Damos las gracias a Michael Dubbert, Hoffmann Oliver, Scharstein Hans, Jan Sydow y Anne Wosnitza por su excelente asistencia técnica. Este estudio fue apoyado por la DFG conceder Bu 857 / 8,10 a AB

1. La superficie de paso La superficie que camina negro se compone de dos placas de metal de níquel recubierto de forma permanente se unió al lado del otro y eléctricamente aisladas entre sí por una franja de 2 mm de ancho de 2-componente adhesivo epoxi (UHU plus, UHU GmbH, Alemania) directamente debajo del eje longitudinal del el animal. Que producen una superficie total de 13.5x15.5cm (Figura 1). La separación de los planos medio de las piernas izquierda y derecha permite el control independiente de contacto tarsal de una sola pierna en cada lado. <ol><li> La placa se lubrica con una mezcla de glicerina / agua en una proporción de 95 partes de glicerina a 5 partes de NaCl saturado de solución para transmitir deslizamiento y conductividad eléctrica, la viscosidad es de aproximadamente 430cStokes (Shankar y Kumar, 1994). </li><li> La mezcla se aplica directamente sobre la superficie y se dispersa con un trozo de tejido blando para asegurar un espesor total de 0.1-0.2mm. </li></ol> 2. Configuración de la estimulación óptica <ol><li> Episodios son provocados caminar usando dos proyectores según lo descrito por Scharstein (1989) para proyectar un patrón de rayas en dos rondas, pantallas de cristal esmerilado (diámetro 130 mm, pantallas Marata, Linos Photonics, Göttingen, Alemania) que se colocan a una distancia de aprox. 70 mm de los ojos, y en un ángulo de 45 ° en la parte delantera izquierda y derecha de la placa (Fig. 1). La longitud de onda del diseño a rayas se mantiene constante en λ = 21 °. La frecuencia de cambio de los estímulos en movimiento puede variar entre 0,35, 0,72, 1,07 y 1.49Hz. Ya que la reacción de los animales depende sólo de la frecuencia ω contraste / λ (ω = velocidad angular, λ = longitud de onda patrón) si el patrón de cambio es lo suficientemente alta (Fermi y Reichhardt, 1963), que no varió a lo largo de los experimentos λ . La luminancia de las rayas brillantes en la parte del animal es de aproximadamente 15cd/m2 y el contraste 0,8. El ojo compuesto de los insectos palo (Carausio morosus) tiene 24 omatidios en el eje dorso-ventral (Friza, 1928) y algunos más en el eje rostro-caudal. A medida que el ángulo de divergencia del ojo de un insecto palo es en promedio de 6,2 ° (Jander y Volk Henrichs, 1970) nuestra longitud de onda patrón fue de aproximadamente 4 veces el ángulo de la omatidios. Los experimentos se configuran en una jaula de Faraday oscuro y se realizó en un cuarto oscuro a 20-22 ° C. </li><li> Caminar hacia adelante es inducida por un patrón progresivo en ambas pantallas, donde las rayas en cada pantalla se mueven hacia el exterior, o de un solo rayo negro sobre fondo blanco situado entre las pantallas </li><li> De giro es inducida por las rayas en movimiento en la misma dirección en ambas pantallas. No hemos encontrado una correlación entre la velocidad de las bandas en movimiento y el ángulo de la curva. Una vez que la luminancia del patrón de rayas se fija para inducir a caminar, por lo general no se precisa ningún ajuste adicional, pero se puede ajustar para diferentes animales, según las necesidades de la tensión de las lámparas de halógeno de los proyectores. </li></ol> 3. Preparación de los animales de experimentación <ol><li> Mujer insectos palo adulto (Carausio morosus) se pegan (cemento dental, ProTempII, 3M ESPE, Seefeld, Alemania) con la parte ventral hacia abajo sobre una delgada vara de balsa (3x5x100mm, WxHxL), que se inserta en un tubo de latón que tiene varios conectores. El animal se lleva a cabo durante aproximadamente un minuto hasta que la cola es por lo menos parcialmente endurecidos. </li><li> La cabeza y las piernas sobresalen de la parte frontal y lateral de la varilla para permitir su libre circulación. El área de las coxas de todas las piernas, así como la mayor parte del abdomen tiene que ser dejado libre de pegamento. </li><li> Cabeza de insecto, el tórax y los extremos distales de cada fémur y la tibia están marcados con pigmentos fluorescentes (Dr. Kremer Farbmühle, Aichstetten, Alemania) se mezcla con cemento dental para el seguimiento de video más tarde. </li></ol> 4. La colocación de electrodos EMG La actividad muscular de los músculos de la pierna diferente, como en este ejemplo, el transportador de ángulos y músculos retractores coxas, que se encuentran en el tórax y la prolongación causa (movimiento hacia adelante) y retracción (movimiento hacia atrás) de la pierna, se registra por medio de electrodos de EMG implantado en el tórax. Todos los registros de EMG son diferencialmente amplificadas. La señal fue amplificada 100 veces en un pre-amplificador (electrónica taller, Instituto Zoológico, Colonia), la banda de filtrado paso-, (100Hz-2000Hz), amplificada (10x), e importados a través de un convertidor AD en Spike2 (Vers.5.05, CED, Cambridge, UK). <ol><li> Los electrodos están hechos de cables de cobre recubiertos (ELEKTRISOLA, Eckernhagen, Alemania; diámetro exterior 47μm). Para uno de los electrodos, dos cables son los primeros untado con pegamento, entonces, los dos hilos pegajosos están trenzados uno alrededor del otro </li><li> En un extremo de los extremos de hilos trenzados se sueldan a un mini-plug. En el otro extremo de los cables se cortan los extremos para proporcionar limpio sin aislamiento para la inserción en el animal. </li><li> Los electrodos de EMG son Plugged en el conector pequeño en el extremo del tubo de latón. </li><li> Un pin minuten se usa para perforar orificios en la cutícula </li><li> Los extremos cortados de los electrodos se separan y se inserta en un músculo de aproximadamente 1 mm de distancia el uno del otro, que, en nuestra experiencia, da una buena señal-ruido. Se debe tener cuidado de no introducir los electrodos demasiado profunda en el músculo con el fin de evitar su daño. La figura 2 muestra la ubicación de los electrodos en el tórax del animal. La Figura 3 muestra un animal con los cables de electrodos en su lugar. </li><li> Nosotros usamos una pequeña gota de pegamento histoacrylic (3M Vetbond, San Pablo, MN, EE.UU.) para mantener los cables en su lugar. </li><li> Un cable de tierra se introduce en el abdomen. </li></ol> 5. Grabación del contacto del tarso Contacto del tarso se registra siempre en conjunto con los rastros de EMG. Puesto que la superficie resbaladiza se divide en dos mitades, un máximo de dos contactos del tarso contralateral pueden ser registrados en el mismo tiempo. Para ello, la pierna se utiliza como un &quot;interruptor&quot; para cerrar un circuito entre la placa y el amplificador. La corriente puede ser aplicada a las placas por separado a través de dos tomas de corriente en la base de cada plato. Podemos generar dos señales de onda cuadrada con 2-4mV amplitudes con un generador de pulsos (modelo MS501, electrónica taller, Instituto Zoológico, Colonia) que son de fase retrasada en 90 °. Las señales son atenuadas por 60dB (/ 1000) y aplicado a las dos mitades de la superficie resbaladiza. En este experimento se usan sólo una de las dos señales. Es a la vez alimenta a un lock-in-amplificador como una señal de referencia. El lock-in amplificador de dos fases (la electrónica del taller, Instituto Zoológico, Colonia) de forma selectiva sólo amplifica las señales de la misma frecuencia y fase que la señal de referencia siempre. Un segundo canal sólo detecta la señal · Fase 90 retraso. Las señales de ruido en las frecuencias que no sean la referencia de frecuencia son rechazados y no afectan la medición. La señal de salida del amplificador se alimenta a un convertidor AD (1401k Micro II, CED, Cambridge, Reino Unido) y Spike2 digitalizadas utilizando. Entre la toma de contacto y de elevación inicial del tarso en y desde la superficie resbaladiza, la corriente fluye a través de la placa tarso y la tibia en el alambre de cobre (ver a continuación: 5.3 a 5.8). El amplificador elegido tiene una alta resistencia de entrada (1MΩ) y el voltaje de la señal es muy pequeña con el fin de no afectar el comportamiento de caminar del animal. La corriente que circula por el tarso y la tibia es de entre 2 y 4NA. El plazo de entrega de señal durante la toma de