본 연구는 직원은 국립 드 라 공들인 (프로젝트 ANR-2010-BLAN-1535)에 의해 지역 일 레드 프랑스 (DIM-Malinf 110058을)에서 부여에 의해 지원되었다.

1. 단백질 생산 및 정제 <ol><li> MEXA, 녹농균에서 MexB <ol><li> E.의 MEXA 및 MexB 유전자를 품고 플라스미드를 변환 콜라이 생산 균주 (예 C43 DE3). LB 한천 플레이트에 중간 적절한 항생제로 보충. O / N의 전 배양액을 접종하기 위해 하나의 식민지를 선택합니다. 다음 날 아침, LB의 1 L에 예비 배양을 접종하고 교반 (240 RPM)에서 37 ° C에서 성장한다. </li><li> 세포가 기하 급수적 단계에 도달하면 (OD 600 = 0.6 ~ 0.8)을 1 mM의 IPTG로 유도한다. 교반하면서 30 ℃에서 2 ~ 3 시간 동안 유도를 수행합니다. </li><li> 원심 분리기 세포 (20 분 9,000 XG) 30 ㎖의 트리스 - 염산하는 20 mM, pH가 8, 염화나트륨 150 mm 단위에 resuspend. </li><li> 프랑스 언론 (10,000 PSI, 4 패스)를 사용하여 세포를 방해. 20 분 동안 9,000 XG에서 원심 분리하여 손상되지 않은 세포 봉입체를 폐기하십시오. </li><li> 100,000 XG 및 R에서 펠렛 막 1 시간30 ㎖의 비스 - 트리스 10 mM의 pH를 7.4, 글리세롤 20 % (W / V), 이미 다졸 10 mM의 NaCl을 500 mM의 각 펠렛을 esuspend. </li><li> BCA 비색 분석을 사용하여 전체 막 단백질 농도를 결정하고 그 세제 이렇게 결정된 최종 부피 2 % 도데 실 말토 사이드 (DDM)로 막은 O / N을 가용화 : 단백질 (w / w) 1:1.5이다. </li><li> 비 가용화 및 집계 자료를 폐기하는 1 시간 동안 10 만 XG에 초 원심 분리기. </li><li> 니켈 수지 (MEXA 정화) 또는 비스 - 트리스 10 mM의 pH를 7.4, 글리세롤 5 % 평형 코발트 수지 (MexB 정화)와 4 ° C에서 2 시간 동안 상층 액을 품어 (W / V), 이미 다졸 10 밀리미터, 염화나트륨 500 밀리미터, DDM 0.2 %. </li><li> 빈 열에서 수지를 붓는다. 을 통해 흐름을 수집합니다. </li><li> 다음 비스 - 트리스 10 mM의 pH를 7.4, 글리세롤 20 % (W / V), 이미 다졸 10 mM의 NaCl을 500 밀리미터, DDM 0.2 %, 비스 - 트리스 10 mM의 pH를 6, 글리세롤 25 ㎖와 50 ㎖로 수지를 세척 5 % (W / V), 이미 다졸 10 mM의 NaCl을 500 밀리미터, DDM 0.2 %. </li><li> P 용출20 ㎖ 비스 - 트리스 10 mM의 pH를 7.4, 글리세롤 5 % (W / V), 이미 다졸 300 mM의 NaCl을 500 밀리미터, DDM은 0.2 %로 rotein. </li><li> 이미 다졸없는 버퍼 평형 탈염 컬럼에 3 ㎖ 및 부하에 이르기까지 한외 여과 장치로 단백질을 집중한다. 그냥 재구성하기 전에 (아래 참조), 가용화 된 단백질 지질 및 unsolubilized 단백질을 제거하기 (20 분 10 XG)를 초 원심 분리기. 이어서 0.3 ml로 다시 농축 단백질. </li></ol></li><li> Halobacter의 salinarium에서 박테리오로돕신 <ol><li> 염화나트륨 4 M, 망초 150 밀리미터, 구연산 된 10 mM, KCl을 30 ㎜, 효모 추출물 5g / L에, 그리고 펩톤 5g / L을 함유하는 액체 성장 매체에 10 일 동안 37 ° C에서 조명 아래 Halobacter의 salinarium 세포를 성장 </li><li> 탈 이온수에 대해 투석에 의해 세포를 방해. </li><li> 30~40%에 보라색 막 (w / v)의 자당 기울기 (17 시간 동안 100,000 XG)를 정화. </li><li> 2 % octylgluc으로 막 현탁액을 가용화37 ° C (: 단백질의 비율을 2:1 (w / w) 세제에서 막을 재현 탁하기 위해 가용화를위한 볼륨)에서 24 시간 동안 oside. ε (570 NM) = 54,000 M -1 cm -1을 사용하여 가용화 BR의 농도를 추정한다. 그냥 재구성하기 전에 (아래 참조), 지질 및 unsolubilized 단백질을 제거하는 가용화 BR (20 분 10 XG)를 초 원심 분리기. 참고 : 기본 막은 자연스럽게 그래서 더 정제가 필요하지 않습니다 BR에 충실. </li></ol></li></ol> 2. Proteoliposomes의 준비 <ol><li> 리포좀 형성 : 유리 비커에 클로로포름 (25 ㎎ / ㎖)에 용해 DOPC 400 μl를 넣고 가루로 저장 콜레스테롤의 1.5 밀리그램을 추가합니다. 유리 비커에 적어도 1 시간 동안 단지 질소, 진공 스팀에서 조작하기 전에 건조. DOPC는 : 콜레스테롤 몰비는 3.3:1이다. <ol><li> 그들은 건조 후, HEPES 25 mM의 pH를 7 1 ㎖의 지질을 수화K 2 SO 4 100 ㎜, MgCl2를 2 ㎜, pyranine 2 ㎜. 서스펜션은이 단계에서 혼탁이 나타납니다. </li><li> 37 ℃에서 10 분 동안 용액을 가열 30 초 펄스, 실온에서 30 초 일시 정지 사이클 40 W에서 10 분 동안 초음파 처리. 서스펜션은이 단계에서 분명히 나타납니다. </li><li> 리포좀의 단 분산 인구를 얻으려면, 압출의 2주기를 수행하고 각주기에, 적어도 11 배 필터를 통해 리포좀 현탁액을 전달합니다. 첫번째주기를 들어 200 ㎚의 막 공극 크기를 사용하고 제 2 사이클에 대한 100 ㎚의 막 공극 크기를 사용한다. 동적 광산란 측정은 현탁액의 균질성을 확인하기 위해이 단계에서 수행 될 수있다. </li></ol></li><li> 단백질 결합 원리 : 막 단백질은 세제의 용해 효과 리포좀 덕분에 재구성 할 수 있습니다. 세제 용해 리포좀은 P의 세제 용해 막 단백질과 형성과 배양roteoliposomes 폴리스티렌 비즈 9와 세제의 신속한 제거에 의해 트리거됩니다. <ol><li> 트리톤 X-100 (최종 0.56 %)의 28 밀리그램을 추가하고 4 ° C (용해 온도는 단백질이 연구되고 적용 할 수 있습니다)에 O / N을 품어. </li><li> 가용화 된 리포좀에 세제 용해 단백질 (BR, MexB 및 MEXA)를 추가하고 4 ℃에서 15 분 알을 품다 지질 / MexB = 20, MexB / MEXA = 2.5, 지질 / BR = 30 : 다음의 비율 (W / W)에서의 가용화 리포좀 현탁액에 단백질을 추가합니다. </li><li> (정제 된 단백질을 첨가 세제를 포함한 세제의 총 중량을 고려하여 W / W,,) 세제 비율을 부드러운에서 RT에 (때문에 BR의) 어둠 속에서 5 시간을 품어 : 30:1 구슬에 폴리스티렌 비즈를 추가 교반. 이전 절차에, 메탄올, 에탄올 배양과 biobeads을 활성화하고 광범위하게 물로 씻을 것. </li><li> PD-10을 사용하여 proteoliposomes 단백질과 무료 기판을 정화HEPES 25 mM의 pH를 7, K 2 평형 탈염 열 SO 4 100 ㎜, MgCl2를 2 ㎜. </li><li> 최대 2 ~ 3 주 동안 어둠 속에서 18 ° C에서 proteoliposomes을 저장합니다. </li></ol></li><li> 자당 기울기의 재구성 효능 평가. MexB 및 BR 모두 리포좀에 재구성되어 있는지 확인하기 위해 불연속 자당 기울기에 proteoliposome 서스펜션을 정화. <ol><li> 부드럽게 자당의 5 층 구배에 proteoliposomes 정착 (60 %, 20 %, 10 %, 5 %, 2.5 %, w / v). </li><li> (최소한의 가속 및 감속 속도로) 10 XG에 17 시간 동안 초 원심 분리기. </li><li> 조심스럽게 다양한 그라데이션 분수 (자당의 각 층 사이, 특히 인터페이스)를 수집하고 쿠마시 염색 또는 웨스턴 블롯을 사용하여 SDS-PAGE (10 %)에이를 분석 할 수 있습니다. nonincorporated, 세제 용해 단백질의 맨 위에있는 동안 집계 된 단백질은 튜브의 하단에서 찾을 수 있습니다관. Proteoliposomes와 리포좀은 자신의 고유 밀도에 해당 자당 인터페이스에서 찾을 수 있습니다. 빈 리포솜은 proteoliposomes보다 그래디언트에서 멀리까지 복구됩니다. </li></ol></li></ol> 3. 형광 측정 <ol><li> 이중 파장 측정을 위해 허용하는 분광 (크세논 (Xe) 램프 150 W)를 사용하여 25.0 ° C에서 형광 측정을 수행합니다. 대체 조명 기간 (550 ㎚ / 550 ㎚의 여기 / 방출 파장 BR을 활성화하기 위해) 및 pyranine 형광을 측정하는 2 초 동안 455 ㎚ / 509 ㎚의 여기 / 방출 파장의 형광 측정. 5 nm의 여기 및 방출 대역폭을 설정합니다. 역방향 막 전위 ΔΨ의 형성을 방지하기 위해 50 nm의 발리 노마 이신 (Valinomycin)의 존재하에 측정을 수행한다. 참고 : 사실, BR은 양성자 펌프 때문에, 외부보다 리포좀 내부에 긍정적 인 책임이있다. 이 책임그라데이션은 K + 선택적 이온 운반체 인, 발리 노마 이신 (Valinomycin) 사용하여 삭제 할 수 있습니다. 일단 리포좀 현탁액에 첨가 발리 노마 이신 (Valinomycin), 소수성 분자로서, 리포솜 막에 삽입 수동적 K + 수송, 따라서 막 전위 ΔΨ을 방산한다. </li></ol>

