Este trabajo fue apoyado por una beca de Lundbeck Jefe de Grupo Junior de LNN. PWW reconoce el apoyo financiero donación de Ciencias Naturales e Ingeniería de Investigación de Canadá (NSERC). También agradecemos a la Molecular Bioimaging Centro Danés de la Universidad del Sur de Dinamarca para el acceso a girar microscopía disco.

Adquisición de proteínas EGFP-etiquetados en la membrana de plasma para el análisis de CCI se puede hacer en un microscopio de epifluorescencia, una configuración de TIRF o en un microscopio de disco giratorio fijado para adquirir imágenes de la membrana de interés. El tamaño de los píxeles de la cámara, así como el tiempo entre cuadros de imagen es necesaria para el análisis. Las secuencias de imágenes de 100-1,200 fotogramas a una velocidad de 4-30 Hz se pueden utilizar para el análisis. Durante la adquisición, es importante para mantener la membrana en el foco a lo largo de la duración de la formación de imágenes y centrarse en una fracción de la membrana plana en la que la fluorescencia se distribuye de manera uniforme. Mover vesículas, que sobresale regiones de membrana y orgánulos celulares se pueden recortar más tarde en el proceso de análisis. El tiempo de adquisición debe ser elegido de modo que no hay deriva o el movimiento de la célula. Para obtener las secuencias de comandos de código de las CCI para MATLAB, póngase en contacto con Paul Wiseman (Paul.Wiseman @ McGill.ca). La primera vez que el código de las CCI se utiliza, MAT abiertaLAB y haga clic en archivo, la ruta a continuación, establecer, a continuación, haga clic en añadir a las subcarpetas y busque la carpeta en la computadora en la que se encuentra el código CCI. Haga clic en Aceptar, guardar y cerrar. Ahora hay que continuar con el análisis de los cultivos que se describen en los siguientes puntos. 1. Importe la secuencia de imágenes de interés en un programa de análisis de imagen como TIFF Stack Guarde el archivo con el nombre: stack1.tif. <ol><li> Seleccione una región rectangular de interés (ROI) en la parte plana de la membrana de exclusión de orgánulos celulares móviles y sobresaliendo regiones de membrana. El tamaño de la cosecha se seleccionará de forma que suficientes estadísticas se generan para el bien k 2 parcelas. </li><li> Recortar la región y salvar el cultivo como un archivo TIFF en una carpeta adecuada. Si hay varios cultivos de la misma película, use un incremento de número, por ejemplo, &quot;stack1crop.tif&quot;, &quot;stack1crop2.tif&quot;, &quot;stack1crop3.tif&quot;. </li><li> Coloque la carpeta que contiene los cultivos a nivel localen el equipo, no en el servidor, mientras que hace un análisis de las CCI. </li></ol> 2. Importe los Cultivos en el software de análisis de uno en uno para realizar el análisis de <ol><li> Abrir MATLAB y tipo &quot;icsgui&quot; en la ventana de comandos y presione ENTRAR. ICS GUI es el nombre del ejecutable para el programa de interfaz gráfica de usuario de la espectroscopia de correlación de imágenes. </li><li> En la interfaz gráfica de usuario de ICS, haga clic en la pestaña &quot;CCI&quot;. Una captura de pantalla de la ventana de análisis se muestra en la Figura 1. </li><li> Encuentre la carpeta con el nombre de la carpeta &quot;código MATLAB&quot; y desplácese hasta el archivo con el nombre de archivo &quot;Scripts&quot; y abra esta haciendo doble clic en él. Alternativamente, haga clic derecho en el archivo y seleccione &quot;abrir con MATLAB&quot; o ir a un archivo, se abre en MATLAB y abra el archivo scripts. Este archivo se llama Editor. </li><li> En el libro del editor de «CCI Cargar conjuntos de datos&quot; y, a continuación, copie o nombre de archivo tipo y ubicación de la carpeta en la línea de comandos que comienzacon img = por ejemplo, &quot;C: Users Documents AQP3dynamics stack1crop.tif&quot;. En la línea de comandos debajo de la ubicación de la carpeta ajustar el número de fotogramas que se van a analizar - por ejemplo, [1:500]. Utilice los mismos ajustes para todas las películas consecutivas en la serie de datos. Si hay desviación foco en cuadros posteriores, éstos deben ser excluidos del análisis. </li><li> En el editor, haga clic en &quot;Guardar&quot; y luego haga clic en &quot;evaluar la celda&quot;. El conjunto de datos ya está cargado en en el software de análisis. </li><li> En la ventana de Análisis de las CCI en los GUI, introduzca los valores para el análisis: <ol><li> Desmarca casillas &quot;células T&quot;. </li><li> Introduzca el número de retardos a analizar. El número de retardos de