AB agradece la Fundación Nacional de Ciencia para la financiación con arreglo al programa de Cyber ​​sistemas físicos (1239243) y la División de Educación de Pregrado (1245680); y la Agencia de Defensa de Investigación Avanzada de Proyectos (DARPA) para soportar las primeras etapas de este trabajo. Las primeras etapas de este trabajo fue realizado por AB en el laboratorio del Prof. Amit Lal en la Universidad de Cornell. AB gracias Ayesa Sinha y el Prof. Lal orientación experimental y la generación de ideas en esa etapa. Manduca sexta (Linnaeus 1763) se obtuvieron de una colonia mantenida por el Departamento de Biología de la Universidad de Duke, Durham, Carolina del Norte, EE.UU.. Las polillas se utilizaron dentro de los 5 días de la eclosión. Nos gustaría dar las gracias al Triángulo Biosystems Internacional, especialmente David Juranas y Katy Millay por su excelente asistencia técnica y el uso de su sistema Neuroware. También nos gustaría dar las gracias a Will Caffey por su ayuda durante los experimentos.

NOTA: La fuente de los materiales y reactivos necesarios para seguir el protocolo se proporciona en la tabla &quot;Reactivos&quot; a continuación. 1. Preparación de placas de circuito impreso (PCB) para la grabación de electrodos de conexión NOTA: Con el fin de proporcionar un procedimiento experimental práctico, electrodos de alambre se sueldan a un PCB para insertar estos electrodos en un conector FFC (cable plano flexible). <ol><li> Corte un 0.5x5 cm 2 pieza de revestimiento de cobre laminado. </li><li> El uso de un marcador de punta fina, dibuja tres almohadillas 0.1x5cm 2 rectángulo como el grabado patrones de máscara. </li><li> Grabe el laminado expuesto usando un grabador de PCB dentro de un área ventilada o campana de humos. Cubre alrededor de 1 cm de longitud del corte laminado con cinta no reactivo. Llene un vaso graduado con al menos 100 ml de reactivo de ataque PCB y cinta del corte lámina de cobre en el interior del vaso graduado con cinta scotch. La mitad de la lámina de cobre cutout debe ser sumergido en el grabador de PCB. </li><li> Colocar el vaso de precipitados sobre una plataforma giratoria durante 20 min. </li><li> Retire el recorte de la solución de ataque y colocarlo en un vaso lleno de agua durante 10 minutos. </li><li> El uso de un pañuelo de papel, aplique alcohol isopropílico y borrar las marcas para exponer las almohadillas de cobre no grabadas. </li><li> Cortar la placa de circuitos impresos en cuadrados más pequeños de aproximadamente 1 cm de largo. </li><li> Corte dos pedazos de alambre de acero revestido, recocido, acero (0.11 &quot;revestidos, 0.008&quot; desnudos) con una cuchilla afilada para longitudes de 3 cm cada uno. Estas piezas de alambre de acero inoxidable son los electrodos activos que se pueden insertar en el tórax del insecto. </li><li> Utilizando una cuchilla, de 4-5 mm de eliminar el recubrimiento de plástico de cada extremo de cada cable. Se recomienda el uso de un microscopio. </li><li> Cortar un trozo de 0,7 cm de alambre de acero inoxidable aislado para crear una extensión de la punta del electrodo de tierra. Retire con cuidado el revestimiento con una cuchilla o derretir con el calor de un ir de soldadurasobre como se realizó en el paso 1.9. </li><li> Para la conexión a tierra, cortar una pieza de flexible (Litz o inductor) de alambre a una longitud de 4,5 cm. </li><li> Suelde la pieza 0.7 cm de acero inoxidable preparada en el paso 1.10 al cable de conexión a tierra preparada en el paso 1.11. Una punta de acero expuesto debe estar al final de la conexión a tierra. </li><li> Pegue la placa de electrodos dispuestos firmemente al espacio de trabajo de soldadura utilizando una cinta no reactivo. Utilice la cinta para enmascarar todos menos 1-2 mm de las pastillas en el tablero donde se sueldan los electrodos. Este extremo enmascarado,-soldadura libre de las almohadillas se inserta en el conector FFC descrito en el paso 4.1. </li><li> Alinear los tres hilos de los electrodos de tal manera que un extremo de cada uno puede ser soldado a las almohadillas correspondientes de la placa de electrodo. Aplicar flujo de acero inoxidable a través de los electrodos para soldadura más fácil. </li><li> Soldar cada uno de los electrodos expuestos en las almohadillas. </li><li> Sumergir los electrodos en acetona y alcohol isopropílico durante 10 mincada uno para limpiar los residuos de soldadura. El uso de un baño de ultrasonidos mejora el rendimiento de limpieza. </li></ol> 2. Inserción quirúrgica a la Manduca Sexta Pupas NOTA: Los insectos serán más activos durante las transiciones entre el día y la noche. Por lo tanto, un ciclo día / noche artificial debe establecerse dentro de una cámara de insectos utilizando temporizadores automáticos de salida. Los ajustes deben ser para simular un oscuro 7 horas y 17 ciclo de luz hr. <ol><li> Examine la sexta pupas Manduca diariamente para determinar un tiempo de inserción correspondiente. Las pupas están listos para la inserción de aproximadamente un día después de las alas presentan manchas oscuras. </li><li> Para anestesiar las pupas, colóquelos en el refrigerador (4C) por alrededor de 6 horas. </li><li> Prepare el área de trabajo de inserción. El espacio de trabajo debe incluir alcohol isopropílico, pinzas cortantes, cuchillas, y una aguja hipodérmica 30 G. Como una opción, adhesivo de cianoacrilato puede ser utilizado para mejorar la fijación del electrodo.