<ol>
	<li>Granseth, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+protein+structural+biology+-+How+far+can+the+bugs+take+us?+(Review).">Membrane protein structural biology - How far can the bugs take us? (Review).</a> Molecular Membrane Biology. 24 (5-6), 329 (2007).</li><li>Nikaido, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multidrug+resistance+in+bacteria.">Multidrug resistance in bacteria.</a> Annu Rev Biochem. 78, 119 (2009).</li><li>Pos, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+transport+mechanism+of+the+AcrB+efflux+pump.">Drug transport mechanism of the AcrB efflux pump.</a> Biochim Biophys Acta. 1794 (5), 782 (2009).</li><li>Murakami, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structures+of+a+multidrug+transporter+reveal+a+functionally+rotating+mechanism.">Crystal structures of a multidrug transporter reveal a functionally rotating mechanism.</a> Nature. 443 (7108), 173 (2006).</li><li>Seeger, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+Asymmetry+of+AcrB+Trimer+Suggests+a+Peristaltic+Pump+Mechanism.">Structural Asymmetry of AcrB Trimer Suggests a Peristaltic Pump Mechanism.</a> Science. 313 (5791), 1295 (2006).</li><li>Sennhauser, G., Bukowska, M. A., Briand, C., Grutter, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+multidrug+exporter+MexB+from+Pseudomonas+aeruginosa.">Crystal structure of the multidrug exporter MexB from Pseudomonas aeruginosa.</a> J Mol Biol. 389 (1), 134 (2009).</li><li>Su, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+CusBA+heavy-metal+efflux+complex+of+Escherichia+coli.">Crystal structure of the CusBA heavy-metal efflux complex of Escherichia coli.</a> Nature. 470 (7335), (2011).</li><li>Nikaido, H., Takatsuka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+RND+multidrug+efflux+pumps.">Mechanisms of RND multidrug efflux pumps.</a> Biochim Biophys Acta. 1794 (5), 769 (2009).</li><li>Rigaud, J. L., Levy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+membrane+proteins+into+liposomes.">Reconstitution of membrane proteins into liposomes.</a> Methods in enzymology. 372, 65 (2003).</li><li>Aires, J. R., Nikaido, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aminoglycosides+are+captured+from+both+periplasm+and+cytoplasm+by+the+AcrD+multidrug+efflux+transporter+of+Escherichia+coli.">Aminoglycosides are captured from both periplasm and cytoplasm by the AcrD multidrug efflux transporter of Escherichia coli.</a> J Bacteriol. 187 (6), 1923 (2005).</li><li>Picard, M., Verchere, A., Broutin, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+the+active+transport+of+efflux+pumps+after+their+reconstitution+into+proteoliposomes:+caveats+and+keys.">Monitoring the active transport of efflux pumps after their reconstitution into proteoliposomes: caveats and keys.</a> Anal Biochem. 420 (2), 194 (2012).</li><li>Verchere, A., Dezi, M., Broutin, I., Picard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Methods+in+Protein+Purification+and+Analysis,+edited+by+iConcept+Press.">Basic Methods in Protein Purification and Analysis, edited by iConcept Press.</a> , (2012).</li><li>Verchere, A., Broutin, I., Picard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photo-induced+proton+gradients+for+the+in+vitro+investigation+of+bacterial+efflux+pumps.">Photo-induced proton gradients for the in vitro investigation of bacterial efflux pumps.</a> Sci Rep. 2, 306 (2012).</li></ol>

