Agradecemos a Manon Laprise para la formación en ecocardiografía y Ann Chamberland para tomar las fotos que se muestran en las figuras 1 y 2. Este trabajo fue financiado por los Institutos Canadienses de Investigación en Salud de subvención MOP 44363 y Canadá Cátedra de 950 a 216.684.

Todos los procedimientos que se muestran en este protocolo ha sido aprobado por el Comité de Cuidado de Animales IRCM. 1. Sistema de ultrasonido y de la estación Preparación <ol><li> Iniciar el sistema de imágenes de ultrasonido y conectar el cabezal de exploración, así como la unidad de controlador de la fisiología de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Figura 1). Elegir programa de medición cardíaca y la cabeza de exploración que corresponde al transductor de 30 MHz. </li><li> Llenar la boquilla del cabezal de exploración con agua desionizada. Evite las burbujas de aire ya que interfieren con la resolución de imagen. Coloque el cabezal de exploración con el lado de la manija arriba en su soporte cerca de la plataforma de formación de imágenes (Figura 1A). </li><li> Desinfectar la plataforma de imágenes y zona de trabajo. </li><li> Llene por completo la botella de gel de ultrasonido para evitar que se formen burbujas y colocarlo boca abajo en su conjunto recipiente de precalentamiento a 37 ° C (Figura 1B). </li><li> Verificar los niveles de oxígenogeneración y el isoflurano y el sistema de tubos para la anestesia. Uno de los experimentos con embriones ~ 8 usaría aproximadamente 15 a 20 L de oxígeno. </li><li> Coloque las botellas de bálsamo oftálmica, crema depilatoria y gel para electrodos cerca de la plataforma de imágenes (Figura 1B). </li><li> Verifique que las funciones de la lámpara de calor infrarrojo. Durante el entrenamiento, establecer el nivel de calor, la posición de la lámpara y la distancia de la lámpara a ratones con el fin de mantener constante la temperatura corporal y el ritmo cardíaco. Nota: La preparación adecuada del sistema y el material es crítica. Procedimientos largos pueden afectar a las características fisiológicas y hemodinámicas de los fetos como anestesia de larga deprime la función cardiaca mediante la reducción de la frecuencia cardíaca, la presión arterial y el nivel de oxigenación de la sangre-. El tiempo de tramitación de ~ 8 fetos (tamaño medio de la camada en ratones C57BL / 6) debe ser de aproximadamente 1 hora. Otras cepas de ratón pueden proporcionar un mayor número de fetos, posiblemente con un tamaño hembra de mayor tamaño. La formación es esencial para optimizar el processitiempo ng. </li></ol> 2. Preparación Ratón <ol><li> Anestesie la mujer embarazada en una cámara con suministro continuo de 2% de isoflurano en oxígeno (200 ml / min) hasta que se convierte en no responde. </li><li> Coloque el ratón en la plataforma de imágenes en posición supina, ajuste el tubo para la inhalación continua de 1,5% de isoflurano en oxígeno (200 ml / min), y fijar el tubo de inhalación con cinta (Figura 2A). Anestesia suficientes deben ser confirmados durante el procedimiento por la postura relajada del ratón y la ausencia de respuesta a la cola y los pies pellizcos. </li><li> Coloque gel de electrodos sólo en la parte superior izquierda y los cojines del electrodo inferior derecha (justo antes de la pierna y la pata trasera izquierda, también llamada posición de la derivación II) de la electrocardiografía. Plazo de entrega de la posición II proporciona un mejor onda P definido en posición vertical positivo y complejo QRS para determinar la frecuencia cardíaca. Asegure las cuatro patas a cada pad usando cinta (Figura 2A). Para prevenir la sequedad de los ojos, aplique 1 gota debálsamo oftálmica en cada ojo. </li><li> Afeitar el abdomen desde el pecho hasta la vejiga con una cortadora de cabello. A continuación, aplicar la crema depilatoria durante 2 minutos y limpie con una gasa y / o un hisopo de algodón para eliminar cuidadosamente cualquier resto del cabello. Tenga cuidado de no cortar los pezones. </li><li> Insertar el termómetro prelubricados con gel de electrodo en el recto de la hembra para supervisar la temperatura del cuerpo (debe mantenerse a 37 ± 0,5 ° C mediante el ajuste de una lámpara de calor infrarrojo colocado por encima de la plataforma). La frecuencia cardíaca debe ser de 450 ± 50 latidos / min (lpm). Tanto la temperatura y la frecuencia cardíaca se muestran en la unidad de control de la fisiología (Figura 1B). Nota: Long anestesia, pérdida de cabello y el gel de ultrasonido (aunque precalentado) pueden conducir a la hipotermia, la cual puede afectar el ritmo cardiaco de la hembra. Si la temperatura del cuerpo cae por debajo de 36,5 ° C, detener el procedimiento y modificar la posición de la lámpara de calentamiento para ajustar la temperatura y la frecuencia cardíaca. Espere un par de minutos befmineral de proceder de nuevo. </li></ol> 3. Embrión de identificación <ol><li> Presione suavemente sobre el abdomen desnudo para localizar los embriones. Lenta y suavemente esparcirán al tener la mayoría de los embriones en una sola capa bajo la superficie abdominal. En cada cuerno uterino, sacos están