La espectroscopia de correlación cruzada de fluorescencia es un método estadístico que utiliza la fluorescencia de resultado de tiempo para identificar la firma dinámica de los receptores acoplados a la proteína G en las células vivas. Aquí, estamos particularmente interesados, en los receptores adrenérgicos beta-2. Los receptores esfingolípidos proporcionan principalmente información sobre la dinámica de difusión traslacional y con la ayuda de la anisotropía de fluorescencia también la difusión rotacional.
Al introducir una etiqueta adicional, también podemos pro-unión o incluso cambios conformacionales si fomentamos la transferencia de energía de resonancia entre las etiquetas como sondeado. La fluorescencia cuantitativa resuelta en tiempo requiere una alineación cuidadosa de las mediciones de configuración y calibración. En los siguientes minutos, proporcionaremos una guía experimental para la espectroscopia de correlación de fluorescencia de células de vida, la espectroscopia de correlación cruzada y la transferencia de energía de resonancia de Forster de receptores acoplados a proteínas G, utilizando etiquetas clonadas y fuerza de flujo sintética.
El cuidado celular y la transfijación deben realizarse en condiciones estériles. Coloque una barra deslizante de cubierta limpia sobre una placa de cultivo de seis pomos y lávela con solución salina tampón de fosfato estéril, agregue dos ml de medio de cultivo celular con rojo fenol complementado con suero bovino fetal al 10%, 100 microgramos, por penicilina de amina y 100 microgramos por ml de estreptomicina a cada pomo, y manténgalo a un lado. Tome las células CHO que se cultivan en el mismo medio con rojo fenol a 37 grados centígrados en un cinco por ciento de CO2 y lávelas con cinco ml de PBS para eliminar las células muertas.
Añadir dos ml de tripsina e incubar durante dos minutos a temperatura ambiente. Diluir las células de datos con ocho ml de medio con rojo fenol y mezclar cuidadosamente mediante pipeteo. Cuente las células en una cámara de Neubauer y site las células a una densidad de 150.000 células por pozo en la placa de cultivo de seis pozos que contiene el deslizamiento de la cubierta.
Deje que las células crezcan en una incubadora durante 24 horas para lograr aproximadamente el 80% de confluencia. Diluir dos microgramos del ADN vectorial deseado. Por ejemplo, CT SNAP o NT SNAP, y seis microlitros de ese reactivo de transfección en dos tubos separados.
Cada uno contiene 500 microlitros de medio sérico reducido para cada pozo e incubarlos durante cinco minutos a temperatura ambiente. Mezcle las dos soluciones para obtener la mezcla de transfección e incube durante otros 20 minutos a temperatura ambiente. Mientras tanto, lave las células CHO sentadas una vez con PBS estéril.
Reemplace el PBS con un ml por pozo de medio libre de fenol rojo, complementado con suero bovino fetal al 10% y sin antibióticos. Agregue toda la mezcla de construcción de una gota de ml a cada pozo e incube las células durante la noche a 37 grados en un cinco por ciento de CO2. Para el etiquetado, diluya el sustrato SNAP apropiado en un medio ml suplementado con suero bovino fetal al 10% para obtener una concentración final de un micromolar.
Lave las células transfectadas una vez con PBS y agregue un ml por pozo de una solución de sustrato snap micromolar. Incubar las células durante 20 minutos a 37 grados en un cinco por ciento de CO2. Lave las células tres veces con medio libre de fenol rojo, y agregue dos ml por medio libre de fenol rojo bien.
Incubar las células durante 30 minutos a 37 grados centígrados en un cinco por ciento de CO2. Transfiera el resbalón de la cubierta de todas las muestras posteriormente a la cámara de imágenes y lávelo con 500 microlitros de imágenes Buffer. Agregue un búfer de imágenes de 500 microlitros antes de pasar a la configuración de FRED FCS.
La configuración de FRED FCS está equipada con un objetivo de agua de microscopía confocal, dos líneas láser, un sistema de conteo extranjero único de colcha de tiempo, dos BMC híbridos y dos acciones para la recolección de fotones y el software de recopilación de datos. Es muy importante alinear la configuración cada vez antes de la medición en células vivas. Para ajustar el enfoque, el agujero de alfiler y la posición de coloración, coloque dos soluciones de calibración verde nanomolar en un resbalón de cubierta de vidrio y encienda el láser de 485 nanómetros y 560 nanómetros operado en pilas, excitación intercalada o modo PI.
