Este trabajo ha sido financiado por el Hermelin Brain Tumor Center, Henry Ford Hospital.

1. Suspensión unicelular de la muestra quirúrgica fresca del glioblastoma para el cultivo de la neurosfera
<ol><li>Con el consentimiento por escrito de los pacientes y de acuerdo con las directrices institucionales, recoger muestras de tumores para cultivo celular inmediatamente después de la cirugía de resección de glioma de alto grado.</li>
	<li>Confirmar el diagnóstico de la muestra tumoral por histopatología. Transporte inmediatamente la muestra desde la sala de operaciones hasta la campana de cultivo de tejido de flujo laminar, para su procesamiento dentro de 1 hora desde la cirugía. NOTA: Para cirugías en un sitio remoto, corte la muestra de tumor en fragmentos más pequeños y colóquela en un tubo que contenga DMEM/F12 (manténgase en el hielo). El tumor se puede procesar varias horas después de la cirugía.</li>
	<li>Comenzando con el magnesio 200-500 del tejido (óptimo), picando la muestra del tumor usando una lámina del bisturí, y transferencia a un tubo de 15 ml que contiene el medio sin suero 10 ml DMEM/F12. Mezcle invirtiendo varias veces, deje que las piezas del tumor se sedimente por gravedad, elimine el medio y repita según sea necesario.</li>
	<li>Prepare la solución de disociación de tejido enzimático y detenga la solución fresca.<ol>
<li>Solución de disociación de tejido enzimático: 5 ml 0.05% Tripsina-EDTA, 2.5 ml Solución Salina Balanceada de Hank (HBSS) libre de calcio y magnesio, 2.5 ml Colagenasa IV solución madre (2,000 U / ml en HBSS con calcio y magnesio).</li>
		<li>Solución de parada: 5 ml de solución inhibidora de tripsina, 5 ml de DMEM/F12, 2 μl de 5.000 U/ml de DNAse I (fabricado en HBSS libre de calcio y magnesio).</li>
	</ol></li>
	<li>Retire el medio y agregue la solución de disociación de tejido enzimático a la muestra de tumor picado, utilizando 2 ml por cada tejido de 0,5 g. Mezclar suavemente invirtiendo.</li>
	<li>Incubar el tejido en solución a 37 °C en una incubadora de cultivo de tejidos en rotación durante 30 min.</li>
	<li>Triturar con una pipeta de 2 ml y detener la digestión o volver a la incubadora durante otros 15-30 min de incubación dependiendo del nivel de digestión.</li>
	<li>Detener la digestión añadiendo 2 volúmenes de Solución Stop y triturar mecánicamente con una pipeta serológica de 5 ml.</li>
	<li>Filtre el material no didigido a través de un colador de células de 40 μm. Pellet de las células a 800 x g durante 5 min a temperatura ambiente, seguido de lavado 3x en 10 ml DMEM/F12.</li>
	<li>Resuspend el pellet final de la célula en 5 ml DMEM/F12.</li>
	<li>Lentamente la capa de la suspensión celular sobre 5 ml de Linfólito-M y pellet a 1.300 x g durante 20 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Transfiera la capa de interfaz que contiene las células nucleadas a un tubo de 15 ml que contenga 10 ml de DMEM/F12.</li>
	<li>Pellet de las células a 800 x g durante 5 min a temperatura ambiente. Repetir el lavado con DMEM/F12 2x más.</li>
	<li>Criopreserve las células individuales resultantes para su uso posterior mediante la reutilización del pellet en el medio de congelación de células de recuperación, alícuota en crioviales, congelación lenta y almacenamiento en nitrógeno líquido.</li>
	<li>Para cultivar, resuspend las células en medio de neuroesfera suplementado con factores de crecimiento (NMGF), y la placa a una densidad relativamente baja (<1 x 105 células / ml) en un matraz de cultivo de tejido T25 regular en condiciones estándar, 5% de CO2,37 ° C, incubadora de cultivo de tejido humidificado (Figura 1A).<ol>
<li>Preparar NMGF usando la siguiente receta<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="384">
<colgroup>
<col>
<col>
<col>
</colgroup>
<tbody>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;width:188px;">Para 500 ml de DMEM/F12</td>
					<td style="width:79px;"></td>
					<td style="width:117px;"></td>
				</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">Solución de stock</td>
					<td>volumen</td>
					<td>concentración final</td>
				</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">Suplemento de N2 (10x)</td>
					<td>5 ml</td>
					<td>1x</td>
				</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">250 mg/ml de solución común de BSA</td>
					<td>1 ml</td>
					<td>0,5 mg/ml</td>
				</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">10 mg/ml Reactivo de gentamicina</td>
					<td>1,25 ml</td>
					<td>25 μg/ml</td>
				</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">100x antibiótico/antimicótico</td>
