consistirían en la preparación de un gran lote de proteoliposoma, y ​​en la dispensación de alícuotas en un 96 habría entonces que añadir pozos placa. Sustratos (y también los inhibidores posibles) y después de la incubación en la oscuridad durante 45 min la placa sería sometido a ciclos de medición de fluorescencia iluminación / piranina en un lector de microplacas. Para obtener información adicional sobre el protocolo, se invita a los lectores a leer Verchere et al 12,13.

Proteínas integrales de membrana representan hasta el 30% de los genes codificados en genomas eucariotas. Comparten papeles fundamentales como el mantenimiento de la puerta (receptores), el transporte de nutrientes, iones o compuestos nocivos (transportistas) o el mantenimiento de la permeabilidad a través de bicapas de membrana (canales) entre todas las células vivas 1. Bombas de eflujo tener un papel central en la resistencia contra la terapia con antibióticos 2. En las bacterias Gram-negativas Pseudomonas aeruginosa, que está protegido por una membrana externa, transportadores de salida están organizados como sistemas tripartitos donde MexB, la bomba de salida situada en la membrana interna, que trabaja en conjunto con MexA, una proteína periplásmica y OprM, un canal de membrana externa. La proteína de la membrana citoplasmática interna actúa como una bomba dependiente de energía con amplia especificidad de sustrato. La proteína de membrana externa actúa como una porina mientras que la tercera se encuentra en el espacio periplásmico y se piensa para estabilizar todo el complejo <shasta&gt; 3. A continuación, nos centramos en el diseño de un ensayo funcional para el montaje MexA MexB. La información estructural se ha acumulado en los últimos 5 años, gracias a la determinación de rayos X de la AcrB proteína homóloga a partir de Escherichia coli 4-7. Aunque es claramente importante para acoplar dicha información con datos dinámicos y cinéticos, el diseño de un ensayo funcional para este transportador es un verdadero reto 8. De hecho, las proteínas de la membrana se debe mantener en un ambiente membranosa y un compartimiento cerrado deben mantenerse durante un transporte vectorial del sustrato que se ha logrado. La reconstitución de proteínas de membrana en proteoliposomas ha sido ampliamente presentado y revisado (véase Rigaud y Levy 9). Dichos protocolos permiten la monitorización de la actividad de proteínas de membrana, por ejemplo siguiendo los sustratos a través de la membrana del liposoma. En este caso limitaciones surgen a partir de la unaISPONIBILIDAD de sustratos titulable (fluorescente, radioactivo, etc.) y del hecho de que muy a menudo estos sustratos son hidrófobos y tienen una tendencia a cruzar membranas independientemente de la presencia del transportador. Como alternativa, se puede seguir las variaciones espectroscópicas de un colorante de informes sensible a los cambios químicos que ocurren como consecuencia de transporte. Como se indicó anteriormente, los protones energizan el transporte a través de MexB. Por lo tanto, una opción relevante es monitorear las variaciones espectroscópicas de un colorante sensible al pH de informes para seguir las variaciones del pH debido al transporte de sustrato de protones impulsados. La elección de un colorante fluorescente evita cualquier efecto de artefactos debido a la naturaleza hidrofóbica del sustrato. Una dificultad adicional es la generación de un gradiente de protones. Varios protocolos se pueden encontrar en la literatura. Entre ellos, el uso de la técnica de valinomicina es generalizada pero hemos demostrado que es tedioso para llevar a cabo 10-11. Además, esno reproducible y no es reversible. Hemos recurrido a la utilización de bacteriorhodopsin (BR), una bomba de protones activada por la luz de Halobacter Salinarium, un archaeon halófilas gramnegativos marina obligado aeróbico. Esta proteína se coreconstituted en liposomas con MexB y, tras la iluminación, BR bombas de protones dentro de los liposomas y por lo tanto crea la ΔpH (ácida en el interior) que necesita la proteína para transportar el sustrato 12-13.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1051">
	<tbody>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:363px;">DOPC (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)</td>
			<td style="width:344px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:344px;">850375C</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:363px;">Cholesterol</td>
			<td style="width:344px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">C8667</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:363px;">Hoechst 33342</td>
			<td style="width:344px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">B2261</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:363px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:344px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">93427</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:363px;">Valinomycin</td>
			<td style="width:344px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:344px;">V-1644</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:363px;">Pyranine (8-hydroxypyrene-1,3,6-trisulphonic acid)</td>
			<td style="width:344px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:344px;">H-348</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:363px;">DDM (n-Dodecyl-&#946;-D-maltopyranoside)</td>
			<td style="width:344px;">Affymetrix</td>
			<td style="width:344px;">D310LA</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:363px;">Extruder kit (extruder, Hamilton gas-tight syringes)</td>
			<td style="width:344px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:344px;">610000</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:363px;">Biobeads SM-2 Adsorbents</td>
			<td style="width:344px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:344px;">152-3920</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:363px;">Econo-Pac Chromatography empty column</td>
			<td style="width:344px;">Biorad</td>
			<td style="width:344px;">732-1010</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:363px;">Desalting columns</td>
			<td style="width:344px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:344px;">54805</td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:363px;">Dynamic light scattering instrument</td>
			<td style="width:344px;">Wyatt Technology</td>
			<td style="width:344px;">DynaPro NanoStar</td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:363px;">Fluorometer JASCO FP-6200</td>
			<td style="width:344px;">JASCO</td>
			<td style="width:344px;">6816-J002A</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro investigation of the mexab efflux pump from pseudomonas aeruginosa

