Cette étude a été soutenue par l&#39;Agence Nationale de la Recherche (ANR-2010-BLAN-1535) et par une subvention de la Région Ile-de-France (DIM-Malinf 110058).

Une. Production et purification de protéines <ol><li> MexA, MexB de Pseudomonas aeruginosa <ol><li> Transformer les plasmides hébergeant les gènes MexA et MexB dans un E. souche de production coli (par exemple C43 DE3). Plaque sur gélose LB supplémenté avec l&#39;antibiotique approprié. Choisissez une seule colonie pour inoculer une préculture O / N. Le lendemain matin, ensemencer la préculture dans 1 L de LB et de croître à 37 ° C sous agitation (240 rpm). </li><li> Une fois que les cellules ont atteint la phase exponentielle (DO600 = 0,6 à 0,8) induisent avec 1 mM d&#39;IPTG. Effectuer induction pour 2-3 heures à 30 ° C sous agitation. </li><li> Centrifuger les cellules (9000 xg pendant 20 min) et les remettre en suspension dans 30 ml de Tris-HCl 20 mM, pH 8, NaCl 150 mM. </li><li> Broyer les cellules en utilisant une presse française (10 000 psi, 4 passes). Jeter les cellules intactes et des corps d&#39;inclusion par centrifugation à 9000 g pendant 20 min. </li><li> Membranes Pellet 1 heure à 100 000 xg et resuspend chaque culot dans 30 ml de bis-Tris 10 mM pH 7,4, glycérol 20% (p / v), de l&#39;imidazole 10 mM, NaCl 500 mM. </li><li> Déterminer la concentration totale en protéine de membrane en utilisant le dosage colorimétrique BCA et de solubiliser les membranes O / N avec 2% de maltoside de dodécyle (DDM) dans un volume final déterminé de telle sorte que le détergent: protéine est de 1:1,5 (p / p). </li><li> Ultracentrifugation à 100 000 g pendant 1 h à jeter matériau non solubilisé et agrégées. </li><li> Incuber le surnageant pendant 2 heures à 4 ° C avec une résine de nickel (de purification MexA) ou une résine de cobalt (de purification MexB) équilibrée avec du Bis-Tris 10 mM pH 7,4, glycerol à 5% (p / v), de l&#39;imidazole 10 mM, NaCl 500 mM, 0,2% DDM. </li><li> Verser la résine dans une colonne vide. Recueillir le accréditives. </li><li> Laver la résine avec 50 ml de bis-Tris 10 mM pH 7,4, glycérol 20% (p / v), de l&#39;imidazole 10 mM, NaCl 500 mM, 0,2% DDM, puis avec 25 ml de bis-Tris 10 mM pH 6, le glycérol 5% (p / v), de l&#39;imidazole 10 mM, NaCl 500 mM, 0,2% DDM. </li><li> Éluer le protein avec 20 ml de bis-Tris 10 mM pH 7,4, glycerol à 5% (p / v), de l&#39;imidazole 300 mM, NaCl 500 mM, 0,2% DDM. </li><li> Concentrer la protéine avec un dispositif d&#39;ultrafiltration vers le bas à 3 ml et de la charge sur une colonne de dessalage équilibrée avec un tampon imidazole-libre. Juste avant la reconstitution (voir ci-dessous), ultracentrifugation les protéines solubilisées (100 000 xg pendant 20 minutes) pour se débarrasser des lipides et des protéines non solubilisées. Puis se concentrer de nouveau sur la protéine à 0,3 ml. </li></ol></li><li> Bactériorhodopsine de Halobacter salinarium <ol><li> Cultiver des cellules Salinarium Halobacter sous éclairage à 37 ° C pendant 10 jours dans un milieu de croissance liquide contenant du NaCl 4 M, MgSO 4, 150 mM, citrate 10 mM, KCl 30 mM, extraits de levure 5 g / L, et la peptone 5 g / L. </li><li> Broyer les cellules par dialyse contre de l&#39;eau déminéralisée. </li><li> Purifier la membrane pourpre sur un 30 à 40% (p / v) de gradient de saccharose (100 000 xg pendant 17 h). </li><li> Solubiliser la suspension membranaire avec 2% octylglucosidique pendant 24 heures à 37 ° C (volume de solubilisation afin de remettre en suspension la membrane à une 2:1 (poids / poids) du détergent: rapport de protéine). Estimer la concentration de BR solubilisé en utilisant ε (570 nm) = 54 000 M -1 cm -1. Juste avant la reconstitution (voir ci-dessous), l&#39;ultracentrifugation BR solubilisé (100.000 g pendant 20 min) pour se débarrasser des lipides et des protéines non solubilisées. Remarque: Les membranes natives sont naturellement enrichis en BR donc pas de purification supplémentaire est nécessaire. </li></ol></li></ol> 2. Préparation des protéoliposomes <ol><li> la formation de liposomes: Mettre 400 ul de DOPC dissous dans du chloroforme (25 mg / ml) dans un bêcher en verre et ajoute 1,5 mg de cholestérol stocké sous forme de poudre. Séchez-les juste avant manipulation sous un courant d&#39;azote ou sous vide pendant au moins 1 heure dans un récipient en verre. La DOPC: rapport molaire de cholestérol est de 3,3:1. <ol><li> Après avoir séché, hydrater les lipides avec 1 ml de tampon HEPES 25 mM pH 7,K 2 SO 4 à 100 mM, MgCl 2 2 mM, 2 mM de pyranine. La suspension doit apparaître trouble à ce stade. </li><li> Chauffer la solution pendant 10 min à 37 ° C. Ultrasons pendant 10 min à 40 W avec 30 impulsions sec, 30 sec pause cycles à la température ambiante. La suspension doit être clair à ce stade. </li><li> Pour obtenir une population monodisperse de liposomes, effectuer deux cycles de l&#39;extrusion et pour chaque cycle, passer la suspension de liposomes à travers le filtre au moins 11x. Pour le premier cycle, en utilisant une taille de pores de membrane de 200 nm, et pour le deuxième cycle, en utilisant une taille de pores de membrane de 100 nm. Mesures dynamiques de diffusion de la lumière peuvent être effectués à cette étape pour vérifier l&#39;homogénéité de la suspension. </li></ol></li><li> Protéine incorporation Principe: membrane protéines peuvent être reconstitués dans des liposomes grâce à l&#39;effet de solubilisation des détergents. Liposomes détergent solubilisées sont incubés avec la protéine membranaire solubilisée détergent et la formation de la proteoliposomes est déclenchée par une élimination rapide du détergent avec des billes de polystyrène 9. <ol><li> Ajouter 28 mg de Triton X-100 (0,56% final) et incuber O / N à 4 ° C (la température de solubilisation peut être adapté à la protéine à l&#39;étude). </li><li> Ajouter la protéine solubilisée par du détergent (BR, MexB et MexA) aux liposomes solubilisés et incuber 15 min à 4 ° C. Ajouter les protéines de la suspension de liposomes solubilisé dans les rapports suivants (p / p): lipides / MexB = 20, MexB / MexA = 2,5, lipides et / BR = 30. </li><li> Ajouter des perles de polystyrène à une 30:1 perles: rapport de détergent (en poids / poids, compte tenu du poids total du détergent, y compris un détergent ajoutée avec les protéines purifiées) et incuber 5 heures, à l&#39;obscurité (en raison de la BR) à température ambiante sous douce agitation. Avant cette procédure, activer les BioBeads avec du méthanol et de l&#39;éthanol incubation et abondamment avec de l&#39;eau de lavage. </li><li> Purifier la protéine de protéoliposomes et substrats libres, utilisez un PD-10colonne de dessalage équilibrée avec de l&#39;HEPES 25 mM pH 7, K 2 SO 4 et 100 mM de MgCl 2 2 mM. </li><li> Conserver les protéoliposomes à 18 ° C dans l&#39;obscurité jusqu&#39;à 2-3 semaines. </li></ol></li><li> Évaluation de l&#39;efficacité de reconstitution sur gradient de saccharose. Pour vérifier que les deux MexB et le BR ont été reconstitués dans des liposomes, de purifier la suspension de protéoliposome sur un gradient de saccharose discontinu. <ol><li> Régler délicatement les protéoliposomes sur un gradient de cinq couches de saccharose (60%, 20%, 10%, 5% et 2,5%, p / v). </li><li> Ultracentrifugation pendant 17 heures à 100 000 xg (avec une accélération minimal et le taux de décélération). </li><li> Recueillir soigneusement les diverses fractions de gradient (en particulier les interfaces entre chaque couche de saccharose) et de les analyser sur SDS-PAGE (10%) à l&#39;aide Coomassie ou Western Blot. Protéines agrégées se trouvent au fond du tube, tandis que les protéines non incorporés, détergents solubilisé se trouvent en haut dele tube. Protéoliposomes et des liposomes se trouvent au niveau des interfaces de saccharose qui correspondent à leur densité intrinsèque. Liposomes vides sont récupérés plus loin dans la pente que les protéoliposomes. </li></ol></li></ol> 3. Fluorescence Mesure <ol><li> Effectuer des mesures de fluorescence à 25,0 ° C en utilisant un spectrofluorimètre pour permettre des mesures deux longueurs d&#39;onde (lampe Xe, 150 W). Périodes d&#39;éclairage de substitution (pour activer BR avec longueurs d&#39;onde d&#39;excitation / émission de 550 nm / 550 nm) et des mesures de fluorescence de longueurs d&#39;onde d&#39;excitation / émission de 455 nm / 509 nm pendant 2 secondes pour mesurer la fluorescence pyranine. Définissez les excitation et d&#39;émission des largeurs de bande de 5 nm. Effectuer les mesures en présence de 50 nM de valinomycine pour empêcher la formation d&#39;une membrane ΔΨ potentiel inverse. Remarque: En effet, parce que les pompes à protons BR, il ya des frais plus positifs à l&#39;intérieur du liposome qu&#39;à l&#39;extérieur. Cette chargegradient peut être éliminé en utilisant la valinomycine, qui est un ionophore sélectif de K +. Une fois ajouté à la valinomycine liposomes en suspension, comme une molécule hydrophobe, permet d&#39;insérer dans la membrane du liposome, transporter passivement K +, et par conséquent de dissiper la membrane ΔΨ potentiel. </li></ol>