</li><li> Esterilizar la aguja, pinzas, y los electrodos sumergiéndolos en o limpiando con alcohol isopropílico. </li><li> Retire la pupa de la nevera y la transfiere al área de trabajo. </li><li> Determine la ubicación en el tórax que corresponde al grupo muscular de interés. El enfoque de los trabajos en este ejemplo es que los músculos responsables del movimiento dorsoventrales ala carrera ascendente. </li><li> Usando un cuchillo afilado, rascar suavemente un 1x1 cm 2 rectángulo a través de la capa de exocutical. Usando las pinzas, tire lentamente estas piezas. </li><li> (Opcional) Utilice una aspiradora para eliminar el vello de ala de la región expuesta del tórax. </li><li> Introduzca lentamente la aguja alrededor de 5 mm en el mesotórax donde las alas se unen al tórax para crear dos puntos de inserción dirigidos al grupo de músculos. </li><li> Usando las pinzas, guiar a los dos electrodos de registro en los dos puntos de inserción. </li><li> (Opcional) Para mejorar la durabilidad mecánica, limpiar el pelo alrededor de los electrodosy generosamente aplicar adhesivo cianoacrilato alrededor de cada punto de inserción en el tórax con un aplicador de alambre. </li><li> Preparar una jaula para la emergencia con el material adecuado (áspero y con textura) que cubren las paredes y el techo para que el insecto puede subirse a la emergencia. Cajas de cartón perforadas o papel de embalaje se pueden utilizar. </li><li> Prepare un palo fijación rígida con una longitud en torno a 6 cm y 2 mm de diámetro. Agitadores de plástico, un hisopo de algodón, o alambres de metal se pueden utilizar para este paso. </li><li> Deslice con cuidado este palo a través del orificio debajo de la trompa que sobresale. </li><li> Fijar los dos lados de la palanca en la superficie de jaula de tal manera que la pupa no puede rodar alrededor. Coloque la pupa dentro de la jaula de manera que el mesotórax quede hacia arriba. Amplia movimiento puede causar daños en el electrodo, pérdida de hemolinfa, o hacer la inserción inútil. </li></ol> 3. Insertar el electrodo de masa en Manduca Sexta NOTA: La tierra (consultecia) electrodo debe ser insertado en las partes distales del abdomen o el tórax para evitar el acoplamiento de la señal. Esta inserción se puede hacer ya sea durante las etapas posteriores del desarrollo pupal o después de que el insecto emerge. La ventana para el electrodo de tierra tiene que estar preparado en la etapa de pupa, ya sea para una pupa o adulto etapa de inserción de electrodos de tierra. <ol><li> Para la inserción estado de pupa: después de pelar de la cutícula mesothoracic alrededor del electrodo activo (vea el paso 2.7), rayar otro rectángulo a través de la capa de exocutical (alrededor de 0.5x0.5 cm 2) en el abdomen dorsal cerca del tórax utilizando el hipodérmica 30 G aguja. Inserte el electrodo de tierra en esta ventana utilizando la técnica descrita en la sección 2. </li><li> Para adultos la inserción de electrodos de tierra etapa: una vez que ha surgido el insecto, colóquelo en el refrigerador a 4 ° C durante 6 a 24 horas para inmovilizar. Los pasos restantes son los mismos para ambos de pupa y las inserciones etapa adulta. </li><li> Preparar la inserción<html> ción del espacio de trabajo, incluido el alcohol isopropílico, pinzas cortantes, una aguja hipodérmica 30 G, adhesivo de cianoacrilato, un pedazo de alambre para la aplicación de pegamento, un cauterizador térmico (opcional) y un palo de cera dental (opcional). </li><li> Localice un punto de inserción de aproximadamente 1-2 cm de distancia de los electrodos de registro a lo largo de la parte posterior del abdomen. </li><li> Introduzca lentamente la aguja para perforar el abdomen y el proporcionar un sitio de inserción. </li><li> Usando las pinzas inserte con cuidado el electrodo de masa en el sitio de inserción y aplique presión hasta que quede 3-4 mm de profundidad. Mantenga el electrodo en su lugar y usar un alambre para aplicar pegamento alrededor del sitio de inserción. </li><li> (Opcional) Para mejorar la resistencia mecánica, utilice el cauterizador térmico y recoger un pequeño (2-3 mm) gota de cera en la punta. Coloque la punta cerca de la zona de inserción y aplicar calor de tal manera que la cera rodea el electrodo y lo mantiene firmemente en su lugar. </li></ol> 4. Preparación de la tarjeta de adaptador ontenido &quot;&gt; NOTA:. una placa de adaptador es necesario para conectar la placa del electrodo a la headstage grabación inalámbrica a través de un FFC (cable flexible plano) Conector Para ello, una tabla similar a la placa de electrodos tiene que estar preparado siguiendo los pasos 1,1 a 1,7 . <ol><li> Soldar un conector FFC a un extremo de la placa preparada. </li><li> Suelde tres 30 AWG (American Wire Gauge) conectar cables a tres almohadillas en el otro extremo. </li><li> Suelde tres conectores mini-a las tres almohadillas en la placa del adaptador para las lecturas del osciloscopio como se describe en la siguiente etapa. </li><li> Soldar el otro extremo de estos tres cables al conector de headstage. </li><li> Fije la placa de circuito headstage en parte superior del marco