Concéntrese en la solución y ajuste la posición del orificio y el anillo del collar de tal manera que se obtenga la tasa de recuento más alta y el volumen confocal más pequeño para obtener el máximo brillo molecular. Repita este proceso para los canales rojos con una solución de calibración de rojo nanomolar de 10 y una mezcla de ambos. Coloque 10 soluciones de ADN nanomolar en el resbalón de la cubierta de vidrio y ajuste el foco del agujero de alfiler y la posición del anillo del collar de modo que los colores cruzados entre los canales de detección verde y rojo sea el más alto.
Esa es la fuente de mayor amplitud. Para mediciones en células vivas, encuentre una célula adecuada limitando con la lámpara de marcador y observando a través del ocular. Encienda ambos láseres en modo PI y concéntrese en la membrana buscando los recuentos máximos por segundo.
Tenga en cuenta que es posible que sea necesario reducir la potencia del láser para las muestras de células. Preferiblemente menos de cinco microvatios en el objetivo. Esto depende en gran medida de la flor utilizada y la configuración.
Observe las curvas de coll automática y cruzada de la AR beta-2 enlazadas a EGP y las sondas de etiquetas instantáneas en la vista previa en línea del software de recopilación de datos y recopile varias mediciones de clasificación con un tiempo de adquisición entre 60 y 180 segundos. Exporte el curso de correlación y el contraste de todas las mediciones. Tenga cuidado aquí para definir correctamente las ventanas de tiempo de aviso y retraso y use alguna opción de obtención de micro tiempo en el software de correlación de datos.
En total, se requieren tres correlaciones diferentes. Correlación automática de la ventana de tiempo de aviso del canal verde. Correlación automática de los canales rojos y la ventana de tiempo de retardo.
Y finalmente la correlación cruzada de la señal del canal verde, y la ventana de tiempo rápida fue la señal del canal rojo en la ventana de tiempo de retraso. Aquí están las funciones de correlación automática del FRED verde y rojo para soluciones y ajustarlas a un modelo de difusión de 3 DT con un término triplete adicional de requerido para calibrar la forma y el tamaño del volumen de detección confocal para los dos canales de color de uso, donde B es la línea de base de la curva y el número de moléculas y enfoque, TD el tiempo de difusión y S, el cero sobre omega cero el factor de forma del elemento de volumen confocal. El triplete parpadeante y la fotofísica se describen como amplitud AR y tiempo de relajación TR. Utilice el coeficiente de difusión conocido para los destacamentos de calibración verde y rojo y obtenga factores de forma para determinar las dimensiones y el volumen del elemento de volumen confocal infeccioso.
Calcule el espectro a través de IFR, la señal fluorescente verde recogida en los canales ceros, y dos en el canal de detección correcto, canal uno y tres, como una relación de las señales de fondo recogidas. Determine la expectativa directa del flujo de datos del aceptor por las longitudes de onda de excitación del donante por la relación entre el contraste de fondo recopilado de las mediciones de calibración en rojo y la excitación de la ventana de tiempo rápida por láser verde a la cuenta correcta de fondo justo en la excitación de la ventana de tiempo de retardo por láser rojo. Calcular el brillo molecular de B tanto la fuerza de flujo verde como la roja en función del contraste de fondo recogido, y para obtener el número de moléculas y centrarse en el ajuste de difusión 3 DT.
Ajustar tanto las correlaciones ultra del canal verde y rojo, como la correlación a través del indicador verde y el retraso rojo del ADN de doble nivel al modelo de difusión 3 DT mantiene constantes los factores de forma de obtención para las funciones de correlación automática. El factor de forma para las funciones de correlación cruzada suele estar entre esos dos valores. Determine la amplitud en el tiempo de correlación cero en función de los valores de fuente del número aparente de moléculas y el enfoque.
Calcular la relación de amplitud para una muestra fue una co-difusión del 100% de la fuerza del piso verde y rojo. Ajuste las muestras de células a un modelo apropiado. La forma en que se muestran la difusión del receptor de membrana no es curiosa de una manera bimodal fue un tiempo de difusión corto, no largo.
Además, la física de la foto y el parpadeo de la fuerza del piso deben ser considerados. Aquí a TD1 y TD2, son los dos requeridos para los tiempos de difusión. Y un uno es una fracción del primer tiempo de difusión En contraste con la medición de calibración en la que los dados libres y las hebras de ADN de difusión, en todas las direcciones, los receptores de membrana muestran solo difusión 2D a lo largo de las membranas celulares calculan la concentración de proteínas de etiqueta verde o roja a partir del respeto del número de moléculas y el enfoque.