<ol>
	<li>Granseth, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+protein+structural+biology+-+How+far+can+the+bugs+take+us?+(Review).">Membrane protein structural biology - How far can the bugs take us? (Review).</a> Molecular Membrane Biology. 24 (5-6), 329 (2007).</li><li>Nikaido, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multidrug+resistance+in+bacteria.">Multidrug resistance in bacteria.</a> Annu Rev Biochem. 78, 119 (2009).</li><li>Pos, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+transport+mechanism+of+the+AcrB+efflux+pump.">Drug transport mechanism of the AcrB efflux pump.</a> Biochim Biophys Acta. 1794 (5), 782 (2009).</li><li>Murakami, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structures+of+a+multidrug+transporter+reveal+a+functionally+rotating+mechanism.">Crystal structures of a multidrug transporter reveal a functionally rotating mechanism.</a> Nature. 443 (7108), 173 (2006).</li><li>Seeger, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+Asymmetry+of+AcrB+Trimer+Suggests+a+Peristaltic+Pump+Mechanism.">Structural Asymmetry of AcrB Trimer Suggests a Peristaltic Pump Mechanism.</a> Science. 313 (5791), 1295 (2006).</li><li>Sennhauser, G., Bukowska, M. A., Briand, C., Grutter, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+multidrug+exporter+MexB+from+Pseudomonas+aeruginosa.">Crystal structure of the multidrug exporter MexB from Pseudomonas aeruginosa.</a> J Mol Biol. 389 (1), 134 (2009).</li><li>Su, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+CusBA+heavy-metal+efflux+complex+of+Escherichia+coli.">Crystal structure of the CusBA heavy-metal efflux complex of Escherichia coli.</a> Nature. 470 (7335), (2011).</li><li>Nikaido, H., Takatsuka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+RND+multidrug+efflux+pumps.">Mechanisms of RND multidrug efflux pumps.</a> Biochim Biophys Acta. 1794 (5), 769 (2009).</li><li>Rigaud, J. L., Levy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+membrane+proteins+into+liposomes.">Reconstitution of membrane proteins into liposomes.</a> Methods in enzymology. 372, 65 (2003).</li><li>Aires, J. R., Nikaido, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aminoglycosides+are+captured+from+both+periplasm+and+cytoplasm+by+the+AcrD+multidrug+efflux+transporter+of+Escherichia+coli.">Aminoglycosides are captured from both periplasm and cytoplasm by the AcrD multidrug efflux transporter of Escherichia coli.</a> J Bacteriol. 187 (6), 1923 (2005).</li><li>Picard, M., Verchere, A., Broutin, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+the+active+transport+of+efflux+pumps+after+their+reconstitution+into+proteoliposomes:+caveats+and+keys.">Monitoring the active transport of efflux pumps after their reconstitution into proteoliposomes: caveats and keys.</a> Anal Biochem. 420 (2), 194 (2012).</li><li>Verchere, A., Dezi, M., Broutin, I., Picard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Methods+in+Protein+Purification+and+Analysis,+edited+by+iConcept+Press.">Basic Methods in Protein Purification and Analysis, edited by iConcept Press.</a> , (2012).</li><li>Verchere, A., Broutin, I., Picard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photo-induced+proton+gradients+for+the+in+vitro+investigation+of+bacterial+efflux+pumps.">Photo-induced proton gradients for the in vitro investigation of bacterial efflux pumps.</a> Sci Rep. 2, 306 (2012).</li></ol>