공개 아무것도 없다.

우리는 막 단백질 수송 시금 위해 설계된 재구성 절차를 설명한다. 일단 설정되면, 단백질 재구성 절차는 매우 재현성 측정에 이르게한다. 그러나 단백질을 재구성에 대한 정확한 조건은 하나의 단백질에서 다른 다릅니다. 대부분 치료는 다음과 같은 매개 변수를 최적화주의해야합니다 : 정화 (순도 및 집계 자료의 부재)의 I) 품질, 세제 용해 단계 (수의 II)의 효율성, 낮은 CMC 세제 선호한다 그들이 얻을 쉽게 때문에 ) 제거; 세제 III) 탈착 (그것이 투석 단계와 폴리스티렌 비드의 사용을 결합하지만 이것은 탈착의 비율, 단백질의 후속 활동에 대한 중요한 매개 변수에 영향을 미칠 수있는 예를 들어 가능 심판을 [참조 15]); IV) 지질 재구성 (지질의 화학적 성질, 단백질 비율 추가적인 amphiph의 존재로 지질레스)는 다양하고 최적화해야합니다 중요한 매개 변수입니다. 또한 온도와 배양 시간이 모든 문제에 영향을 미칩니다. 품질 관리는 재구성 절차의 각 단계에 따라서 원시이다. 그것은 빠른 비파괴이며, 단지 마이크로 몰 범위의 농도에서 샘플 20 ㎕를 요구하기 때문에 이러한 관점에서, 빛의 산란이 매우 편리한 기술이다. 질적 (단백질이 실제로 리포좀 막에 포함됩니다)뿐만 아니라 정량 (얼마나 많은 단백질 한 리포좀의) : proteoliposomes가 형성되면 그것을 재구성의 체계적인 검증을 향해 길을 열기 때문에, 자당 기울기는 큰 도움도. 후자 정확하게 단백질 및 지질 농도를 측정함으로써 해결 될 것이다. 우리의 분석은 기판 자체의 적정에 의존하지 않으며, 이는 가능 인공적 수동적 확산에 대한 불안 고려 피할<html> 때문에 세포막의 소수성 분할에 분자. 분석은 모니터링 pH 변화에 대한 신뢰성 및 정량 조사로 pyranine의 속성을 이용한다. 우리의 결과는 양성자 구배 형성은 발리 노마 이신 (Valinomycin) (10)를 사용하여 실시 하였다 다른 프로 시저로 얻은 결과와 일치한다, 그러나 더 강력하고 재현성있게 구배 11. 또한, 양성자 구배 정확하게 단순히 (추가 세부 사항을 위해 Verchere 외. 12 참조) 버퍼의 농도를 변화시킴으로써 조정될 수있다. 제어 측정은 제 1 기판의 부재하에 수행되는 절차 (이는 단백질의 수동적 활동에 대한 액세스를 제공한다). 기판은 동일한 큐벳에 첨가 한 후 실제 세포막 단백질 수송 체 활성을 측정한다. 실험 진짜 비 모호, 기판 - 유도 결과로 간주 될 수 있기 때문 진정한 자산이다. 샘플을 조명하는 반응. 자동화 및 병렬화는 proteoliposome의 큰 배치를 준비 이루어져 것이다 트리거 때문에 ENT &quot;&gt; 프로토콜이 높은 매체 처리량 (예를 들어 96 - 웰 측정) 자동화에 적용 할 수 있으며, 96에서 분취 량을 디스 펜싱 - 웰 플레이트. 기판 (그리고 가능 억제제)을 첨가 할 것입니다 45 분 동안 어둠 속에서 부화 후 판은 마이크로 플레이트 리더에 조명 / pyranine 형광 측정주기를 실시 할 것입니다. 프로토콜에 대한 자세한 내용은 독자가 Verchere 등을 읽어 초대합니다. (12, 13)