					<td>2,5 ml</td>
					<td>0,5x</td>
				</tr>
<tr height="20">
<td>100 mg/ml de bFGF</td>
					<td>0,1 ml</td>
					<td>20 ng/ml</td>
				</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">100 mg/ml de EGF</td>
					<td>0,1 ml</td>
					<td>20 ng/ml</td>
				</tr>
</tbody>
</table>
</li>
	</ol></li>
	<li>Transferir neuroesferas que se forman durante 1-3 semanas (Figuras 1B-E) a frascos frescos, para separar de las células adheridas y los desechos. Realice cambios parciales de medios cada 3-4 días. NOTA: Si disocia el tumor orthotopic del xenoinjerto usando el protocolo antedicho, los pasos 1.11-1.13 pueden ser omitidos.</li>
</ol>2. Mantenimiento del cultivo de la neuroesfera de glioblastoma y aplicaciones aguas abajo
<ol><li>
Disociación :Monitorizar los cultivos de neuroesfera y realizar cambios parciales de medios cada 3-4 días. Cuando la mayoría de las neuroesferas multicelulares del matraz alcancen los 100 μm de diámetro, se desvinculen en una suspensión unicelular:<ol>
<li>Transferir el medio que contiene las neuroesferas a un tubo de 15 ml, sedimentar por gravedad las neuroesferas durante unos 5 min, retirar el medio y resuspend el pellet celular en 10 ml de DPBS libre de calcio y magnesio.</li>
		<li>Mezclar e incubar durante 10 min a temperatura ambiente, ya que las células sedimenta por gravedad.</li>
		<li>Retire 7-8 ml de DPBS y luego disocida las neuroesferas mecánicamente con una pipeta serológica prewetted.</li>
		<li>Pellet de las células disociadas a 800 x g durante 5 min a 4 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Passaging: Resuspend las células disociadas (paso 2.1.) en NMGF y dividir en el número necesario de matraces (1:3), e incubar en condiciones estándar. Las neuroesferas secundarias se formarán, y deben ser posteriormente disociadas para la formación de esferas terciarias.</li>
	<li>
Evaluación de la auto-renovación a largo plazo: Repetir el procedimiento de disociación hasta que el cultivo de la neuroesfera logre al menos 10 pasajes, lo que equivale a un mínimo de 2 meses en cultivo.</li>
	<li>
Congelación: Para criopreservar las neuroesferas, disociar las neuroesferas (paso 2.1.) y resuspend el pellet celular en medio de congelación de células de recuperación, alícuota en crioviales, congelación lenta, y almacenar en nitrógeno líquido.<ol>
<li>Para cultivar células de la neuroesfera a partir de un stock congelado: descongelar las células a 37 °C y transferirlas inmediatamente a un tubo de 15 ml que contenga 10 ml de DMEM/F12. Mezcle el tubo suavemente y luego gire las células a 800 x g durante 5 min a 4 °C. Lave el pellet celular una vez más y resuspend las células en NMGF y transferir a un matraz de cultivo de tejido T25.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Suspensión celular para implante intracraneal en ratón inmunocomprometado:<ol>
<li>Disociar las neuroesferas (paso 2.1.) y resuspend el pellet celular en DPBS libre de calcio y magnesio. Cuente las células viables usando un hemocytometer y la exclusión azul del trypan.</li>
		<li>Calcule el número de células necesarias para el implante, típicamente 3 x 105 células/ratón, transfiera el número deseado de células en un vial y g.</li>
		<li>Resuspend el pellet celular en un volumen apropiado para el implante (5 μl/ratón) tocando suavemente el tubo de microcentrífuga. Coloque la suspensión celular sobre hielo y use dentro de las 2 horas.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Protocolo alternativo para el cultivo de células de glioblastoma tumorigénicas (para los casos en que el cultivo de neuroesfera falla)
<ol><li>Complemente el medio NMGF con suero bovino fetal a una concentración final de FBS/NMGF del 2%.</li>
	<li>
Comenzando con células en cultivo NMGF:Cosechar células viables del matraz NMGF(Figura 1F),resuspend en FBS/NMGF al 2% y placa a densidad relativamente baja (<1 x 105 células/ml) en un matraz de cultivo de tejidos T25 regular, y cultivo en condiciones estándar, 5% de CO2,37 °C, incubadora de cultivo de tejido humidificado(Figura 1G).</li>
	<li>
Comenzando con células congeladas nunca cultivadas (paso 1.14.): Descongelar las células, lavar en medio libre de suero y placa en FBS/NMGF al 2% y cultivar como se describe en el paso 3.2. El cultivo en NMGF durante 3 días antes de transferir células viables al 2% de FBS/NMGF es una alternativa para preseleccionar las células diferenciadas.</li>
</ol>4. Análisis Morfológico y Molecular de Neuroesferas por Inmunohistoquímica
<ol><li>Cultivar las neuroesferas hasta que la mayoría de los esferoides multicelulares flotantes alcancen los 100 μm de diámetro.</li>