linealmente conectados el uno al otro. Trate de respetar este orden cuando se propague. </li><li> Marque cada embrión en el vientre desnudo de la mujer con un marcador permanente con su anterior / posterior y dorsal / ventral direcciones. Conociendo la orientación facilitará la localización de la corazón con la sonda. Número de los embriones en el derecho y cuernos izquierda a partir de la cérvix (1, 2, 3 ... y 1 &#39;, 2&#39;, 3 &#39;..., respectivamente; Figura 2B). Nota: (i) Evitar la difusión de los embriones con una fuerza excesiva. Dibuje su ubicación en una hoja de papel para hacer un seguimiento de ellos (Figura 2 C). (Ii) de C57BL / 6 hembras tienen ~ 8 fetos por camada. Sin embargo, de 0-2 embriones en cada camada son lituado debajo de las demás, por lo que su imagen imposible. Excluir estos embriones a partir del análisis y evaluación más camadas si es necesario. </li></ol> 4. Medición de la frecuencia cardíaca <ol><li> Coloque una pequeña cantidad de gel de ultrasonido precalentado en el abdomen desnudo y extenderla uniformemente. Evite la formación de burbujas. Añadir una mayor cantidad de gel de (~ 5 ml) en el área específica de la imagen. </li><li> Mantenga la sonda en contacto con la capa de gel de espesor (10 mm) y avanzar gradualmente la sonda hacia la piel mientras buscaba el corazón latiendo. Una vez que el corazón latiente se visualiza en la pantalla, ajuste el ángulo de la sonda a tener ambos ventrículos en su tamaño más grande en el plano de la imagen (Figura 2D). </li><li> Comience la adquisición de imágenes. Con el antebrazo apoyado en la estación, coloque el transductor sobre el gel de ultrasonido para obtener una imagen en vivo en la pantalla de visualización (Figura 2D). El mantenimiento de la loma del transductor en la parte superior y haga clic en el orientatio cabeza del exploradorn marcador (en la esquina superior izquierda de la imagen) permite la coordinación del movimiento de la mano y el área visualizada en la pantalla. </li><li> A partir de la cerviz, mueva al embrión más cercana marcada (1 ó 1 &#39;en la trompa uterina derecha oa la izquierda, respectivamente) para visualizar el corazón que late en la pantalla. Debido a la profundidad focal es fija, mover suavemente la sonda hacia arriba / abajo y hacia los lados sin perder el contacto con el gel para obtener el plano de la imagen deseada. </li><li> Coloque el corazón que late en el centro de la pantalla dentro de la región indicada por la línea discontinua de color amarillo que representa la zona de coordinación para mejor la adquisición de datos. </li><li> Adquirir la grabación en vivo. Obtenga la imagen exploradora y reanudar la grabación (Figura 3A). Una vez obtenido un mínimo de 10 segundos de grabación estable, detener la grabación y guardar. </li><li> Continúe con el siguiente embrión. </li><li> Una vez que todos los embriones son analizados, pulse &quot;Examinar&quot; en el teclado para ver la lista de las grabaciones. Juega cada traci modo M grabadang y realizar mediciones múltiples (por lo menos 5 por rastreo) de la separación entre los picos adyacentes (ciclo de tiempo / flujo) para obtener el promedio del ritmo cardíaco (Figura 3B). Nota: Algunos protocolos sugieren el uso de un soporte estacionario para la cabeza de exploración para evitar sacudidas. Sin embargo, se restringe el ángulo de análisis, por lo que la observación de embriones laterales difícil. También se ralentiza el análisis, ya que el soporte tiene que ser ajustado para cada embrión. La celebración de la cabeza de exploración, mientras que la solución del antebrazo en la estación minimiza eficazmente temblando. Se recomienda entrenamiento con 5 a 10 mujeres embarazadas para optimizar el resultado. </li></ol> 5. Genotipado <ol><li> El uso de tijeras y pinzas quirúrgicas limpias, incisión longitudinal en la piel y la capa muscular del abdomen. Localice los sacos en cada cuerno uterino y coinciden con los números. Corte y abra el saco vitelino para exponer el embrión en el orden utilizado anteriormente. Si no está en una disposición lineal, el dibujo de las posiciones de embriones en un pedazode papel será esencial una vez que las marcas en la piel ya no son visibles. </li><li> Cortar sólo ~ 4 mm de la cola para la genotipificación como ADN genómico se extrae de manera muy eficiente de las colas embrionarias. Nota: (i) El procedimiento quirúrgico puede tener que ser realizado en una ubicación separada de la sala de formación de imágenes. Sin embargo, es importante que no se mueva el ratón y tener el procedimiento quirúrgico en la plataforma de formación de imágenes con el fin de realizar un seguimiento de los embriones numerados. Consulte con el administrador de instalación de animales para optimizar el procedimiento quirúrgico. (Ii) La mujer embarazada muere rápidamente debido a la pérdida de sangre que se extraen los fetos para el genotipado después de la impresión. Después de cortar la cola, los fetos se colocan 3 min en hielo durante la anestesia por hipotermia y luego decapitados con unas tijeras, según lo recomendado por nuestro Comité de Cuidado de Animales. </li></ol>