완전한 막 단백질은 진핵 생물의 게놈에 인코딩 유전자의 30 %를 나타냅니다. 그들은 같은 게이트 유지 (수용체), 영양분, 이온 또는 유해 화합물 (트랜스 포터)을 운반 또는 모든 살아있는 세포 1 사이 막 이중층 (채널)에 걸쳐 투과성의 유지 등의 중추적 인 역할을 공유 할 수 있습니다. 유출은 항생제 치료 2에 대한 저항의 중심 역할을 펌프. 그람 음성 세균의 외막에 의해 보호되는 녹농균은, 유출 운송은 MexB, 내부 막에있는 유출 펌프, MEXA, 세포질 단백질과 OprM와 함께 작동 삼자 시스템으로 구성되어 있습니다 외막 채널. 세포질 내부 막 단백질은 광범위한 기질 특이성과 에너지에 의존하는 펌프 역할을합니다. 세번째는 주변 세포질 공간에 있으며, 전체 복합체를 안정화하는 것으로 생각되는 반면 외막 단백질 포린 역할 <s업&gt; 3. 이하에서, 우리는 MEXA MexB 조립체위한 기능적 어 세이의 설계에 초점을 맞춘다. 구조 정보는 대장균 4-7에서 상동 단백질 AcrB의 X-선 결정에 지난 5 년간의 감사를 통해 축적하고있다. 그것은 분명이 수송에 대한 기능 분석을 디자인하는 동적 운동 데이터를 몇 이러한 정보에 대한 중요하지만 진정한 도전 8입니다. 실제로, 막 단백질은 멤브레인 형 환경에서 유지되어야하고 폐쇄 구획 달성 될 기판의 vectorial 전송을 위해 유지되어야한다. proteoliposomes에 막 단백질의 재구성 광범위하게 (리고 레비 9 참조) 제시 및 검토되었다. 이러한 프로토콜은 리포솜 막을 가로 질러 기판을 다음 순서 인스턴스 막 단백질 활성의 모니터링을 허용. 이 경우 제한에서 발생적정 기판 vailability (형광 방사능, 등.)과 매우 자주 이러한 기질은 소수성과 관계없이 수송의 존재의 세포막을 통과하는 경향이있다는 사실에서. 다른 방법으로, 하나는 교통의 결과로 발생하는 화학 변화에 민감보고 염료의 광학적 변화를 볼 수 있습니다. 위에서 언급 한 바와 같이, 양자는 MexB를 통해 전송 전원을 공급. 따라서, 관련 옵션은 양성자 기반의 기판 이송으로 인한 산도의 변화를 수행 할 수있는 pH 민감성보고 염료의 분광 변화를 모니터하는 것입니다. 형광 염료의 선택은 기판의 소수성 성질에 따라 어떤 인공적 효과를 피한다. 추가적인 어려움 양성자 구배의 발생이다. 몇몇 프로토콜은 문헌에서 찾을 수있다. 그 중에서도 발리 노마 이신 (Valinomycin) 기술의 사용이 확대되고 있지만, 우리는 10-11을 수행하는 지루한 것으로 나타났습니다. 또한 그것은이다재현 할 수없는 그것은 되돌릴 수 없습니다. 우리는 박테리오로돕신 (BR), Halobacter의 salinarium에서 빛을 활성화 프로톤 펌프, 염성 해양 그람 음성 호기성 의무를 archaeon의 사용에 의지했다. 이 단백질은 조명에 따라, BR은 리포좀의 내부 양성자 펌프 따라서 기판 12-13을 수송하는 단백질을 필요로 (내부 산성) ΔpH를 생성, MexB와 리포좀에 coreconstituted된다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1051">
	<tbody>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:363px;">DOPC (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)</td>
			<td style="width:344px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:344px;">850375C</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:363px;">Cholesterol</td>
			<td style="width:344px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">C8667</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:363px;">Hoechst 33342</td>
			<td style="width:344px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">B2261</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:363px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:344px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">93427</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:363px;">Valinomycin</td>
			<td style="width:344px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:344px;">V-1644</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:363px;">Pyranine (8-hydroxypyrene-1,3,6-trisulphonic acid)</td>
			<td style="width:344px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:344px;">H-348</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:363px;">DDM (n-Dodecyl-&#946;-D-maltopyranoside)</td>
			<td style="width:344px;">Affymetrix</td>
			<td style="width:344px;">D310LA</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:363px;">Extruder kit (extruder, Hamilton gas-tight syringes)</td>
			<td style="width:344px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:344px;">610000</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:363px;">Biobeads SM-2 Adsorbents</td>
			<td style="width:344px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:344px;">152-3920</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:363px;">Econo-Pac Chromatography empty column</td>
			<td style="width:344px;">Biorad</td>
			<td style="width:344px;">732-1010</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:363px;">Desalting columns</td>
			<td style="width:344px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:344px;">54805</td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:363px;">Dynamic light scattering instrument</td>
			<td style="width:344px;">Wyatt Technology</td>
			<td style="width:344px;">DynaPro NanoStar</td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:363px;">Fluorometer JASCO FP-6200</td>
			<td style="width:344px;">JASCO</td>
			<td style="width:344px;">6816-J002A</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro investigation of the mexab efflux pump from pseudomonas aeruginosa