de la levitación. </li></ol> 5. Pregrabando con osciloscopio (Opcional) NOTA: Con el fin de evaluar la fiabilidad de los electrodos y observar la relación señal-ruido, grabaciones osciloscopio atados pueden ser obtenidos antes de desplegar la WIRELSistema de grabación de ess. Los mini conectores de cables en la placa del adaptador se debe utilizar para esto. <ol><li> Conecte el osciloscopio a un amplificador de grabación extracelular neural. Establezca los parámetros del amplificador a una frecuencia de corte de paso alto de 1 Hz, la frecuencia de corte de paso bajo de 20 kHz, y una ganancia de 100. </li><li> Conecte cada uno de los mini conectores de cable hembra de la placa del adaptador a los canales de entrada del amplificador. </li><li> Retire el insecto con el tablero electrodo implantado desde la jaula cuando está en un estado activo (durante su tiempo de la madrugada). Coloque un pedazo de papel de tejido bajo el insecto para que descanse antes de que se tomen medidas. </li><li> Usando las pinzas, deslice la placa de electrodos en el receptor FFC en el tablero de adaptador. Observar una línea de base de tensión plana y baja cuando el insecto está en reposo y la generación de electromiograma (EMG) remata mientras el insecto aletea. NOTA: Consulte la Sección 6: La observación de vuelo del insecto con el Sistema de grabación inalámbrico para representative resultados osciloscopio. </li><li> Ajuste los parámetros de visualización del osciloscopio, según sea necesario. Captura de los datos en el osciloscopio y guardar los datos. </li></ol> 6. Observación de insectos de vuelo con el sistema de grabación sin hilos NOTA: Una plataforma de levitación electromagnética se puede construir para la grabación inalámbrica de señales de EMG durante tethered vuelo Manduca sexta. La plataforma de levitación consiste en un marco diseñado para equilibrar un mecanismo de inmovilización. La levitación permite el marco, y por lo tanto el insecto, a guiñada durante la prueba sin la limitación de alambres de atadura. El marco puede ser rápida-un prototipo utilizando un modelado por deposición fundida (FDM) de la máquina. Un imán tiene que ser fijado a la parte inferior de esta trama que se levita mediante una serie de imanes en la plataforma base. El insecto está conectado al conector FFC suspendido de la parte superior del marco. Esta plataforma de levitación se encuentra en el interior de la Arena LED que fue construido using 60 paneles compuestos por una matriz de LEDs individuales 5x7. Este sistema se basa en métodos establecidos para el desarrollo de un entorno para la estimulación visual de moscas de la fruta 15, 16, 17. La arena es controlado por un microcontrolador que permite la simulación de tanto en sentido horario y en sentido antihorario de rotación así como el control de la velocidad de rotación. <ol><li> Configurar el sistema de grabación inalámbrico conectando la headstage al conector de la placa del adaptador en la plataforma de la levitación. </li><li> Retire el insecto de la jaula cuando está en un estado activo preferiblemente durante su tiempo de amanecer. </li><li> Usando las pinzas, inserte con cuidado la junta del electrodo en el receptor FFC en el marco de levitación de tal manera que el insecto se suspende firmemente dentro de la configuración. </li><li> Coloque la varita magnética cerca del interruptor magnético en la headstage para activar la transmisión inalámbrica de datos. Una luz azul se enciende para indicar que el headstage está activo. </li><li> Apague las luces de laespacio para la más completa oscuridad. Una luz roja se puede utilizar para agregar iluminación a la habitación. Abra el software de recopilación de datos de telemetría en un ordenador y seleccione el archivo de configuración precargado apropiada si se proporciona. Inicie la adquisición de datos para comenzar señales de visualización. </li><li> Seleccione la interfaz de usuario correspondiente para la observación de las señales EMG en el sistema de grabación inalámbrico para asegurar una operación de conexión y electrodos inalámbrica confiable. </li><li> Encienda todos los componentes LED Arena: Fuente de alimentación regulada y microcontroladores DC. El microcontrolador puede ajustar las revoluciones por minuto del patrón de luz cíclica y también puede controlar la dirección de la rotación de la luz. </li><li> Lentamente equilibrar la plataforma de levitación dentro de la arena. Alinear el marco por encima del centro de la base de levitación cuidadosamente, de lo contrario el marco se retiró rápidamente al suelo, posiblemente, lesionar al insecto. </li><li> Iniciar el sistema de grabación de vídeo. </li><li> Seleccione la pestaña de registro pertinente del softwareinterfaz. Designe el tiempo de grabación y el archivo Destino de almacenamiento. Elija los ajustes de salida adecuados para guardar los datos. Haga clic en el botón de inicio para iniciar una sesión de grabación en el software. Esto guardará el archivo de datos que se puede importar en entornos de cálculo numérico. </li><li> Observe que el insecto vuela en la dirección que se corresponde con el movimiento de los LEDs. Invertir el sentido de los LEDs y confirme que el insecto cambia de dirección. Realice este tantas veces como se desee. </li></ol>