contacto, entre la entrada en el lubricante y el contacto con la superficie es menor que 1 ms. La transición de la señal de contacto durante el despegue es menos pronunciada y más retraso. Esto se debe a la ruptura tardía del lubricante del tarso por un efecto de capilaridad y debido al movimiento de la pierna, sin completar el despegue en la fase de impulsión. <ol><li> El tubo de latón con el palo de balsa a la que se pega el animal se introduce en un micromanipulador para permitir el ajuste de altura del animal a entre 7 y 12 mm por encima de la superficie resbaladiza, lo que corresponde a la altura durante la marcha libre. </li><li> A fin de medir el flujo de corriente cuando el tarso del insecto de la pierna se supervisa en el suelo, un cable (47μm de diámetro) se corta en trozos de aproximadamente 15 cm de largo. </li><li> El aislamiento de una de cobre se elimina por la quema de la basura con el alcohol. </li><li> Un bucle se forma con un extremo del cable y se deslizó sobre el tarso de los animales </li><li> El lazo se ata en el extremo distal de la tibia de un buen contacto entre el animal y el alambre. </li><li> El cable se fija en el tórax del animal con una gota de pegamento de dos componentes (ProTempII, véase más arriba), y se conecta al amplificador diferencial a través de una pinza de cocodrilo. </li><li> Para mejorar la conductividad del cable en sus extremos, una gota de crema de electrodo se aplica (Marquette Hellige, Freiburg, Alemania) en las áreas de contacto. </li><li> La intensidad de la señal y luego se examina en el monitor. Debido a las propiedades del filtro de paso bajo del lock-in-amplificador (10 ms de tiempo constante) y la lift-off/touch-down gradual del tarso, la señal no es una señal cuadrada exacta. Uno tiene que fijar umbrales adecuados cerca del punto de transición para determinar el momento exacto del contacto del tarso y comprobar manualmente cada caso determinado por el software de digitalización. Con base en el contacto del tarso, que define el momento en el tarso de una pierna que se dio fue en el suelo como la posición y el momento en que estaba en el aire como la fase de impulsión. </li><li> La señal de disparo de la cámara se graba al mismo tiempo con el seguimiento de EMG y la señal de contacto del tarso, y permite un marco preciso de correlación del marco de la conducta y las huellas registradas. </li></ol> 6. Grabación óptica del movimiento de las piernas para el Análisis Digital La frecuencia de intensificación de los insectos palo en superficies resbaladizas puede alcanzar los 3-4 Hz (Graham y Cruse, 1981). <ol><li>Antes de grabar secuencias de a pie, se coloca un espejo en un ángulo de 45 ° detrás del animal para tener un monitor adicional visual para la toma de contacto. La cámara se activa el exterior y las imágenes se introducen en un PC a través de una interfaz FireWire. </li><li> Grabamos caminar secuencias de arriba con una cámara de video de alta velocidad (Marlin F-033C, Allied Vision Technologies, Stadtroda, Alemania) a 100fps para analizar los movimientos de las piernas de forma digital, y se correlacionan con la actividad de EMG y el contacto del tarso. </li><li> Durante la grabación de las secuencias de a pie, el animal se ilumina con azul matrices de LED (30-50V DC, 24cd luminancia, Electrónica Taller, Instituto de Zoología de la Universidad de Colonia), que se ajustan en la intensidad para iluminar los marcadores fluorescentes. De acuerdo con la literatura (Schlegtendal, 1934), los insectos palo no poseen visión en color y no hemos observado un efecto adverso de la iluminación de la luz ultravioleta sobre la respuesta de inflexión. Un filtro amarillo en el frontal de la lente de la cámara suprime la corta longitud de onda de la luz de activación y da un mayor contraste para las grabaciones de vídeo. </li><li> Los archivos de video pueden ser analizadas utilizando software de seguimiento de movimiento (WINanalyze, Vers.1.9, Mikromak servicio, Berlín, Alemania). </li></ol> 7. Grabación de las secuencias de Ruta <ol><li> Como control, en primer lugar una secuencia de a pie con un animal intacto se registra. </li><li> La velocidad del patrón de rayas está establecido, y el patrón y la grabación de vídeo se inicia aproximadamente al mismo tiempo. </li><li> Si el animal no se inicia la locomoción espontánea, puede ser estimulado en el abdomen con un cepillo (Bassler y Wegener, 1983), o por un soplo de aire a las antenas. En este caso, los animales tocado en el lado izquierdo del abdomen tienden a girar a la izquierda y viceversa. El patrón de rayas es mantenerse en movimiento hasta que el animal deja de caminar o hasta que al cabo de 3 minutos de grabación continua. </li><li> Con el fin de probar hasta qué punto la actividad muscular en una pierna depende de la información sensorial de las piernas de vecinos, el animal es inducido a autotomize sus piernas. El sitio de autotomía se cierra de forma natural en cuestión de segundos. Un ejemplo de un animal con el frente y las patas traseras autotomized se muestra en la Figura 3. </li><li> Por ejemplo, para los experimentos con animales que tienen una sola pierna medio, nos induce autotomía de las patas a favor y en metathoracic apretando el fémur proximal con un par de pinzas (Schmidt y Grund, 2003) o cortar las piernas a nivel de las coxas después de la grabación de los animales intactos. Después de que un mínimo de 30 minutos de tiempo de recuperación se da a los animales. </li><li> Luego grabamos nuevas secuencias de caminar como antes. En los preparativos reducida, a menudo la necesidad de inducir a pie con trazos de pintura del pincel. </li></ol> 8. Los resultados representativos: <img src="/files/ftp_upload/2629/2629fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1 Montaje experimental; A:. Fotografía de un insecto palo atado por encima de la superficie resbaladiza, marcado con pigmentos fluorescentes para el seguimiento de la pierna y por cable para la grabación de EMG y medición sin contacto del tarso. B: diagrama de cableado para la grabación de doble contacto tarsal pierna al caminar sobre la superficie resbaladiza. <img src="/files/ftp_upload/2629/2629fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Posiciones para la colocación de los electrodos de EMG en los músculos transportador y el retractor en el tórax de la pierna palo medio de insectos. ML: pierna medio, FL: frente a la pierna <img src="/files/ftp_upload/2629/2629fig3.jpg" alt="Figura 3" /> . Figura 3 insecto palo con alambres de EMG en los músculos a favor y retractor de la pierna media en el lugar, las patas delanteras y traseras se han quitado para estudiar el efecto de la presencia de las piernas de vecinos de la cinemática y la actividad muscular de las piernas en el medio la preparación reducido. <img src="/files/ftp_upload/2629/2629fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Rastro Ejemplo de retractor actividad EMG con señal de referencia de contacto tarsal en una pierna dentro de media durante el giro. En el inicio de la traza (caja azul primero) el retractor está activo durante el apoyo, mientras que la pierna tiene contacto con el suelo (&quot;circuito cerrado&quot;), lo que indica que el partido de ida hace hacia delante pasos, después de un cambio a corto (caja azul segundo), la retractor está activo durante el swing, mientras que la pierna está en el aire (&quot;circuito abierto&quot;, tercera caja azul), que muestra la existencia de pasos hacia atrás indica. <img src="/files/ftp_upload/2629/2629fig5.jpg" alt="Figura 5" /> Figura 5. Captura de pantalla de una grabación del transportador (trazo superior) y el retractor (en el centro de seguimiento) los músculos y al mismo tiempo la huella grabada en contacto tarsal (traza inferior). Tenga en cuenta la actividad alterna en las huellas de EMG, que corresponde a la actividad de los dos músculos en el ciclo de paso, que es la actividad de un transportador justo antes y duranteswing, cuando la huella de contacto del tarso señales de pérdida de contacto con el suelo, y la actividad retractor durante y después de la toma de contacto del tarso, cuando la pierna está en posición. El inserto muestra el archivo de vídeo juego correspondiente a esta grabación que se utiliza para verificar el comportamiento del animal.