세포막 단백질 수송을 모니터링하기위한 신뢰할 수있는 도구에 대한 신흥 과학적 필요가있다. 우리는 교통의 자신의 활동에 대한 정확한 조사를 위해 할 수있는 생체 모방 환경에서 그람 음성 세균 녹농균에서 유출 펌프의 재구성에 이르는 방법을 제시한다. 세 가지 전제 조건이 충족 : lipidic 환경, 교통의 해당 인덱스의 사용, 양성자 기울기의 세대 격실. 세포막 단백질 전달체 함께 박테리오로돕신 견고한뿐만 아니라 가역적 및 가변 인 양성자 구배를 생성하고 광 - 활성화 프로톤 펌프 리포좀으로 재구성된다. 단백질의 활성은 pyranin, pH에 의존하는 형광 프로브를 이용하여, 리포솜 내에서 발생 산도 변화로부터 추론된다. 우리는 단계별 절차 세포막 단백질 정제, 리포좀 형성, 단백질 재구성 및 전송을 설명(분석)가 해결됩니다. 그들은 특별히 RND 수송을 위해 고안된 것이지만, 기술 된 방법은 잠재적 양성자 구배 통전 다른 세포막 단백질 수송 체와 함께 사용하기 위해 적응 될 수있다.

분석은 양성자 구배가 생성되는 동안 시간의 함수로서 pyranine 형광을 모니터로 구성된다. 그 목적을 위해 샘플 (트리거 BR에 의해 따라서 양성자 펌프) 조명을 선택적으로 실시 된 후 여기 및 방출 pyranine의 파장을 이용하여 측정, 형광하는 (λ 전 = 455 nm의 및 λ EM은 509 nm의 =). 도 1은 BR에 의해 생성 된 양성자 구배 가역적임을 확인, MEXA / MexB의 부재에, 상기 분석으로 얻은 대표적인 컨트롤을 나타낸다. 산성화의 1주기 완료 후, proteoliposomes는 양성자 (양성자가 농도 구배 다음과 같은 지질 이중층에 걸쳐 천천히 수동적으로 확산) 펌핑 중지 BR에 대한 순서로 45 분 동안 어둠에 보관됩니다. 이 복구 시간 후, BR의 활성화는 단순히 다시 같은 서스펜션 조명에 의해 가능합니다. 그림 2실제 전송 측정에 해당합니다. 단백질 자유로운 리포좀과 음성 대조군은 예상대로, pH가 (도 2a 및도 2b, 오렌지 서클) 조명시 일정하다는 것을 보여준다. 그러나, 세포막에 BR을 포함 proteoliposomes, 따라서 리포좀 감소 내부의 pH와 안정된 구배가 내장되어 있습니다 (그림 2A와 2B, 보라색 사각형) 양성자 펌프 않습니다. 회색 삼각형 레드 다이아몬드 (도 2A)는 각각 존재 또는 훽스트 33342의 부재하에, BR 및 MexB 함유 proteoliposomes 내부의 pH를 나타낸다. 우리는 양성자 기울기가 부분적으로 만 MexB 카운터 수송에 의해 방출되는 기판 독립적 인 활동을 관찰합니다. 우리는 MexB의 기초 활동이 관측 때문이다. MexB의 활성에 MEXA의 효과를 시험하기 위해, MEXA은 (제 어떠한 기판의 부재에서, 재구성에 첨가 <st룽&gt; 그림 2B, 블루 다이아몬드). 다시, BR에 의해 생성 된 양성자 구배는 단지 부분적으로 소모된다. 실제 전송 측정은 매우 동일한 샘플에 구현된다. 미리, 양성자 구배는 초기화되어야하며 상기 기판은 단백질의 결합 부위에 도달하기 위해 현탁액에 첨가되어야한다. 그 목적을 위하여 현탁액을 45 분 동안 기판의 존재하에 어둠 속에서 배양한다. 후속 조명하면, 하나는 펌프에 의해 기판 운반의 결과로서, BR에 의해 생성 된 양성자 구배는 이제 완전히 MexAB (도 2B, 녹색 삼각형)에 의해 손실되는 것을 볼 수있다. <img alt="그림 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50894/50894fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50894/50894fig1.jpg" /> . BR 조명에 의해 만들어진 양성자 기울기의 그림 1 가역성 : Pyranine 플로리다시간의 함수로서 측정 된 BR proteoliposomes의 uorescence. 0-15 분에서 BR 빛 활성화의 결과로 양성자 펌프. 15 ~ 60 분에서 proteoliposomes은 어둠 속에서 배양됩니다 intravesicular pH와 extravesicular pH가 동일 할 때까지이 시간 동안, 양자는 수동적으로 리포좀 밖으로 이동합니다. 60 ~ 75 분에서, BR은 여전히​​ 기능과 조명에 양성자 펌프. <img alt="그림 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50894/50894fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50894/50894fig2.jpg" /> .. 그림 2 교통 분석 : pyranine 형광, 시간의 함수 제어 리포좀 (주황색 동그라미)의 내부 A) pH가 해당 산도의 변화로 변환; 막에있는 BR (보라색 사각형)를 포함 proteoliposomes 내부의 pH, 산도 내부 훽스트 33342 (빨강 D없이 막에 BR 및 MexB를 포함 proteoliposomes의. iamonds) 훽스트 33342 (회색 삼각형) B 제어 리포좀 (주황색 동그라미)의 내부)의 pH와 막에있는 BR과 MexB를 포함 proteoliposomes 내부의 pH, 막 (보라색 사각형)에 BR을 포함 proteoliposomes 내부의 pH, 산도 내부 훽스트 33342 (블루 다이아몬드)없이 막에 BR, MexB 및 MEXA를 포함 proteoliposomes의, 훽스트 33342 (녹색 삼각형)와 막에 BR, MexB 및 MEXA를 포함 proteoliposomes 내부의 pH.