Y el volumen del elemento de volumen confocal, utilizando masa sesgada. Ajuste las dos correlaciones altas de la muestra de doble etiquetado utilizando el mismo modelo que para el constructo de un solo nivel y la función de correlación cruzada utilizando un modelo de difusión bimodal, Nota para una descripción global del sistema. Los tres cultivos tienen que encajar conjuntamente.
El término de difusión es idéntico para los tres cultivos. Y la única diferencia es que el tiempo de reputación cae, la función de correlación cruzada. Calcule la concentración de proteínas de trabajo verdes o rojas a partir del número respectivo de moléculas y enfoque y el volumen del elemento de volumen confocal.
Estimar la fracción o concentración de proteínas de etiqueta verde y roja que interactúan a partir de las muestras celulares utilizando los factores de corrección obtenidos de las muestras de ADN, las relaciones de amplitud de la muestra celular y las respectivas concentraciones obtenidas. Ajuste las dos correlaciones alter de la muestra FRED como una sola muestra etiquetada y la correlación cruzada frontal a un modelo de difusión bimodal que contiene un término anticorre correlación, donde AF refleja la amplitud de la anti correlación total y AR y TR la amplitud respectiva y el tiempo de relajación. En caso de cambios de fluorescencia anticorrelacionados debido a FRED, se podrían requerir uno o varios términos de anticorrelación, lo que resultó en una caída de la función de correlación cruzada de Fred en tiempos de correlación bajos que coinciden con un aumento en las dos funciones de correlación automática.
Las medidas de calibración de las soluciones florales verdes y rojas para afeitar factores de 6.5 y los canales verdes, y 6.8 en los canales rojos. Por lo tanto, el volumen confocal tiene el tamaño de 1.4 y 1.9 femto más tarde en este día de medición, el brillo de la molécula se encuentra en 12.5 kilohercios por molécula y 2.6 kilohercios por molécula. Tenemos un 15% de diafonía desde el floral verde para los canales rojos después de la excitación del donante y el 38% de la excitación directa excepto la excitación de la forma floral roja por el verde, a partir de nuestra medición de ADN, determinamos los factores de corrección para el volumen de superposición confocal a 0.6 y 0.7 también, las células transfectadas con la construcción de etiqueta única muestran difusión bimodal bidimensional en la membrana celular donde aproximadamente la mitad de las moléculas se difunden lentamente en la escala de tiempo de 50 a cien milisegundos y la otra mitad relativamente rápida alrededor de dos milisegundos en ambas construcciones.
Además, el parpadeo del triplete está presente. Sin embargo, en la construcción de snap de nivel rojo se adquiere otro tiempo de relajación a 180 microsegundos, que podría provenir de un snap straight. Desde la doble etiqueta en sí, transectada con la construcción anti snap donde las dos etiquetas en dos lados diferentes de la membrana celular, se han recogido dos mediciones menos del ruido y la capa roja en correlación.
Y la correlación cruzada de PI es bastante alta aquí. Aquí el 70% de las moléculas, si se reduce lentamente a una escala de tiempo de cien milisegundos, y solo un 30% rápido alrededor de un milisegundo, la fracción de moléculas de doble liberación es baja y se encuentra entre el 15 y el 25%Los datos para el chasquido de TC se ven mejor y son menos ruidosos. Sin embargo, la anticorre correlación frontal más profunda esperada no se puede ver y es muy probable que sea masa por la alta cantidad de diafonía, la excitación de aceptación directa y el parpadeo triplete de ambas fuerzas florales, y una vez que los esquemas de análisis de datos aprovechando la intensidad de fluorescencia recopilada, DKS podrían ayudar a rescatar esto como se muestra para el conjunto de datos simulados.
La ventaja de la técnica Fred FCS es que, junto con la movilidad, podemos investigar la dinámica de conferencia de los GPCR. Sin embargo, realizar FRED FCs en laboratorios es un desafío y solicita buenas células transfectadas, etiquetado eficiente y una configuración calibrada perfecta. Solo una fuerza profesional de par FRED también es muy crucial.
Los pasos experimentales críticos incluyen la optimización de la optimización de la transfección, la minimización del fondo y la fluorescencia automática. Además, la tubería de análisis de átomos ayudará a comprender las diversas dinámicas de los preceptores en las células vivas. Esperamos que este protocolo sea útil para realizar el enfoque FRED FCS en experimentos con células vivas.