<ol>
	<li>Hoffman, J. I., Kaplan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+incidence+of+congenital+heart+disease.">The incidence of congenital heart disease.</a> J. Am. Coll. Cardiol. 39, 1890-1900 (2002).</li><li>Miller, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+brain+development+in+newborns+with+congenital+heart+disease.">Abnormal brain development in newborns with congenital heart disease.</a> N. Engl. J. Med. 357, 1928-1938 (2007).</li><li>Bruneau, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+developmental+genetics+of+congenital+heart+disease.">The developmental genetics of congenital heart disease.</a> Nature. 451, 943-948 (2008).</li><li>Wessels, A., Sedmera, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+anatomy+of+the+heart:+a+tale+of+mice+and.">Developmental anatomy of the heart: a tale of mice and.</a> 15, 165-176 (2003).</li><li>Yu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ENU+induced+mutations+causing+congenital+cardiovascular+anomalies.">ENU induced mutations causing congenital cardiovascular anomalies.</a> Development. 131, 6211-6223 (2004).</li><li>Seidah, N. G., Prat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+and+therapeutic+targeting+of+the+proprotein+convertases.">The biology and therapeutic targeting of the proprotein convertases.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 11, 367-383 (2012).</li><li>Roebroek, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Failure+of+ventral+closure+and+axial+rotation+in+embryos+lacking+the+proprotein+convertase+Furin.">Failure of ventral closure and axial rotation in embryos lacking the proprotein convertase Furin.</a> Development. 125, 4863-4876 (1998).</li><li>Roebroek, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limited+redundancy+of+the+proprotein+convertase+furin+in+mouse+liver.">Limited redundancy of the proprotein convertase furin in mouse liver.</a> J. Biol. Chem. 279, 53442-53450 (2004).</li><li>Kisanuki, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tie2-Cre+transgenic+mice:+a+new+model+for+endothelial+cell-lineage+analysis+in+vivo.">Tie2-Cre transgenic mice: a new model for endothelial cell-lineage analysis in vivo.</a> Dev. Biol. 230, 230-242 (2001).</li><li>Kim, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+endothelial+furin+leads+to+cardiac+malformation+and+early+postnatal+death.">Loss of endothelial furin leads to cardiac malformation and early postnatal death.</a> Mol. Cell Biol. 32, 3382-3391 (2012).</li></ol>

Ningún conflicto de interés declarado.

Ecocardiografía en modo M es un método eficaz y sencillo para medir la frecuencia cardíaca en el útero de los embriones de ratón. Transductores disponibles en el mercado proporcionan suficiente resolución para visualizar pequeños corazones latiendo. Por lo tanto, permiten una medición de la frecuencia cardíaca de alta precisión, en comparación con otros métodos tales como la medición del pulso, y pueden sustituir de vídeo microscopía de alta resolución. Sin embargo, las herramientas actuales no ...