Hay una necesidad científica emergente de herramientas confiables para el monitoreo de las proteínas de transporte de membrana. Se presenta una metodología que conduce a la reconstitución de las bombas de eflujo de la bacterias Gram-negativos Pseudomonas aeruginosa en un entorno biomimético que permite una investigación precisa de su actividad de transporte. Tres requisitos previos se cumplen: la compartimentación en un entorno lipídico, el uso de un índice relevante para el transporte, y la generación de un gradiente de protones. El transportador de proteína de la membrana se reconstituye en liposomas junto con bacteriorhodopsin, una bomba de protones activada por la luz que genera un gradiente de protones que es robusta y reversible y ajustable. La actividad de la proteína se deduce de las variaciones del pH que ocurren dentro del liposoma, usando pyranin, una sonda fluorescente dependiente del pH. Se describe un procedimiento paso a paso en el que la purificación de proteínas de membrana, la formación del liposoma, la reconstitución de proteínas, y el transporte de unanálisis se abordan. A pesar de que se han diseñado específicamente para un transportador de RND, los métodos descritos potencialmente podrían ser adaptados para su uso con cualquier otro transportador de proteína de la membrana activado por un gradiente de protones.

El ensayo consiste en el seguimiento de fluorescencia piranina como una función de tiempo, mientras se genera un gradiente de protones. Para ese fin, las muestras se sometan a la iluminación (de bombeo de protones, por tanto, por la BR se activa) y luego a la medición de fluorescencia utilizando la excitación y emisión de longitudes de onda de piranina (λ ex = 455 nm y λ em = 509 nm). La figura 1 muestra un control representante obtenidos con el ensayo, en ausencia de MexA / MexB, la verificación de que el gradiente de protones generado por la BR es reversible. Después de un ciclo de la acidificación, proteoliposomas se mantienen en la oscuridad durante 45 min para que la BR para detener el bombeo de protones (protones se difunden lentamente y de forma pasiva a través de las bicapas de lípidos después de su gradiente de concentración). Después de este tiempo de recuperación, la activación de la BR es posible, simplemente mediante la iluminación de la misma suspensión de nuevo. Figura 2corresponde a una medición real de transporte. Un control negativo con proteína liposomas gratuitas muestra que, como era de esperar, el pH es constante tras la iluminación (Figuras 2A y 2B, círculos de color naranja). Sin embargo, proteoliposomas que contienen BR en sus membranas no la bomba de protones, por lo tanto el pH dentro de las disminuciones de liposomas y un gradiente estable se construye (Figuras 2A y 2B, casillas de color púrpura). Triángulos grises y diamantes rojos (Figura 2A) representan pH en el interior de proteoliposomas que contienen BR y MexB, en presencia o en ausencia de Hoechst 33342, respectivamente. Observamos una actividad de sustrato independiente donde el gradiente de protones es sólo parcialmente disipada por MexB contra-transporte. Atribuimos esta observación a una actividad basal de MexB. Con el fin de probar el efecto de MexA sobre la actividad de MexB, MexA se añadió a la reconstitución, primero en la ausencia de cualquier sustrato ( <strong&gt; Figura 2B, los diamantes azules). Una vez más, el gradiente de protones generado por la BR está sólo parcialmente disipada. La medición real de transporte se realiza en la misma muestra. De antemano, el gradiente de protones debe ser reinicializado y el sustrato se debe añadir en la suspensión con el fin de llegar a su sitio de unión en la proteína. Para este fin, la suspensión se incuba en la oscuridad en la presencia del substrato durante 45 min. Después de la iluminación posterior, se puede ver que el gradiente de protones generado por la BR está ahora totalmente disipada por MexAB (Figura 2B, triángulos verdes), como consecuencia del transporte de sustrato por la bomba. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50894/50894fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50894/50894fig1.jpg" /> . Figura 1 Reversibilidad del gradiente de protones construido por la iluminación BR: piranina FLuorescencia de proteoliposomas BR medidos como una función de tiempo. De 0 a 15 min, BR bombea protones como resultado de la activación de la luz. De 15 a 60 min, proteoliposomas se incuban en la oscuridad, durante este tiempo, los protones se mueven pasivamente de los liposomas hasta que el pH intravesicular y pH extravesicular son iguales. De 60 a 75 min, BR sigue siendo funcional y bombas de protones sobre la iluminación. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50894/50894fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50894/50894fig2.jpg" /> . Figura 2 Transporte de ensayo: piranina de fluorescencia, convierte a las variaciones de pH correspondientes, como una función del tiempo A) pH en el interior de los liposomas de control (círculos de color naranja); pH en el interior de proteoliposomas que contienen BR en la membrana (cuadrados de color púrpura); pH en el interior. de proteoliposomas contienen BR y MexB en la membrana sin Hoechst 33342 (d rojoiamonds); pH en el interior de proteoliposomas contienen BR y MexB en la membrana con Hoechst 33342 (triángulos grises) B) pH en el interior de los liposomas de control (círculos naranjas);. pH en el interior de proteoliposomas contienen BR en la membrana (casillas de color púrpura); pH en el interior de proteoliposomas contienen BR, MexB y MexA en la membrana sin Hoechst 33342 (diamantes azules); pH en el interior de proteoliposomas contienen BR, MexB y MexA en la membrana con Hoechst 33342 (triángulos verdes).

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In vitro Investigation of the MexAB Efflux Pump From Pseudomonas aeruginosa

Se presenta un protocolo para la investigación in vitro de bombas de expulsión de Pseudomonas aeruginosa. Este protocolo permite la generación de un gradiente de protones robusta, reversible y ajustable dentro de la membrana de los liposomas y por lo tanto debe ser adaptable a cualquier proteína de la membrana activado por la fuerza protomotive.

In vitro Investigación de la bomba de salida MexAB De Pseudomonas aeruginosa

There is an emerging scientific need for reliable tools for monitoring membrane protein transport. We present a methodology leading to the reconstitution ...

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Research

JoVE Journal

Biology

In vitro Investigation of the MexAB Efflux Pump From Pseudomonas aeruginosa

11.8K vistas.  CNRS & Université Paris Descartes.  Se presenta un protocolo para la investigación in vitro de bombas de expulsión de Pseudomonas aeruginosa. Este protocolo permite la generación de un gradiente de protones robusta, reversible y ajustable dentro de la membrana de los liposomas y por lo tanto debe ser adaptable a cualquier proteína de la membrana activado por la fuerza protomotive. 