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	<li>B&#228;ssler, U., Wegener, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+output+of+the+denervated+thoracic+ventral+nerve+cord+in+the+stick+insect+Carausius+morosus.">Motor output of the denervated thoracic ventral nerve cord in the stick insect Carausius morosus.</a> J. Exp. Biol. 105, 127-147 (1983).</li><li>B&#246;hm, H., Messai, E., Heinzel, H. -. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+of+command+fibres+in+free-ranging+crayfish,+Orconectes+limosus+Raf.">Activity of command fibres in free-ranging crayfish, Orconectes limosus Raf.</a> Naturwissenschaften. 84, 408-410 (1997).</li><li>B&#252;schges, A., Gruhn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanosensory+feedback+in+walking:+from+joint+control+to+locomotor+pattern.">Mechanosensory feedback in walking: from joint control to locomotor pattern.</a> Adv.Insect Physiology. 34, 194-234 (2008).</li><li>B&#252;schges, A., Akay, T., JP, G. a. b. r. i. e. l., Schmidt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organizing+network+action+for+locomotion:+insights+from+studying+insect+walking.">Organizing network action for locomotion: insights from studying insect walking.</a> Brain Res Rev. 57, 162-171 (2008).</li><li>Camhi, J. M., Levy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+a+complex+movement:+fixed+and+variable+components+of+the+cockroach+escape+behavior.">Organization of a complex movement: fixed and variable components of the cockroach escape behavior.</a> J Comp Physiol A. 163, 317-328 (1988).</li><li>Camhi, J. M., Nolen, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+the+escape+system+of+cockroaches+during+walking.">Properties of the escape system of cockroaches during walking.</a> J Comp Physiol A. 142, 339-346 (1981).</li><li>Clarac, F., Libersat, F., Pfl&#252;ger, H. J., Rathmayer, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+pattern+analysis+in+the+shore+crab+(Carcinus+maenas)+walking+freely+in+water+and+on+land.">Motor pattern analysis in the shore crab (Carcinus maenas) walking freely in water and on land.</a> J Exp Biol. 133, 395-414 (1987).</li><li>Duch, C., Pfl&#252;ger, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+patterns+for+horizontal+and+upside+down+walking+and+vertical+climbing+in+the+locust.">Motor patterns for horizontal and upside down walking and vertical climbing in the locust.</a> J Exp Biol. 198, 1963-1976 (1995).</li><li>Fermi, G., Reichhardt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optomotorische+Reaktionen+der+Fliege+Musca+domestica.+Abh&#228;ngigkeit+der+Reaktion+von+der+Wellenl&#228;nge,+der+Geschwindigkeit,+dem+Kontrast+und+der+mittleren+Leuchtdichte+bewegter+periodischer+Muster.">Optomotorische Reaktionen der Fliege Musca domestica. Abh&#228;ngigkeit der Reaktion von der Wellenl&#228;nge, der Geschwindigkeit, dem Kontrast und der mittleren Leuchtdichte bewegter periodischer Muster.</a> Kybernetik. 2, 15-28 (1963).</li><li>Fischer, H., Kautz, H., Kutsch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+radiotelemetric+2-channel+unit+for+transmission+of+muscle+potentials+during+free+flight+of+the+desert+locust,+Schistocerca+gregaria.">A radiotelemetric 2-channel unit for transmission of muscle potentials during free flight of the desert locust, Schistocerca gregaria.</a> J Neurosci Methods. 64, 39-45 (1996).</li><li>Friza, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zur+Frage+der+F&#228;rbung+und+Zeichnung+des+facettierten+Insektenauges.">Zur Frage der F&#228;rbung und Zeichnung des facettierten Insektenauges.</a> Zeitschr. f. vergl. Physiologie. 8, 289-336 (1928).</li><li>G&#246;tz, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+optomotor+reactions+in+insects.">Principles of optomotor reactions in insects.</a> Bibl. Ophthalmol. 82, 251-2559 (1972).</li><li>Gruhn, M., Rathmayer, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+implantable+electrode+design+for+both+chronic+in+vivo+nerve+recording+and+axon+stimulation+in+freely+behaving+crayfish.">An implantable electrode design for both chronic in vivo nerve recording and axon stimulation in freely behaving crayfish.</a> J Neurosci Methods. 118, 33-40 (2002).</li><li>Gruhn, M., Hoffmann, O., D&#252;bbert, M., Scharstein, H., B&#252;schges, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tethered+stick+insect+walking:+a+modified+slippery+surface+setup+with+optomotor+stimulation+and+electrical+monitoring+of+tarsal+contact.">Tethered stick insect walking: a modified slippery surface setup with optomotor stimulation and electrical monitoring of tarsal contact.</a> J Neurosci Methods. 158, 195-206 (2006).</li><li>Gruhn, M., Zehl, L., B&#252;schges, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Straight+walking+and+turning+on+a+slippery+surface.">Straight walking and turning on a slippery surface.</a> J Exp Biol. 212, 194-209 .</li><li>Gruhn, M., Uckermann, G. v. o. n., Westmark, S., Wosnitza, A., B&#252;schges, A., Borgmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+stepping+velocity+in+the+stick+insect+Carausius+morosus.">Control of stepping velocity in the stick insect Carausius morosus.</a> J Neurophysiol. 102, 1180-1192 .</li><li>Hama, N., Tsuchida, Y., Takahata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+context-dependent+modulation+of+descending+statocyst+pathways+during+free+walking,+as+revealed+by+optical+telemetry+in+crayfish.">Behavioral context-dependent modulation of descending statocyst pathways during free walking, as revealed by optical telemetry in crayfish.</a> J Exp Biol. 210, 2199-2211 (2007).</li><li>Hassenstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#220;ber+die+Wahrnehmung+der+Bewegung+von+Figuren+und+unregelm&#228;&#946;igen+Helligkeitsmustern+(nach+verhaltensphysiologischen+Untersuchungen+an+dem+R&#252;sselk&#228;fer+Chlorophanus+viridis.">&#220;ber die Wahrnehmung der Bewegung von Figuren und unregelm&#228;&#946;igen Helligkeitsmustern (nach verhaltensphysiologischen Untersuchungen an dem R&#252;sselk&#228;fer Chlorophanus viridis.</a> Zeitschr. f. vergl. Physiologie. 40, 556-592 (1958).</li><li>Jander, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Untersuchungen zum Mechanismus und zur zentralnerv&#246;sen Steuerung des Kurvenlaufs bei Stabheuschrecken (Carausius morosus) [dissertation]. , (1982).</li><li>Jander, R., Volk-Henrichs, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Das+strauch-spezifische+Perzeptorsystem+der+Stabheuschrecke+(Carausius+morosus).">Das strauch-spezifische Perzeptorsystem der Stabheuschrecke (Carausius morosus).</a> Zeitschr. f. vergl. Physiologie. 70, 425-447 (1970).</li><li>Kirschfeld, K., Zettler, F., Weiler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+resolution+of+lens+and+compound+eyes.">The resolution of lens and compound eyes.</a> Neural Principles in Vision. , 354-370 (1976).</li><li>Kutsch, W., Schwarz, G., Fischer, H., Kautz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wireless+transmission+of+muscle+potentials+during+free+flight+of+a+locust.">Wireless transmission of muscle potentials during free flight of a locust.</a> J Exp Biol. 185, 367-373 (1993).</li><li>Scharstein, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+universal+projector+for+optomotor+stimulation.">A universal projector for optomotor stimulation.</a> , (1985).</li><li>Schlegtendal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beitrag+zum+Farbensinn+der+Arthropoden.">Beitrag zum Farbensinn der Arthropoden.</a> Zeitschr. f. vergl. Physiologie. 20, 573-581 .</li><li>Schmidt, J., Grund, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rhythmic+activity+in+a+motor+axon+induced+by+axotomy.">Rhythmic activity in a motor axon induced by axotomy.</a> Neuroreport. 14, 1267-1271 (2003).</li><li>Shankar, P. N., Kumar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+Determination+of+the+Kinematic+Viscosity+of+Glycerol-Water+Mixtures.">Experimental Determination of the Kinematic Viscosity of Glycerol-Water Mixtures.</a> Proc. Mathematical and Physical Sci. 444, 573-581 (1994).</li><li>Tryba, A. K., Ritzmann, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-Joint+coordination+during+walking+and+foothold+searching+in+the+Blaberus+cockroach+I.+Kinematics+and+electromyograms.">Multi-Joint coordination during walking and foothold searching in the Blaberus cockroach I. Kinematics and electromyograms.</a> J Neurophysiol. 83, 3323-3336 .</li><li>Tryba, A. K., Ritzmann, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-Joint+coordination+during+walking+and+foothold+searching+in+the+Blaberus+cockroach.+II.+Extensor+motor+neuron+pattern.">Multi-Joint coordination during walking and foothold searching in the Blaberus cockroach. II. Extensor motor neuron pattern.</a> J Neurophysiol. 83, 3337-3350 .</li><li>Tsuchida, Y., Hama, N., Takahata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optical+telemetry+system+for+underwater+recording+of+electromyogram+and+neuronal+activity+from+non-tethered+crayfish.">An optical telemetry system for underwater recording of electromyogram and neuronal activity from non-tethered crayfish.</a> J Neurosci Methods. 137, 103-109 (2004).</li><li>Wang, H., Ando, N., Kanzaki, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+control+of+free+flight+maneuvers+in+a+hawkmoth,+Agrius+convolvuli.">Active control of free flight maneuvers in a hawkmoth, Agrius convolvuli.</a> J Exp Biol. 211, 423-432 (2008).</li></ol>