<ol>
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Authors have no conflict of interest in this study.

Hay varios pasos críticos durante la inserción quirúrgica de los electrodos de registro que afectan a la capacidad de grabar datos en los pasos posteriores del protocolo. Los electrodos de registro se deben insertar en la pupa un día después de que exhibe manchas del ala en su lado dorsal. Si la inserción se realiza dos o más días después de este tiempo, el tejido del insecto no tendrá tiempo suficiente para desarrollar y estabilizar alrededor de los electrodos insertados. Esto podría dar lugar al movimiento ...

Insertando electrodos, incluso con sistemas electrónicos conectados a los insectos para aplicaciones de grabación de telemetría, ha sido un método importante para entender cómo funcionan los sistemas neuronales durante el vuelo naturales 1. Colocación o la implantación de sistemas artificiales en los insectos ha planteado muchos desafíos relacionados con el potencial para perturbar el vuelo natural de insecto. Apego superficial o la inserción quirúrgica de plataformas artificiales en el insecto adulto es poco fiable debido a la posible desplazamiento de los dispositivos insertados causadas por la inercia y el estrés inducido por las fuerzas del cuerpo-. Superficialmente unidos o electrodos insertados quirúrgicamente también son propensos a ser rechazado por los insectos como un cuerpo extraño. Además, la operación de implantación requiere la eliminación de las escamas y las pilas en todo el exoesqueleto. La capa de la cutícula gruesa también necesita ser penetrado por inervaciones quirúrgicos que pudieran causar daños colaterales al tejido, lo que interfiere con el vuelo natural de los insectos. Todos los tstos factores pueden hacer que una operación de implante quirúrgico o superficial una tarea difícil y delicada. Con el fin de resolver estos problemas implicados en la unión de los sistemas de control externo y de detección para los insectos, una metodología novedosa que implica el crecimiento metamórfico se describe en este artículo. El desarrollo metamórfico de insectos holometabolic comienza con la transformación de la larva (o ninfa) en un adulto con una fase de pupa intermedio (Figura 1). El proceso de la metamorfosis implica una extensa reprogramación tejido incluyendo la degeneración seguido de remodelación. Esta transformación se vuelve una larva terrestre a un insecto adulto que demuestra varios comportamientos complejos 2,3. La supervivencia de los insectos después de cirugías parabiotic extremas se ha demostrado donde se realizaron las cirugías durante las primeras etapas metamórficas 4,5. En estas cirugías, las caus histogénesis de desarrolloheridas quirúrgicas ed para ser reparado en duraciones más cortas. Siguiendo estas observaciones, una nueva técnica ha sido desarrollada donde se realizó la implantación de electrodos conductores de la electricidad durante las primeras etapas de crecimiento metamórfica (Figura 1). Esto permite una fijación biomecánicamente segura en el insecto 6. Una interfaz altamente fiable también se asegura con neuronal del insecto y sistemas neuromusculares 7. Esta técnica es conocida como &quot;La tecnología de inserción temprana Metamorfosis&quot; (MACI) 8. Después de la reconstrucción de todo el sistema de tejidos, estructuras insertados en la pupa surgen con el insecto adulto. Grupos de músculos de vuelo hacen hasta un 65% de la masa corporal total y torácica, por lo tanto, es un objetivo relativamente conveniente para el procedimiento EMIT 9. Durante el batir de las alas de base, los cambios en la morfología del vuelo alimentar dorsolongitudinal (dl) y el dorsoventral (DV) músculos hacen que el ala Articulatgeometría ion para generar la elevación 10. Por lo tanto la coordinación funcional de los músculos dl y DV ha sido un tema de investigación activa en virtud de la neurofisiología de vuelo. Insectos Tethering en entornos visuales programados electrónicamente ha sido el método más común para el estudio de la neurofisiología de los comportamientos locomotores complejas 11,12. Arenas cilíndricas compuestas de paneles de diodos emisores de luz han sido utilizados para estos entornos de realidad virtual, donde los insectos voladores son atados en el medio y el movimiento se simula mediante la actualización dinámica de la pantalla de visualización panorámica de los alrededores. En el caso de los insectos más pequeños, tales como mosca de la fruta Drosophila, la inmovilización se logra mediante la fijación de un pasador metálico en el tórax dorsal de la insectos y colocar el pasador en virtud de un imán permanente 13,14. Este método sólo permite la cuantificación de las respuestas motoras a través de observaciones visuales con cámaras de alta velocidad sin ningún análisis electrofisiológico. Por otra parte, esta metod ha sido ineficiente para suspender el cuerpo más grande y más pesado de Manduca sexta. Para resolver este problema, nos beneficiamos de los marcos de levitación magnética, donde Marcos peso ligero con imanes unidos a su parte inferior levitan mediante fuerzas electromagnéticas. Cuando se combina con amplificadores neuronales disponibles en el mercado y las matrices de LED, lo que proporciona una plataforma para controlar la salida del vuelo con motor y registrar la electrofisiología relacionados de Manduca sexta.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="579">
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">Coated stainless steel wire</td>
			<td style="width:113px;">A-M Systems</td>
			<td style="width:137px;">791900</td>
			<td style="width:135px;">0.008&#8217;&#8217; bare, 0.011&#8217;&#8217; coated, annealed</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Flexible electrode wire</td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:135px;">Litz or inductor wire can be used.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:195px;">Surface-mount FFC connector</td>
			<td style="width:113px;">Hirose Connector</td>
			<td style="width:137px;">FH28E-20S-0.5SH(05)</td>
			<td style="width:135px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">Tweezers</td>
			<td style="width:113px;">Grobet USA</td>
			<td style="width:137px;">N/A</td>
			<td style="width:135px;">Clean with 70% alcohol before use on the insect.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">Kim-Wipes</td>
			<td style="width:113px;">Kimberly-Clark Worldwide</td>
			<td style="width:137px;">34155</td>
			<td style="width:135px;">Any size delicate-wipe tissues can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Teflon tape</td>
			<td style="width:113px;">N/A</td>
			<td style="width:137px;">N/A</td>
			<td style="width:135px;">5 mm width Teflon tape.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:195px;">Hypodermic Needle</td>
			<td style="width:113px;">Becton Dickinson &#38; Co.</td>
			<td style="width:137px;">30511</td>
			<td style="width:135px;">20-30 gauge hypodermic needle can be used. Video showed 30 gauge.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:195px;">Rigid Fixation Stick</td>
			<td style="width:113px;">N/A</td>
			<td style="width:137px;">N/A</td>
			<td style="width:135px;">Variety of materials can be used (e.g. coffee stirrers)</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:195px;">Insect Emergence Cage</td>
			<td style="width:113px;">N/A</td>
			<td style="width:137px;">N/A</td>
			<td style="width:135px;">Plastic pet cage lined with packing paper or similar padding. Ventilation holes are needed.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:195px;">Thermal Cauterizer</td>
			<td style="width:113px;">Advanced Meditech International</td>
			<td style="width:137px;">CH-HI CT2103 (tip)</td>
			<td style="width:135px;">Optional equipment used for application of dental wax.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:195px;">Dental Wax</td>
			<td style="width:113px;">Orthomechanics LC., Broken Arrow, Oklahoma</td>
			<td style="width:137px;">N/A</td>
			<td style="width:135px;">Optional material used for stabilizing the electrodes on the insect.</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:195px;">Magnetic Levitation Platform</td>
			<td style="width:113px;">N/A</td>
			<td style="width:137px;">N/A</td>
			<td style="width:135px;">Custom designed frame fabricated in-house with 3D prototyping</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:195px;">CA40 Instant Adhesive</td>
			<td style="width:113px;">3M</td>
			<td style="width:137px;">62-3803-0330-5</td>
			<td style="width:135px;">Avoid skin contact. Use gloves when handling.</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:195px;">70% Isopropyl alcohol</td>
			<td style="width:113px;">store brand</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:135px;">Commercially available from many suppliers.</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:195px;">PCB Etchant</td>
			<td style="width:113px;">RadioShack</td>
			<td style="width:137px;">276-1535</td>
			<td style="width:135px;">Toxic if swallowed or ingested, skin irritant&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:195px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:135px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EQUIPMENT:</td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:135px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Name of Reagent/Material</td>
			<td style="width:113px;">Company</td>
			<td style="width:137px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="231">
			<td height="231" style="height:231px;width:195px;">TBSI Neuroware Software</td>
			<td style="width:113px;">Triangle Biosystems International</td>
			<td style="width:137px;">N/A</td>
			<td style="width:135px;">NeuroWare v1.4. Software for importing .nex files obtained at Technologies, N. NeuroExplorer Code and Scripts. (2012).at http://www.neuroexplorer.com/code.html</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">TBSI Wireless Recording System</td>
			<td style="width:113px;">Triangle Biosystems International</td>
			<td style="width:137px;">W5 FI</td>
			<td style="width:135px;">USB Base station, headstage unit, charger</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">16 Channel Amplifier A-C Amplifier</td>
			<td style="width:113px;">A-M Systems&#160;</td>
			<td style="width:137px;">950000</td>
			<td style="width:135px;">Model 3500 (110 V)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Oscilloscope&#160;</td>
			<td style="width:113px;">Agilent Technologies&#160;</td>
			<td style="width:137px;">DSO1014A</td>
			<td style="width:135px;">Oscilloscope, 100 MHz, 4 channel</td>
		</tr>
		<tr height="120">
			<td height="120" style="height:120px;width:195px;">Microscope</td>
			<td style="width:113px;">N/A</td>
			<td style="width:137px;">N/A</td>
			<td style="width:135px;">5x magnification microscope to assist visualization during electronics construction.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:195px;">Ultrasonic Cleaner</td>
			<td style="width:113px;">ColeParmer</td>
			<td style="width:137px;">EW-08848-10</td>
			<td style="width:135px;">Ultrasonic Cleaner with Timer,&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

