AB ringrazia la National Science Foundation per il finanziamento nell&#39;ambito del programma Cyber ​​sistemi fisici (1239243) e di divisione dei Undergraduate Education (1245680); e l&#39;Agenzia della Difesa Advanced Research Progetto (DARPA) per sostenere le prime fasi di questo lavoro. Le tappe precedenti di questo lavoro è stata effettuata da AB nel laboratorio del Prof. Amit Lal presso la Cornell University. AB grazie Ayesa Sinha e il Prof. Lal di orientamento sperimentale e la generazione di idee in quella fase. Manduca Sexta (Linnaeus 1763) sono stati ottenuti da una colonia gestito dal Dipartimento di Biologia presso la Duke University, Durham, NC, USA. Falene sono stati utilizzati entro 5 giorni di eclosion. Vorremmo ringraziare Triangolo Biosystems internazionale, in particolare David Juranas e Katy Millay per la loro eccellente assistenza tecnica e l&#39;uso del loro sistema Neuroware. Vorremmo anche ringraziare Will Caffey per il suo aiuto durante gli esperimenti.

NOTA: L&#39;origine dei materiali e reagenti necessari per seguire il protocollo è previsto nella tabella &quot;reagenti&quot; qui sotto. 1. Preparazione di circuiti stampati (PCB) per la registrazione elettrodo Connection NOTA: Al fine di fornire una procedura pratica sperimentale, elettrodi a filo sono saldati ad un PCB di inserire questi elettrodi in un connettore FFC (cavo piatto flessibile). <ol><li> Tagliare una 0.5x5 cm 2 pezzo di rame rivestito in laminato. </li><li> Con un pennarello a punta fine, disegnare tre pastiglie 0.1x5cm 2 rettangolo come acquaforte modelli di maschera. </li><li> Etch il laminato esposto utilizzando un etchant PCB all&#39;interno di una zona ventilata o cappa. Coprire circa 1 cm di lunghezza del ritaglio laminato con del nastro non reattivo. Riempire un bicchiere graduato con almeno 100 ml di PCB mordenzante e il nastro il ritaglio laminato di rame all&#39;interno del bicchiere graduato con lo scotch. Metà del cutou laminato di ramet deve essere immerso nel mordenzante PCB. </li><li> Porre il bicchiere su una piattaforma rotante per 20 min. </li><li> Togliere il ritaglio dal mordenzante e metterlo in un bicchiere pieno d&#39;acqua per 10 minuti. </li><li> Utilizzando una carta velina, applicare alcool isopropilico e rimuovere i marcatori per esporre le piazzole di rame non inciso. </li><li> Tagliare il circuito stampato in piccoli quadrati lungo circa 1 cm. </li><li> Tagliate due pezzi di filo rivestito, ricotto, acciaio inox (0,11 &quot;rivestiti, 0.008&quot; nudi) con una lama affilata di lunghezza di 3 cm ciascuno. Questi pezzi di filo di acciaio inossidabile sono gli elettrodi attivi che verranno inseriti nel torace dell&#39;insetto. </li><li> Utilizzando una lama, rimuovere 4-5 mm del rivestimento di plastica da ciascuna estremità di ciascun filo. Si raccomanda l&#39;uso di un microscopio. </li><li> Tagliare un 0,7 centimetri pezzo di filo in acciaio inox coibentato per creare un&#39;estensione di punta per l&#39;elettrodo di massa. Rimuovere delicatamente il rivestimento con una lama o fondere con il calore di una ir saldaturacome previsto al passaggio 1.9. </li><li> Per il collegamento di terra, tagliare un pezzo di flessibile (Litz o induttore) filo ad una lunghezza di 4,5 cm. </li><li> Saldare il 0,7 centimetri pezzo di acciaio inossidabile preparato in fase 1.10 al filo di collegamento a terra preparato al punto 1.11. Una punta acciai inossidabili esposti dovrebbe essere alla fine del collegamento a terra. </li><li> Nastro il consiglio elettrodo preparato saldamente al lavoro di saldatura utilizzando un nastro non reattivo. Utilizzare il nastro per mascherare tutti, ma 1-2 mm delle pastiglie sul tabellone in cui verranno saldati gli elettrodi. Questo, estremità mascherato senza saldatura dei pad verrà inserito nel connettore FFC descritto al punto 4.1. </li><li> Allineare i tre fili elettrodi in modo tale che una estremità di ciascun possono essere saldati ai pad corrispondenti sulla scheda elettrodo. Applicare flusso in acciaio inox attraverso gli elettrodi per facilitare la saldatura. </li><li> Saldare ciascuno degli elettrodi esposti sui pad. </li><li> Immergere gli elettrodi in acetone e alcool isopropilico per 10 minciascuno per pulire i residui di saldatura. Uso di un bagno ad ultrasuoni di migliorare il rendimento di pulizia. </li></ol> 2. Inserimento chirurgica per la Manduca Sexta Pupae NOTA: Gli insetti saranno più attive durante le transizioni tra giorno e notte. Pertanto, un ciclo giorno / notte artificiale dovrebbe essere istituito all&#39;interno di una camera di insetto con timer di uscita automatici. Questi dovrebbero essere impostati per simulare un oscuro 7 ore e 17 ciclo di luce hr. <ol><li> Esaminare la Sesta pupe Manduca giornaliero per determinare un tempo di inserimento appropriato. Le pupe sono pronti per l&#39;inserimento di circa un giorno dopo le ali presentano macchie scure. </li><li> Per anestetizzare le pupe, metterli in frigorifero (4C) per circa 6 ore. </li><li> Preparare l&#39;area di lavoro di inserimento. L&#39;area di lavoro dovrebbe includere alcool isopropilico, pinzette taglienti, lame e un ago ipodermico G 30. Come opzione, cianoacrilato può essere utilizzato per migliorare la fissazione elettrodo.