Hemos descrito una configuración que permite la generación inducida ópticamente de convertir a la conducta y permite en gran medida de la disociación de la actividad neuronal generada a pie de los efectos pasivos causados ​​por el desplazamiento mecánico de las demás partes a pie en el suelo. Flujo de información de potencial entre las piernas a través del sistema nervioso por las fuerzas de reacción del suelo o el contacto del tarso, por otro lado, todavía es posible y permite que el investigador para estudiar la influencia de dicha información en la preparación reducido. Las principales ventajas de la configuración de la superficie resbaladiza incluyen que los animales muestran una tendencia muy alta a caminar, y contrariamente a caminar o pisar una treadwheel, el animal puede realizar movimientos de balanceo y la fase de apoyo en todas las direcciones de andar natural. Además, los grados de libertad para todas las piernas que el animal pueda realizar la curva de caminar si se trata de una preparación intacta o semi-intacta. Porque las piernas no se puede mueve en forma pasiva por el simple movimiento hacia delante del animal o el movimiento del sustrato por debajo, cada movimiento refleja la potencia del motor de la pierna (Cruse, 1976; Graham y Wendler, 1981). La configuración es muy adecuado para investigar las bases neuronales de los comportamientos de adaptación, tales como dar vuelta o hacia adelante frente a caminar hacia atrás, porque se puede combinar registros electrofisiológicos de la actividad motora con el análisis de la cinemática de movimiento de las extremidades. Hemos utilizado la respuesta optomotor el insecto palo para sacar a caminar. Las respuestas de los animales al patrón de la raya de rotación se muestran dispuestos a realizar la curva de pie, mientras que atados por la superficie resbaladiza. Lo más sorprendente para nosotros, solo las piernas en una sola pierna preparados cualitativamente muestran el mismo patrón en movimiento como en el animal intacto. Así pues, tenemos razones para creer que el control de la curva de caminar puede funcionar en gran parte sin la coordinación de la información sensorial de las piernas de vecinos. Será importante para poner a prueba en los experimentos, además, si la actividad de las neuronas motoras de las piernas se elimina también influenciados por el patrón optomotor. La configuración se puede modificar fácilmente para permitir el estudio de otras tareas, como hacia adelante y caminar hacia atrás, colocando una sola raya en la parte delantera del animal o tirando suavemente de las antenas. La medición precisa del contacto con el suelo nos permite relacionar la actividad muscular y la posición de las piernas. La alta resolución temporal de esta señal de contacto eléctrico es mejor que 1 ms y nos lleva a una nueva visión sobre el momento en que el cambio de giro a la fase de apoyo. La resolución es peor para la posición de giro de transición debido a la demora en la corte de la realización de lubricante y la falta de necesidad de completar el despegue durante la prolongación de la superficie resbaladiza. Sin embargo, el conocimiento en el columpio precisa para la transición postura es un primer paso muy útil si queremos entender los mecanismos que controlan el tiempo los músculos y las actividades coordinadas de músculos de las piernas en diferentes contextos de comportamiento (ver también: Büschges et al, 2008;. Büschges y Gruhn 2008). A modo de ejemplo, se utilizó el retractor y el músculo coxas transportador de la pierna y media, precisamente relacionada su actividad con el cambio de giro a la fase de apoyo, mientras que al mismo tiempo controlar el contexto del comportamiento en el que se utilizó la pierna. Para ello, nos induce a pie y registraron la actividad muscular continua. Una pierna dado puede ser un interior o una pierna fuera, dependiendo del sentido de giro. En el partido de medio paso a paso, actuando como una pierna interior en el sentido funcional, se puede observar que los músculos retractores y transportador puede trabajar tanto como los músculos de la posición funcional, porque la pierna de forma intermitente produce retrocesos, además de un paso adelante dirigido (ver Fig. 4 ). El electromiograma (EMG) de los músculos se rectificaron y normalizado a la hora de la toma de contacto y la latencia de los picos de los músculos primero se calculó. Curiosamente, las latencias de ambos músculos en lo que respecta a depender del despegue y aterrice sobre la función del músculo como el swing o postura respectivos muscular (ver Fig. 4) y no en el propio músculo, y sólo muestran pequeñas alteraciones en la momento de inicio de actividad. La mayoría de las explicaciones para el cambio de estado de giro a la postura de asumir que las señales sensoriales de disparo de contacto tarsal del inicio de la postura. La pregunta interesante de cómo las latencias cortas entre la toma de contacto y la activación muscular en el insecto palo se produjo y en qué la información sensorial que dependen ahora se pueden abordar con la configuración modificada. En resumen, se muestra una configuración de superficie deslizante que nos permite obtener de forma fiable caminar en línea recta y la curva de los insectos palo parado. Cinemática, la actividad muscular y el tiempo de contacto del tarso hacia abajo y el despegue puede ser monitoreada y correlación en los dos diferentes de comportamiento contexts al mismo tiempo. Esto nos da una excelente herramienta para estudiar la relación detallada entre la actividad muscular y el contexto del comportamiento de una sola pierna, así como en el animal intacto y los mecanismos subyacentes.