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In vitro Investigation of the MexAB Efflux Pump From Pseudomonas aeruginosa

우리는 녹농균에서 유출 펌프의 체외 조사에 대한 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜은 리포좀 막 내에서 강력한 가역 및 조정할 수있는 양성자 기울기의 생성을 허용하고 따라서 protomotive 힘에 의해 격려하는 막 단백질에 적용 할 수 있어야한다.

녹농균에서 MexAB 유출 펌프의 체외 조사

There is an emerging scientific need for reliable tools for monitoring membrane protein transport. We present a methodology leading to the reconstitution ...

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Research

JoVE Journal

Biology

In vitro Investigation of the MexAB Efflux Pump From Pseudomonas aeruginosa

11.8K 조회수.  CNRS & Université Paris Descartes.  우리는 녹농균에서 유출 펌프의 체외 조사에 대한 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜은 리포좀 막 내에서 강력한 가역 및 조정할 수있는 양성자 기울기의 생성을 허용하고 따라서 protomotive 힘에 의해 격려하는 막 단백질에 적용 할 수 있어야한다. 

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In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

활성 T.의 체외의 Reconstitution에서 castaneum의 Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

연구

생물학

Rapid Generation of Amyloid from Native Proteins In vitro

Proteins carry out crucial tasks in organisms by exerting functions elicited from their specific three dimensional folds. Although the native structures of polypeptides fulfill many purposes, it is now recognized that most proteins can adopt an alternative assembly of beta-sheet rich amyloid. Insoluble amyloid fibrils are initially associated with multiple human ailments, but they are increasingly shown as functional players participating in various important cellular processes. In addition, amyloid deposited in patient tissues contains nonproteinaceous components, such as nucleic acids and glycosaminoglycans (GAGs). These cofactors can facilitate the formation of amyloid, resulting in the generation of different types of insoluble precipitates. By taking advantage of our understanding how proteins misfold via an intermediate stage of soluble amyloid precursor, we have devised a method to convert native proteins to amyloid fibrils in vitro. This approach allows one to prepare amyloid in large quantities, examine the properties of amyloid generated from specific proteins, and evaluate the structural changes accompanying the conversion.

Rapid Generation of Amyloid from Native Proteins In vitro

Proteins can either adopt a native structure or misfold into insoluble amyloid. Conditions that favor the misfolding pathway lead to the formation of different types of amyloid fibrils. The methods described here allow rapid conversion of native proteins into amyloid in vitro.

천연 단백질에서 아밀로이드의 빠른 생성<em&gt; 체외</em

Proteins carry out crucial tasks in organisms by exerting functions elicited from their specific three dimensional folds. Although the native structures ...

MALDI-Mass Spectrometric Imaging for the Investigation of Metabolites in Medicago truncatula Root Nodules

Most techniques used to study small molecules, such as pharmaceutical drugs or endogenous metabolites, employ tissue extracts which require the homogenization of the tissue of interest that could potentially cause changes in the metabolic pathways being studied1. Mass spectrometric imaging (MSI) is a powerful analytical tool that can provide spatial information of analytes within intact slices of biological tissue samples1-5. This technique has been used extensively to study various types of compounds including proteins, peptides, lipids, and small molecules such as endogenous metabolites. With matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI)-MSI, spatial distributions of multiple metabolites can be simultaneously detected. Herein, a method developed specifically for conducting untargeted metabolomics MSI experiments on legume roots and root nodules is presented which could reveal insights into the biological processes taking place. The method presented here shows a typical MSI workflow, from sample preparation to image acquisition, and focuses on the matrix application step, demonstrating several matrix application techniques that are useful for detecting small molecules. Once the MS images are generated, the analysis and identification of metabolites of interest is discussed and demonstrated. The standard workflow presented here can be easily modified for different tissue types, molecular species, and instrumentation.

MALDI-Mass Spectrometric Imaging for the Investigation of Metabolites in Medicago truncatula Root Nodules

Mass spectrometric imaging (MSI) is a powerful tool that can be used to discover and identify various chemical species in intact tissues, preserving the compounds in their native environments, which can provide new insights into biological processes. Herein a MSI method developed for the analysis of small molecules is described.&#160;

의 대사 산물의 조사를위한 MALDI-질량 분석 이미징<em&gt; 개자리 truncatula</em&gt; 루트 결절

Most techniques used to study small molecules, such as pharmaceutical drugs or endogenous metabolites, employ tissue extracts which require the ...

Synchronization of Caulobacter Crescentus for Investigation of the Bacterial Cell Cycle

The cell cycle is important for growth, genome replication, and development in all cells. In bacteria, studies of the cell cycle have focused largely on unsynchronized cells making it difficult to order the temporal events required for cell cycle progression, genome replication, and division. Caulobacter crescentus provides an excellent model system for the bacterial cell cycle whereby cells can be rapidly synchronized in a G0 state by density centrifugation. Cell cycle synchronization experiments have been used to establish the molecular events governing chromosome replication and segregation, to map a genetic regulatory network controlling cell cycle progression, and to identify the establishment of polar signaling complexes required for asymmetric cell division. Here we provide a detailed protocol for the rapid synchronization of Caulobacter NA1000 cells. Synchronization can be performed in a large-scale format for gene expression profiling and western blot assays, as well as a small-scale format for microscopy or FACS assays. The rapid synchronizability and high cell yields of Caulobacter make this organism a powerful model system for studies of the bacterial cell cycle.

Synchronization of Caulobacter Crescentus for Investigation of the Bacterial Cell Cycle

Synchronization of bacterial cells is essential for studies of the bacterial cell cycle and development. Caulobacter crescentus is synchronizable through density centrifugation allowing a rapid and powerful tool for studies of the bacterial cell cycle. Here we provide a detailed protocol for the synchronization of Caulobacter cells.

의 동기화<em&gt; Caulobacter Crescentus</em&gt; 세균 세포주기의 조사에 대한

The cell cycle is important for growth, genome replication, and development in all cells.  In bacteria, studies of the cell cycle have focused largely on ...