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In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

En la reconstitución in vitro de los activos T. castaneum telomerasa

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Investigación

Biología

Rapid Generation of Amyloid from Native Proteins In vitro

Proteins carry out crucial tasks in organisms by exerting functions elicited from their specific three dimensional folds. Although the native structures of polypeptides fulfill many purposes, it is now recognized that most proteins can adopt an alternative assembly of beta-sheet rich amyloid. Insoluble amyloid fibrils are initially associated with multiple human ailments, but they are increasingly shown as functional players participating in various important cellular processes. In addition, amyloid deposited in patient tissues contains nonproteinaceous components, such as nucleic acids and glycosaminoglycans (GAGs). These cofactors can facilitate the formation of amyloid, resulting in the generation of different types of insoluble precipitates. By taking advantage of our understanding how proteins misfold via an intermediate stage of soluble amyloid precursor, we have devised a method to convert native proteins to amyloid fibrils in vitro. This approach allows one to prepare amyloid in large quantities, examine the properties of amyloid generated from specific proteins, and evaluate the structural changes accompanying the conversion.

Rapid Generation of Amyloid from Native Proteins In vitro

Proteins can either adopt a native structure or misfold into insoluble amyloid. Conditions that favor the misfolding pathway lead to the formation of different types of amyloid fibrils. The methods described here allow rapid conversion of native proteins into amyloid in vitro.

Proteins carry out crucial tasks in organisms by exerting functions elicited from their specific three dimensional folds. Although the native structures ...

MALDI-Mass Spectrometric Imaging for the Investigation of Metabolites in Medicago truncatula Root Nodules

Most techniques used to study small molecules, such as pharmaceutical drugs or endogenous metabolites, employ tissue extracts which require the homogenization of the tissue of interest that could potentially cause changes in the metabolic pathways being studied1. Mass spectrometric imaging (MSI) is a powerful analytical tool that can provide spatial information of analytes within intact slices of biological tissue samples1-5. This technique has been used extensively to study various types of compounds including proteins, peptides, lipids, and small molecules such as endogenous metabolites. With matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI)-MSI, spatial distributions of multiple metabolites can be simultaneously detected. Herein, a method developed specifically for conducting untargeted metabolomics MSI experiments on legume roots and root nodules is presented which could reveal insights into the biological processes taking place. The method presented here shows a typical MSI workflow, from sample preparation to image acquisition, and focuses on the matrix application step, demonstrating several matrix application techniques that are useful for detecting small molecules. Once the MS images are generated, the analysis and identification of metabolites of interest is discussed and demonstrated. The standard workflow presented here can be easily modified for different tissue types, molecular species, and instrumentation.

MALDI-Mass Spectrometric Imaging for the Investigation of Metabolites in Medicago truncatula Root Nodules

Mass spectrometric imaging (MSI) is a powerful tool that can be used to discover and identify various chemical species in intact tissues, preserving the compounds in their native environments, which can provide new insights into biological processes. Herein a MSI method developed for the analysis of small molecules is described.&#160;

Imaging MALDI espectrometría de masas para la Investigación de metabolitos en<em&gt; Medicago truncatula</em&gt; nódulos de las raíces

Most techniques used to study small molecules, such as pharmaceutical drugs or endogenous metabolites, employ tissue extracts which require the ...

Synchronization of Caulobacter Crescentus for Investigation of the Bacterial Cell Cycle

The cell cycle is important for growth, genome replication, and development in all cells. In bacteria, studies of the cell cycle have focused largely on unsynchronized cells making it difficult to order the temporal events required for cell cycle progression, genome replication, and division. Caulobacter crescentus provides an excellent model system for the bacterial cell cycle whereby cells can be rapidly synchronized in a G0 state by density centrifugation. Cell cycle synchronization experiments have been used to establish the molecular events governing chromosome replication and segregation, to map a genetic regulatory network controlling cell cycle progression, and to identify the establishment of polar signaling complexes required for asymmetric cell division. Here we provide a detailed protocol for the rapid synchronization of Caulobacter NA1000 cells. Synchronization can be performed in a large-scale format for gene expression profiling and western blot assays, as well as a small-scale format for microscopy or FACS assays. The rapid synchronizability and high cell yields of Caulobacter make this organism a powerful model system for studies of the bacterial cell cycle.