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>2-component epoxy glue</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>UHU plus, UHU GmbH, Germany</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>glass screens (diameter 130mm)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Marata screens, Linos Photonics, G&#246;ttingen, Germany</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>dental cement</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>ProTemp II, 3M ESPE, Seefeld, Germany</td>
<td>3M Id : 70-2011-0358-0 Catalog Number : 46430</td>
<td>Available through 3M (<a href="http://www.3m.com/">http://www.3m.com/</a>)or dental suppliers</td>
</tr>
<tr>
<td>fluorescent pigments </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dr. Kremer Farbm&#252;hle, Aichstetten, Germany</td>
<td>Cat.#s: i.e 56200 Fluorescent Pigment Golden Yellow 56350 Fluorescent Pigment Flame Red</td>
<td><a href="http://kremer-pigmente.de/en">http://kremer-pigmente.de/en</a> or <a href="http://www.kremerpigments.com/
">http://www.kremerpigments.com/</a>
</td>
</tr>
<tr>
<td>histoacrylic glue </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>3M Vetbond, St.Paul, MN, USA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>supplier: WPI</td>
</tr>
<tr>
<td>coated copper wire</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Elektrisola Eckernhagen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td><a href="http://www.elektrisola.com/">http://www.elektrisola.com/</a></td>
</tr>
<tr>
<td>electrode cream </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Marquette Hellige, Freiburg, Germany</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Product is now discontinued, we suggest for example: <a href="www.grasstechnologies.com">www.grasstechnologies.com</a></td>
</tr>
<tr>
<td>pulse generator </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Model MS501, electronics workshop, Zoological Institute, Cologne, Germany</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>lock-in-amplifier </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>electronics workshop, Zoological Institute, Cologne, Germany</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>AD converter </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Micro 1401k II, CED, Cambridge, UK</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>preamplifier </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>electronics workshop, Zoological Institute, Cologne, Germany</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>high speed video camera </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Marlin F-033C, Allied Vision Technologies, Stadtroda, Germany</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>UV LED arrays </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>30-50V DC, electronics workshop, Zoological Institute, Cologne, Germany</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&lambda;390-395nm 
Luminance 24cd</td>
</tr>
<tr>
<td>Digitalizing software Spike2 </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vers.5.05, CED, Cambridge, UK</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>motion tracking software </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>(WINanalyze, Vers.1.9, Mikromak service, Berlin, Germany</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