early metamorphic insertion technology for insect flight behavior monitoring

Early Metamorphosis Insertion Technology (EMIT) is a novel methodology for integrating microfabricated neuromuscular recording and actuation platforms on insects during their metamorphic development. Here, the implants are fused within the structure and function of the neuromuscular system as a result of metamorphic tissue remaking. The implants emerge with the insect where the development of tissue around the electronics during pupal development results in a bioelectrically and biomechanically enhanced tissue interface. This relatively more reliable and stable interface would be beneficial for many researchers exploring the neural basis of the insect locomotion with alleviated traumatic effects caused during adult stage insertions. In this article, we implant our electrodes into the indirect flight muscles of Manduca sexta. Located in the dorsal-thorax, these main flight powering dorsoventral and dorsolongitudinal muscles actuate the wings and supply the mechanical power for up and down strokes. Relative contraction of these two muscle groups has been under investigation to explore how the yaw maneuver is neurophysiologically coordinated. To characterize the flight dynamics, insects are often tethered with wires and their flight is recorded with digital cameras. We also developed a novel way to tether Manduca sexta on a magnetically levitating frame where the insect is connected to a commercially available wireless neural amplifier. This set up can be used to limit the degree of freedom to yawing &#8220;only&#8221; while transmitting the related electromyography signals from dorsoventral and dorsolongitudinal muscle groups.

Un diagrama esquemático del procedimiento global EMIT se presenta en la Figura 1, que muestra las principales etapas en el ciclo metamórfico de la hawkmoth y los pasos de inserción de electrodos correspondientes. La inserción del electrodo se debe realizar en la fase de pupa tarde de 4 a 7 días antes de la eclosión. Esto permite que las fibras musculares que se desarrollan alrededor de los electrodos y fijar el implante en el insecto. El resultado típico de una inserc...

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Early Metamorphic Insertion Technology for Insect Flight Behavior Monitoring

We present a novel surgical procedure to implant electrodes in Manduca sexta during its early metamorphic stages. This technique allows mechanically stable and electrically reliable coupling with the neuromuscular tissue to study flight neurophysiology dynamics. We also present a novel magnetic levitation platform for tethered studies of insect yaw.

Tecnología de Inserción Metamórfica temprana para insectos de vuelo Supervisión del comportamiento

Early Metamorphosis Insertion Technology (EMIT) is a novel methodology for integrating microfabricated neuromuscular recording and actuation platforms on ...

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Research

JoVE Journal

Behavior

14.4K vistas.  North Carolina State University. We present a novel surgical procedure to implant electrodes in Manduca sexta during its early metamorphic stages. This technique allows mechanically stable and electrically reliable coupling with the neuromuscular tissue to study flight neurophysiology dynamics. We also present a novel magnetic levitation platform for tethered studies of insect yaw.