</li><li> Sterilizzare l&#39;ago, pinzette, e gli elettrodi immergendoli in o pulire con alcol isopropilico. </li><li> Rimuovere la pupa dal frigorifero e trasferirlo al lavoro. </li><li> Determinare la posizione sul torace che corrisponde al gruppo muscolare di interesse. Il focus del lavoro in questo esempio è i muscoli dorsoventrale responsabili per il movimento dell&#39;ala salita. </li><li> Utilizzando una lama affilata, graffiare delicatamente un 1x1 cm 2 rettangolo attraverso lo strato exocutical. Usando le pinzette, lentamente staccare questi pezzi. </li><li> (Facoltativo) Utilizzare un aspirapolvere per rimuovere i capelli ala dalla regione esposta del torace. </li><li> Lentamente inserire l&#39;ago circa 5mm in mesothorax dove le ali si attaccano al torace per creare due punti di inserimento rivolti al gruppo muscolare. </li><li> Usando le pinzette, guidare i due elettrodi di registrazione nei due punti di inserimento. </li><li> (Facoltativo) Per migliorare la durabilità meccanica, pulire il pelo intorno agli elettrodie generosamente applicare l&#39;adesivo cianoacrilato attorno a ciascun punto di inserimento sul torace con un applicatore filo. </li><li> Preparare una gabbia per emergere con materiale adeguato (ruvida e strutturato) che coprono le pareti e il soffitto in modo che l&#39;insetto può salire su di emergere. Possono essere utilizzate scatole di cartone perforate o carta da imballaggio. </li><li> Preparare un bastone fissaggio rigido con lunghezza di circa 6 cm, diametro di 2 mm. Agitatori in plastica, un bastoncino di cotone o fili metallici possono essere usati per questo passo. </li><li> Far scorrere delicatamente questo bastone attraverso il foro sotto la proboscide sporgente. </li><li> Fissare entrambi i lati del bastone sulla superficie gabbia tale che la pupa non può rotolare intorno. Posizionare la pupa all&#39;interno della gabbia in modo che il mesothorax sia rivolto verso l&#39;alto. Ampio movimento potrebbe danneggiare l&#39;elettrodo, perdita di emolinfa, o rendere inutile l&#39;inserimento. </li></ol> 3. Inserimento della terra elettrodo in Manduca Sexta NOTA: Il terreno (vediza) elettrodo deve essere inserito nelle parti addome o distali del torace per evitare l&#39;accoppiamento del segnale. Questo inserimento può essere fatto sia durante le fasi successive di sviluppo pupa o dopo l&#39;insetto emerge. La finestra per l&#39;elettrodo di massa deve essere preparato in fase di pupa sia per una pupa o la fase adulta inserimento elettrodo di massa. <ol><li> Per l&#39;inserimento stadio di pupa: dopo la pelatura della cuticola mesothoracic intorno l&#39;elettrodo attivo (vedi punto 2.7), graffiare un altro rettangolo attraverso lo strato exocutical (circa 0.5x0.5 cm 2) sull&#39;addome dorsale vicino al torace utilizzando il 30 G ipodermica ago. Inserire l&#39;elettrodo di massa in questa finestra usando la tecnica descritta nella sezione 2. </li><li> Per l&#39;adulto inserimento elettrodo di massa tappa: una volta che l&#39;insetto è emerso, metterlo in frigorifero a 4 ° C per 6-24 ore per immobilizzare. Le fasi successive sono le stesse per entrambi pupa e inserimenti stadio adulto. </li><li> Preparare il inseri<html> zione di lavoro compreso l&#39;alcool isopropilico, pinzette taglienti, un ago ipodermico G 30, cianoacrilato, un pezzo di filo per l&#39;applicazione di colla, un cauterizer termica (opzionale), e un bastone di cera dentale (opzionale). </li><li> Individuare il punto di inserimento di circa 1-2 cm di distanza dagli elettrodi di registrazione lungo l&#39;addome posteriore. </li><li> Lentamente inserire l&#39;ago per perforare l&#39;addome e fornire un sito di inserimento. </li><li> Con una pinzetta inserire con cautela l&#39;elettrodo di terra nel sito di inserimento ed applicare la pressione fino a quando è di 3-4 mm di profondità. Tenere l&#39;elettrodo in posizione e usare un filo per applicare colla intorno al sito di inserzione. </li><li> (Facoltativo) Per migliorare la resistenza meccanica, utilizzare il cauterizer termico e raccogliere un piccolo (2-3 mm) di cera sulla punta. Posizionare la punta vicino al sito di inserzione e applicare tale calore che la cera circonda l&#39;elettrodo e lo tiene saldamente in posizione. </li></ol> 4. Preparazione della scheda adattatore ONTENUTO &quot;&gt;. NOTA: Una scheda adattatore è necessario per collegare la scheda elettrodo headstage di registrazione wireless attraverso un connettore FFC (Flat Flexible Cable) Per questo, una tavola simile alla scheda elettrodo deve essere preparato seguendo i passi da 1.1 a 1.7 . <ol><li> Saldare un connettore FFC ad una estremità della tavola preparata. </li><li> Saldare tre 30 AWG (American Wire Gauge) collegare i fili a tre pastiglie all&#39;altra estremità. </li><li> Saldare tre mini connettori ai tre rilievi sulla scheda adattatore per le letture oscilloscopio come descritto nella fase successiva. </li><li> Saldare l&#39;altra estremità di questi tre fili al connettore headstage. </li><li> Fissare il circuito headstage sulla parte superiore del telaio levitazione. </li></ol> 5. Preregistrazione con oscilloscopio (opzionale) NOTA: Al fine di valutare l&#39;affidabilità degli elettrodi e osservare il rapporto segnale-rumore, registrazioni frenati dell&#39;oscilloscopio possono essere ottenuti prima di distribuire il wirelsistema di registrazione ess. I mini cavi di collegamento sulla scheda adattatore deve essere usato per questo. <ol><li> Collegare l&#39;oscilloscopio ad un amplificatore di registrazione neurale extracellulare. Impostare i parametri di amplificazione ad un passa-alto frequenza di cut-off di 1 Hz, un passa-basso frequenza di taglio di 20 kHz, e un guadagno di 100. </li><li> Collegare ciascuno dei connettori femmina a filo mini sulla scheda adattatore per i canali di ingresso dell&#39;amplificatore. </li><li> Rimuovere l&#39;insetto con il bordo elettrodo impiantato dalla gabbia quando è in uno stato attivo (durante il suo tempo alba). Posizionare un pezzo di carta velina sotto l&#39;insetto per riposare prima di effettuare le misurazioni. </li><li> Usando le pinzette, far scorrere la scheda elettrodo nel recettore FFC sulla scheda adattatore. Osservare una linea di base piatta e bassa tensione quando l&#39;insetto è a riposo e la generazione di elettromiografia (EMG) punte come l&#39;insetto sbatte le ali. NOTA: fare riferimento alla Sezione 6: Osservare volo degli insetti con il sistema di registrazione senza fili per representative risultati oscilloscopio. </li><li> Regolare i parametri di visualizzazione dell&#39;oscilloscopio come necessario. Catturare i dati sull&#39;oscilloscopio e salvare i dati. </li></ol> 6. Observing Insetto volo con il sistema di registrazione Wireless NOTA: Una piattaforma levitazione elettromagnetica può essere costruito per la registrazione wireless di segnali EMG durante tethered volo sexta Manduca. La piattaforma levitazione costituita da un telaio progettato per bilanciare un meccanismo tethering. La levitazione consente al frame, e quindi l&#39;insetto, di imbardata durante la prova senza la costrizione di fili di legatura. Il telaio può essere rapido prototipo utilizzando un Fused Deposition Modeling (FDM) macchina. Un magnete deve essere fissato alla base di questo telaio da sollevare da una serie di magneti nella piattaforma di base. L&#39;insetto è collegato al connettore FFC sospeso dalla parte superiore del telaio. Questa piattaforma levitante si trova all&#39;interno dell&#39;Arena LED che è stato costruito using 60 pannelli composti da una serie di singoli LED 5x7. Questo sistema era basato su metodi stabiliti per lo sviluppo di un ambiente per la stimolazione visiva di frutta mosche 15, 16, 17. L&#39;arena è controllato da un microcontrollore che permette di simulazione sia in senso orario che antiorario di rotazione e il controllo della velocità di rotazione. <ol><li> Impostare il sistema di registrazione wireless collegando il headstage al connettore della scheda adattatore sulla piattaforma levitazione. </li><li> Rimuovere l&#39;insetto dalla gabbia quando è in uno stato attivo preferibilmente durante il suo tempo di Alba. </li><li> Usando le pinzette, inserire con attenzione la scheda elettrodo nel recettore FFC sul telaio levitare in modo tale che l&#39;insetto è sospesa saldamente all&#39;interno del setup. </li><li> Posizionare la bacchetta magnetici vicino l&#39;interruttore magnetico sul headstage per attivare la trasmissione dati senza fili. Una luce blu si accende per indicare che il headstage è attivo. </li><li> Spegnere le luci inspazio per completa oscurità. Una luce rossa può essere utilizzata per aggiungere illuminazione per la stanza. Aprire il software di raccolta dati di telemetria su un computer e selezionare il file di configurazione precaricata appropriato, se disponibile. Avviare l&#39;acquisizione dati per iniziare segnali di visualizzazione. </li><li> Selezionare l&#39;interfaccia utente rilevante per l&#39;osservazione dei segnali EMG dal sistema di registrazione wireless per garantire un collegamento ed elettrodo funzionamento wireless affidabile. </li><li> Accendere tutti i componenti LED Arena: regolamentata alimentazione e microcontrollori DC. Il microcontrollore può regolare i giri al minuto del modello di luce ciclico e può anche controllare la direzione di rotazione della luce. </li><li> Lentamente bilanciare la piattaforma levitazione all&#39;interno dell&#39;arena. Allineare la cornice di sopra del centro della base levitazione attenzione, altrimenti il ​​frame verrà tirato rapidamente a terra possibilmente ferire l&#39;insetto. </li><li> Avviare il sistema di registrazione video. </li><li> Selezionare la scheda di registrazione dedicata del softwareinterfaccia. Designare il tempo di registrazione e file di salvataggio di destinazione. Scegliere le impostazioni di output appropriate per salvare i dati. Fare clic sul pulsante Start per avviare una sessione di registrazione all&#39;interno del software. Ciò salverà il file di dati che può essere importato in ambienti di calcolo numerico. </li><li> Osservare come l&#39;insetto vola nella direzione che corrisponde con il movimento dei LED. Invertire la direzione dei LED e confermare che l&#39;insetto inverte la direzione. Eseguire questo tutte le volte che lo desideri. </li></ol>