studying the neural basis of adaptive locomotor behavior in insects

Estudiar la base neural de la conducta a pie, a menudo se enfrenta con el problema que es difícil separar la salida neuronal producido la intensificación de los movimientos de las piernas que el resultado de fuerzas pasivas y las interacciones con otras piernas a través del contacto frecuente con el sustrato. Si queremos entender, que parte de un movimiento dado se produce por la salida del sistema nervioso motor, el análisis cinemático de los movimientos paso a paso, por lo tanto, debe ser complementado con registros electrofisiológicos de la actividad motora. El registro de actividad neuronal o muscular en un animal de comportamiento es a menudo limitada por el equipo electrofisiológicos que pueden limitar el animal en su capacidad para moverse con tantos grados de libertad como sea posible. Esto puede ser evitado mediante el uso de electrodos implantables y luego tener el movimiento de animales en una correa larga (es decir, Clarac et al, 1987;. Duch y Pflüger, 1995; Böhm et al, 1997;. Gruhn y Rathmayer, 2002) o mediante la transmisión de los datos utilizando dispositivos de telemetría (Kutsch et al, 1993; Fischer et al, 1996;. Tsuchida et al 2004;. Hama et al, 2007;.. Wang et al, 2008). Ambos métodos elegante, que se utilizan con éxito en las grandes artrópodos, a menudo resultan difíciles de aplicar en los insectos más pequeños que, o bien caminar con facilidad se enredan en la cuerda larga o se ven obstaculizados por el peso del dispositivo telemétrico y sus baterías. Además, en todos estos casos, todavía es imposible distinguir entre la base puramente neuronal de la locomoción y los efectos ejercidos por acoplamiento mecánico entre las piernas caminando a través del sustrato. Una solución para este problema es llevar a cabo los experimentos en un animal atado que es libre para caminar en su lugar y que se suspendió a nivel local, por ejemplo, sobre una superficie resbaladiza, lo que elimina de forma efectiva la mecánica de contacto más baja. Esto ha sido utilizado para estudiar las respuestas de escape (Camhi y Nolen, 1981; Camhi y Levy, 1988), giro (Tryba y Ritzman, 2000a, b;. Gruhn et al, 2009a), caminando hacia atrás (Graham y Epstein, 1985) o cambios en la velocidad (Gruhn et al., 2009b) y permite que el experimentador fácil de combinar intra y extracelular fisiología con el análisis cinemático (Gruhn et al., 2006). Nosotros utilizamos una configuración de superficies resbaladizas para investigar el tiempo de músculos de las piernas en el insecto palo comportarse con respecto a la toma de contacto y de elevación inicial bajo diferentes paradigmas de comportamiento, tales como caminar en línea recta hacia adelante y curvas en los preparativos intacta y reducida.

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Studying the Neural Basis of Adaptive Locomotor Behavior in Insects

Se describe un método para registrar la actividad motora, programada para la señal de contacto eléctrico registrado en el tarso un insecto atado, caminar sobre una superficie resbaladiza. Esto se utiliza para estudiar la base neural de la conducta adaptativa bajo la influencia de la reducción de la interacción mecánica entre las piernas a través del sustrato.

Estudiar la base neural de la conducta adaptativa Locomotor en insectos

Studying the neural basis of walking behavior, one often faces the problem that it is hard to separate the neuronally produced stepping output from those ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.7K vistas.  University of Cologne. Se describe un método para registrar la actividad motora, programada para la señal de contacto eléctrico registrado en el tarso un insecto atado, caminar sobre una superficie resbaladiza. Esto se utiliza para estudiar la base neural de la conducta adaptativa bajo la influencia de la reducción de la interacción mecánica entre las piernas a través del sustrato.

Video: Studying the Neural Basis of Adaptive Locomotor Behavior in Insects

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed in sensory hairs called sensilla, which cover the surface of olfactory organs. The surface of each sensillum is covered with tiny pores, through which odorants pass and dissolve in a fluid called sensillum lymph, which bathes the sensory dendrites of the OSNs housed in a given sensillum. The OSN dendrites express odorant receptor (OR) proteins, which in insects function as odor-gated ion channels4, 5. The interaction of odorants with ORs either increases or decreases the basal firing rate of the OSN. This neuronal activity in the form of action potentials embodies the first representation of the quality, intensity, and temporal characteristics of the odorant6, 7.
Given the easy access to these sensory hairs, it is possible to perform extracellular recordings from single OSNs by introducing a recording electrode into the sensillum lymph, while the reference electrode is placed in the lymph of the eye or body of the insect. In Drosophila, sensilla house between one and four OSNs, but each OSN typically displays a characteristic spike amplitude. Spike sorting techniques make it possible to assign spiking responses to individual OSNs. This single sensillum recording (SSR) technique monitors the difference in potential between the sensillum lymph and the reference electrode as electrical spikes that are generated by the receptor activity on OSNs1, 2, 8. Changes in the number of spikes in response to the odorant represent the cellular basis of odor coding in insects. Here, we describe the preparation method currently used in our lab to perform SSR on Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae, and show representative traces induced by the odorants in a sensillum-specific manner.

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

Electrophysiological responses of olfactory sensory neurons to odorants can be measured in insects using single sensillum recordings. In this video article we will demonstrate how to perform single sensillum recordings in the antennae of the vinegar fly (Drosophila melanogaster) and the maxillary palps of the malaria mosquito (Anopheles gambiae).

Grabaciones solo Sensillum en los insectos Drosophila melanogaster Y Anopheles gambiae</em

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed ...

Investigación

Neurociencias

Studying the Integration of Adult-born Neurons

Neurogenesis occurs in adult mammalian brains in the sub-ventricular zone (SVZ) of the lateral ventricle and in the sub-granular zone (SGZ) of the hippocampal dentate gyrus throughout life. Previous reports have shown that adult hippocampal neurogenesis is associated with diverse brain disorders, including epilepsy, schizophrenia, depression and anxiety (1). Deciphering the process of normal and aberrant adult-born neuron integration may shed light on the etiology of these diseases and inform the development of new therapies.
SGZ adult neurogenesis mirrors embryonic and post-natal neuronal development, including stages of fate specification, migration, synaptic integration, and maturation. However, full integration occurs over a prolonged, 6-week period. Initial synaptic input to adult-born SGZ dentate granule cells (DGCs) is GABAergic, followed by glutamatergic input at 14 days (2). The specific factors which regulate circuit formation of adult-born neurons in the dentate gyrus are currently unknown.
Our laboratory uses a replication-deficient retroviral vector based on the Moloney murine leukemia virus to deliver fluorescent proteins and hypothesized regulatory genes to these proliferating cells. This viral technique provides high specificity and resolution for analysis of cell birth date, lineage, morphology, and synaptogenesis.
A typical experiment often employs two or three viruses containing unique label, transgene, and promoter elements for single-cell analysis of a desired developmental process in vivo. The following protocol describes a method for analyzing functional newborn neuron integration using a single green (GFP) or red (dTomato) fluorescent protein retrovirus and patch-clamp electrophysiology.

A way to study the integration of newborn dentate granule cells in adult animals is described. This technique uses an engineered retrovirus to label newborn neurons, followed by electrophysiological recordings to determine in vivo functional integration.

El estudio de la integración de los adultos nacidos en las neuronas

Neurogenesis occurs in adult mammalian brains in the sub-ventricular zone (SVZ) of the lateral ventricle and in the sub-granular zone (SGZ) of the ...

High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central nervous system (CNS). Although much is known about the molecular mechanisms that pattern the spinal cord and elicit neuronal differentiation1, 2, we lack a deep understanding of these early events at the level of cell behavior. It is thus critical to study the behavior of neural progenitors in real time as they undergo neurogenesis.
In the past, real-time imaging of early embryonic tissue has been limited by cell/tissue viability in culture as well as the phototoxic effects of fluorescent imaging. Here we present a novel assay for imaging such tissue for long periods of time, utilizing a novel ex vivo slice culture protocol and wide-field fluorescence microscopy (Fig. 1). This approach achieves long-term time-lapse monitoring of chick embryonic spinal cord progenitor cells with high spatial and temporal resolution.
This assay may be modified to image a range of embryonic tissues3, 4 In addition to the observation of cellular and sub-cellular behaviors, the development of novel and highly sensitive reporters for gene activity (for example, Notch signaling5) makes this assay a powerful tool with which to understand how signaling regulates cell behavior during embryonic development.