Synchronization of Caulobacter Crescentus for Investigation of the Bacterial Cell Cycle

Synchronization of bacterial cells is essential for studies of the bacterial cell cycle and development. Caulobacter crescentus is synchronizable through density centrifugation allowing a rapid and powerful tool for studies of the bacterial cell cycle. Here we provide a detailed protocol for the synchronization of Caulobacter cells.

Sincronización de<em&gt; Caulobacter crescentus</em&gt; Para la Investigación del Ciclo Celular Bacteriana

The cell cycle is important for growth, genome replication, and development in all cells.  In bacteria, studies of the cell cycle have focused largely on ...

Contractility Measurements on Isolated Papillary Muscles for the Investigation of Cardiac Inotropy in Mice

Papillary muscle isolated from adult mouse hearts can be used to study cardiac contractility during different physiological/pathological conditions. The contractile characteristics can be evaluated independently of external influences such as vascular tonus or neurohumoral status. It depicts a scientific approach between single cell measurements with isolated cardiac myocytes and in vivo studies like echocardiography. Thus, papillary muscle preparations serve as an excellent model to study cardiac physiology/pathophysiology and can be used for investigations like the modulation by pharmacological agents or the exploration of transgenic animal models. Here, we describe a method of isolating the murine left anterior papillary muscle to investigate cardiac contractility in an organ bath setup. In contrast to a muscle strip preparation isolated from the ventricular wall, the papillary muscle can be prepared in toto without damaging the muscle tissue severely. The organ bath setup consists of several temperature-controlled, gassed and electrode-equipped organ bath chambers. The isolated papillary muscle is fixed in the organ bath chamber and electrically stimulated. The evoked twitch force is recorded using a pressure transducer and parameters such as twitch force amplitude and twitch kinetics are analyzed. Different experimental protocols can be performed to investigate the calcium- and frequency-dependent contractility as well as dose-response curves of contractile agents such as catecholamines or other pharmaceuticals. Additionally, pathologic conditions like acute ischemia can be simulated.

Murine left ventricular papillary muscle can be used to investigate cardiac contractility in vitro. This article describes in detail the isolation and experimental protocols to study cardiac contractile characteristics.

Contractilidad Mediciones en músculos papilares aislados para la Investigación de Cardíaca inotropía en ratones

Papillary muscle isolated from adult mouse hearts can be used to study cardiac contractility during different physiological/pathological conditions. The ...

Improving the Accuracy of Flow Cytometric Assessment of Mitochondrial Membrane Potential in Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Through the Inhibition of Efflux Pumps

As cellular metabolism is a key regulator of hematopoietic stem cell (HSC) self-renewal, the various roles played by the mitochondria in hematopoietic homeostasis have been extensively studied by HSC researchers. Mitochondrial activity levels are reflected in their membrane potentials (&#916;&#936;m), which can be measured by cell-permeant cationic dyes such as TMRM (tetramethylrhodamine, methyl ester). The ability of efflux pumps to extrude these dyes from cells can limit their usefulness, however. The resulting measurement bias is particularly critical when assessing HSCs, as xenobiotic transporters exhibit higher levels of expression and activity in HSCs than in differentiated cells. Here, we describe a protocol utilizing Verapamil, an efflux pump inhibitor, to accurately measure &#916;&#936;m across multiple bone marrow populations. The resulting inhibition of pump activity is shown to increase TMRM intensity in hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs), while leaving it relatively unchanged in mature fractions. This highlights the close attention to dye-efflux activity that is required when &#916;&#936;m-dependent dyes are used, and as written and visualized, this protocol can be used to accurately compare either different populations within the bone marrow, or the same population across different experimental models.

Xenobiotic efflux pumps are highly active in hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and cause extrusion of TMRM, a mitochondrial membrane potential fluorescent dye. Here, we present a protocol to accurately measure mitochondrial membrane potential in HSPCs by TMRM in the presence of Verapamil, an efflux pump inhibitor.

Mejorar la precisión de la evaluación citométrica de flujo del potencial de la membrana mitocondrial en células hematopoyéticas de tallo y progenitor a través de la inhibición de las bombas de eflujo

As cellular metabolism is a key regulator of hematopoietic stem cell (HSC) self-renewal, the various roles played by the mitochondria in hematopoietic ...