tiempo (τ) tendrá efecto en la trama de difusión y debe ser elegido de modo que la trama de difusión es lineal. Comience con la participación en el 25 y después disminuir hasta donde la trama de difusión es lineal. τ es el número de desfases el análisis compara las CCI y un lapso de tiempo es el tiempo de bntre una trama y la siguiente. El valor más pequeño que da una representación lineal debe ser seleccionado. El número máximo de retrasos de tiempo se elige de manera que se obtiene un ajuste lineal, la elección de un valor más alto producirá datos que no pueden ser línea ajustada. </li><li> Introduzca el valor máximo k 2 (ver Círculo 1 de la figura 1), por lo general es de 20-50. Un buen k 2 parcela es un trazado en el que hay muchos puntos de datos que se distribuyen a lo largo de una línea. Comience con la participación en el 70 y luego disminuir después de haber evaluado los k 2 y difusión parcelas y seleccione el valor más bajo en el que el grupo de puntos de datos en torno a una línea recta. El valor de k 2 es la magnitud al cuadrado de la k-vector espacial en el espacio de Fourier. Inicialmente, el análisis debe repetirse hasta que se determinen los mejores valores, a continuación, utilizar la misma configuración para todas las películas consecutivas en la serie de datos, pero siempre asegúrese de que los ajustes seleccionados dan un buen ajuste a los datos: bien k 2 parcelasy una trama de difusión lineal. </li><li> Haga clic en &quot;Configuración de las tiendas y proceder&quot;. </li><li> Haz clic en &quot;Sí&quot; para mostrar todos los gráficos. </li><li> Haga clic en &quot;imagen de la serie de carga&quot; (véase el círculo 2 de la Figura 1), a continuación, haga clic en &quot;espacio de trabajo&quot;. </li><li> Seleccione &quot;imgSerCrop&quot;, a continuación, haga clic en &quot;Importar de espacio de trabajo&quot;. </li><li> Introduzca los valores de recogida de sistema de imágenes. En el &quot;tamaño del píxel&quot; cuadro de introducir el tamaño del pixel proyectado para el sistema de imágenes en la que las pilas de imágenes son adquiridas. Para AQP3-EGFP, se utilizó 0.111. En el cuadro &quot;Especifique el tiempo (s) entre bastidores&quot;, 0.1150 se utilizó para AQP3-EGFP. </li><li> Haga clic en &quot;seleccionar ROI&quot;, introduzca &quot;1&quot;, haga clic en Aceptar y &quot;utilizar toda la imagen&quot;. </li><li> Haga clic en &quot;análisis Do CCI&quot; y haga clic en Sí para hacer &quot;filtrado inmóvil&quot;. Resultados se abrirán automáticamente como imágenes. </li><li> Minimizar la ventana de ajustes, minimizar la información de célula window, y minimizar la ventana fotofísica. En la ventana de la dinámica, compruebe que la trama dinámica muestra un ajuste lineal de los datos a una línea con una pendiente negativa lo que significa que los puntos de datos se correlacionan y difusión libre se puede suponer. Registre el coeficiente de difusión para el lapso de tiempo específico y k 2 ajustes (no es necesario tener en cuenta la desviación estándar del ajuste). Los puntos de datos en los k 2 parcelas deben ser agrupados en torno a la línea para el momento dado se queda. </li><li> Marque la casilla &quot;Guardar figuras abiertas como imágenes&quot;, a continuación, haga clic en &quot;Guardar figuras abiertas como imágenes&quot; para guardar los archivos de resultado. Guarda en una nueva carpeta en C: Users Documentos AQP3diffusion. Haga clic en &quot;claro de datos actual&quot; y continuar con el análisis de la próxima cosecha. </li></ol></li></ol> 3. Promedio del Coeficiente de Difusión Calculado está calculado para obtener una visión general de los datos analizados <ol><li> Introduzca los coeficientes de difusión individuales de cada ROI en un spreadsheet (asegúrese de tomar nota de la τ y k 2 valores), utilice los nombres de los cultivos establecidos anteriormente. </li><li> Calcule el promedio de coeficiente de difusión y la desviación estándar utilizando un programa de hoja de cálculo. </li><li> Realice una prueba de Kolmogorov-Smirnov o estudiantes t-test para evaluar diferencias estadísticas con un nivel de significación del 5%. Comparaciones Quantitave entre las células (por ejemplo, tratados vs no tratado) se pueden hacer. </li><li> Abra la versión de hoja de cálculo de las parcelas de difusión que se generan por el software de análisis para cada cultivo, y un promedio de los datos de cada estado para cada intervalo de tiempo. Generar una nueva trama de difusión promedio de presentación de documentos o las presentaciones. </li></ol>