Il n&#39;y a rien à divulguer.

Nous décrivons une procédure de reconstitution conçu pour le dosage du transport membranaire des protéines. Une fois établie, la procédure de reconstitution de protéines conduit à des mesures qui sont très reproductibles. Cependant, les conditions précises pour la reconstitution de la protéine variera d&#39;une protéine à l&#39;autre. Beaucoup de soin doit être pris dans l&#39;optimisation des paramètres suivants: i) la qualité de la purification (pureté et de l&#39;absence de matière agrégée), ii) l&#39;efficacité de l&#39;étape de détergent solubilisant (lorsque cela est possible, un faible détergent cmc doit être préférée, car ils sont plus faciles à obtenir débarrasser d&#39;), iii) la désorption du détergent (il est par exemple possible de combiner l&#39;utilisation de billes de polystyrène avec une étape de dialyse, mais cela peut affecter la vitesse de désorption, un paramètre critique pour l&#39;activité ultérieure de la protéine, voir réf [ 9]), iv) la reconstitution des lipides (la nature chimique du lipide, le lipide à rapport de la protéine, la présence de plus d&#39;amphiphiles sont des paramètres essentiels qui doivent être modifiés et optimisés). De la température de plus et le temps d&#39;incubation affecter toutes ces questions. Le contrôle de qualité est donc primordial à chaque étape de la procédure de reconstitution. De ce point de vue, diffusion de la lumière est une technique très pratique car il est rapide, non destructive, et il ne nécessite que 20 ul d&#39;échantillon à une concentration dans la gamme micromolaire. Une fois que les protéoliposomes sont formés, gradient de saccharose est également d&#39;une grande aide, car elle ouvre la voie à une vérification systématique de la reconstitution: qualitative (est la protéine en effet intégré dans la membrane du liposome) ainsi que quantitative (combien de protéine dans un liposome). Ce dernier serait adressée par la mesure précisément la protéine et les concentrations de lipides. Notre analyse ne repose pas sur le titrage du substrat lui-même et cela évite les considérations inquiets concernant une éventuelle diffusion passive d&#39;artefact de<html> la molécule en raison de partitionnement hydrophobe dans les membranes. Le test exploite les propriétés de pyranine comme sonde fiable et quantitative pour surveiller les changements de pH. Nos résultats sont en accord avec les résultats obtenus avec une autre procédure où la formation de gradient de protons a été réalisée en utilisant la valinomycine 10, mais il permet un gradient plus robuste et reproductible 11. En outre, le gradient de protons peut être réglé avec précision, en faisant simplement varier la concentration du tampon (pour plus de détails voir Verchere et al. 12). Dans le mode opératoire d&#39;une mesure de contrôle est effectuée en premier, en l&#39;absence de substrat (ce qui donne accès à l&#39;activité de la protéine passive). L&#39;activité de transporteur de la protéine de la membrane proprement dite est ensuite mesurée après que le substrat a été ajouté dans la même cuve. C&#39;est vraiment un atout parce que l&#39;expérience peut être considérée comme un véritable ambiguïté, résultat, non induite par le substrat. ent &quot;&gt; Le protocole pourrait être adapté à la haute-moyen débit (par exemple 96 puits mesures) automatisation parce éclairer l&#39;échantillon déclenche la réaction. automatisation et parallélisation consisterait à préparer un grand lot de protéoliposome, et dans la distribution des aliquotes dans un 96 puits plaque. substrats (et également des inhibiteurs possibles) seraient alors ajoutés et après incubation dans l&#39;obscurité pendant 45 minutes la plaque serait soumis à des cycles de mesure de la fluorescence éclairage / pyranine sur un lecteur de microplaques. Pour plus d&#39;informations sur le protocole, les lecteurs sont invités à lire Verchere et al. 12,13