CHD es la causa infecciosa más común de muerte al nacer 1. Cirugías múltiples a menudo son necesarios para corregir los defectos estructurales en sujetos cuya calidad de vida puede quedar comprometida 1. Los niños con CHD frecuentemente desarrollan trastornos neurológicos, incluso si no han sido sometidos a cirugía, lo que indica importantes consecuencias en el útero de 2,3 desarrollo. Ambos factores genéticos y ambientales, como la exposición a los virus o químicos (alcohol) durante el embarazo, la causa de CHD. El estudio de los contribuyentes genéticos se encuentra todavía en su fase inicial, pero está creciendo rápidamente. Para identificar estos contribuyentes y entender su papel en el desarrollo del corazón, fenotipo de los ratones mutantes con una herramienta sencilla y potente será altamente beneficioso. Mouse es de hecho un modelo animal de elección para estudiar las enfermedades del corazón, y la mayoría de los casos humanos puede ser reproducida en ratones 4,5. En consecuencia, fetal de ratón fenotipificación cardiaca se ha convertido Increasingly importante investigar la etiología de las enfermedades del corazón humano y requiere de las herramientas adecuadas. Aunque los estudios histológicos de las muestras fijadas son invaluables, imágenes en tiempo real de los animales vivos es crucial para entender la fisiología del corazón. Microscopía de vídeo ofrece imágenes en vivo. Sin embargo, requiere una laparotomía para exponer embriones, comprometiendo de ese modo su estado fisiológico y hemodinámica. Recientemente, la ecocardiografía se ha convertido en la técnica de imagen estándar para evaluaciones cardíacas en la clínica, así como en ratones. Ratón ecocardiografía fetal se realiza utilizando sistemas estándar de ultrasonido clínicos, así como los sistemas de ultrasonido ultra-alta frecuencia. Estos últimos proporcionan 30 MHz o transductores de frecuencias más altas que generan imágenes en dos dimensiones y permiten la evaluación de las etapas embrionarias tempranas. Estos transductores tienen una profundidad relativamente escasa penetración (~ 13 mm), que es, sin embargo, suficiente para obtener planos de imagen adecuados y determinar PA fundamental corazónparámetros, como la frecuencia cardíaca, el diámetro interno del ventrículo izquierdo y la derecha en la diástole y la sístole y el tabique y el espesor de la pared, sin necesidad de realizar una laparotomía. En nuestro estudio, hemos utilizado un sistema de ultrasonido de frecuencia ultra alta para evaluar las tasas de corazón de embriones de ratón en el día E18.5 embrionarias. Elegimos un transductor de 30 MHz que proporciona un campo de visión de 20 mm x 20 mm, que es ideal dado el tamaño de los fetos, con una longitud focal de 12,7 mm. Sin embargo, un transductor de frecuencia más alta puede ser elegido para analizar las etapas de desarrollo anteriores. El modo M seleccionada permite la visualización de los tejidos en movimiento gracias a una alta resolución temporal de 1000 cuadros / seg. El procedimiento completo es simple y se debe realizar lo más rápidamente posible para evitar cualquier perturbación de los estados fisiológicos y hemodinámicos del feto. El análisis de alrededor de 8 embriones requiere aproximadamente 1 h.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="591">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:164px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:160px;">Pharmaceutical Partners of Canada Inc.</td>
			<td style="width:104px;">CP0406v2</td>
			<td style="width:163px;">1-chloro-2,2,2-trifluoroethyl difluoromethyl ether</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Ultrasound gel</td>
			<td>Parker Laboratories Inc.</td>
			<td>Aquasonic Clear</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Electrode gel</td>
			<td>Parker Laboratories Inc.</td>
			<td>Spectra 360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Ophthalmic gel</td>
			<td>Novartis</td>
			<td>Tear-Gel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Depilatory cream</td>
			<td>Church &#38; Dwight Co., Inc.</td>
			<td>Nair</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Hair clipper</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Gauze/cotton swap</td>
			<td>Q-tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Permanent marker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:164px;">High-Resolution In vivo Ultrasound Imaging System</td>
			<td style="width:160px;">Visual Sonics</td>
			<td style="width:104px;">Vevo770</td>
			<td style="width:163px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">30 MHz Transducer</td>
			<td>Visual Sonics</td>
			<td>RMV707B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:164px;">Imaging platform and physiology controller unit</td>
			<td>Visual Sonics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Anesthetic System</td>
			<td>Cyprane North America Inc.</td>
			<td>312462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Infrared heating lamp</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in utero measurement of heart rate in mouse by noninvasive m-mode echocardiography

La cardiopatía congénita (CHD) es la causa infecciosa más frecuente de muerte en el nacimiento. La incidencia de la CHD oscila entre 4 y 50/1, 000 nacimientos (Enfermedad y estimaciones regionales de lesiones, Organización Mundial de la Salud, 2004). Se requieren cirugías que a menudo ponen en peligro la calidad de vida para corregir los defectos del corazón, que nos recuerda la importancia de encontrar las causas de las enfermedades del corazón. Modelos de ratones mutantes y la tecnología de imágenes en directo se han convertido en herramientas esenciales para el estudio de la etiología de esta enfermedad. Aunque los métodos avanzados permiten imágenes en vivo de los corazones anormales en los embriones, los estados fisiológicos y hemodinámicos de este último a menudo comprometida debido a los procedimientos quirúrgicos y / o prolongados. De imágenes por ultrasonido no invasiva, sin embargo, se puede utilizar sin exponer quirúrgicamente los embriones, manteniendo de ese modo su fisiología. Aquí, utilizamos sencilla ecografía en modo M para evaluar la frecuencia cardíaca de los embriones en E18.5 en el útero. La detección de las frecuencias cardíacas anormales es sin duda un buen indicadorTor de la disfunción del corazón y por lo tanto constituye un primer paso en la identificación de defectos de desarrollo que pueden conducir a insuficiencia cardiaca.

El método anterior se utilizó para evaluar el impacto de la presencia o ausencia de la furina serina proteasa en células endoteliales en las tasas de corazón de embriones de ratón en E18.5 en el útero. La furina pertenece a la familia de las convertasas de proproteína (PC) que los precursores de proteínas escinden después de los residuos básicos. La furina y sus sustratos son proteínas secretoras y la escisión pueden ocurrir en el aparato de Golgi, endosomas o en la superficie celular. Sustratos cla...