Imaging embryonic tissue in real-time is challenging over long periods of time. Here we present an assay for monitoring cellular and sub-cellular changes in chick spinal cord for long periods with high spatial and temporal resolution. This technique can be adapted for other regions of the nervous system and developing embryo.

Imágenes de alta resolución en vivo del comportamiento de las células en el desarrollo de neuroepitelio

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central ...

Co-analysis of Brain Structure and Function using fMRI and Diffusion-weighted Imaging

The study of complex computational systems is facilitated by network maps, such as circuit diagrams. Such mapping is particularly informative when studying the brain, as the functional role that a brain area fulfills may be largely defined by its connections to other brain areas. In this report, we describe a novel, non-invasive approach for relating brain structure and function using magnetic resonance imaging (MRI). This approach, a combination of structural imaging of long-range fiber connections and functional imaging data, is illustrated in two distinct cognitive domains, visual attention and face perception. Structural imaging is performed with diffusion-weighted imaging (DWI) and fiber tractography, which track the diffusion of water molecules along white-matter fiber tracts in the brain (Figure 1). By visualizing these fiber tracts, we are able to investigate the long-range connective architecture of the brain. The results compare favorably with one of the most widely-used techniques in DWI, diffusion tensor imaging (DTI). DTI is unable to resolve complex configurations of fiber tracts, limiting its utility for constructing detailed, anatomically-informed models of brain function. In contrast, our analyses reproduce known neuroanatomy with precision and accuracy. This advantage is partly due to data acquisition procedures: while many DTI protocols measure diffusion in a small number of directions (e.g., 6 or 12), we employ a diffusion spectrum imaging (DSI)1, 2 protocol which assesses diffusion in 257 directions and at a range of magnetic gradient strengths. Moreover, DSI data allow us to use more sophisticated methods for reconstructing acquired data. In two experiments (visual attention and face perception), tractography reveals that co-active areas of the human brain are anatomically connected, supporting extant hypotheses that they form functional networks. DWI allows us to create a "circuit diagram" and reproduce it on an individual-subject basis, for the purpose of monitoring task-relevant brain activity in networks of interest.

We describe a novel approach for simultaneous analysis of brain function and structure using magnetic resonance imaging (MRI). We assess brain structure with high-resolution diffusion-weighted imaging and white-matter fiber tractography. Unlike standard structural MRI, these techniques allow us to directly relate anatomical connectivity to functional properties of brain networks.

Co-análisis de la estructura y función cerebral mediante resonancia magnética funcional y la difusión de imágenes ponderado

The study of complex computational systems is facilitated by network maps, such as circuit diagrams. Such mapping is particularly informative when ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety of brain disorders1,2. To better understand the mechanisms by which brain circuits react to an animal's experience requires the ability to monitor the experience-dependent molecular changes in a given set of neurons, over a prolonged period of time, in the live animal. While experience and associated neural activity is known to trigger gene expression changes in neurons1,2, most of the methods to detect such changes do not allow repeated observation of the same neurons over multiple days or do not have sufficient resolution to observe individual neurons3,4. Here, we describe a method that combines in vivo two-photon microscopy with a genetically encoded fluorescent reporter to track experience-dependent gene expression changes in individual cortical neurons over the course of day-to-day experience. 
One of the well-established experience-dependent genes is Activity-regulated cytoskeletal associated protein (Arc)5,6. The transcription of Arc is rapidly and highly induced by intensified neuronal activity3, and its protein product regulates the endocytosis of glutamate receptors and long-term synaptic plasticity7. The expression of Arc has been widely used as a molecular marker to map neuronal circuits involved in specific behaviors3. In most of those studies, Arc expression was detected by in situ hybridization or immunohistochemistry in fixed brain sections. Although those methods revealed that the expression of Arc was localized to a subset of excitatory neurons after behavioral experience, how the cellular patterns of Arc expression might change with multiple episodes of repeated or distinctive experiences over days was not investigated. 
In vivo two-photon microscopy offers a powerful way to examine experience-dependent cellular changes in the living brain8,9. To enable the examination of Arc expression in live neurons by two-photon microscopy, we previously generated a knock-in mouse line in which a GFP reporter is placed under the control of the endogenous Arc promoter10. This protocol describes the surgical preparations and imaging procedures for tracking experience-dependent Arc-GFP expression patterns in neuronal ensembles in the live animal. In this method, chronic cranial windows were first implanted in Arc-GFP mice over the cortical regions of interest. Those animals were then repeatedly imaged by two-photon microscopy after desired behavioral paradigms over the course of several days. This method may be generally applicable to animals carrying other fluorescent reporters of experience-dependent molecular changes4.

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Experience-dependent molecular changes in neurons are essential for the brain's ability to adapt in response to behavioral challenges. An in vivo two-photon imaging method is described here that allows the tracking of such molecular changes in individual cortical neurons through genetically encoded reporters.

In vivo de dos fotones de imágenes de dependientes Experience-Los cambios moleculares en las neuronas corticales

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

Determination of the Spontaneous Locomotor Activity in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster has been used as an excellent model organism to study environmental and genetic manipulations that affect behavior. One such behavior is spontaneous locomotor activity. Here we describe our protocol that utilizes Drosophila population monitors and a tracking system that allows continuous monitoring of the spontaneous locomotor activity of flies for several days at a time. This method is simple, reliable, and objective and can be used to examine the effects of aging, sex, changes in caloric content of food, addition of drugs, or genetic manipulations that mimic human diseases.

Determination of the Spontaneous Locomotor Activity in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster are useful in studying genetic or environmental manipulations that affect behaviors such as spontaneous locomotor activity.&#160; Here we describe a protocol that utilizes monitors with infrared beams and data analysis software to quantify spontaneous locomotor activity.&#160;

Determinación de la actividad locomotora espontánea en<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Drosophila melanogaster has been used as an excellent model organism to study environmental and genetic manipulations that affect behavior. One such ...

Dyeing Insects for Behavioral Assays: the Mating Behavior of Anesthetized Drosophila

Mating experiments using Drosophila have contributed greatly to the understanding of sexual selection and behavior. Experiments often require simple, easy and cheap methods to distinguish between individuals in a trial. A standard technique for this is CO2 anaesthesia and then labelling or wing clipping each fly. However, this is invasive and has been shown to affect behavior. Other techniques have used coloration to identify flies. This article presents a simple and non-invasive method for labelling Drosophila that allows them to be individually identified within experiments, using food coloring. This method is used in trials where two males compete to mate with a female. Dyeing allowed quick and easy identification. There was, however, some difference in the strength of the coloration across the three species tested. Data is presented showing the dye has a lower impact on mating behavior than CO2 in Drosophila melanogaster. The impact of CO2 anaesthesia is shown to depend on the species of Drosophila, with D. pseudoobscura and D. subobscura showing no impact, whereas D. melanogaster males had reduced mating success. The dye method presented is applicable to a wide range of experimental designs.