<ol>
	<li>Kolin, D. L., Ronis, D., Wiseman, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=k-Space+image+correlation+spectroscopy:+A+method+for+accurate+transport+measurements+independent+of+fluorophore+photophysics.">k-Space image correlation spectroscopy: A method for accurate transport measurements independent of fluorophore photophysics.</a> Biophysical Journal. 91, 3061-3075 (2006).</li><li>Saxton, M. J., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-particle+tracking:+Applications+to+membrane+dynamics.">Single-particle tracking: Applications to membrane dynamics.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 26, 373-399 (1997).</li><li>Bannai, H., Levi, S., Schweizer, C., Dahan, M., Triller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+lateral+diffusion+of+membrane+molecules+with+quantum+dots.">Imaging the lateral diffusion of membrane molecules with quantum dots.</a> Nat Protoc. 1, 2628-2634 (2006).</li><li>Jaqaman, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+single-particle+tracking+in+live-cell+time-lapse+sequences.">Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences.</a> Nat Methods. 5, 695-702 (2008).</li><li>Pinaud, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+partitioning+of+a+glycosyl-phosphatidylinositol-anchored+protein+in+glycosphingolipid-rich+microdomains+imaged+by+single-quantum+dot+tracking.">Dynamic partitioning of a glycosyl-phosphatidylinositol-anchored protein in glycosphingolipid-rich microdomains imaged by single-quantum dot tracking.</a> Traffic. 10, 691-712 (2009).</li><li>Wieser, S., Axmann, M., Schutz, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+analysis+of+single-molecule+tracking+data+by+comprehensive+testing+against+Monte+Carlo+simulations.">Versatile analysis of single-molecule tracking data by comprehensive testing against Monte Carlo simulations.</a> Biophys J. 95, 5988-6001 (2008).</li><li>Sbalzarini, I. F., Koumoutsakos, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feature+point+tracking+and+trajectory+analysis+for+video+imaging+in+cell+biology.">Feature point tracking and trajectory analysis for video imaging in cell biology.</a> Journal of Structural Biology. 151, 182-195 (2005).</li><li>Durisic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+correction+of+blinking+bias+in+image+correlation+transport+measurements+of+quantum+dot+tagged+macromolecules.">Detection and correction of blinking bias in image correlation transport measurements of quantum dot tagged macromolecules.</a> Biophys J. 93, 1338-1346 (2007).</li><li>Umenishi, F., Verbavatz, J. M., Verkman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cAMP+regulated+membrane+diffusion+of+a+green+fluorescent+protein-aquaporin+2+chimera.">cAMP regulated membrane diffusion of a green fluorescent protein-aquaporin 2 chimera.</a> Biophys J. 78, 1024-1035 (2000).</li><li>Levin, M. H., Haggie, P. M., Vetrivel, L., Verkman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusion+in+the+endoplasmic+reticulum+of+an+aquaporin-2+mutant+causing+human+nephrogenic+diabetes+insipidus.">Diffusion in the endoplasmic reticulum of an aquaporin-2 mutant causing human nephrogenic diabetes insipidus.</a> The Journal of biological chemistry. 276, 21331-21336 (2001).</li><li>Semrau, S., Schmidt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle+image+correlation+spectroscopy+(PICS):+retrieving+nanometer-scale+correlations+from+high-density+single-molecule+position+data.">Particle image correlation spectroscopy (PICS): retrieving nanometer-scale correlations from high-density single-molecule position data.</a> Biophys J. 92, 613-621 (2007).</li><li>Petersen, N. O., Hoddelius, P. L., Wiseman, P. W., Seger, O., Magnusson, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+membrane+receptor+distributions+by+image+correlation+spectroscopy:+concept+and+application.">Quantitation of membrane receptor distributions by image correlation spectroscopy: concept and application.</a> Biophys J. 65, 1135-1146 (1993).</li><li>Marlar, S., Arnspang, E. C., Koffman, J. S., L&#248;cke, E. M., Christensen, B. M., Nejsum, L. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+cAMP+increases+aquaporin-3+plasma+membrane+diffusion.">Elevated cAMP increases aquaporin-3 plasma membrane diffusion.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 306, (2014).</li></ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