<ol>
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Authors have no conflict of interest in this study.

Ci sono diversi passaggi critici durante l&#39;inserimento chirurgico degli elettrodi di registrazione che influenzano la capacità di registrare dati nelle fasi successive del protocollo. Gli elettrodi di registrazione devono essere inseriti pupa un giorno dopo esibendo macchie ala sul lato dorsale. Se l&#39;inserimento viene effettuato due o più giorni dopo questo periodo, tessuto dell&#39;insetto non avrà abbastanza tempo per sviluppare intorno e stabilizzare gli elettrodi inseriti. Questo potrebbe portare a movime...

Inserimento di elettrodi, anche con sistemi elettronici collegati a insetti per applicazioni di registrazione telemetrici, è stato un metodo importante per capire come funzionano i sistemi neurali durante il volo naturale 1. Collegamento o impiantare sistemi artificiali in insetti ha posto molte sfide che coinvolgono il potenziale per disturbare il volo naturale dell&#39;insetto. Attaccamento superficiale o inserimento chirurgico di piattaforme artificiali sulla insetto adulto è inaffidabile a causa della possibile spostamento dei dispositivi inseriti causati da inerziali e lo stress le forze indotte corpo. Superficialmente attaccati o elettrodi inseriti chirurgicamente sono anche soggetti a essere riprovato dagli insetti come un corpo estraneo. Inoltre l&#39;operazione di impianto richiede la rimozione di scale e pali intorno l&#39;esoscheletro. Lo strato spessa cuticola ha anche bisogno di essere penetrato per innervazioni chirurgiche che potrebbero causare danni ai tessuti collaterali, interferendo così con il volo naturale dell&#39;insetto. Tutte le tfattori ueste possono fare un chirurgico o superficiale operazione di impianto un compito impegnativo e delicato. Al fine di alleviare tali preoccupazioni coinvolti nel fissare esternamente sistemi di controllo e rilevazione per gli insetti, una nuova metodologia che coinvolge la crescita metamorfica sarà descritto in questo articolo. Lo sviluppo metamorfico di insetti holometabolic inizia con la trasformazione della larva (o ninfa) in un adulto con uno stadio di pupa intermedia (Figura 1). Il processo di metamorfosi coinvolge una vasta riprogrammazione dei tessuti tra cui la degenerazione seguita da rimodellamento. Questa trasformazione trasforma una larva terrestre ad un adulto insetto dimostrando diversi comportamenti complessi 2,3. La sopravvivenza degli insetti dopo interventi chirurgici parabiotic estreme è stata dimostrata, dove sono stati eseguiti interventi chirurgici durante le prime fasi metamorfiche 4,5. In questi interventi, i Caus istogenesi di sviluppoferite chirurgiche ED per essere riparati in durate più brevi. A seguito di queste osservazioni, una nuova tecnica è stata sviluppata in cui è stata eseguita l&#39;impianto di elettrodi elettricamente conduttivi durante i primi stadi di crescita metamorfica (Figura 1). Ciò consente un fissaggio sicuro biomeccanicamente sulla insetto 6. Un&#39;interfaccia estremamente affidabile è inoltre assicurata con neurale dell&#39;insetto e sistemi neuromuscolari 7. Questa tecnica è conosciuta come &quot;Early Metamorphosis inserimento Technology&quot; (EMIT) 8. Dopo la ricostruzione dell&#39;intero sistema tessuto, strutture inserite nel pupa emergono con l&#39;insetto adulto. Gruppi muscolari ponti rendono fino al 65% della massa totale del corpo toracica e, quindi, è un bersaglio relativamente conveniente per la procedura EMIT 9. Durante il battito delle ali di base, i cambiamenti nella morfologia del volo alimentare dorsolongitudinal (dl) e il dorsoventral (dv) muscoli causano il articulat alageometria ione per generare cremagliera 10. Pertanto, il coordinamento funzionale del dl e dv muscoli è stato un argomento di ricerca attiva in neurofisiologia volo. Insetti tethering in ambienti visivi programmati elettronicamente è stato il metodo più comune per lo studio della neurofisiologia di complessi comportamenti locomotore 11,12. Arene cilindrici composti da pannelli di diodi emettitori di luce sono stati utilizzati per questi ambienti di realtà virtuale, in cui gli insetti volanti sono legati al centro e il movimento è simulato attraverso l&#39;aggiornamento dinamico la visualizzazione panoramica circostante. Nel caso di piccoli insetti, come frutta Drosophila, tethering sono ottenute applicando un perno metallico al torace dorsale dell&#39;insetto e posizionando il perno sotto un magnete permanente 13,14. Questo metodo consente la quantificazione delle risposte motorie solo attraverso osservazioni visive con telecamere ad alta velocità, senza alcuna analisi elettrofisiologiche. Inoltre, questo metod è stata inefficiente a sospendere il corpo più grande e pesante di Manduca Sexta. Per risolvere questo problema, abbiamo beneficiato cornici magneticamente levitazione dove il peso leggero Cornici con i magneti attaccati al loro fondo rimangono sospesi attraverso le forze elettromagnetiche. Se combinato con disponibili in commercio amplificatori neurali e array di LED, questo fornisce una piattaforma per controllare l&#39;output di volo a motore e registrare il relativo elettrofisiologia di Manduca Sexta.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="579">
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">Coated stainless steel wire</td>
			<td style="width:113px;">A-M Systems</td>
			<td style="width:137px;">791900</td>
			<td style="width:135px;">0.008&#8217;&#8217; bare, 0.011&#8217;&#8217; coated, annealed</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Flexible electrode wire</td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:135px;">Litz or inductor wire can be used.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:195px;">Surface-mount FFC connector</td>
			<td style="width:113px;">Hirose Connector</td>
			<td style="width:137px;">FH28E-20S-0.5SH(05)</td>
			<td style="width:135px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">Tweezers</td>
			<td style="width:113px;">Grobet USA</td>
			<td style="width:137px;">N/A</td>
			<td style="width:135px;">Clean with 70% alcohol before use on the insect.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">Kim-Wipes</td>
			<td style="width:113px;">Kimberly-Clark Worldwide</td>
			<td style="width:137px;">34155</td>
			<td style="width:135px;">Any size delicate-wipe tissues can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Teflon tape</td>
			<td style="width:113px;">N/A</td>
			<td style="width:137px;">N/A</td>
			<td style="width:135px;">5 mm width Teflon tape.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:195px;">Hypodermic Needle</td>
			<td style="width:113px;">Becton Dickinson &#38; Co.</td>
			<td style="width:137px;">30511</td>
			<td style="width:135px;">20-30 gauge hypodermic needle can be used. Video showed 30 gauge.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:195px;">Rigid Fixation Stick</td>
			<td style="width:113px;">N/A</td>
			<td style="width:137px;">N/A</td>
			<td style="width:135px;">Variety of materials can be used (e.g. coffee stirrers)</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:195px;">Insect Emergence Cage</td>
			<td style="width:113px;">N/A</td>
			<td style="width:137px;">N/A</td>
			<td style="width:135px;">Plastic pet cage lined with packing paper or similar padding. Ventilation holes are needed.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:195px;">Thermal Cauterizer</td>
			<td style="width:113px;">Advanced Meditech International</td>
			<td style="width:137px;">CH-HI CT2103 (tip)</td>
			<td style="width:135px;">Optional equipment used for application of dental wax.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:195px;">Dental Wax</td>
			<td style="width:113px;">Orthomechanics LC., Broken Arrow, Oklahoma</td>
			<td style="width:137px;">N/A</td>
			<td style="width:135px;">Optional material used for stabilizing the electrodes on the insect.</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:195px;">Magnetic Levitation Platform</td>
			<td style="width:113px;">N/A</td>
			<td style="width:137px;">N/A</td>
			<td style="width:135px;">Custom designed frame fabricated in-house with 3D prototyping</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:195px;">CA40 Instant Adhesive</td>
			<td style="width:113px;">3M</td>
			<td style="width:137px;">62-3803-0330-5</td>
			<td style="width:135px;">Avoid skin contact. Use gloves when handling.</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:195px;">70% Isopropyl alcohol</td>
			<td style="width:113px;">store brand</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:135px;">Commercially available from many suppliers.</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:195px;">PCB Etchant</td>
			<td style="width:113px;">RadioShack</td>
			<td style="width:137px;">276-1535</td>
			<td style="width:135px;">Toxic if swallowed or ingested, skin irritant&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:195px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:135px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EQUIPMENT:</td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:135px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Name of Reagent/Material</td>
			<td style="width:113px;">Company</td>
			<td style="width:137px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="231">
			<td height="231" style="height:231px;width:195px;">TBSI Neuroware Software</td>
			<td style="width:113px;">Triangle Biosystems International</td>
			<td style="width:137px;">N/A</td>
			<td style="width:135px;">NeuroWare v1.4. Software for importing .nex files obtained at Technologies, N. NeuroExplorer Code and Scripts. (2012).at http://www.neuroexplorer.com/code.html</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">TBSI Wireless Recording System</td>
			<td style="width:113px;">Triangle Biosystems International</td>
			<td style="width:137px;">W5 FI</td>
			<td style="width:135px;">USB Base station, headstage unit, charger</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">16 Channel Amplifier A-C Amplifier</td>
			<td style="width:113px;">A-M Systems&#160;</td>
			<td style="width:137px;">950000</td>
			<td style="width:135px;">Model 3500 (110 V)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Oscilloscope&#160;</td>
			<td style="width:113px;">Agilent Technologies&#160;</td>
			<td style="width:137px;">DSO1014A</td>
			<td style="width:135px;">Oscilloscope, 100 MHz, 4 channel</td>
		</tr>
		<tr height="120">
			<td height="120" style="height:120px;width:195px;">Microscope</td>
			<td style="width:113px;">N/A</td>
			<td style="width:137px;">N/A</td>
			<td style="width:135px;">5x magnification microscope to assist visualization during electronics construction.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:195px;">Ultrasonic Cleaner</td>
			<td style="width:113px;">ColeParmer</td>
			<td style="width:137px;">EW-08848-10</td>
			<td style="width:135px;">Ultrasonic Cleaner with Timer,&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