Watch this Scientific Journal Video about In utero Measurement of Heart Rate in Mouse by Noninvasive M-mode Echocardiography at JoVE.com

In utero Measurement of Heart Rate in Mouse by Noninvasive M-mode Echocardiography

Ultra-alta frecuencia de ultrasonido es una poderosa herramienta de imágenes en directo para examinar anormalidades cardíacas en animales pequeños. Su carácter no invasivo permite el mantenimiento del estado fisiológico de los embriones. En este documento, se muestra el uso del modo M ultrasonido para medir el ritmo cardíaco de los embriones en E18.5 en el útero.

En el útero de medición de la frecuencia cardíaca en el ratón por no invasiva Ecocardiografía en modo M

Congenital heart disease (CHD) is the most frequent noninfectious cause of death at birth. The incidence of CHD ranges from 4 to 50/1,000 births (Disease ...

in-utero-measurement-heart-rate-mouse-noninvasive-m-mode

Research

JoVE Journal

Medicine

In utero Measurement of Heart Rate in Mouse by Noninvasive M-mode Echocardiography

11.3K vistas.  Institut de Recherches Cliniques de Montréal.  Ultra-alta frecuencia de ultrasonido es una poderosa herramienta de imágenes en directo para examinar anormalidades cardíacas en animales pequeños. Su carácter no invasivo permite el mantenimiento del estado fisiológico de los embriones. En este documento, se muestra el uso del modo M ultrasonido para medir el ritmo cardíaco de los embriones en E18.5 en el útero. 

Video: In utero Measurement of Heart Rate in Mouse by Noninvasive M-mode Echocardiography

Transthoracic Echocardiography in Mice

In recent years, murine models have become the primary avenue for studying the molecular mechanisms of cardiac dysfunction resulting from changes in gene expression. Transgenic and gene targeting methods can be used to generate mice with altered cardiac size and function,1-3 and as a result, in vivo techniques are needed to evaluate their cardiac phenotype. Transthoracic echocardiography, pulse wave Doppler (PWD), and tissue Doppler imaging (TDI) can be used to provide dimensional measurements of the mouse heart and to quantify the degree of cardiac systolic and diastolic performance. Two-dimensional imaging is used to detect abnormal anatomy or movements of the left ventricle, whereas M-mode echo is used for quantification of cardiac dimensions and contractility.4,5 In addition, PWD is used to quantify localized velocity of turbulent flow,6 whereas TDI is used to measure the velocity of myocardial motion.7 Thus, transthoracic echocardiography offers a comprehensive method for the noninvasive evaluation of cardiac function in mice.

Transthoracic echocardiography offers a noninvasive method for the evaluation of cardiac function in mice. A combination of ultrasound and Doppler imaging modalities can be used to obtain dimensional measurements of the heart and intracardiac blood flow, which together provide an assessment of cardiac systolic and diastolic performance.

Ecocardiografía transtorácica en ratones

In recent years, murine models have become the primary avenue for studying the molecular mechanisms of cardiac dysfunction resulting from changes in gene ...

Investigación

Medicina

A Mouse Model of in Utero Transplantation

The transplantation of stem cells and viruses in utero has tremendous potential for treating congenital disorders in the human fetus. For example, in utero transplantation (IUT) of hematopoietic stem cells has been used to successfully treat patients with severe combined immunodeficiency.1,2 In several other conditions, however, IUT has been attempted without success.3 Given these mixed results, the availability of an efficient non-human model to study the biological sequelae of stem cell transplantation and gene therapy is critical to advance this field. We and others have used the mouse model of IUT to study factors affecting successful engraftment of in utero transplanted hematopoietic stem cells in both wild-type mice4-7 and those with genetic diseases.8,9 The fetal environment also offers considerable advantages for the success of in utero gene therapy. For example, the delivery of adenoviral10, adeno-associated viral10, retroviral11, and lentiviral vectors12,13 into the fetus has resulted in the transduction of multiple organs distant from the site of injection with long-term gene expression. in utero gene therapy may therefore be considered as a possible treatment strategy for single gene disorders such as muscular dystrophy or cystic fibrosis. Another potential advantage of IUT is the ability to induce immune tolerance to a specific antigen. As seen in mice with hemophilia, the introduction of Factor IX early in development results in tolerance to this protein.14 
In addition to its use in investigating potential human therapies, the mouse model of IUT can be a powerful tool to study basic questions in developmental and stem cell biology. For example, one can deliver various small molecules to induce or inhibit specific gene expression at defined gestational stages and manipulate developmental pathways. The impact of these alterations can be assessed at various timepoints after the initial transplantation. Furthermore, one can transplant pluripotent or lineage specific progenitor cells into the fetal environment to study stem cell differentiation in a non-irradiated and unperturbed host environment.
The mouse model of IUT has already provided numerous insights within the fields of immunology, and developmental and stem cell biology. In this video-based protocol, we describe a step-by-step approach to performing IUT in mouse fetuses and outline the critical steps and potential pitfalls of this technique.