Nuclei Isolation from Adult Mouse Kidney for Single-Nucleus RNA-Sequencing

The kidneys regulate diverse biological processes such as water, electrolyte, and acid-base homeostasis. Physiological functions of the kidney are executed by multiple cell types arranged in a complex architecture across the corticomedullary axis of the organ. Recent advances in single-cell transcriptomics have accelerated the understanding of cell type-specific gene expression in renal physiology and disease. However, enzyme-based tissue dissociation protocols, which are frequently utilized for single-cell RNA-sequencing (scRNA-seq), require mostly fresh (non-archived) tissue, introduce transcriptional stress responses, and favor the selection of abundant cell types of the kidney cortex resulting in an underrepresentation of cells of the medulla.
Here, we present a protocol that avoids these problems. The protocol is based on nuclei isolation at 4 &#176;C from frozen kidney tissue. Nuclei are isolated from a central piece of the mouse kidney comprised of the cortex, outer medulla, and inner medulla. This reduces the overrepresentation of cortical cells typical for whole-kidney samples for the benefit of medullary cells such that data will represent the entire corticomedullary axis at sufficient abundance. The protocol is simple, rapid, and adaptable and provides a step towards the standardization of single-nuclei transcriptomics in kidney research.

Here, we present a protocol to isolate high-quality nuclei from frozen mouse kidneys that improve the representation of medullary kidney cell types and avoids the gene expression artifacts from enzymatic tissue dissociation.

Aislamiento de núcleos de riñón de ratón adulto para secuenciación de ARN de un solo núcleo

The kidneys regulate diverse biological processes such as water, electrolyte, and acid-base homeostasis. Physiological functions of the kidney are ...

Isolation of Cardiac and Vascular Smooth Muscle Cells from Adult, Juvenile, Larval and Embryonic Zebrafish for Electrophysiological Studies

Zebrafish have long been used as a model vertebrate organism in cardiovascular research. The technical difficulties of isolating individual cells from the zebrafish cardiovascular tissues have been limiting in studying their electrophysiological properties. Previous methods have been described for dissection of zebrafish hearts and isolation of ventricular cardiac myocytes. However, the isolation of zebrafish atrial and vascular myocytes for electrophysiological characterization was not detailed. This work describes new and modified enzymatic protocols that routinely provide isolated juvenile and adult zebrafish ventricular and atrial cardiomyocytes, as well as vascular smooth muscle (VSM) cells from the bulbous arteriosus, suitable for patch-clamp experiments. There has been no literary evidence of electrophysiological studies on zebrafish cardiovascular tissues isolated at embryonic and larval stages of development. Partial dissociation techniques that allow patch-clamp experiments on individual cells from larval and embryonic hearts are demonstrated.

The present protocol describes the acute isolation of viable cardiac and vascular smooth muscle cells from adult, juvenile, larval, and embryonic zebrafish (Danio rerio), suitable for electrophysiological studies.

Aislamiento de células musculares lisas cardíacas y vasculares de peces cebra adultos, juveniles, larvales y embrionarios para estudios electrofisiológicos

Zebrafish have long been used as a model vertebrate organism in cardiovascular research. The technical difficulties of isolating individual cells from the ...

Single-Cell Analysis of the Expression of Pseudomonas syringae Genes within the Plant Tissue