Des protéines membranaires intégrales représentent jusqu&#39;à 30% des gènes codés dans les génomes eucaryotes. Ils partagent des rôles essentiels tels que la grille de maintien (récepteurs), le transport des nutriments, d&#39;ions ou de composés toxiques (transporteurs) ou le maintien de la perméabilité à travers les bicouches membranaires (canaux) parmi toutes les cellules vivantes 1. Les pompes à efflux jouer un rôle central dans la résistance contre l&#39;antibiothérapie 2. Dans les bactéries à Gram négatif Pseudomonas aeruginosa, qui est protégée par une membrane extérieure, les transporteurs d&#39;efflux sont organisées comme des systèmes tripartites où MexB, la pompe d&#39;efflux situé dans la membrane interne, fonctionne en conjonction avec MexA, une protéine périplasmique, et OprM, un le canal de la membrane externe. La protéine de la membrane cytoplasmique interne agit comme une pompe énergie dépendante avec une large spécificité de substrat. La protéine de membrane externe agit comme une porine tandis que le troisième se trouve dans l&#39;espace périplasmique et on pense à stabiliser l&#39;ensemble du complexe <sjusqu&#39;à&gt; 3. Dans ce qui suit, nous nous concentrons sur la conception d&#39;un test fonctionnel pour l&#39;ensemble MexA MexB. Les informations structurelles a accumulé au cours de la 5 dernières années grâce à la détermination des rayons X de la AcrB de protéine homologue de Escherichia coli 4-7. Bien que il est très important de coupler ces informations avec des données dynamiques et cinétiques, la conception d&#39;un test fonctionnel pour ce transporteur est un véritable défi 8. En effet, les protéines de la membrane doivent être maintenues dans un environnement membraneux et un compartiment fermé doivent être maintenues pendant un transport vectoriel de substrat à atteindre. Reconstitution de protéines membranaires en protéoliposomes a été largement présenté et examiné (voir Rigaud et Levy 9). Ces protocoles permettent la surveillance de l&#39;activité des protéines de membrane, par exemple en suivant les substrats à travers la membrane du liposome. Dans ce cas limitations proviennent de la uneDisponibilité des substrats titrable (fluorescent, radioactif, etc.) et du fait que très souvent, ces substrats sont hydrophobes et ont une tendance à traverser les membranes, indépendamment de la présence du transporteur. Comme alternative, on peut suivre les variations spectroscopiques d&#39;un colorant rapports sensibles aux changements chimiques qui se produisent en raison du transport. Comme indiqué plus haut, les protons dynamiser le transport par MexB. Par conséquent, une option correspondante est de surveiller les variations d&#39;un spectroscopiques rapports colorant sensible au pH de suivre les variations de pH dues au transport du substrat conduit à protons. Le choix d&#39;un colorant fluorescent permet d&#39;éviter tous les effets d&#39;artefact en raison de la nature hydrophobe du substrat. Une difficulté supplémentaire est la génération d&#39;un gradient de protons. Plusieurs protocoles peuvent être trouvés dans la littérature. Parmi eux, l&#39;utilisation de la technique de la valinomycine est très répandue mais nous avons montré qu&#39;il est fastidieux à accomplir 10-11. En outre, il estpas reproductible et il n&#39;est pas réversible. Nous avons eu recours à l&#39;utilisation de la bactériorhodopsine (BR), une pompe à protons activé par la lumière de Halobacter salinarium, une archée obligatoire halophile marine Gram négatif aérobie. Cette protéine est coreconstituted dans des liposomes avec MexB et, lors de l&#39;illumination, pompes BR protons à l&#39;intérieur des liposomes et donc crée la ApH (acide à l&#39;intérieur) requis par la protéine de transport du substrat 12-13.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1051">
	<tbody>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:363px;">DOPC (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)</td>
			<td style="width:344px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:344px;">850375C</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:363px;">Cholesterol</td>
			<td style="width:344px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">C8667</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:363px;">Hoechst 33342</td>
			<td style="width:344px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">B2261</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:363px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:344px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">93427</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:363px;">Valinomycin</td>
			<td style="width:344px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:344px;">V-1644</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:363px;">Pyranine (8-hydroxypyrene-1,3,6-trisulphonic acid)</td>
			<td style="width:344px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:344px;">H-348</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:363px;">DDM (n-Dodecyl-&#946;-D-maltopyranoside)</td>
			<td style="width:344px;">Affymetrix</td>
			<td style="width:344px;">D310LA</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:363px;">Extruder kit (extruder, Hamilton gas-tight syringes)</td>
			<td style="width:344px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:344px;">610000</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:363px;">Biobeads SM-2 Adsorbents</td>
			<td style="width:344px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:344px;">152-3920</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:363px;">Econo-Pac Chromatography empty column</td>
			<td style="width:344px;">Biorad</td>
			<td style="width:344px;">732-1010</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:363px;">Desalting columns</td>
			<td style="width:344px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:344px;">54805</td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:363px;">Dynamic light scattering instrument</td>
			<td style="width:344px;">Wyatt Technology</td>
			<td style="width:344px;">DynaPro NanoStar</td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:363px;">Fluorometer JASCO FP-6200</td>
			<td style="width:344px;">JASCO</td>
			<td style="width:344px;">6816-J002A</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro investigation of the mexab efflux pump from pseudomonas aeruginosa