A Mouse Model of in Utero Transplantation

The mouse model of in utero transplantation is a versatile tool that can be used to study the potential clinical applications of stem cell transplantation and gene therapy in the fetus. In this protocol, we present a general approach to performing this technique

Un modelo de ratón En el útero Trasplante

The transplantation of stem cells and viruses in utero has tremendous potential for treating congenital disorders in the human fetus.  For example, in ...

Assessment of Right Ventricular Structure and Function in Mouse Model of Pulmonary Artery Constriction by Transthoracic Echocardiography

Emerging clinical data support the notion that RV dysfunction is critical to the pathogenesis of cardiovascular disease and heart failure1-3. Moreover, the RV is significantly affected in pulmonary diseases such as pulmonary artery hypertension (PAH). In addition, the RV is remarkably sensitive to cardiac pathologies, including left ventricular (LV) dysfunction, valvular disease or RV infarction4. To understand the role of RV in the pathogenesis of cardiac diseases, a reliable and noninvasive method to access the RV structurally and functionally is essential.
A noninvasive trans-thoracic echocardiography (TTE) based methodology was established and validated for monitoring dynamic changes in RV structure and function in adult mice. To impose RV stress, we employed a surgical model of pulmonary artery constriction (PAC) and measured the RV response over a 7-day period using a high-frequency ultrasound microimaging system. Sham operated mice were used as controls. Images were acquired in lightly anesthetized mice at baseline (before surgery), day 0 (immediately post-surgery), day 3, and day 7 (post-surgery). Data was analyzed offline using software.
Several acoustic windows (B, M, and Color Doppler modes), which can be consistently obtained in mice, allowed for reliable and reproducible measurement of RV structure (including RV wall thickness, end-diastolic&#160;and end-systolic dimensions), and function (fractional area change, fractional shortening, PA peak velocity, and peak pressure gradient) in normal mice and following PAC.
Using this method, the pressure-gradient resulting from PAC was accurately measured in real-time using Color Doppler mode and was comparable to direct pressure measurements performed with a Millar high-fidelity microtip catheter. Taken together, these data demonstrate that RV measurements obtained from various complimentary views using echocardiography are reliable, reproducible and can provide insights regarding RV structure and function. This method will enable a better understanding of the role of RV cardiac dysfunction.

Right ventricle (RV) dysfunction is critical to the pathogenesis of cardiovascular disease, yet limited methodologies are available for its evaluation. Recent advances in ultrasound imaging provide a noninvasive and accurate option for longitudinal RV study. Herein, we detail a step-by-step echocardiographic method using a murine model of RV pressure overload.

Evaluación del ventrículo derecho Estructura y función en modelo de ratón de la constricción de la arteria pulmonar mediante ecocardiografía transtorácica

Emerging clinical data support the notion that RV dysfunction is critical to the pathogenesis of cardiovascular disease and heart failure1-3. Moreover, ...

Noninvasive Assessment of Cardiac Abnormalities in Experimental Autoimmune Myocarditis by Magnetic Resonance Microscopy Imaging in the Mouse

Myocarditis is an inflammation of the myocardium, but only ~10% of those affected show clinical manifestations of the disease. To study the immune events of myocardial injuries, various mouse models of myocarditis have been widely used. This study involved experimental autoimmune myocarditis (EAM) induced with cardiac myosin heavy chain (Myhc)-&#945; 334-352 in A/J mice; the affected animals develop lymphocytic myocarditis but with no apparent clinical signs. In this model, the utility of magnetic resonance microscopy (MRM) as a non-invasive modality to determine the cardiac structural and functional changes in animals immunized with Myhc-&#945; 334-352 is shown. EAM and healthy mice were imaged using a 9.4 T (400 MHz) 89 mm vertical core bore scanner equipped with a 4 cm millipede radio-frequency imaging probe and 100 G/cm triple axis gradients. Cardiac images were acquired from anesthetized animals using a gradient-echo-based cine pulse sequence, and the animals were monitored by respiration and pulse oximetry. The analysis revealed an increase in the thickness of the ventricular wall in EAM mice, with a corresponding decrease in the interior diameter of ventricles, when compared with healthy mice. The data suggest that morphological and functional changes in the inflamed hearts can be non-invasively monitored by MRM in live animals. In conclusion, MRM offers an advantage of assessing the progression and regression of myocardial injuries in diseases caused by infectious agents, as well as response to therapies.

This study demonstrates the successful establishment of magnetic resonance microscopy imaging as a non-invasive tool to assess the cardiac abnormalities in mice affected with autoimmune myocarditis. The data indicate that the technique can be used to monitor the disease-progression in live animals.

Evaluación no invasiva de la cardiaca Anomalías en la miocarditis autoinmune experimental por Resonancia Magnética de imágenes de microscopía en el ratón

Myocarditis is an inflammation of the myocardium, but only ~10% of those affected show clinical manifestations of the disease. To study the immune events ...