Contractility Measurements on Isolated Papillary Muscles for the Investigation of Cardiac Inotropy in Mice

Papillary muscle isolated from adult mouse hearts can be used to study cardiac contractility during different physiological/pathological conditions. The contractile characteristics can be evaluated independently of external influences such as vascular tonus or neurohumoral status. It depicts a scientific approach between single cell measurements with isolated cardiac myocytes and in vivo studies like echocardiography. Thus, papillary muscle preparations serve as an excellent model to study cardiac physiology/pathophysiology and can be used for investigations like the modulation by pharmacological agents or the exploration of transgenic animal models. Here, we describe a method of isolating the murine left anterior papillary muscle to investigate cardiac contractility in an organ bath setup. In contrast to a muscle strip preparation isolated from the ventricular wall, the papillary muscle can be prepared in toto without damaging the muscle tissue severely. The organ bath setup consists of several temperature-controlled, gassed and electrode-equipped organ bath chambers. The isolated papillary muscle is fixed in the organ bath chamber and electrically stimulated. The evoked twitch force is recorded using a pressure transducer and parameters such as twitch force amplitude and twitch kinetics are analyzed. Different experimental protocols can be performed to investigate the calcium- and frequency-dependent contractility as well as dose-response curves of contractile agents such as catecholamines or other pharmaceuticals. Additionally, pathologic conditions like acute ischemia can be simulated.

Murine left ventricular papillary muscle can be used to investigate cardiac contractility in vitro. This article describes in detail the isolation and experimental protocols to study cardiac contractile characteristics.

마우스의 심장 수축력의 조사에 대 한 격리 유두 근육의 수축력 측정

Papillary muscle isolated from adult mouse hearts can be used to study cardiac contractility during different physiological/pathological conditions. The ...

Improving the Accuracy of Flow Cytometric Assessment of Mitochondrial Membrane Potential in Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Through the Inhibition of Efflux Pumps

As cellular metabolism is a key regulator of hematopoietic stem cell (HSC) self-renewal, the various roles played by the mitochondria in hematopoietic homeostasis have been extensively studied by HSC researchers. Mitochondrial activity levels are reflected in their membrane potentials (&#916;&#936;m), which can be measured by cell-permeant cationic dyes such as TMRM (tetramethylrhodamine, methyl ester). The ability of efflux pumps to extrude these dyes from cells can limit their usefulness, however. The resulting measurement bias is particularly critical when assessing HSCs, as xenobiotic transporters exhibit higher levels of expression and activity in HSCs than in differentiated cells. Here, we describe a protocol utilizing Verapamil, an efflux pump inhibitor, to accurately measure &#916;&#936;m across multiple bone marrow populations. The resulting inhibition of pump activity is shown to increase TMRM intensity in hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs), while leaving it relatively unchanged in mature fractions. This highlights the close attention to dye-efflux activity that is required when &#916;&#936;m-dependent dyes are used, and as written and visualized, this protocol can be used to accurately compare either different populations within the bone marrow, or the same population across different experimental models.

Xenobiotic efflux pumps are highly active in hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and cause extrusion of TMRM, a mitochondrial membrane potential fluorescent dye. Here, we present a protocol to accurately measure mitochondrial membrane potential in HSPCs by TMRM in the presence of Verapamil, an efflux pump inhibitor.

에플로프 펌프 억제를 통해 조혈 줄기 및 전조 세포에서 미토콘드리아 막 전위성 유동 세포 측정 평가의 정확도 향상

As cellular metabolism is a key regulator of hematopoietic stem cell (HSC) self-renewal, the various roles played by the mitochondria in hematopoietic ...

Nuclei Isolation from Adult Mouse Kidney for Single-Nucleus RNA-Sequencing

The kidneys regulate diverse biological processes such as water, electrolyte, and acid-base homeostasis. Physiological functions of the kidney are executed by multiple cell types arranged in a complex architecture across the corticomedullary axis of the organ. Recent advances in single-cell transcriptomics have accelerated the understanding of cell type-specific gene expression in renal physiology and disease. However, enzyme-based tissue dissociation protocols, which are frequently utilized for single-cell RNA-sequencing (scRNA-seq), require mostly fresh (non-archived) tissue, introduce transcriptional stress responses, and favor the selection of abundant cell types of the kidney cortex resulting in an underrepresentation of cells of the medulla.
Here, we present a protocol that avoids these problems. The protocol is based on nuclei isolation at 4 &#176;C from frozen kidney tissue. Nuclei are isolated from a central piece of the mouse kidney comprised of the cortex, outer medulla, and inner medulla. This reduces the overrepresentation of cortical cells typical for whole-kidney samples for the benefit of medullary cells such that data will represent the entire corticomedullary axis at sufficient abundance. The protocol is simple, rapid, and adaptable and provides a step towards the standardization of single-nuclei transcriptomics in kidney research.

Here, we present a protocol to isolate high-quality nuclei from frozen mouse kidneys that improve the representation of medullary kidney cell types and avoids the gene expression artifacts from enzymatic tissue dissociation.

Single-Nucleus RNA 시퀀싱을 위한 성인 마우스 신장에서 핵 분리

The kidneys regulate diverse biological processes such as water, electrolyte, and acid-base homeostasis. Physiological functions of the kidney are ...

Isolation of Cardiac and Vascular Smooth Muscle Cells from Adult, Juvenile, Larval and Embryonic Zebrafish for Electrophysiological Studies

Zebrafish have long been used as a model vertebrate organism in cardiovascular research. The technical difficulties of isolating individual cells from the zebrafish cardiovascular tissues have been limiting in studying their electrophysiological properties. Previous methods have been described for dissection of zebrafish hearts and isolation of ventricular cardiac myocytes. However, the isolation of zebrafish atrial and vascular myocytes for electrophysiological characterization was not detailed. This work describes new and modified enzymatic protocols that routinely provide isolated juvenile and adult zebrafish ventricular and atrial cardiomyocytes, as well as vascular smooth muscle (VSM) cells from the bulbous arteriosus, suitable for patch-clamp experiments. There has been no literary evidence of electrophysiological studies on zebrafish cardiovascular tissues isolated at embryonic and larval stages of development. Partial dissociation techniques that allow patch-clamp experiments on individual cells from larval and embryonic hearts are demonstrated.