Il ya un besoin scientifique émergente pour des outils fiables pour la surveillance du transport membranaire des protéines. Nous présentons une méthode qui conduit à la reconstitution de pompes d&#39;efflux de la bactérie à Gram négatif Pseudomonas aeruginosa dans un environnement biomimétique qui permet une investigation précise de leur activité de transport. Trois conditions sont remplies: la compartimentation dans un environnement lipidique, l&#39;utilisation d&#39;un indice de référence pour le transport, et la génération d&#39;un gradient de protons. Le transporteur de la protéine de membrane est reconstitué dans des liposomes ainsi que la bactériorhodopsine, une pompe à protons activé par la lumière qui génère un gradient de protons qui est robuste ainsi que réversible et réglable. L&#39;activité de la protéine est déduit des variations de pH qui se produisent à l&#39;intérieur du liposome, en utilisant pyranin, une sonde fluorescente dépendante du pH. Nous décrivons un procédé étape par étape, où la purification des protéines de membrane, la formation de liposomes, de protéines reconstitution, et le transport d&#39;unnalyse sont adressées. Bien qu&#39;ils aient été spécifiquement conçus pour un transporteur RND, les procédés décrits pourraient être adaptés pour être utilisés avec n&#39;importe quel autre transporteur de la protéine de la membrane sous tension par un gradient de protons.

L&#39;essai consiste à surveiller la fluorescence de la pyranine comme une fonction du temps pendant un gradient de protons est généré. À cette fin, les échantillons sont soumis à un éclairage en variante (et donc le pompage de protons par le BR est déclenchée) et ensuite à l&#39;aide de la mesure de fluorescence d&#39;excitation et d&#39;émission de longueurs d&#39;onde de la pyranine (λ ex = 455 nm et λ em = 509 nm). La figure 1 montre une commande représentatif obtenu par le test, en l&#39;absence de MexA / MexB, vérifier que le gradient de protons généré par le BR est réversible. Après un cycle d&#39;acidification, protéoliposomes sont conservés à l&#39;obscurité pendant 45 min afin que le BR à arrêter le pompage des protons (protons diffusent lentement et de manière passive à travers les bicouches lipidiques suivant leur gradient de concentration). Après cette période de récupération, l&#39;activation de BR est possible, simplement en allumant à nouveau la même suspension. Figure 2correspond à une mesure réelle de transport. Un témoin négatif avec des protéines liposomes libres montre que, comme attendu, le pH est constant lors de l&#39;illumination (figures 2A et 2B, cercles oranges). Cependant, protéoliposomes contenant BR dans leurs membranes ne la pompe à protons, donc le pH à l&#39;intérieur des baisses de liposomes et un gradient stable est construit (Figures 2A et 2B, carrés violets). Triangles gris et losanges rouges (Figure 2A) représentent pH à l&#39;intérieur de protéoliposomes contenant BR et MexB, en présence ou en l&#39;absence de Hoechst 33342, respectivement. On observe une activité de substrat indépendante où le gradient de protons n&#39;est que partiellement dissipée par MexB contre-transport. Nous attribuons cette observation à une activité basale de MexB. Afin de tester l&#39;effet de MexA sur l&#39;activité de MexB, MexA a été ajouté à la reconstitution, d&#39;abord en l&#39;absence de tout substrat ( <strong&gt; Figure 2B, diamants bleus). Encore une fois, le gradient de protons généré par le BR n&#39;est que partiellement dissipée. La mesure réelle de transport est réalisé sur le même échantillon. Au préalable, le gradient de protons doit être réinitialisé et le substrat doit être ajoutée à la suspension pour atteindre son site de liaison à la protéine. À cette fin, la suspension est incubée à l&#39;obscurité en présence du substrat pendant 45 mn. Lors de l&#39;illumination subséquente, on peut voir que le gradient de protons généré par le BR est maintenant totalement dissipée par MexAB (Figure 2B, triangles verts), en conséquence de transport de substrat par la pompe. <img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50894/50894fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50894/50894fig1.jpg" /> . Figure 1 réversibilité du gradient de proton construit par illumination BR: pyranine fluorescence de protéoliposomes BR mesurées en fonction du temps. De 0-15 min, pompes BR protons en raison de l&#39;activation de la lumière. De 15 à 60 min, protéoliposomes sont incubées dans l&#39;obscurité, pendant ce temps, les protons se déplacent de manière passive sur les liposomes jusqu&#39;à ce que le pH et le pH intravésiculaire extravésiculaire sont égales. De 60-75 min, BR est toujours fonctionnel et pompes protons lors de l&#39;illumination. <img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50894/50894fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50894/50894fig2.jpg" /> . Figure 2 Transport dosage: pyranine fluorescence, convertie aux variations de pH correspondantes, en fonction du temps A) de pH à l&#39;intérieur de liposomes témoins (cercles oranges); pH à l&#39;intérieur de protéoliposomes contenant BR dans la membrane (carrés violets); du pH à l&#39;intérieur. de protéoliposomes contenant BR, et MexB dans la membrane sans Hoechst 33342 (d rougeiamonds); pH à l&#39;intérieur de protéoliposomes contenant BR et MexB dans la membrane avec Hoechst 33342 (triangles gris) B) de pH à l&#39;intérieur de liposomes témoins (cercles oranges),. pH à l&#39;intérieur de protéoliposomes contenant BR dans la membrane (carrés violets); pH à l&#39;intérieur de protéoliposomes contenant BR, MexB et MexA dans la membrane sans Hoechst 33342 (losanges bleus); pH à l&#39;intérieur de protéoliposomes contenant BR, MexB et MexA dans la membrane avec Hoechst 33342 (triangles verts).

Watch this Scientific Journal Video about In vitro Investigation of the MexAB Efflux Pump From Pseudomonas aeruginosa at JoVE.com

In vitro Investigation of the MexAB Efflux Pump From Pseudomonas aeruginosa

Nous présentons un protocole pour l&#39;étude in vitro de pompes à efflux de Pseudomonas aeruginosa. Ce protocole permet la génération d&#39;un gradient de protons solide, réversible, et accordable à l&#39;intérieur de la membrane du liposome et par conséquent doit être adaptable à n&#39;importe quelle protéine de la membrane sous tension par la force protomotive.