Noninvasive Determination of Vortex Formation Time Using Transesophageal Echocardiography During Cardiac Surgery

Trans-mitral blood flow produces a three-dimensional rotational body of fluid, known as a vortex ring, that enhances the efficiency of left ventricular (LV) filling compared with a continuous linear jet. Vortex ring development is most often quantified with vortex formation time (VFT), a dimensionless parameter based on fluid ejection from a rigid tube. Our group is interested in factors that affect LV filling efficiency during cardiac surgery. In this report, we describe how to use standard two-dimensional (2D) and Doppler transesophageal echocardiography (TEE) to noninvasively derive the variables needed to calculate VFT. We calculate atrial filling fraction (&#946;) from velocity-time integrals of trans-mitral early LV filling and atrial systole blood flow velocity waveforms measured in the mid-esophageal four-chamber TEE view. Stroke volume (SV) is calculated as the product of the diameter of the LV outflow track measured in the mid-esophageal long axis TEE view and the velocity-time integral of blood flow through the outflow track determined in the deep transgastric view using pulse-wave Doppler. Finally, mitral valve diameter (D) is determined as the average of major and minor axis lengths measured in orthogonal mid-esophageal bicommissural and long axis imaging planes, respectively. VFT is then calculated as 4 &#215; (1-&#946;) &#215; SV/(&#960;D3). We have used this technique to analyze VFT in several groups of patients with differing cardiac abnormalities. We discuss our application of this technique and its potential limitations and also review our results to date. Noninvasive measurement of VFT using TEE is straightforward in anesthetized patients undergoing cardiac surgery. The technique may allow cardiac anesthesiologists and surgeons to assess the impact of pathological conditions and surgical interventions on LV filling efficiency in real time.

We describe a protocol to measure vortex formation time, an index of left ventricular filling efficiency, using standard transesophageal echocardiography techniques in patients undergoing cardiac surgery. We apply this technique to analyze vortex formation time in several groups of patients with differing cardiac pathologies.

Determinación no invasiva del tiempo de formación de vórtice mediante ecocardiograma transesofágico durante la cirugía cardíaca

Trans-mitral blood flow produces a three-dimensional rotational body of fluid, known as a vortex ring, that enhances the efficiency of left ventricular ...

Transdermal Measurement of Glomerular Filtration Rate in Mice

Transdermal analysis of glomerular filtration rate (GFR) is an established technique that is used to assess renal function in mouse and rat models of acute kidney injury and chronic kidney disease. The measurement system consists of a miniaturized fluorescence detector that is directly attached to the skin on the back of conscious, freely moving animals, and measures the excretion kinetics of the exogenous GFR tracer, fluorescein-isothiocyanate (FITC) conjugated sinistrin (an inulin analog). This system has been described in detail in rats. However, because of their smaller size, measurement of transcutaneous GFR in mice presents additional technical challenges. In this paper we therefore provide the first detailed practical guide to the use of transdermal GFR monitors in mice based on the combined experience of three different investigators who have been performing this assay in mice over a number of years.

Here we describe a protocol to measure glomerular filtration rate (GFR) in conscious, freely moving mice using a transdermal GFR monitor.

Transdérmica de medición de la tasa de filtración Glomerular en los ratones

Transdermal analysis of glomerular filtration rate (GFR) is an established technique that is used to assess renal function in mouse and rat models of ...

Noninvasive Electrocardiography in the Perinatal Mouse

Electrocardiography (ECG) has long been relied upon as an effective and reliable method of assessing cardiovascular (and cardiopulmonary) function in both human and animal models of disease. Individual heart rate, rhythm, and regularity, combined with quantitative parameters collected from ECG, serve to assess the integrity of the cardiac conduction system as well as the integrated physiology of the cardiac cycle. This article provides a comprehensive description of the methods and techniques used to perform a noninvasive ECG on perinatal and neonatal mouse pups as early as the first postnatal day, without requiring the use of anesthetics. This protocol was designed to directly address a need for a standardized and repeatable method for obtaining ECG in newborn mice. From a translational perspective, this protocol proves to be entirely effective for characterization of congenital cardiopulmonary defects generated using transgenic mouse lines, and particularly for analysis of defects causing lethality at or during the first postnatal days. This protocol also aims to directly address a gap in the scientific literature to characterize and provide normative data associated with maturation of the early postnatal cardiac conduction system. This method is not limited to a specific postnatal timepoint, but rather allows for ECG data collection in neonatal mouse pups from birth to postnatal day 10 (P10), a window that is of critical importance for modeling human diseases in vivo, with particular emphasis on congenital heart disease (CHD).

Here, we present a noninvasive electrocardiography (ECG) protocol, optimized for early postnatal mice, that does not require the use of anesthetics.

Electrocardiografía no invasiva en el ratón perinatal

Electrocardiography (ECG) has long been relied upon as an effective and reliable method of assessing cardiovascular (and cardiopulmonary) function in both ...