En este trabajo se presenta una descripción detallada paso a paso de cómo aplicar el método de análisis de las CCI para determinar los coeficientes de difusión de imágenes de microscopía de proteínas marcadas con proteínas fluorescentes. El análisis es independiente de la elección de la sonda con un muy amplio rango dinámico en la densidad de etiquetado y puede por lo tanto también se puede aplicar a proteínas marcadas con puntos cuánticos, así como colorantes y proteínas fluorescentes tales como EGFP. ...

La organización espacio-temporal de cuatro dimensiones y la movilidad lateral de proteínas de membrana de plasma están fuertemente regulados y pueden desempeñar un papel en la función de la proteína, la actividad y de las interacciones proteína-proteína. Difusión lateral de las proteínas de la membrana plasmática, que tradicionalmente se ha estudiado mediante el cálculo de los coeficientes de difusión de las partículas individuales de time-lapse de punto cuántico o teñir las proteínas de membrana plasmática etiquetados 2-4. Este enfoque requiere la inserción de una etiqueta extracelular en la proteína de la membrana de plasma de punto cuántico o tinte de etiquetado, lo que puede comprometer plegado y función de las proteínas y, por tanto, no pueden ser alcanzados para algunas proteínas. El volumen estérico de un punto cuántico se ha demostrado que reducir la velocidad de difusión de la proteína 5 y por otra parte, sólo una pequeña fracción de las proteínas de la población está marcada con puntos cuánticos, y no se sabe si esta fracción es representativa para el total grupo de proteínas de la membrana de plasma. Tra de partículas individualescking (SPT) mediciones de los coeficientes de difusión de imagen de serie de proteínas marcadas puntos cuánticos implica el mapeo de las posiciones de los picos fotografiados de las partículas con dos gaussiana bidimensional encaja seguido de algoritmos de análisis extensos. El análisis es computacionalmente muy intensivo, que requiere extensa de curva no lineal apropiado en cada cuadro de imagen de una secuencia de lapso de tiempo a las aproximaciones de la función de dispersión de punto microscopio (típicamente de dos dimensiones gaussianas espacial) y la posterior unión de las posiciones de partículas en trayectorias de las partículas que describe el movimiento de las moléculas individuales 6,7. Una técnica de correlación de imágenes recientemente desarrollada, k-espacio Correlación Imagen Espectroscopía (CCI) permite mediciones sencillas relativas de los coeficientes de difusión de los etiquetados con fluorescencia proteínas de la membrana de plasma. La posibilidad de calcular de forma rutinaria coeficientes de difusión de las proteínas de membrana marcadas con proteínas fluorescentes por las CCI es una herramienta única que mantienevarias ventajas sobre cuántica tradicional salpican análisis SPT: No se requiere la inserción de etiquetas y tiempo extracelulares que consumen etiquetado extracelular (líneas celulares que expresan proteínas fluorescentes se pueden utilizar); los coeficientes de difusión se extraen de la piscina total de proteínas fluorescentes en comparación con un subconjunto marcado con puntos cuánticos; análisis es simple sin la necesidad de realizar un seguimiento de las proteínas individuales y el análisis se puede realizar utilizando un código existente con ningún requisito para la programación de usuario adicional. El método es rápido, ya que es una técnica de promedio que permite el cálculo rápido y cálculo de los coeficientes de difusión. Estas mediciones de difusión rápida para la población de proteínas se complementan la información de transporte molecular más detallada obtenida de un subconjunto de la población por los métodos SPT esmerados. tiempo CCI correlaciona secuencias de imágenes de microscopía de fluorescencia que primero han sido transformadas para el espacio de Fourier, y por lo tanto separa flfluctuaciones uorescencia debido a fotofísica de las debidas al transporte molecular 1. Como resultado, las CCI pueden determinar la densidad del número, la velocidad de flujo, y la difusión de moléculas, mientras que la etiqueta fluorescente ser imparcial por fotoblanqueo complejo o parpadeo de los fluoróforos. Esto hace que las CCI una herramienta útil para determinar rápidamente la dinámica de difusión de proteínas de membrana de células con fluorescencia marcado con y sin la necesidad de algoritmos de escritura personalizados. Además de las proteínas marcadas fluorescentemente, CCI también se pueden aplicar a proteínas de membrana de punto marcado cuánticos 8. Este documento ofrece una introducción paso a paso de cómo utilizar las CCI para extraer los coeficientes de difusión de las proteínas de la membrana plasmática de etiquetado EGFP mediante la demostración de cómo colocar la cosecha, cómo utilizar el código y cómo evaluar las parcelas generadas, de las cuales la difusión coeficientes se extraen. A modo de ejemplo, los datos obtenidos por hilado conjunto de discos-microscopía en semi-reflexión interna total fluorescenciaModo nce (TIRF), de un canal de agua renal de proteínas acuaporina-3 (AQP3) etiquetados con EGFP se presenta.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="406">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">31600-083</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">FBS</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td>10082147</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Penicilin&#160;&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/13752?lang=en&amp;region=DK">13752</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Kanamycin</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td>15160070</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Streptomycin</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td>11860038</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Phenol red free medium</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td>11880-028</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMSO</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d8418?lang=en&amp;region=DK">D8418&#160;</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HEPES</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td>15630056</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Apparatus</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Spinning Disk Microscope</td>
			<td style="width:71px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">Ti Eclipse</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EMCCD Camera</td>
			<td style="width:71px;">Andor</td>
			<td style="width:119px;">Ixon+</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

easy measurement of diffusion coefficients of egfp-tagged plasma membrane proteins using k-space image correlation spectroscopy

Difusión lateral y la compartimentación de proteínas de la membrana de plasma están fuertemente regulados en las células y, por tanto, el estudio de estos procesos se revelan nuevas perspectivas al plasma la función de proteínas de membrana y la regulación. Recientemente, k-espacio de correlación de imágenes de espectroscopia (CCI) 1 fue desarrollado para permitir mediciones de rutina de los coeficientes de difusión directa a partir de imágenes de proteínas de la membrana plasmática marcados con fluorescencia, que evitaron sesgos sistemáticos introducidos por fotofísica sonda. Aunque la base teórica para el análisis es complejo, el método puede ser implementado por los no expertos utilizando un código libremente disponibles para medir los coeficientes de difusión de las proteínas. CCI calcula una función de correlación de tiempo a partir de una imagen Pila microscopía de fluorescencia después de la transformación de Fourier de cada imagen para recíproca (k-) el espacio. Posteriormente, promediado circular, logaritmo natural transformada lineal y se ajusta a la función de correlación se obtiene el coeficiente de difusión. Estedocumento proporciona una guía paso a paso para el análisis de imágenes y la medición de los coeficientes de difusión a través de las CCI. En primer lugar, una secuencia de imágenes de alta velocidad de fotogramas de una proteína de membrana plasmática marcada con fluorescencia se adquiere mediante un microscopio de fluorescencia. Entonces, se selecciona una región de interés (ROI) evitando orgánulos intracelulares, vesículas en movimiento o que sobresale regiones de membrana. La pila de retorno de la inversión se importa en un código de libre acceso y varios parámetros definidos (véase la sección Método) se establecen para el análisis de las CCI. Entonces, el programa genera una &quot;pendiente de las laderas&quot; complot de las funciones de correlación de tiempo k-espacio, y el coeficiente de difusión se calcula a partir de la pendiente de la parcela. A continuación se muestra un procedimiento paso a paso las CCI para medir el coeficiente de difusión de una proteína de membrana utilizando el renal canal de agua acuaporina-3 etiquetados con EGFP como un ejemplo canónico.