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Examining Recall Memory in Infancy and Early Childhood Using the Elicited Imitation Paradigm

The ability to recall the past allows us to report on details of previous experiences, from the everyday to the significant. Because recall memory is commonly assessed using verbal report paradigms in adults, studying the development of this ability in preverbal infants and children proved challenging. Over the past 30 years, researchers have developed a non-verbal means of assessing recall memory known as the elicited or deferred imitation paradigm. In one variant of the procedure, participants are presented with novel three-dimensional stimuli for a brief baseline period before a researcher demonstrates a series of actions that culminate in an end- or goal-state. The participant is allowed to imitate the demonstrated actions immediately, after a delay, or both. Recall performance is then compared to baseline or to performance on novel control sequences presented at the same session; memory can be assessed for the individual target actions and the order in which they were completed. This procedure is an accepted analogue to the verbal report techniques used with adults, and it has served to establish a solid foundation of the nature of recall memory in infancy and early childhood. In addition, the elicited or deferred imitation procedure has been modified and adapted to answer questions relevant to other aspects of cognitive functioning. The broad utility and application of imitation paradigms is discussed, along with limitations of the approach and directions for future research.

The elicited imitation procedure was established to examine the development of recall memory in infancy and early childhood. This procedure has been widely used to establish a solid foundation of the nature of recall memory in infancy and early childhood.

El examen de recuperación de memoria en la infancia y la niñez Uso de la imitación provocada Paradigma

The ability to recall the past allows us to report on details of previous experiences, from the everyday to the significant. Because recall memory is ...

Investigación

Comportamiento

Protocol for Data Collection and Analysis Applied to Automated Facial Expression Analysis Technology and Temporal Analysis for Sensory Evaluation

We demonstrate a method for capturing emotional response to beverages and liquefied foods in a sensory evaluation laboratory using automated facial expression analysis (AFEA) software. Additionally, we demonstrate a method for extracting relevant emotional data output and plotting the emotional response of a population over a specified time frame. By time pairing each participant's treatment response to a control stimulus (baseline), the overall emotional response over time and across multiple participants can be quantified. AFEA is a prospective analytical tool for assessing unbiased response to food and beverages. At present, most research has mainly focused on beverages. Methodologies and analyses have not yet been standardized for the application of AFEA to beverages and foods; however, a consistent standard methodology is needed. Optimizing video capture procedures and resulting video quality aids in a successful collection of emotional response to foods. Furthermore, the methodology of data analysis is novel for extracting the pertinent data relevant to the emotional response. The combinations of video capture optimization and data analysis will aid in standardizing the protocol for automated facial expression analysis and interpretation of emotional response data.

A protocol for capturing and statistically analyzing emotional response of a population to beverages and liquefied foods in a sensory evaluation laboratory using automated facial expression analysis software is described.

Protocolo para la Recolección de Datos y Análisis Aplicado a Automatizado facial Tecnología de Análisis de Expresión y Análisis temporal para la Evaluación Sensorial

We demonstrate a method for capturing emotional response to beverages and liquefied foods in a sensory evaluation laboratory using automated facial ...

An Objective and Child-friendly Assessment of Arm Function by Using a 3-D Sensor

Progressive and irreversible muscle atrophy characterizes Spinal Muscular Atrophy (SMA) and other similar muscle disorder diseases. Objective assessment of muscle functions is an essential and important, although challenging, prerequisite for successful clinical trials. Current clinical rating scales restrain the movement abnormalities to certain predefined coarse-grained individual items. The Kinect 3-D sensor has emerged as a low-cost and portable motion sensing technology used to capture and track people&#39;s movement in many medical and research fields. A novel approach using this 3-D sensor was developed and a game-like test was designed to objectively measure the upper limb function of patients with SMA. The prototype test targeted joint movement capability. While sitting in a virtual scene, the patient was instructed to extend, flex, and lift the whole arm in order to reach and place some objects. Both kinematic and spatiotemporal characteristics of upper limb movement were extracted and analyzed, e.g., elbow extension and flexion angles, hand velocity, and acceleration. The first study included a small cohort of 18 ambulant SMA patients and 19 age- and gender-matched healthy controls. A comprehensive analysis of arm movement was achieved; however, no significant difference between the groups were found due to the mismatch of patient&#39;s capability and the test difficulty. Based on this experience, a second version of the test consisting of a modified version of the first game with increased difficulties and a second game targeting muscle endurance were designed and implemented. The new test has not been conducted in any patient groups yet. Our work has demonstrated the potential capability of the 3-D sensor in assessing such muscle function and suggested an objective approach to complement the clinical rating scales.

An objective measure of muscle functions is challenging especially in children. Based on a commercially available digital 3-D sensor, a child-friendly gaming test was developed to assess upper limb function for clinical trials.

Una evaluación objetiva y respetuosa con el niño de la función del brazo utilizando un Sensor 3D

Progressive and irreversible muscle atrophy characterizes Spinal Muscular Atrophy (SMA) and other similar muscle disorder diseases. Objective assessment ...

Key Elements of Photo Attraction Bioassay for Insect Studies or Monitoring Programs

Optimized visual attractants will increase insect trapping efficiency by using the target insect&#39;s innate behaviors (positive photo-taxis) as a means to lure the insect into a population control or monitoring trap. Light emitting diodes (LEDs) have created customizable lighting options with specific wavelengths (colors), intensities, and bandwidths, all of which can be customized to the target insects. Photo-attraction behavioral bioassays can use LEDs to optimize the attractive color(s) for an insect species down to specific life history stages or behaviors (mating, feeding, or seeking shelter). Researchers must then confirm the bioassay results in the field and understand the limited attractive distance of the visual attractants.
The cloverleaf bioassay arena is a flexible method to assess photo attraction while also assessing a range of natural insect behaviors such as escape and feeding responses. The arena can be used for terrestrial or aerial insect experiments, as well as diurnal, and nocturnal insects. Data collection techniques with the arena are videotaping, counting contact with the lights, or physically collecting the insects as they are attracted towards the lights. The assay accounts for insects that make no-choice and the arenas can be single (noncompetitive) color or multiple (competitive) colors. The cloverleaf design causes insects with strong thigmotaxis to return to the center of the arena where they can view all the options in a competitive LED tests. The cloverleaf arena presented here has been used with mosquitoes, bed bugs, Hessian fly, house flies, biting midges, red flour beetles, and psocids. Bioassays are used to develop accurate and effective insect traps to guide the development and optimization of insect traps used to monitor pest population fluctuations for disease vector risk assessments, the introduction of invasive species, and/or be used for population suppression.