A plethora of pathogenic microorganisms constantly attack plants. The Pseudomonas syringae species complex encompasses Gram-negative plant-pathogenic bacteria of special relevance for a wide number of hosts. P. syringae enters the plant from the leaf surface and multiplies rapidly within the apoplast, forming microcolonies that occupy the intercellular space. The constitutive expression of fluorescent proteins by the bacteria allows for visualization of the microcolonies and monitoring of the development of the infection at the microscopic level. Recent advances in single-cell analysis have revealed the large complexity reached by clonal isogenic bacterial populations. This complexity, referred to as phenotypic heterogeneity, is the consequence of cell-to-cell differences in gene expression (not linked to genetic differences) among the bacterial community. To analyze the expression of individual loci at the single-cell level, transcriptional fusions to fluorescent proteins have been widely used. Under stress conditions, such as those occurring during colonization of the plant apoplast, P. syringae differentiates into distinct subpopulations based on the heterogeneous expression of key virulence genes (i.e., the Hrp type III secretion system). However, single-cell analysis of any given P. syringae population recovered from plant tissue is challenging due to the cellular debris released during the mechanical disruption intrinsic to the inoculation and bacterial extraction processes. The present report details a method developed to monitor the expression of P. syringae genes of interest at the single-cell level during the colonization of Arabidopsis and bean plants. The preparation of the plants and the bacterial suspensions used for inoculation using a vacuum chamber are described. The recovery of endophytic bacteria from infected leaves by apoplastic fluid extraction is also explained here. Both the bacterial inoculation and bacterial extraction methods are empirically optimized to minimize plant and bacterial cell damage, resulting in bacterial preparations optimal for microscopy and flow cytometry analysis.

Single-Cell Analysis of the Expression of Pseudomonas syringae Genes within the Plant Tissue

The present protocol describes a method that allows single-cell gene expression analysis on Pseudomonas syringae populations grown within the plant apoplast.

Análisis unicelular de la expresión de genes de Pseudomonas syringae dentro del tejido vegetal

A plethora of pathogenic microorganisms constantly attack plants. The Pseudomonas syringae species complex encompasses Gram-negative plant-pathogenic ...

Investigación del mecanismo de transporte de zinc en células de mamíferos con el ensayo FluoZin-3

Characterizing Mammalian Zinc Transporters Using an In Vitro Zinc Transport Assay

Transition metals such as Zn2+ ions must be tightly regulated due to their cellular toxicity. Previously, the activity of Zn2+ transporters was measured indirectly by determining the expression level of the transporter under different concentrations of Zn2+. This was done by utilizing immunohistochemistry, measuring mRNA in the tissue, or determining the cellular Zn2+ levels. With the development of intracellular Zn2+ sensors, the activities of zinc transporters are currently primarily determined by correlating changes in intracellular Zn2+, detected using fluorescent probes, with the expression of the Zn2+ transporters. However, even today, only a few labs monitor dynamic changes in intracellular Zn2+ and use it to measure the activity of zinc transporters directly. Part of the problem is that out of the 10 zinc transporters of the ZnT family, except for ZnT10 (transports manganese), only zinc transporter 1 (ZnT1) is localized at the plasma membrane. Therefore, linking the transport activity to changes in the intracellular Zn2+ concentration is hard. This article describes a direct way to determine the zinc transport kinetics using an assay based on a zinc-specific fluorescent dye, FluoZin-3. This dye is loaded into mammalian cells in its ester form and then trapped in the cytosol due to cellular di-esterase activity. The cells are loaded with Zn2+ by utilizing the Zn2+ ionophore pyrithione. The ZnT1 activity is assessed from the linear part of the reduction in fluorescence following the cell washout. The fluorescence measured at an excitation of 470 nm and emission of 520 nm is proportional to the free intracellular Zn2+. Selecting the cells expressing ZnT1 tagged with the mCherry fluorophore allows for monitoring only the cells expressing the transporter. This assay is used to investigate the contribution of different domains of ZnT1 protein to the transport mechanism of human ZnT1, a eukaryotic transmembrane protein that extrudes excess zinc from the cell.

Autor destacado: Explorando la regulación celular del zinc a través de la funcionalidad de ZnT1 

Zinc transport has proven challenging to measure due to the weak causal links to protein function and the low temporal resolution. This protocol describes a method for monitoring, with high temporal resolution, Zn2+ extrusion from living cells by utilizing a Zn2+ sensitive fluorescent dye, thus providing a direct measure of Zn2+ efflux.

Caracterización de transportadores de zinc en mamíferos mediante un ensayo de transporte de zinc in vitro

Transition metals such as Zn2+ ions must be tightly regulated due to their cellular toxicity. Previously, the activity of Zn2+ transporters was measured ...