In vitro enquête de la pompe à efflux MexAB De Pseudomonas aeruginosa

There is an emerging scientific need for reliable tools for monitoring membrane protein transport. We present a methodology leading to the reconstitution ...

in-vitro-investigation-mexab-efflux-pump-from-pseudomonas

Research

JoVE Journal

Biology

In vitro Investigation of the MexAB Efflux Pump From Pseudomonas aeruginosa

11.8K vues.  CNRS & Université Paris Descartes.  Nous présentons un protocole pour l'étude in vitro de pompes à efflux de Pseudomonas aeruginosa. Ce protocole permet la génération d'un gradient de protons solide, réversible, et accordable à l'intérieur de la membrane du liposome et par conséquent doit être adaptable à n'importe quelle protéine de la membrane sous tension par la force protomotive. 

Vidéo: In vitro Investigation of the MexAB Efflux Pump From Pseudomonas aeruginosa

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

La reconstitution in vitro de l&#39;actif T. La télomérase castaneum

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Recherche

Biologie

Rapid Generation of Amyloid from Native Proteins In vitro

Proteins carry out crucial tasks in organisms by exerting functions elicited from their specific three dimensional folds. Although the native structures of polypeptides fulfill many purposes, it is now recognized that most proteins can adopt an alternative assembly of beta-sheet rich amyloid. Insoluble amyloid fibrils are initially associated with multiple human ailments, but they are increasingly shown as functional players participating in various important cellular processes. In addition, amyloid deposited in patient tissues contains nonproteinaceous components, such as nucleic acids and glycosaminoglycans (GAGs). These cofactors can facilitate the formation of amyloid, resulting in the generation of different types of insoluble precipitates. By taking advantage of our understanding how proteins misfold via an intermediate stage of soluble amyloid precursor, we have devised a method to convert native proteins to amyloid fibrils in vitro. This approach allows one to prepare amyloid in large quantities, examine the properties of amyloid generated from specific proteins, and evaluate the structural changes accompanying the conversion.

Rapid Generation of Amyloid from Native Proteins In vitro

Proteins can either adopt a native structure or misfold into insoluble amyloid. Conditions that favor the misfolding pathway lead to the formation of different types of amyloid fibrils. The methods described here allow rapid conversion of native proteins into amyloid in vitro.

Proteins carry out crucial tasks in organisms by exerting functions elicited from their specific three dimensional folds. Although the native structures ...

MALDI-Mass Spectrometric Imaging for the Investigation of Metabolites in Medicago truncatula Root Nodules

Most techniques used to study small molecules, such as pharmaceutical drugs or endogenous metabolites, employ tissue extracts which require the homogenization of the tissue of interest that could potentially cause changes in the metabolic pathways being studied1. Mass spectrometric imaging (MSI) is a powerful analytical tool that can provide spatial information of analytes within intact slices of biological tissue samples1-5. This technique has been used extensively to study various types of compounds including proteins, peptides, lipids, and small molecules such as endogenous metabolites. With matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI)-MSI, spatial distributions of multiple metabolites can be simultaneously detected. Herein, a method developed specifically for conducting untargeted metabolomics MSI experiments on legume roots and root nodules is presented which could reveal insights into the biological processes taking place. The method presented here shows a typical MSI workflow, from sample preparation to image acquisition, and focuses on the matrix application step, demonstrating several matrix application techniques that are useful for detecting small molecules. Once the MS images are generated, the analysis and identification of metabolites of interest is discussed and demonstrated. The standard workflow presented here can be easily modified for different tissue types, molecular species, and instrumentation.

MALDI-Mass Spectrometric Imaging for the Investigation of Metabolites in Medicago truncatula Root Nodules

Mass spectrometric imaging (MSI) is a powerful tool that can be used to discover and identify various chemical species in intact tissues, preserving the compounds in their native environments, which can provide new insights into biological processes. Herein a MSI method developed for the analysis of small molecules is described.&#160;

Imagerie MALDI-spectrométrie de masse pour l&#39;investigation des métabolites dans<em&gt; Medicago truncatula</em&gt; nodules racinaires

Most techniques used to study small molecules, such as pharmaceutical drugs or endogenous metabolites, employ tissue extracts which require the ...

Synchronization of Caulobacter Crescentus for Investigation of the Bacterial Cell Cycle

The cell cycle is important for growth, genome replication, and development in all cells. In bacteria, studies of the cell cycle have focused largely on unsynchronized cells making it difficult to order the temporal events required for cell cycle progression, genome replication, and division. Caulobacter crescentus provides an excellent model system for the bacterial cell cycle whereby cells can be rapidly synchronized in a G0 state by density centrifugation. Cell cycle synchronization experiments have been used to establish the molecular events governing chromosome replication and segregation, to map a genetic regulatory network controlling cell cycle progression, and to identify the establishment of polar signaling complexes required for asymmetric cell division. Here we provide a detailed protocol for the rapid synchronization of Caulobacter NA1000 cells. Synchronization can be performed in a large-scale format for gene expression profiling and western blot assays, as well as a small-scale format for microscopy or FACS assays. The rapid synchronizability and high cell yields of Caulobacter make this organism a powerful model system for studies of the bacterial cell cycle.

Synchronization of Caulobacter Crescentus for Investigation of the Bacterial Cell Cycle

Synchronization of bacterial cells is essential for studies of the bacterial cell cycle and development. Caulobacter crescentus is synchronizable through density centrifugation allowing a rapid and powerful tool for studies of the bacterial cell cycle. Here we provide a detailed protocol for the synchronization of Caulobacter cells.

Synchronisation de<em&gt; Caulobacter crescentus</em&gt; Des enquêtes sur le cycle cellulaire bactérienne

The cell cycle is important for growth, genome replication, and development in all cells.  In bacteria, studies of the cell cycle have focused largely on ...