early metamorphic insertion technology for insect flight behavior monitoring

Early Metamorphosis Insertion Technology (EMIT) is a novel methodology for integrating microfabricated neuromuscular recording and actuation platforms on insects during their metamorphic development. Here, the implants are fused within the structure and function of the neuromuscular system as a result of metamorphic tissue remaking. The implants emerge with the insect where the development of tissue around the electronics during pupal development results in a bioelectrically and biomechanically enhanced tissue interface. This relatively more reliable and stable interface would be beneficial for many researchers exploring the neural basis of the insect locomotion with alleviated traumatic effects caused during adult stage insertions. In this article, we implant our electrodes into the indirect flight muscles of Manduca sexta. Located in the dorsal-thorax, these main flight powering dorsoventral and dorsolongitudinal muscles actuate the wings and supply the mechanical power for up and down strokes. Relative contraction of these two muscle groups has been under investigation to explore how the yaw maneuver is neurophysiologically coordinated. To characterize the flight dynamics, insects are often tethered with wires and their flight is recorded with digital cameras. We also developed a novel way to tether Manduca sexta on a magnetically levitating frame where the insect is connected to a commercially available wireless neural amplifier. This set up can be used to limit the degree of freedom to yawing &#8220;only&#8221; while transmitting the related electromyography signals from dorsoventral and dorsolongitudinal muscle groups.

Uno schema della procedura complessiva EMIT è presentato nella figura 1, che mostra le fasi principali del ciclo metamorfico del hawkmoth e le fasi di inserimento dell&#39;elettrodo corrispondenti. L&#39;inserimento dell&#39;elettrodo deve essere eseguita in fase avanzata di pupa 4 a 7 giorni prima della eclosion. Questo permette alle fibre muscolari di sviluppare attorno agli elettrodi e assicurare l&#39;impianto in dell&#39;insetto. Il risultato tipico di una fase di inse...

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Early Metamorphic Insertion Technology for Insect Flight Behavior Monitoring

We present a novel surgical procedure to implant electrodes in Manduca sexta during its early metamorphic stages. This technique allows mechanically stable and electrically reliable coupling with the neuromuscular tissue to study flight neurophysiology dynamics. We also present a novel magnetic levitation platform for tethered studies of insect yaw.

All&#39;inizio metamorfica Tecnologia Inserzione per Insect Volo monitoraggio del comportamento

Early Metamorphosis Insertion Technology (EMIT) is a novel methodology for integrating microfabricated neuromuscular recording and actuation platforms on ...

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Research

JoVE Journal

Behavior

14.4K Views.  North Carolina State University. We present a novel surgical procedure to implant electrodes in Manduca sexta during its early metamorphic stages. This technique allows mechanically stable and electrically reliable coupling with the neuromuscular tissue to study flight neurophysiology dynamics. We also present a novel magnetic levitation platform for tethered studies of insect yaw.