Photo-attraction bioassay arenas are used to determine the optimal light color(s) to maximize insect attraction; however bioassays and methods are specific to target insect behaviors and habitats. Customizable equipment and modifications are explained for nocturnal or diurnal and terrestrial or aerial insects.

Elementos clave de la prueba biológica de atracción foto insectos estudios o programas de monitoreo

Optimized visual attractants will increase insect trapping efficiency by using the target insect&#39;s innate behaviors (positive photo-taxis) as a means ...

A Wind Tunnel for Odor Mediated Insect Behavioural Assays

Olfaction is the most important sensory mechanism by which many insects interact with their environment and a wind tunnel is an excellent tool to study insect chemical ecology. Insects can locate point sources in a three-dimensional environment through the sensory interaction and sophisticated behavior. The quantification of this behavior is a key element in the development of new tools for pest control and decision support. A wind tunnel with a suitable flight section with laminar air flow, visual cues for in-flight feedback and a variety of options for the application of odors can be used to measure complex behaviour which subsequently may allow the identification of attractive or repellent odors, insect flight characteristics, visual-odor interactions and interactions between attractants and odors lingering as background odors in the environment. A wind tunnel holds the advantage of studying the odor mediated behavioural repertoire of an insect in a laboratory setting. Behavioural measures in a controlled setting provide the link between the insect physiology and field application. A wind tunnel must be a flexible tool and should easily support the changes to setup and hardware to fit different research questions. The major disadvantage to the wind tunnel setup described here, is the clean odor background which necessitates special attention when developing a synthetic volatile blend for field application.

Here, we describe the construction and use of a wind tunnel for odor mediated behavioural assays with insects. The wind tunnel design facilitates the release of odor sources by several methods, with and without visual stimuli. Wind tunnel experiments are important methods to identify behaviorally active volatile chemicals.

Un túnel de viento para olor mediada por insectos ensayos conductuales

Olfaction is the most important sensory mechanism by which many insects interact with their environment and a wind tunnel is an excellent tool to study ...

Using Flight Mills to Measure Flight Propensity and Performance of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera (LeConte)

The western corn rootworm, Diabrotica virgifera virgifera (LeConte) (Coleoptera: Chrysomelidae), is an economically important pest of corn in the northern United States. Some populations have developed resistance to management strategies including transgenic corn that produces insecticidal toxins derived from the bacterium Bacillus thuringiensis (Bt). Knowledge of western corn rootworm dispersal is of critical importance for models of resistance evolution, spread, and mitigation. Flight behavior of an insect, especially over a long distance, is inherently difficult to observe and characterize. Flight mills provide a means to directly test developmental and physiological impacts and consequences of flight in the laboratory that cannot be obtained in field studies. In this study, flight mills were used to measure the timing of flight activity, total number of flights, and the distance, duration, and speed of flights taken by female rootworms during a 22-h test period. Sixteen flight mills were housed in an environmental chamber with programmable lighting, temperature, and humidity control. The flight mill described is of a typical design, where a flight arm is free to rotate about a central pivot. Rotation is caused by flight of an insect tethered to one end of the flight arm, and each rotation is recorded by a sensor with a time-stamp. Raw data are compiled by software, which are subsequently processed to provide summary statistics for flight parameters of interest. The most difficult task for any flight mill study is attachment of the tether to the insect with an adhesive, and the method used must be tailored to each species. The attachment must be strong enough to hold the insect in a rigid orientation and to prevent detachment during movement, while not interfering with natural wing motion during flight. The attachment process requires dexterity, finesse, and speed, making video footage of the process for rootworms of value.

Using Flight Mills to Measure Flight Propensity and Performance of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera LeConte

Flight mills are important tools for comparing how age, sex, mating status, temperature, or various other factors may influence an insect&#8217;s flight behavior. Here we describe protocols to tether and measure the flight propensity and performance of western corn rootworm under different treatments.

Uso de molinos de vuelo para medir la propensión de vuelo y el rendimiento de la raíz de maíz occidental, Diabrotica virgifera virgifera (LeConte)

The western corn rootworm, Diabrotica virgifera virgifera (LeConte) (Coleoptera: Chrysomelidae), is an economically important pest of corn in the northern ...

Nest Building Behavior as an Early Indicator of Behavioral Deficits in Mice

Nest building is an innate behavior in male and female rodents, even when raised in laboratory settings. As such, many researchers provide rodents synthetic and/or natural materials (such as twine, tissue, cotton, paper, and hay) as a gauge of their overall well-being and as an ancillary assessment to predict the possible decline in cognition. Typically, changes in nesting behaviors, such as failure to create a nest, indicate a change in health or welfare. In addition, nesting behavior is sensitive to many environmental and physiological challenges, as well as many genetic mutations underlying pathological disease states. The following protocol describes a nesting behavior paradigm that explores the usage of four types of nesting material. In addition, the protocol utilizes intraclass correlations to demonstrate that inter-rater reliability is higher when nests are constructed out of shredded paper compared to other common nesting materials such as cotton squares, paper twists, and soft cob bedding. The chosen methodology and statistical considerations (i.e., intraclass correlation) for this assay may be of interest for those conducting experiments assessing the quality of living of mice.&#160;

Here, we present a protocol to quantify nest building behavior in mice, which is known to be impaired in several neurological disorders and diseases. This protocol examines the utility of four materials and offers the opportunity to quantify the rater agreement in scoring, improving the validity and reliability of the assay.