Contractility Measurements on Isolated Papillary Muscles for the Investigation of Cardiac Inotropy in Mice

Papillary muscle isolated from adult mouse hearts can be used to study cardiac contractility during different physiological/pathological conditions. The contractile characteristics can be evaluated independently of external influences such as vascular tonus or neurohumoral status. It depicts a scientific approach between single cell measurements with isolated cardiac myocytes and in vivo studies like echocardiography. Thus, papillary muscle preparations serve as an excellent model to study cardiac physiology/pathophysiology and can be used for investigations like the modulation by pharmacological agents or the exploration of transgenic animal models. Here, we describe a method of isolating the murine left anterior papillary muscle to investigate cardiac contractility in an organ bath setup. In contrast to a muscle strip preparation isolated from the ventricular wall, the papillary muscle can be prepared in toto without damaging the muscle tissue severely. The organ bath setup consists of several temperature-controlled, gassed and electrode-equipped organ bath chambers. The isolated papillary muscle is fixed in the organ bath chamber and electrically stimulated. The evoked twitch force is recorded using a pressure transducer and parameters such as twitch force amplitude and twitch kinetics are analyzed. Different experimental protocols can be performed to investigate the calcium- and frequency-dependent contractility as well as dose-response curves of contractile agents such as catecholamines or other pharmaceuticals. Additionally, pathologic conditions like acute ischemia can be simulated.

Murine left ventricular papillary muscle can be used to investigate cardiac contractility in vitro. This article describes in detail the isolation and experimental protocols to study cardiac contractile characteristics.

Mesures de contractilité des muscles papillaires isolés sur pour l&#39;Investigation des inotropie cardiaque chez la souris

Papillary muscle isolated from adult mouse hearts can be used to study cardiac contractility during different physiological/pathological conditions. The ...

Improving the Accuracy of Flow Cytometric Assessment of Mitochondrial Membrane Potential in Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Through the Inhibition of Efflux Pumps

As cellular metabolism is a key regulator of hematopoietic stem cell (HSC) self-renewal, the various roles played by the mitochondria in hematopoietic homeostasis have been extensively studied by HSC researchers. Mitochondrial activity levels are reflected in their membrane potentials (&#916;&#936;m), which can be measured by cell-permeant cationic dyes such as TMRM (tetramethylrhodamine, methyl ester). The ability of efflux pumps to extrude these dyes from cells can limit their usefulness, however. The resulting measurement bias is particularly critical when assessing HSCs, as xenobiotic transporters exhibit higher levels of expression and activity in HSCs than in differentiated cells. Here, we describe a protocol utilizing Verapamil, an efflux pump inhibitor, to accurately measure &#916;&#936;m across multiple bone marrow populations. The resulting inhibition of pump activity is shown to increase TMRM intensity in hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs), while leaving it relatively unchanged in mature fractions. This highlights the close attention to dye-efflux activity that is required when &#916;&#936;m-dependent dyes are used, and as written and visualized, this protocol can be used to accurately compare either different populations within the bone marrow, or the same population across different experimental models.

Xenobiotic efflux pumps are highly active in hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and cause extrusion of TMRM, a mitochondrial membrane potential fluorescent dye. Here, we present a protocol to accurately measure mitochondrial membrane potential in HSPCs by TMRM in the presence of Verapamil, an efflux pump inhibitor.

Améliorer la précision de l'évaluation cytométrique du débit du potentiel de membrane mitochondriale dans les cellules hématopoïétiques de tige et d'ancêtre grâce à l'inhibition des pompes d'Efflux

As cellular metabolism is a key regulator of hematopoietic stem cell (HSC) self-renewal, the various roles played by the mitochondria in hematopoietic ...

Nuclei Isolation from Adult Mouse Kidney for Single-Nucleus RNA-Sequencing

The kidneys regulate diverse biological processes such as water, electrolyte, and acid-base homeostasis. Physiological functions of the kidney are executed by multiple cell types arranged in a complex architecture across the corticomedullary axis of the organ. Recent advances in single-cell transcriptomics have accelerated the understanding of cell type-specific gene expression in renal physiology and disease. However, enzyme-based tissue dissociation protocols, which are frequently utilized for single-cell RNA-sequencing (scRNA-seq), require mostly fresh (non-archived) tissue, introduce transcriptional stress responses, and favor the selection of abundant cell types of the kidney cortex resulting in an underrepresentation of cells of the medulla.
Here, we present a protocol that avoids these problems. The protocol is based on nuclei isolation at 4 &#176;C from frozen kidney tissue. Nuclei are isolated from a central piece of the mouse kidney comprised of the cortex, outer medulla, and inner medulla. This reduces the overrepresentation of cortical cells typical for whole-kidney samples for the benefit of medullary cells such that data will represent the entire corticomedullary axis at sufficient abundance. The protocol is simple, rapid, and adaptable and provides a step towards the standardization of single-nuclei transcriptomics in kidney research.

Here, we present a protocol to isolate high-quality nuclei from frozen mouse kidneys that improve the representation of medullary kidney cell types and avoids the gene expression artifacts from enzymatic tissue dissociation.

Isolement de noyaux à partir de reins de souris adultes pour le séquençage de l’ARN mononucléaire

The kidneys regulate diverse biological processes such as water, electrolyte, and acid-base homeostasis. Physiological functions of the kidney are ...

Isolation of Cardiac and Vascular Smooth Muscle Cells from Adult, Juvenile, Larval and Embryonic Zebrafish for Electrophysiological Studies

Zebrafish have long been used as a model vertebrate organism in cardiovascular research. The technical difficulties of isolating individual cells from the zebrafish cardiovascular tissues have been limiting in studying their electrophysiological properties. Previous methods have been described for dissection of zebrafish hearts and isolation of ventricular cardiac myocytes. However, the isolation of zebrafish atrial and vascular myocytes for electrophysiological characterization was not detailed. This work describes new and modified enzymatic protocols that routinely provide isolated juvenile and adult zebrafish ventricular and atrial cardiomyocytes, as well as vascular smooth muscle (VSM) cells from the bulbous arteriosus, suitable for patch-clamp experiments. There has been no literary evidence of electrophysiological studies on zebrafish cardiovascular tissues isolated at embryonic and larval stages of development. Partial dissociation techniques that allow patch-clamp experiments on individual cells from larval and embryonic hearts are demonstrated.