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Examining Recall Memory in Infancy and Early Childhood Using the Elicited Imitation Paradigm

The ability to recall the past allows us to report on details of previous experiences, from the everyday to the significant. Because recall memory is commonly assessed using verbal report paradigms in adults, studying the development of this ability in preverbal infants and children proved challenging. Over the past 30 years, researchers have developed a non-verbal means of assessing recall memory known as the elicited or deferred imitation paradigm. In one variant of the procedure, participants are presented with novel three-dimensional stimuli for a brief baseline period before a researcher demonstrates a series of actions that culminate in an end- or goal-state. The participant is allowed to imitate the demonstrated actions immediately, after a delay, or both. Recall performance is then compared to baseline or to performance on novel control sequences presented at the same session; memory can be assessed for the individual target actions and the order in which they were completed. This procedure is an accepted analogue to the verbal report techniques used with adults, and it has served to establish a solid foundation of the nature of recall memory in infancy and early childhood. In addition, the elicited or deferred imitation procedure has been modified and adapted to answer questions relevant to other aspects of cognitive functioning. The broad utility and application of imitation paradigms is discussed, along with limitations of the approach and directions for future research.

The elicited imitation procedure was established to examine the development of recall memory in infancy and early childhood. This procedure has been widely used to establish a solid foundation of the nature of recall memory in infancy and early childhood.

Esaminando Richiamo Memoria in prima e seconda infanzia Utilizzando il suscitato imitazione Paradigma

The ability to recall the past allows us to report on details of previous experiences, from the everyday to the significant. Because recall memory is ...

Ricerca

Comportamento

Protocol for Data Collection and Analysis Applied to Automated Facial Expression Analysis Technology and Temporal Analysis for Sensory Evaluation

We demonstrate a method for capturing emotional response to beverages and liquefied foods in a sensory evaluation laboratory using automated facial expression analysis (AFEA) software. Additionally, we demonstrate a method for extracting relevant emotional data output and plotting the emotional response of a population over a specified time frame. By time pairing each participant's treatment response to a control stimulus (baseline), the overall emotional response over time and across multiple participants can be quantified. AFEA is a prospective analytical tool for assessing unbiased response to food and beverages. At present, most research has mainly focused on beverages. Methodologies and analyses have not yet been standardized for the application of AFEA to beverages and foods; however, a consistent standard methodology is needed. Optimizing video capture procedures and resulting video quality aids in a successful collection of emotional response to foods. Furthermore, the methodology of data analysis is novel for extracting the pertinent data relevant to the emotional response. The combinations of video capture optimization and data analysis will aid in standardizing the protocol for automated facial expression analysis and interpretation of emotional response data.

A protocol for capturing and statistically analyzing emotional response of a population to beverages and liquefied foods in a sensory evaluation laboratory using automated facial expression analysis software is described.

Protocollo per la raccolta di dati e analisi applicata a Automated viso Tecnologia Espressione Analisi e analisi temporale per la valutazione organolettica

We demonstrate a method for capturing emotional response to beverages and liquefied foods in a sensory evaluation laboratory using automated facial ...

An Objective and Child-friendly Assessment of Arm Function by Using a 3-D Sensor

Progressive and irreversible muscle atrophy characterizes Spinal Muscular Atrophy (SMA) and other similar muscle disorder diseases. Objective assessment of muscle functions is an essential and important, although challenging, prerequisite for successful clinical trials. Current clinical rating scales restrain the movement abnormalities to certain predefined coarse-grained individual items. The Kinect 3-D sensor has emerged as a low-cost and portable motion sensing technology used to capture and track people&#39;s movement in many medical and research fields. A novel approach using this 3-D sensor was developed and a game-like test was designed to objectively measure the upper limb function of patients with SMA. The prototype test targeted joint movement capability. While sitting in a virtual scene, the patient was instructed to extend, flex, and lift the whole arm in order to reach and place some objects. Both kinematic and spatiotemporal characteristics of upper limb movement were extracted and analyzed, e.g., elbow extension and flexion angles, hand velocity, and acceleration. The first study included a small cohort of 18 ambulant SMA patients and 19 age- and gender-matched healthy controls. A comprehensive analysis of arm movement was achieved; however, no significant difference between the groups were found due to the mismatch of patient&#39;s capability and the test difficulty. Based on this experience, a second version of the test consisting of a modified version of the first game with increased difficulties and a second game targeting muscle endurance were designed and implemented. The new test has not been conducted in any patient groups yet. Our work has demonstrated the potential capability of the 3-D sensor in assessing such muscle function and suggested an objective approach to complement the clinical rating scales.

An objective measure of muscle functions is challenging especially in children. Based on a commercially available digital 3-D sensor, a child-friendly gaming test was developed to assess upper limb function for clinical trials.

Una valutazione obiettiva e bambino-amichevole della funzione di braccio usando un sensore 3D

Progressive and irreversible muscle atrophy characterizes Spinal Muscular Atrophy (SMA) and other similar muscle disorder diseases. Objective assessment ...