The present protocol describes the acute isolation of viable cardiac and vascular smooth muscle cells from adult, juvenile, larval, and embryonic zebrafish (Danio rerio), suitable for electrophysiological studies.

전기 생리 학적 연구를위한 성체, 청소년, 애벌레 및 배아 제브라 피쉬에서 심장 및 혈관 평활근 세포 분리

Zebrafish have long been used as a model vertebrate organism in cardiovascular research. The technical difficulties of isolating individual cells from the ...

Single-Cell Analysis of the Expression of Pseudomonas syringae Genes within the Plant Tissue

A plethora of pathogenic microorganisms constantly attack plants. The Pseudomonas syringae species complex encompasses Gram-negative plant-pathogenic bacteria of special relevance for a wide number of hosts. P. syringae enters the plant from the leaf surface and multiplies rapidly within the apoplast, forming microcolonies that occupy the intercellular space. The constitutive expression of fluorescent proteins by the bacteria allows for visualization of the microcolonies and monitoring of the development of the infection at the microscopic level. Recent advances in single-cell analysis have revealed the large complexity reached by clonal isogenic bacterial populations. This complexity, referred to as phenotypic heterogeneity, is the consequence of cell-to-cell differences in gene expression (not linked to genetic differences) among the bacterial community. To analyze the expression of individual loci at the single-cell level, transcriptional fusions to fluorescent proteins have been widely used. Under stress conditions, such as those occurring during colonization of the plant apoplast, P. syringae differentiates into distinct subpopulations based on the heterogeneous expression of key virulence genes (i.e., the Hrp type III secretion system). However, single-cell analysis of any given P. syringae population recovered from plant tissue is challenging due to the cellular debris released during the mechanical disruption intrinsic to the inoculation and bacterial extraction processes. The present report details a method developed to monitor the expression of P. syringae genes of interest at the single-cell level during the colonization of Arabidopsis and bean plants. The preparation of the plants and the bacterial suspensions used for inoculation using a vacuum chamber are described. The recovery of endophytic bacteria from infected leaves by apoplastic fluid extraction is also explained here. Both the bacterial inoculation and bacterial extraction methods are empirically optimized to minimize plant and bacterial cell damage, resulting in bacterial preparations optimal for microscopy and flow cytometry analysis.

Single-Cell Analysis of the Expression of Pseudomonas syringae Genes within the Plant Tissue

The present protocol describes a method that allows single-cell gene expression analysis on Pseudomonas syringae populations grown within the plant apoplast.

식물 조직 내 Pseudomonas syringae 유전자 발현의 단일 세포 분석

A plethora of pathogenic microorganisms constantly attack plants. The Pseudomonas syringae species complex encompasses Gram-negative plant-pathogenic ...

Investigating Zinc Transport Mechanism in Mammalian Cells with FluoZin-3 Assay(FluoZin-3 분석을 통한 포유류 세포의 아연 수송 메커니즘 조사)

Characterizing Mammalian Zinc Transporters Using an In Vitro Zinc Transport Assay

Transition metals such as Zn2+ ions must be tightly regulated due to their cellular toxicity. Previously, the activity of Zn2+ transporters was measured indirectly by determining the expression level of the transporter under different concentrations of Zn2+. This was done by utilizing immunohistochemistry, measuring mRNA in the tissue, or determining the cellular Zn2+ levels. With the development of intracellular Zn2+ sensors, the activities of zinc transporters are currently primarily determined by correlating changes in intracellular Zn2+, detected using fluorescent probes, with the expression of the Zn2+ transporters. However, even today, only a few labs monitor dynamic changes in intracellular Zn2+ and use it to measure the activity of zinc transporters directly. Part of the problem is that out of the 10 zinc transporters of the ZnT family, except for ZnT10 (transports manganese), only zinc transporter 1 (ZnT1) is localized at the plasma membrane. Therefore, linking the transport activity to changes in the intracellular Zn2+ concentration is hard. This article describes a direct way to determine the zinc transport kinetics using an assay based on a zinc-specific fluorescent dye, FluoZin-3. This dye is loaded into mammalian cells in its ester form and then trapped in the cytosol due to cellular di-esterase activity. The cells are loaded with Zn2+ by utilizing the Zn2+ ionophore pyrithione. The ZnT1 activity is assessed from the linear part of the reduction in fluorescence following the cell washout. The fluorescence measured at an excitation of 470 nm and emission of 520 nm is proportional to the free intracellular Zn2+. Selecting the cells expressing ZnT1 tagged with the mCherry fluorophore allows for monitoring only the cells expressing the transporter. This assay is used to investigate the contribution of different domains of ZnT1 protein to the transport mechanism of human ZnT1, a eukaryotic transmembrane protein that extrudes excess zinc from the cell.

저자 스포트라이트: ZnT1 기능을 통한 세포 아연 조절 탐구 

Zinc transport has proven challenging to measure due to the weak causal links to protein function and the low temporal resolution. This protocol describes a method for monitoring, with high temporal resolution, Zn2+ extrusion from living cells by utilizing a Zn2+ sensitive fluorescent dye, thus providing a direct measure of Zn2+ efflux.

In Vitro Zinc Transport Assay를 사용한 포유류 아연 수송체 특성 분석

Transition metals such as Zn2+ ions must be tightly regulated due to their cellular toxicity. Previously, the activity of Zn2+ transporters was measured ...