Comportamiento de la construcción de nidos como un indicador temprano de los déficits conductuales en ratones

Nest building is an innate behavior in male and female rodents, even when raised in laboratory settings. As such, many researchers provide rodents ...

A Novel Pavlovian Fear Conditioning Paradigm to Study Freezing and Flight Behavior

Fear- and anxiety-related behaviors significantly contribute to an organism&#8217;s survival. However, exaggerated defensive responses to perceived threat are characteristic of various anxiety disorders, which are the most prevalent form of mental illness in the United States. Discovering the neurobiological mechanisms responsible for defensive behaviors will aid in the development of novel therapeutic interventions. Pavlovian fear conditioning is a widely used laboratory paradigm to study fear-related learning and memory. A major limitation of traditional Pavlovian fear conditioning paradigms is that freezing is the only defensive behavior monitored. We recently developed a modified Pavlovian fear conditioning paradigm that allows us to study both conditioned freezing and flight (also known as escape) behavior within individual subjects. This model employs higher intensity footshocks and a greater number of pairings between the conditioned stimulus and unconditioned stimulus. Additionally, this conditioned flight paradigm utilizes serial presentation of pure tone and white noise auditory stimuli as the conditioned stimulus. Following conditioning in this paradigm, mice exhibit freezing behavior in response to the tone stimulus, and flight responses during the white noise. This conditioning model can be applied to the study of rapid and flexible transitions between behavioral responses necessary for survival.

Defensive behavioral responses are contingent upon threat intensity, proximity, and context of exposure. Based on these factors, we developed a classical conditioning paradigm that elicits clear transitions between conditioned freezing and flight behavior within individual subjects. This model is crucial for the understanding the pathologies involved in anxiety, panic, and post-traumatic stress disorders.

Un nuevo paradigma de acondicionamiento del miedo pavloviano para estudiar la congelación y el comportamiento del vuelo

Fear- and anxiety-related behaviors significantly contribute to an organism&#8217;s survival. However, exaggerated defensive responses to perceived threat ...

The Participant-Reported Implementation Update and Score (PRIUS): A Novel Method for Capturing Implementation-Related Data Over Time

"Implementation" of new initiatives in healthcare settings typically encompasses two distinct components: a "clinical intervention" plus accompanying "implementation strategies" that support putting the clinical intervention into day-to-day practice. A novel clinical intervention, for example, might consist of a new medication, a new protocol, a new device, or a new program. As clinical interventions are not self-implementing, however, they nearly always require effective implementation strategies in order to succeed. Implementation strategies set out to engage healthcare providers, staff and patients in ways that increase the likelihood of the new initiative being successfully adopted, a process that often involves behavior change and new ways of thinking by participants. One of the challenges in studying implementation is that it can be difficult to collect data about the status and progress of implementation, including participants' own perspectives and experiences concerning implementation to date. This protocol describes a novel method for collecting and analyzing data related to ongoing implementation called the Participant-Reported Implementation Update and Score, or PRIUS. The PRIUS method allows for the efficient and systematic capture of qualitative and quantitative data that can provide a detailed and nuanced account of implementation over time and from multiple viewpoints. This longitudinal method can enable researchers, as well as implementation leaders and organizational stakeholders, to monitor implementation progress more closely, conduct formative evaluation, identify improvement opportunities, and gauge the effect of any implementation changes on a rolling basis.

The Participant-Reported Implementation Update and Score PRIUS: A Novel Method for Capturing Implementation-Related Data Over Time

This protocol describes a novel method for collecting and analyzing data related to ongoing implementation called the Participant-Reported Implementation Update and Score (PRIUS). The PRIUS method allows for the efficient and systematic capture of data over time and from multiple viewpoints in healthcare settings.

La actualización y puntuación de implementación informada por el participante (PRIUS): un método novedoso para capturar datos relacionados con la implementación a lo largo del tiempo

"Implementation" of new initiatives in healthcare settings typically encompasses two distinct components: a "clinical intervention" plus accompanying ...

Embryo Microinjection and Knockout Mutant Identification of CRISPR/Cas9 Genome-Edited Helicoverpa Armigera (H&#252;bner)

The cotton bollworm, Helicoverpa armigera, is one of the most destructive pests in the world. A combination of molecular genetics, physiology, functional genomics, and behavioral studies has made H. armigera a model species in Lepidoptera Noctuidae. To study the in vivo functions of and interactions between different genes, clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/ associated protein 9 (Cas9) genome editing technology is a convenient and effective method used for performing functional genomic studies. In this study, we provide a step-by-step systematic method to complete gene knockout in H. armigera using the CRISPR/Cas9 system. The design and synthesis of guide RNA (gRNA) are described in detail. Then, the subsequent steps consisting of gene-specific primer design for guide RNA (gRNA) creation, embryo collection, microinjection, insect rearing, and mutant detection are summarized. Finally, troubleshooting advice and notes are provided to improve the efficiency of gene editing. Our method will serve as a reference for the application of CRISPR/Cas9 genome editing in H. armigera as well as other Lepidopteran moths.

Embryo Microinjection and Knockout Mutant Identification of CRISPR/Cas9 Genome-Edited Helicoverpa Armigera H&amp;#252;bner

Presented here is a protocol of Helicoverpa armigera (H&#252;bner) embryo microinjection and knockout mutant identification created by CRISPR/Cas9 genome editing. Mutant insects enable further research of gene function and interaction among different genes in vivo.

Microinyección embrionaria e identificación de mutantes knockout de Helicoverpa armigera editada por el genoma CRISPR/Cas9 (Hübner)

The cotton bollworm, Helicoverpa armigera, is one of the most destructive pests in the world. A combination of molecular genetics, physiology, functional ...