The present protocol describes the acute isolation of viable cardiac and vascular smooth muscle cells from adult, juvenile, larval, and embryonic zebrafish (Danio rerio), suitable for electrophysiological studies.

Isolement de cellules musculaires lisses cardiaques et vasculaires provenant de poissons-zèbres adultes, juvéniles, larvaires et embryonnaires pour des études électrophysiologiques

Zebrafish have long been used as a model vertebrate organism in cardiovascular research. The technical difficulties of isolating individual cells from the ...

Single-Cell Analysis of the Expression of Pseudomonas syringae Genes within the Plant Tissue

A plethora of pathogenic microorganisms constantly attack plants. The Pseudomonas syringae species complex encompasses Gram-negative plant-pathogenic bacteria of special relevance for a wide number of hosts. P. syringae enters the plant from the leaf surface and multiplies rapidly within the apoplast, forming microcolonies that occupy the intercellular space. The constitutive expression of fluorescent proteins by the bacteria allows for visualization of the microcolonies and monitoring of the development of the infection at the microscopic level. Recent advances in single-cell analysis have revealed the large complexity reached by clonal isogenic bacterial populations. This complexity, referred to as phenotypic heterogeneity, is the consequence of cell-to-cell differences in gene expression (not linked to genetic differences) among the bacterial community. To analyze the expression of individual loci at the single-cell level, transcriptional fusions to fluorescent proteins have been widely used. Under stress conditions, such as those occurring during colonization of the plant apoplast, P. syringae differentiates into distinct subpopulations based on the heterogeneous expression of key virulence genes (i.e., the Hrp type III secretion system). However, single-cell analysis of any given P. syringae population recovered from plant tissue is challenging due to the cellular debris released during the mechanical disruption intrinsic to the inoculation and bacterial extraction processes. The present report details a method developed to monitor the expression of P. syringae genes of interest at the single-cell level during the colonization of Arabidopsis and bean plants. The preparation of the plants and the bacterial suspensions used for inoculation using a vacuum chamber are described. The recovery of endophytic bacteria from infected leaves by apoplastic fluid extraction is also explained here. Both the bacterial inoculation and bacterial extraction methods are empirically optimized to minimize plant and bacterial cell damage, resulting in bacterial preparations optimal for microscopy and flow cytometry analysis.

Single-Cell Analysis of the Expression of Pseudomonas syringae Genes within the Plant Tissue

The present protocol describes a method that allows single-cell gene expression analysis on Pseudomonas syringae populations grown within the plant apoplast.

Analyse unicellulaire de l’expression des gènes de Pseudomonas syringae dans le tissu végétal

A plethora of pathogenic microorganisms constantly attack plants. The Pseudomonas syringae species complex encompasses Gram-negative plant-pathogenic ...

Étude du mécanisme de transport du zinc dans les cellules de mammifères avec le dosage de FluoZin-3

Characterizing Mammalian Zinc Transporters Using an In Vitro Zinc Transport Assay

Transition metals such as Zn2+ ions must be tightly regulated due to their cellular toxicity. Previously, the activity of Zn2+ transporters was measured indirectly by determining the expression level of the transporter under different concentrations of Zn2+. This was done by utilizing immunohistochemistry, measuring mRNA in the tissue, or determining the cellular Zn2+ levels. With the development of intracellular Zn2+ sensors, the activities of zinc transporters are currently primarily determined by correlating changes in intracellular Zn2+, detected using fluorescent probes, with the expression of the Zn2+ transporters. However, even today, only a few labs monitor dynamic changes in intracellular Zn2+ and use it to measure the activity of zinc transporters directly. Part of the problem is that out of the 10 zinc transporters of the ZnT family, except for ZnT10 (transports manganese), only zinc transporter 1 (ZnT1) is localized at the plasma membrane. Therefore, linking the transport activity to changes in the intracellular Zn2+ concentration is hard. This article describes a direct way to determine the zinc transport kinetics using an assay based on a zinc-specific fluorescent dye, FluoZin-3. This dye is loaded into mammalian cells in its ester form and then trapped in the cytosol due to cellular di-esterase activity. The cells are loaded with Zn2+ by utilizing the Zn2+ ionophore pyrithione. The ZnT1 activity is assessed from the linear part of the reduction in fluorescence following the cell washout. The fluorescence measured at an excitation of 470 nm and emission of 520 nm is proportional to the free intracellular Zn2+. Selecting the cells expressing ZnT1 tagged with the mCherry fluorophore allows for monitoring only the cells expressing the transporter. This assay is used to investigate the contribution of different domains of ZnT1 protein to the transport mechanism of human ZnT1, a eukaryotic transmembrane protein that extrudes excess zinc from the cell.

Pleins feux sur l’auteur : Explorer la régulation cellulaire du zinc grâce à la fonctionnalité ZnT1 

Zinc transport has proven challenging to measure due to the weak causal links to protein function and the low temporal resolution. This protocol describes a method for monitoring, with high temporal resolution, Zn2+ extrusion from living cells by utilizing a Zn2+ sensitive fluorescent dye, thus providing a direct measure of Zn2+ efflux.

Caractérisation des transporteurs de zinc chez les mammifères à l’aide d’un test in vitro de transport du zinc

Transition metals such as Zn2+ ions must be tightly regulated due to their cellular toxicity. Previously, the activity of Zn2+ transporters was measured ...