Para adquirir pilas de imágenes adecuadas para ser analizadas con las CCI, se pueden utilizar diferentes sistemas de microscopio. Es posible analizar secuencias de imágenes de un microscopio de epi-fluorescencia, así como una configuración de disco TIRF o girando. La membrana debe ser plana sin grandes orgánulos celulares móviles o en movimiento vesículas / objetos. En este trabajo se presenta una secuencia de imágenes de lapso de tiempo de AQP3 etiquetados con EGFP en células MDCK en vivo fotografiados en un m...

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Easy Measurement of Diffusion Coefficients of EGFP-tagged Plasma Membrane Proteins Using k-Space Image Correlation Spectroscopy

Este documento proporciona una guía paso a paso a la técnica de análisis de fluctuación de imagen k-espacio espectroscopia de correlación (CCI) para la medición de los coeficientes de difusión de la etiqueta fluorescente proteínas de la membrana plasmática en células de mamíferos vivos.

Fácil Medición de Difusión Coeficientes de etiquetado-EGFP Plasma Proteínas de la Membrana Usando k-espacio Correlación Imagen Spectroscopy

Lateral diffusion and compartmentalization of plasma membrane proteins are tightly regulated in cells and thus, studying these processes will reveal new ...

easy-measurement-diffusion-coefficients-egfp-tagged-plasma-membrane

Research

JoVE Journal

Biology

10.6K vistas.  Aarhus University.  Este documento proporciona una guía paso a paso a la técnica de análisis de fluctuación de imagen k-espacio espectroscopia de correlación (CCI) para la medición de los coeficientes de difusión de la etiqueta fluorescente proteínas de la membrana plasmática en células de mamíferos vivos. 

Video: Easy Measurement of Diffusion Coefficients of EGFP-tagged Plasma Membrane Proteins Using k-Space Image Correlation Spectroscopy

Measuring Diffusion Coefficients via Two-photon Fluorescence Recovery After Photobleaching

Multi-fluorescence recovery after photobleaching is a microscopy technique used to measure the diffusion coefficient (or analogous transport parameters) of macromolecules, and can be applied to both in vitro and in vivo biological systems. Multi-fluorescence recovery after photobleaching is performed by photobleaching a region of interest within a fluorescent sample using an intense laser flash, then attenuating the beam and monitoring the fluorescence as still-fluorescent molecules from outside the region of interest diffuse in to replace the photobleached molecules. We will begin our demonstration by aligning the laser beam through the Pockels Cell (laser modulator) and along the optical path through the laser scan box and objective lens to the sample. For simplicity, we will use a sample of aqueous fluorescent dye. We will then determine the proper experimental parameters for our sample including, monitor and bleaching powers, bleach duration, bin widths (for photon counting), and fluorescence recovery time. Next, we will describe the procedure for taking recovery curves, a process that can be largely automated via LabVIEW (National Instruments, Austin, TX) for enhanced throughput. Finally, the diffusion coefficient is determined by fitting the recovery data to the appropriate mathematical model using a least-squares fitting algorithm, readily programmable using software such as MATLAB (The Mathworks, Natick, MA).

In this article we will describe the procedure for measuring diffusion coefficients using multi-photon fluorescence recovery after photobleaching. We will begin by aligning the laser along the optical path to the sample and determining the proper experimental parameters, then continue generating and finally fitting fluorescence recovery curves.

Medición de los coeficientes de difusión a través de dos fotones de fluorescencia de recuperación después de photobleaching

Multi-fluorescence recovery after photobleaching is a microscopy technique used to measure the diffusion coefficient (or analogous transport parameters) ...

Investigación

Biología

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the lipidic cubic phase or in meso method. The method has been shown to be quite versatile in that it has been used to solve X-ray crystallographic structures of prokaryotic and eukaryotic proteins, proteins that are monomeric, homo- and hetero-multimeric, chromophore-containing and chromophore-free, and alpha-helical and beta-barrel proteins. Recent successes using in meso crystallization are the human engineered beta2-adrenergic and adenosine A2a G protein-coupled receptors. Protocols are presented for reconstituting the membrane protein into the monoolein-based mesophase, and for setting up crystallizations in the manual mode. Additional steps in the overall process, such as crystal harvesting, are to be addressed in future video articles. The time required to prepare the protein-loaded mesophase and to set up a crystallization plate manually is about one hour.

Herein is described the procedure implemented in the Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group to set up manually crystallization trials of membrane proteins in lipidic mesophases.