Dyeing Insects for Behavioral Assays: the Mating Behavior of Anesthetized Drosophila

This protocol describes a simple, cost effective way to individually identify Drosophila or other insects. Demonstration data investigating mating success across three species of Drosophila show that this method is comparable or better than the use of CO2 anaesthesia.

Teñido Insectos de la Conducta ensayos: el comportamiento de apareamiento de anestesiada<em&gt; Drosophila</em

Mating experiments using Drosophila have contributed greatly to the understanding of sexual selection and behavior. Experiments often require simple, easy ...

Time-dependent Increase in the Network Response to the Stimulation of Neuronal Cell Cultures on Micro-electrode Arrays

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network dynamics in neuronal cultures. In contrast with more traditional methods, such as patch-clamping, which can only record activity from a single cell, MEAs can record simultaneously from multiple sites in a network, without requiring the arduous task of placing each electrode individually. Moreover, numerous control and stimulation configurations can be easily applied within the same experimental setup, allowing for a broad range of dynamics to be explored. One of the key dynamics of interest in these in vitro studies has been the extent to which cultured networks display properties indicative of learning. Mouse neuronal cells cultured on MEAs display an increase in response following training induced by electrical stimulation. This protocol demonstrates how to culture neuronal cells on MEAs; successfully record from over 95% of the plated dishes; establish a protocol to train the networks to respond to patterns of stimulation; and sort, plot, and interpret the results from such experiments. The use of a proprietary system for stimulating and recording neuronal cultures is demonstrated. Software packages are also used to sort neuronal units. A custom-designed graphical user interface is used to visualize post-stimulus time histograms, inter-burst intervals, and burst duration, as well as to compare the cellular response to stimulation before and after a training protocol. Finally, representative results and future directions of this research effort are discussed.

Mouse neuronal cells cultured on multi-electrode arrays display an increase in response following electrical stimulation. This protocol demonstrates how to culture neurons, how to record activity, and how to establish a protocol to train the networks to respond to patterns of stimulation.

Incremento dependiente del tiempo en la respuesta de la red a la estimulación de cultivos de células neuronales en matrices de microelectrodos

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network ...

High-throughput Analysis of Locomotor Behavior in the Drosophila Island Assay

Advances in next-generation sequencing technologies contribute to the identification of (candidate) disease genes for movement disorders and other neurological diseases at an increasing speed. However, little is known about the molecular mechanisms that underlie these disorders. The genetic, molecular, and behavioral toolbox of Drosophila melanogaster makes this model organism particularly useful to characterize new disease genes and mechanisms in a high-throughput manner. Nevertheless, high-throughput screens require efficient and reliable assays that, ideally, are cost-effective and allow for the automatized quantification of traits relevant to these disorders. The island assay is a cost-effective and easily set-up method to evaluate Drosophila locomotor behavior. In this assay, flies are thrown onto a platform from a fixed height. This induces an innate motor response that enables the flies to escape from the platform within seconds. At present, quantitative analyses of filmed island assays are done manually, which is a laborious undertaking, particularly when performing large screens.
This manuscript describes the &#34;Drosophila Island Assay&#34; and &#34;Island Assay Analysis&#34; algorithms for&#160;high-throughput, automated data processing and quantification of island assay data. In the setup, a simple webcam connected to a laptop collects an image series of the platform while the assay is performed. The &#34;Drosophila Island Assay&#34; algorithm developed for the open-source software Fiji processes these image series and quantifies, for each experimental condition, the number of flies on the platform over time. The &#34;Island Assay Analysis&#34; script, compatible with the free software R, was developed to automatically process the obtained data and to calculate whether treatments/genotypes are statistically different. This greatly improves the efficiency of the island assay and makes it a powerful readout for basic locomotion and flight behavior. It can thus be applied to large screens investigating fly locomotor ability, Drosophila models of movement disorders, and drug efficacy.

High-throughput Analysis of Locomotor Behavior in the Drosophila Island Assay

The island assay is a relatively new, cost-effective assay that can be used to evaluate the basic locomotor behavior of Drosophila melanogaster. This manuscript describes algorithms for automatic data processing and objective quantification of island assay data, making this assay a sensitive, high-throughput readout for large genetic or pharmacological screens.

Análisis de alto rendimiento del comportamiento Locomotor en el ensayo de la isla de Drosophila

Advances in next-generation sequencing technologies contribute to the identification of (candidate) disease genes for movement disorders and other ...

Measuring Neural Mechanisms Underlying Sleep-Dependent Memory Consolidation During Naps in Early Childhood

Sleep is critical for daily functioning. One important function of sleep is the consolidation of memories, a process that makes them stronger and less vulnerable to interference. The neural mechanisms underlying the benefit of sleep for memory can be investigated using polysomnography (PSG). PSG is a combination of physiological recordings including signals from the brain (EEG), eyes (EOG), and muscles (EMG) that are used to classify sleep stages. In this protocol, we describe how PSG can be used in conjunction with behavioral memory assessments, actigraphy, and parent-report to examine sleep-dependent memory consolidation. The focus of this protocol is on early childhood, a period of significance as children transition from biphasic sleep (consisting of a nap and overnight sleep) to monophasic sleep (overnight sleep only). The effects of sleep on memory performance are measured using a visuospatial memory assessment across periods of sleep and wakeful-rest. A combination of actigraphy and parent report is used to assess sleep rhythms (i.e., characterizing children as habitual or non-habitual nappers). Finally, PSG is used to characterize sleep stages and qualities of those stages (such as frequencies and the presence of spindles) during naps. The advantage of using PSG is that it is the only tool currently available to assess sleep quality and sleep architecture, pointing to the relevant brain state that supports memory consolidation. The main limitations of PSG are the length of time it takes to prepare the recording montage and that recordings are typically taken over one sleep bought. These limitations can be overcome by engaging young participants in distracting tasks during application and combining PSG with actigraphy and self/parent-report measures to characterize sleep cycles. Together, this unique combination of methods allows for investigations into how naps support learning in preschool children.

This protocol describes methods used to examine neural mechanisms underlying sleep-dependent memory consolidation during naps in early childhood. It includes procedures for examining the effect of sleep on behavioral memory performance, as well as the application and recording of both polysomnography and actigraphy.

Medición de los mecanismos neuronales subyacentes a la consolidación de la memoria dependiente del sueño durante las siestas en la primera infancia

Sleep is critical for daily functioning. One important function of sleep is the consolidation of memories, a process that makes them stronger and less ...