Key Elements of Photo Attraction Bioassay for Insect Studies or Monitoring Programs

Optimized visual attractants will increase insect trapping efficiency by using the target insect&#39;s innate behaviors (positive photo-taxis) as a means to lure the insect into a population control or monitoring trap. Light emitting diodes (LEDs) have created customizable lighting options with specific wavelengths (colors), intensities, and bandwidths, all of which can be customized to the target insects. Photo-attraction behavioral bioassays can use LEDs to optimize the attractive color(s) for an insect species down to specific life history stages or behaviors (mating, feeding, or seeking shelter). Researchers must then confirm the bioassay results in the field and understand the limited attractive distance of the visual attractants.
The cloverleaf bioassay arena is a flexible method to assess photo attraction while also assessing a range of natural insect behaviors such as escape and feeding responses. The arena can be used for terrestrial or aerial insect experiments, as well as diurnal, and nocturnal insects. Data collection techniques with the arena are videotaping, counting contact with the lights, or physically collecting the insects as they are attracted towards the lights. The assay accounts for insects that make no-choice and the arenas can be single (noncompetitive) color or multiple (competitive) colors. The cloverleaf design causes insects with strong thigmotaxis to return to the center of the arena where they can view all the options in a competitive LED tests. The cloverleaf arena presented here has been used with mosquitoes, bed bugs, Hessian fly, house flies, biting midges, red flour beetles, and psocids. Bioassays are used to develop accurate and effective insect traps to guide the development and optimization of insect traps used to monitor pest population fluctuations for disease vector risk assessments, the introduction of invasive species, and/or be used for population suppression.

Photo-attraction bioassay arenas are used to determine the optimal light color(s) to maximize insect attraction; however bioassays and methods are specific to target insect behaviors and habitats. Customizable equipment and modifications are explained for nocturnal or diurnal and terrestrial or aerial insects.

Elementi chiave dell'analisi biologica di attrazione di foto per studi di insetti o programmi di monitoraggio

Optimized visual attractants will increase insect trapping efficiency by using the target insect&#39;s innate behaviors (positive photo-taxis) as a means ...

A Wind Tunnel for Odor Mediated Insect Behavioural Assays

Olfaction is the most important sensory mechanism by which many insects interact with their environment and a wind tunnel is an excellent tool to study insect chemical ecology. Insects can locate point sources in a three-dimensional environment through the sensory interaction and sophisticated behavior. The quantification of this behavior is a key element in the development of new tools for pest control and decision support. A wind tunnel with a suitable flight section with laminar air flow, visual cues for in-flight feedback and a variety of options for the application of odors can be used to measure complex behaviour which subsequently may allow the identification of attractive or repellent odors, insect flight characteristics, visual-odor interactions and interactions between attractants and odors lingering as background odors in the environment. A wind tunnel holds the advantage of studying the odor mediated behavioural repertoire of an insect in a laboratory setting. Behavioural measures in a controlled setting provide the link between the insect physiology and field application. A wind tunnel must be a flexible tool and should easily support the changes to setup and hardware to fit different research questions. The major disadvantage to the wind tunnel setup described here, is the clean odor background which necessitates special attention when developing a synthetic volatile blend for field application.

Here, we describe the construction and use of a wind tunnel for odor mediated behavioural assays with insects. The wind tunnel design facilitates the release of odor sources by several methods, with and without visual stimuli. Wind tunnel experiments are important methods to identify behaviorally active volatile chemicals.

Una galleria del vento per odore mediata saggi comportamentali dell'insetto

Olfaction is the most important sensory mechanism by which many insects interact with their environment and a wind tunnel is an excellent tool to study ...

Using Flight Mills to Measure Flight Propensity and Performance of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera (LeConte)

The western corn rootworm, Diabrotica virgifera virgifera (LeConte) (Coleoptera: Chrysomelidae), is an economically important pest of corn in the northern United States. Some populations have developed resistance to management strategies including transgenic corn that produces insecticidal toxins derived from the bacterium Bacillus thuringiensis (Bt). Knowledge of western corn rootworm dispersal is of critical importance for models of resistance evolution, spread, and mitigation. Flight behavior of an insect, especially over a long distance, is inherently difficult to observe and characterize. Flight mills provide a means to directly test developmental and physiological impacts and consequences of flight in the laboratory that cannot be obtained in field studies. In this study, flight mills were used to measure the timing of flight activity, total number of flights, and the distance, duration, and speed of flights taken by female rootworms during a 22-h test period. Sixteen flight mills were housed in an environmental chamber with programmable lighting, temperature, and humidity control. The flight mill described is of a typical design, where a flight arm is free to rotate about a central pivot. Rotation is caused by flight of an insect tethered to one end of the flight arm, and each rotation is recorded by a sensor with a time-stamp. Raw data are compiled by software, which are subsequently processed to provide summary statistics for flight parameters of interest. The most difficult task for any flight mill study is attachment of the tether to the insect with an adhesive, and the method used must be tailored to each species. The attachment must be strong enough to hold the insect in a rigid orientation and to prevent detachment during movement, while not interfering with natural wing motion during flight. The attachment process requires dexterity, finesse, and speed, making video footage of the process for rootworms of value.

Using Flight Mills to Measure Flight Propensity and Performance of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera LeConte

Flight mills are important tools for comparing how age, sex, mating status, temperature, or various other factors may influence an insect&#8217;s flight behavior. Here we describe protocols to tether and measure the flight propensity and performance of western corn rootworm under different treatments.

Utilizzando Flight Mills per misurare la propensione di volo e le prestazioni di Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera (LeConte)

The western corn rootworm, Diabrotica virgifera virgifera (LeConte) (Coleoptera: Chrysomelidae), is an economically important pest of corn in the northern ...

Nest Building Behavior as an Early Indicator of Behavioral Deficits in Mice

Nest building is an innate behavior in male and female rodents, even when raised in laboratory settings. As such, many researchers provide rodents synthetic and/or natural materials (such as twine, tissue, cotton, paper, and hay) as a gauge of their overall well-being and as an ancillary assessment to predict the possible decline in cognition. Typically, changes in nesting behaviors, such as failure to create a nest, indicate a change in health or welfare. In addition, nesting behavior is sensitive to many environmental and physiological challenges, as well as many genetic mutations underlying pathological disease states. The following protocol describes a nesting behavior paradigm that explores the usage of four types of nesting material. In addition, the protocol utilizes intraclass correlations to demonstrate that inter-rater reliability is higher when nests are constructed out of shredded paper compared to other common nesting materials such as cotton squares, paper twists, and soft cob bedding. The chosen methodology and statistical considerations (i.e., intraclass correlation) for this assay may be of interest for those conducting experiments assessing the quality of living of mice.&#160;

Here, we present a protocol to quantify nest building behavior in mice, which is known to be impaired in several neurological disorders and diseases. This protocol examines the utility of four materials and offers the opportunity to quantify the rater agreement in scoring, improving the validity and reliability of the assay.