Cristalización de las proteínas de membrana para la Determinación de la estructura con mesofases lipídico

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

Quantitative Measurement of GLUT4 Translocation to the Plasma Membrane by Flow Cytometry

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces glucose uptake by insulin-sensitive tissues, most notably the brain, skeletal muscle, and adipocytes. Patients suffering from type-2 diabetes and/or obesity often develop insulin resistance and are unable to control their glucose homeostasis. New insights into the mechanisms of insulin resistance may provide new treatment strategies for type-2 diabetes.
The GLUT family of glucose transporters consists of thirteen members distributed on different tissues throughout the body1. Glucose transporter type 4 (GLUT4) is the major transporter that mediates glucose uptake by insulin sensitive tissues, such as the skeletal muscle. Upon binding of insulin to its receptor, vesicles containing GLUT4 translocate from the cytoplasm to the plasma membrane, inducing glucose uptake. Reduced GLUT4 translocation is one of the causes of insulin resistance in type-2 diabetes2,3.
The translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane can be visualized by immunocytochemistry, using fluorophore-conjugated GLUT4-specific antibodies.
Here, we describe a technique to quantify total amounts of GLUT4 translocation to the plasma membrane of cells during a chosen duration, using flow cytometry. This protocol is rapid (less than 4 hours, including incubation with insulin) and allows the analysis of as few as 3,000 cells or as many as 1 million cells per condition in a single experiment. It relies on anti-GLUT4 antibodies directed to an external epitope of the transporter that bind to it as soon as it is exposed to the extracellular medium after translocation to the plasma membrane.

This protocol describes a rapid technique to quantify the translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane of cells by flow cytometry.

La medición cuantitativa de la translocación de GLUT4 a la membrana plasmática por citometría de flujo

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces ...

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are implicated in a multitude of malfunctions and diseases. However, a structural and functional understanding of membrane proteins is strongly lagging behind that of their soluble partners, mainly, due to difficulties associated with their solubilization and generation of diffraction quality crystals. Crystallization in lipidic mesophases (also known as in meso or LCP crystallization) is a promising technique which was successfully applied to obtain high resolution structures of microbial rhodopsins, photosynthetic proteins, outer membrane beta barrels and G protein-coupled receptors. In meso crystallization takes advantage of a native-like membrane environment and typically produces crystals with lower solvent content and better ordering as compared to traditional crystallization from detergent solutions. The method is not difficult, but requires an understanding of lipid phase behavior and practice in handling viscous mesophase materials. Here we demonstrate a simple and efficient way of making LCP and reconstituting a membrane protein in the lipid bilayer of LCP using a syringe mixer, followed by dispensing nanoliter portions of LCP into an assay or crystallization plate, conducting pre-crystallization assays and harvesting crystals from the LCP matrix. These protocols provide a basic guide for approaching in meso crystallization trials; however, as with any crystallization experiment, extensive screening and optimization are required, and a successful outcome is not necessarily guaranteed.

The protocols describe the essential steps for obtaining diffraction quality crystals of a membrane protein starting from reconstitution of the protein in a lipidic cubic phase (LCP), finding initial conditions with LCP-FRAP pre-crystallization assays, setting up LCP crystallization trials and harvesting crystals.

La cristalización de proteínas de membrana en mesofases lipídico

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are ...

Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in quantitation, are associated with a high cost, long lead time, and are fraught with drawbacks (e.g. heterophilic antibodies, autoantibody interference, 'hook-effect').1 An alternative technique is affinity enrichment of peptides coupled with quantitative mass spectrometry, commonly referred to as SISCAPA (Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies).2 In this technique, affinity enrichment of peptides with stable isotope dilution and detection by selected/multiple reaction monitoring mass spectrometry (SRM/MRM-MS) provides quantitative measurement of peptides as surrogates for their respective proteins. SRM/MRM-MS is well established for accurate quantitation of small molecules 3, 4 and more recently has been adapted to measure the concentrations of proteins in plasma and cell lysates.5-7 To achieve quantitation of proteins, these larger molecules are digested to component peptides using an enzyme such as trypsin. One or more selected peptides whose sequence is unique to the target protein in that species (i.e. "proteotypic" peptides) are then enriched from the sample using anti-peptide antibodies and measured as quantitative stoichiometric surrogates for protein concentration in the sample. Hence, coupled to stable isotope dilution (SID) methods (i.e. a spiked-in stable isotope labeled peptide standard), SRM/MRM can be used to measure concentrations of proteotypic peptides as surrogates for quantification of proteins in complex biological matrices. The assays have several advantages compared to traditional immunoassays. The reagents are relatively less expensive to generate, the specificity for the analyte is excellent, the assays can be highly multiplexed, enrichment can be performed from neat plasma (no depletion required), and the technique is amenable to a wide array of proteins or modifications of interest.8-13 In this video we demonstrate the basic protocol as adapted to a magnetic bead platform.

Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies (SISCAPA) couples affinity enrichment of peptides with stable isotope dilution mass spectrometry (MRM-MS) to provide quantitative measurement of peptides as surrogates for their respective proteins. Here we describe the protocol using magnetic particles in a partially automated format.

La cuantificación de proteínas mediante el enriquecimiento de inmunoafinidad péptido acoplado a espectrometría de masas

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in ...