Morphological and Functional Assessment of the Right Ventricle Using 3D Echocardiography

Traditionally, it was believed that the right side of the heart has a minor role in circulation; however, more and more data suggest that right ventricular (RV) function has strong diagnostic and prognostic power in various cardiovascular disorders. Due to its complex morphology and function, assessment of the RV by conventional two-dimensional echocardiography is limited: the everyday clinical practice usually relies on simple linear dimensions and functional measures. Three-dimensional (3D) echocardiography overcame these limitations by providing volumetric quantification of the RV free of geometrical assumptions. Here, we offer a step-by-step guide to obtain and analyze 3D echocardiographic data of the RV using the leading commercially available software. We will quantify 3D RV volumes and ejection fraction. Several technical aspects may help to improve the quality of RV acquisition and analysis as well, which we present in a practical manner. We review the current opportunities and the limiting factors of this method and also highlight the potential applications of 3D RV assessment in current clinical practice.

Here, we provide a step-by-step acquisition and analysis protocol for the 3D volumetric assessment of the right ventricle, mainly focusing on the practical aspects that maximize the feasibility of this technique.

Evaluación morfológica y funcional del ventrículo derecho mediante ecocardiografía 3D

Traditionally, it was believed that the right side of the heart has a minor role in circulation; however, more and more data suggest that right ...

Dynamic Measurement and Imaging of Capillaries, Arterioles, and Pericytes in Mouse Heart

Coronary arterial tone along with the opening or closing of the capillaries largely determine the blood flow to cardiomyocytes at constant perfusion pressure. However, it is difficult to monitor the dynamic changes of the coronary arterioles and the capillaries in the whole heart, primarily due to its motion and non-stop beating. Here we describe a method that enables monitoring of arterial perfusion rate, pressure and the diameter changes of the arterioles and capillaries in mouse right ventricular papillary muscles. The mouse septal artery is cannulated and perfused at a constant flow or pressure with the other dynamically measured. After perfusion with a fluorescently labeled lectin (e.g., Alexa Fluor-488 or -633 labeled Wheat-Germ Agglutinin, WGA), the arterioles and capillaries (and other vessels) in right ventricle papillary muscle and septum could be readily imaged. The vessel-diameter changes could then be measured in the presence or absence of heart contractions. When genetically encoded fluorescent proteins were expressed, specific features could be monitored. For examples, pericytes were visualized in mouse hearts that expressed NG2-DsRed. This method has provided a useful platform to study the physiological functions of capillary pericytes in heart. It is also suitable for studying the effect of reagents on the blood flow in heart by measuring the vascular/capillary diameter and the arterial luminal pressure simultaneously. This preparation, combined with a state-of-the-art optic imaging system, allows one to study the blood flow and its control at cellular and molecular level in the heart under near-physiological conditions.

Presented here is a protocol to study the coronary microcirculation in living murine heart tissue by ex vivo monitoring of the arterial perfusion pressure and flow that maintains the pressure, as well as vascular tree components including the capillary beds and pericytes, as the septal artery is cannulated and pressurized.

Medición dinámica e imagen de capilares, arterias y pericitos en el corazón del ratón

Coronary arterial tone along with the opening or closing of the capillaries largely determine the blood flow to cardiomyocytes at constant perfusion ...

Measurement of Heart Contractility in Isolated Adult Human Primary Cardiomyocytes

The evaluation of changes in heart contractility is essential during preclinical development for new cardiac- and non-cardiac-targeted compounds. This paper describes a protocol for assessing changes in contractility in adult human primary ventricular cardiomyocytes utilizing the MyoBLAZER, a non-invasive optical method that preserves the normal physiology and pharmacology of the cells. This optical recording method continuously measures contractility transients from multiple cells in parallel, providing both medium-throughput and valuable information for each individual cell in the field of view, enabling the real-time tracking of drug effects. The cardiomyocyte contractions are induced by paced electrical field stimulation, and the acquired bright field images are fed to an image-processing software that measures the sarcomere shortening across multiple cardiomyocytes. This method rapidly generates different endpoints related to the kinetics of contraction and relaxation phases, and the resulting data can then be interpreted in relation to different concentrations of a test article. This method is also employed in the late stages of preclinical development to perform follow-up mechanistic studies to support ongoing clinical studies. Thus, the adult human primary cardiomyocyte-based model combined with the optical system for continuous contractility monitoring has the potential to contribute to a new era of in vitro cardiac data translatability in preclinical medical therapy development.

This protocol describes how to measure contractility in adult human primary cardiomyocytes from donor hearts with the MyoBLAZER system, a reliable platform for assessing drug-induced changes in contractility during preclinical development.

Medición de la contractilidad cardíaca en cardiomiocitos primarios humanos adultos aislados

The evaluation of changes in heart contractility is essential during preclinical development for new cardiac- and non-cardiac-targeted compounds. This ...