Il comportamento dell'edificio Nest come indicatore precoce dei deficit comportamentali nei topi

Nest building is an innate behavior in male and female rodents, even when raised in laboratory settings. As such, many researchers provide rodents ...

A Novel Pavlovian Fear Conditioning Paradigm to Study Freezing and Flight Behavior

Fear- and anxiety-related behaviors significantly contribute to an organism&#8217;s survival. However, exaggerated defensive responses to perceived threat are characteristic of various anxiety disorders, which are the most prevalent form of mental illness in the United States. Discovering the neurobiological mechanisms responsible for defensive behaviors will aid in the development of novel therapeutic interventions. Pavlovian fear conditioning is a widely used laboratory paradigm to study fear-related learning and memory. A major limitation of traditional Pavlovian fear conditioning paradigms is that freezing is the only defensive behavior monitored. We recently developed a modified Pavlovian fear conditioning paradigm that allows us to study both conditioned freezing and flight (also known as escape) behavior within individual subjects. This model employs higher intensity footshocks and a greater number of pairings between the conditioned stimulus and unconditioned stimulus. Additionally, this conditioned flight paradigm utilizes serial presentation of pure tone and white noise auditory stimuli as the conditioned stimulus. Following conditioning in this paradigm, mice exhibit freezing behavior in response to the tone stimulus, and flight responses during the white noise. This conditioning model can be applied to the study of rapid and flexible transitions between behavioral responses necessary for survival.

Defensive behavioral responses are contingent upon threat intensity, proximity, and context of exposure. Based on these factors, we developed a classical conditioning paradigm that elicits clear transitions between conditioned freezing and flight behavior within individual subjects. This model is crucial for the understanding the pathologies involved in anxiety, panic, and post-traumatic stress disorders.

Un nuovo paradigma pavloviano di condizionamento della paura per studiare il congelamento e il comportamento di volo

Fear- and anxiety-related behaviors significantly contribute to an organism&#8217;s survival. However, exaggerated defensive responses to perceived threat ...

The Participant-Reported Implementation Update and Score (PRIUS): A Novel Method for Capturing Implementation-Related Data Over Time

"Implementation" of new initiatives in healthcare settings typically encompasses two distinct components: a "clinical intervention" plus accompanying "implementation strategies" that support putting the clinical intervention into day-to-day practice. A novel clinical intervention, for example, might consist of a new medication, a new protocol, a new device, or a new program. As clinical interventions are not self-implementing, however, they nearly always require effective implementation strategies in order to succeed. Implementation strategies set out to engage healthcare providers, staff and patients in ways that increase the likelihood of the new initiative being successfully adopted, a process that often involves behavior change and new ways of thinking by participants. One of the challenges in studying implementation is that it can be difficult to collect data about the status and progress of implementation, including participants' own perspectives and experiences concerning implementation to date. This protocol describes a novel method for collecting and analyzing data related to ongoing implementation called the Participant-Reported Implementation Update and Score, or PRIUS. The PRIUS method allows for the efficient and systematic capture of qualitative and quantitative data that can provide a detailed and nuanced account of implementation over time and from multiple viewpoints. This longitudinal method can enable researchers, as well as implementation leaders and organizational stakeholders, to monitor implementation progress more closely, conduct formative evaluation, identify improvement opportunities, and gauge the effect of any implementation changes on a rolling basis.

The Participant-Reported Implementation Update and Score PRIUS: A Novel Method for Capturing Implementation-Related Data Over Time

This protocol describes a novel method for collecting and analyzing data related to ongoing implementation called the Participant-Reported Implementation Update and Score (PRIUS). The PRIUS method allows for the efficient and systematic capture of data over time and from multiple viewpoints in healthcare settings.

PRIUS (Participant-Reported Implementation Update and Score): un nuovo metodo per acquisire dati relativi all'implementazione nel tempo

"Implementation" of new initiatives in healthcare settings typically encompasses two distinct components: a "clinical intervention" plus accompanying ...

Embryo Microinjection and Knockout Mutant Identification of CRISPR/Cas9 Genome-Edited Helicoverpa Armigera (H&#252;bner)

The cotton bollworm, Helicoverpa armigera, is one of the most destructive pests in the world. A combination of molecular genetics, physiology, functional genomics, and behavioral studies has made H. armigera a model species in Lepidoptera Noctuidae. To study the in vivo functions of and interactions between different genes, clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/ associated protein 9 (Cas9) genome editing technology is a convenient and effective method used for performing functional genomic studies. In this study, we provide a step-by-step systematic method to complete gene knockout in H. armigera using the CRISPR/Cas9 system. The design and synthesis of guide RNA (gRNA) are described in detail. Then, the subsequent steps consisting of gene-specific primer design for guide RNA (gRNA) creation, embryo collection, microinjection, insect rearing, and mutant detection are summarized. Finally, troubleshooting advice and notes are provided to improve the efficiency of gene editing. Our method will serve as a reference for the application of CRISPR/Cas9 genome editing in H. armigera as well as other Lepidopteran moths.

Embryo Microinjection and Knockout Mutant Identification of CRISPR/Cas9 Genome-Edited Helicoverpa Armigera H&amp;#252;bner

Presented here is a protocol of Helicoverpa armigera (H&#252;bner) embryo microinjection and knockout mutant identification created by CRISPR/Cas9 genome editing. Mutant insects enable further research of gene function and interaction among different genes in vivo.

Microiniezione embrionale e identificazione di mutanti knockout di Helicoverpa Armigera (Hübner) modificata dal genoma CRISPR/Cas9

The cotton bollworm, Helicoverpa armigera, is one of the most destructive pests in the world. A combination of molecular genetics, physiology, functional ...