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing (MTT)

Our goal is to obtain a comprehensive description of molecular processes occurring at cellular membranes in different biological functions. We aim at characterizing the complex organization and dynamics of the plasma membrane at single-molecule level, by developing analytic tools dedicated to Single-Particle Tracking (SPT) at high density: Multiple-Target Tracing (MTT)1. Single-molecule videomicroscopy, offering millisecond and nanometric resolution1-11, allows a detailed representation of membrane organization12-14 by accurately mapping descriptors such as cell receptors localization, mobility, confinement or interactions.
We revisited SPT, both experimentally and algorithmically. Experimental aspects included optimizing setup and cell labeling, with a particular emphasis on reaching the highest possible labeling density, in order to provide a dynamic snapshot of molecular dynamics as it occurs within the membrane. Algorithmic issues concerned each step used for rebuilding trajectories: peaks detection, estimation and reconnection, addressed by specific tools from image analysis15,16. Implementing deflation after detection allows rescuing peaks initially hidden by neighboring, stronger peaks. Of note, improving detection directly impacts reconnection, by reducing gaps within trajectories. Performances have been evaluated using Monte-Carlo simulations for various labeling density and noise values, which typically represent the two major limitations for parallel measurements at high spatiotemporal resolution.
The nanometric accuracy17 obtained for single molecules, using either successive on/off photoswitching or non-linear optics, can deliver exhaustive observations. This is the basis of nanoscopy methods17 such as STORM18, PALM19,20, RESOLFT21 or STED22,23, which may often require imaging fixed samples. The central task is the detection and estimation of diffraction-limited peaks emanating from single-molecules. Hence, providing adequate assumptions such as handling a constant positional accuracy instead of Brownian motion, MTT is straightforwardly suited for nanoscopic analyses. Furthermore, MTT can fundamentally be used at any scale: not only for molecules, but also for cells or animals, for instance. Hence, MTT is a powerful tracking algorithm that finds applications at molecular and cellular scales.

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing MTT

Multiple-Target Tracing is a homemade algorithm developed for tracking individually labeled molecules within the plasma membrane of living cells. Efficiently detecting, estimating and tracing molecules over time at high-density provide a user-friendly, comprehensive tool to investigate nanoscale membrane dynamics.

Cartografía de la difusión molecular en la membrana plasmática de objetivos múltiples de Búsquedas (MTT)

Our goal is to obtain a comprehensive description of molecular processes occurring at cellular membranes in different biological functions. We aim at ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through macromolecular X-ray crystallography (MX). An essential ingredient of MX is a steady supply of ideally diffraction-quality crystals. The in meso or lipidic cubic phase (LCP) method for crystallizing membrane proteins is one of several methods available for crystallizing membrane proteins. It makes use of a bicontinuous mesophase in which to grow crystals. As a method, it has had some spectacular successes of late and has attracted much attention with many research groups now interested in using it. One of the challenges associated with the method is that the hosting mesophase is extremely viscous and sticky, reminiscent of a thick toothpaste. Thus, dispensing it manually in a reproducible manner in small volumes into crystallization wells requires skill, patience and a steady hand. A protocol for doing just that was developed in the Membrane Structural &amp; Functional Biology (MS&amp;FB) Group1-3. JoVE video articles describing the method are available1,4. 
The manual approach for setting up in meso trials has distinct advantages with specialty applications, such as crystal optimization and derivatization. It does however suffer from being a low throughput method. Here, we demonstrate a protocol for performing in meso crystallization trials robotically. A robot offers the advantages of speed, accuracy, precision, miniaturization and being able to work continuously for extended periods under what could be regarded as hostile conditions such as in the dark, in a reducing atmosphere or at low or high temperatures. An in meso robot, when used properly, can greatly improve the productivity of membrane protein structure and function research by facilitating crystallization which is one of the slow steps in the overall structure determination pipeline. 
In this video article, we demonstrate the use of three commercially available robots that can dispense the viscous and sticky mesophase integral to in meso crystallogenesis. The first robot was developed in the MS&amp;FB Group5,6. The other two have recently become available and are included here for completeness.	
An overview of the protocol covered in this article is presented in Figure 1. All manipulations were performed at room temperature (~20 &deg;C) under ambient conditions.

Herein is described a robotic approach to high-throughput crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography. Three robots capable of handling the viscous and sticky protein-laden mesophase integral to the method are introduced.

El uso de un robot para la cristalización de alto rendimiento de proteínas de membrana en mesofases lipídicas

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

The Cell-based L-Glutathione Protection Assays to Study Endocytosis and Recycling of Plasma Membrane Proteins

Membrane trafficking involves transport of proteins from the plasma membrane to the cell interior (i.e. endocytosis) followed by trafficking to lysosomes for degradation or to the plasma membrane for recycling. The cell based L-glutathione protection assays can be used to study endocytosis and recycling of protein receptors, channels, transporters, and adhesion molecules localized at the cell surface. The endocytic assay requires labeling of cell surface proteins with a cell membrane impermeable biotin containing a disulfide bond and the N-hydroxysuccinimide (NHS) ester at 4 &#186;C -&#160;a temperature at which membrane trafficking does not occur. Endocytosis of biotinylated plasma membrane proteins is induced by incubation at 37 &#186;C. Next, the temperature is decreased again to 4 &#186;C to stop endocytic trafficking and the disulfide bond in biotin covalently attached to proteins that have remained at the plasma membrane is reduced with L-glutathione. At this point, only proteins that were endocytosed remain protected from L-glutathione and thus remain biotinylated. After cell lysis, biotinylated proteins are isolated with streptavidin agarose, eluted from agarose, and the biotinylated protein of interest is detected by western blotting. During the recycling assay, after biotinylation cells are incubated at 37 &#176;C to load endocytic vesicles with biotinylated proteins and the disulfide bond in biotin covalently attached to proteins remaining at the plasma membrane is reduced with L-glutathione at 4 &#186;C as in the endocytic assay. Next, cells are incubated again at 37 &#176;C to allow biotinylated proteins from endocytic vesicles to recycle to the plasma membrane. Cells are then incubated at 4 &#186;C, and the disulfide bond in biotin attached to proteins that recycled to the plasma membranes is reduced with L-glutathione. The biotinylated proteins protected from L-glutathione are those that did not recycle to the plasma membrane.

Membrane trafficking involves transport of proteins from the plasma membrane to the cell interior (i.e. endocytosis) followed by trafficking to lysosomes for degradation or to the plasma membrane for recycling. Methods described in this article are designed to study endocytosis and recycling of plasma membrane proteins.

Membrane trafficking involves transport of proteins from the plasma membrane to the cell interior (i.e. endocytosis) followed by trafficking to lysosomes ...

Imaging Plasma Membrane Deformations With pTIRFM

To gain novel insights into the dynamics of exocytosis, our group focuses on the changes in lipid bilayer shape that must be precisely regulated during the fusion of vesicle and plasma membranes. These rapid and localized changes are achieved by dynamic interactions between lipids and specialized proteins that control membrane curvature. The absence of such interactions would not only have devastating consequences for vesicle fusion, but a host of other cellular functions that involve control of membrane shape. In recent years, the identity of a number of proteins with membrane-shaping properties has been determined. What remains missing is a roadmap of when, where, and how they act as fusion and content release progress.
Our understanding of the molecular events that enable membrane remodeling has historically been limited by a lack of analytical methods that are sensitive to membrane curvature or have the temporal resolution to track rapid changes. PTIRFM satisfies both of these criteria. We discuss how pTIRFM is implemented to visualize and interpret rapid, submicron changes in the orientation of chromaffin cell membranes during dense core vesicle (DCV) fusion. The chromaffin cells we use are isolated from bovine adrenal glands. The membrane is stained with a lipophilic carbocyanine dye,1,1&#39;-dioctadecyl-3,3,3&#39;,3&#39;-tetramethylindodicarbocyanine, 4-chlorobenzenesulfonate, or&#160;diD. DiD intercalates in the membrane plane with a &#34;fixed&#34; orientation and is therefore sensitive to the polarization of the evanescent field. The diD-stained cell membrane is sequentially excited with orthogonal polarizations of a 561&#160;nm laser (p-pol, s-pol). A 488&#160;nm laser is used to visualize vesicle constituents and time the moment of fusion. Exocytosis is triggered by locally perfusing cells with a depolarizing KCl solution. Analysis is performed offline using custom-written software to understand how diD emission intensity changes relate to fusion pore dilation.

Polarization-based Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (pTIRFM) enables real-time detection of cell membrane dynamics. This article describes the implementation of pTIRFM for the study of membrane remodeling during regulated exocytosis. The technique is generalizable to other processes in cell biology that directly or indirectly involve changes in membrane shape.

Imaging membrana plasmática Deformaciones Con pTIRFM

To gain novel insights into the dynamics of exocytosis, our group focuses on the changes in lipid bilayer shape that must be precisely regulated during ...

Using Digital Image Correlation to Characterize Local Strains on Vascular Tissue Specimens

Characterization of the mechanical behavior of biological and engineered soft tissues is a central component of fundamental biomedical research and product development. Stress-strain relationships are typically obtained from mechanical testing data to enable comparative assessment among samples and in some cases identification of constitutive mechanical properties. However, errors may be introduced through the use of average strain measures, as significant heterogeneity in the strain field may result from geometrical non-uniformity of the sample and stress concentrations induced by mounting/gripping of soft tissues within the test system. When strain field heterogeneity is significant, accurate assessment of the sample mechanical response requires measurement of local strains. This study demonstrates a novel biomechanical testing protocol for calculating local surface strains using a mechanical testing device coupled with a high resolution camera and a digital image correlation technique. A series of sample surface images are acquired and then analyzed to quantify the local surface strain of a vascular tissue specimen subjected to ramped uniaxial loading. This approach can improve accuracy in experimental vascular biomechanics and has potential for broader use among other native soft tissues, engineered soft tissues, and soft hydrogel/polymeric materials. In the video, we demonstrate how to set up the system components and perform a complete experiment on native vascular tissue.

We describe the use of digital image correlation to characterize the local surface strain field on vascular tissue samples subjected to uniaxial tensile testing. These measurements facilitate precise quantification of the sample mechanical response and the generation of constitutive stress-strain relations.

El uso de Correlación Digital de Imágenes para caracterizar cepas locales en muestras de tejido vascular

Characterization of the mechanical behavior of biological and engineered soft tissues is a central component of fundamental biomedical research and ...