	<li>Retire los frascos de cultivo de la incubadora e inmediatamente peletizar las neuroesferas, retire el medio y agregue 10 ml de DPBS sin alterar el pellet. Retire DPBS, resuspend en 10% neutro buffered formalina e incubar durante 20 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Pellet de los esferoides, resuspend en etanol al 30% e incubar durante 30-45 min.</li>
	<li>Reemplace el etanol al 30% con etanol al 50%, incube durante 15 min y reemplácelo con etanol fresco al 50%, incube otros 30 min.</li>
	<li>Repetir (paso 4.4.) con etanol al 70%.</li>
	<li>Reemplazar con etanol al 95% dos cambios de 10-20 min cada uno, y repetir con etanol absoluto hasta que los esferoides sean de color blanco brillante y condensados.</li>
	<li>Haga un pequeño cono de papel de filtro con papel de lente y colóquelo en un pequeño embudo en un beaker. Moje el papel de la lente con alcohol absoluto.</li>
	<li>Afloje ligeramente el pellet con etanol fresco al 100%, vierta el exceso de etanol y vierta los esferoides a través del cono de papel de la lente, asegurándose de que vayan a la punta del cono. Enjuague el tubo con etanol absoluto adicional y vierta los esferoides restantes a través del cono de papel de la lente.</li>
	<li>Retire el cono de papel del embudo y mueva cuidadosamente los esferoides a la parte inferior del cono. Doble el papel en un cuadrado y asegúrese de que los esferoides estén lo más bien cerrados posible.</li>
	<li>Transfiera las neuroesferas empaquetadas a un casete y transfiéntelos a un procesador de tejido automático.</li>
	<li>Programe el procesador de tejido automático de la siguiente manera: etanol absoluto, 10 min, xileno, 15 min (2x), parafina, 10 min (4x).</li>
	<li>Extraiga el cassette del procesador y colócalo en la parte calentada de un sistema de incrustación de parafina. Asegúrese de que toda la superficie esté libre de fragmentos, polvo u otros desechos y sifón toda la parafina de los pozos de calentamiento de las autocarzas. Caliente las órceps libres de parafina limpia y agregue una pequeña cantidad de parafina a un molde de base calentado.</li>
	<li>Abra el cassette, retire el paquete y colócalo en la parte calentada del sistema de incrustación. Abra cuidadosamente el cono de papel hasta que los esferoides sean visibles. Reúna la mayor cantidad posible de material con las autorúceps precalentadas y transfiérame a la parafina líquida en el molde base.</li>
	<li>Repita el artículo según sea necesario para recuperar tantos esferoides como sea posible. Raspe suavemente el papel de seda con una cuchilla de afeitar limpia precalentada que se ha limpiado con etanol para recoger los esferoides residuales sin meter ningún papel en el bloque.</li>
	<li>Rompa cuidadosamente cualquier grupo esferoide con las autonúcciones calientes. Mueva los esferoides lejos de las esquinas en una capa central uniforme. Mueva el molde base al área de enfriamiento para asegurar los esferoides en su lugar, agregue el cassette, llene lentamente con parafina y enfríe bien.</li>
	<li>El bloque de la parafina de la neuroesfera se puede utilizar para el seccionamiento normal y el immunohistochemistry.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Singh, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+cancer+stem+cell+in+human+brain+tumors.">Identification of a cancer stem cell in human brain tumors.</a> Cancer Res. 63, 5821-5828 (2003).</li><li>Ignatova, T. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+cortical+glial+tumors+contain+neural+stem-like+cells+expressing+astroglial+and+neuronal+markers+in+vitro.">Human cortical glial tumors contain neural stem-like cells expressing astroglial and neuronal markers in vitro.</a> Glia. 39, 193-206 (2002).</li><li>Galli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+tumorigenic,+stem-like+neural+precursors+from+human+glioblastoma.">Isolation and characterization of tumorigenic, stem-like neural precursors from human glioblastoma.</a> Cancer Res. 64, 7011-7021 (2004).</li><li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+stem+cells+derived+from+glioblastomas+cultured+in+bFGF+and+EGF+more+closely+mirror+the+phenotype+and+genotype+of+primary+tumors+than+do+serum-cultured+cell+lines.">Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines.</a> Cancer Cell. 9, 391-403 (2006).</li><li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system.">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255, 1707-1710 (1992).</li><li>Bao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioma+stem+cells+promote+radioresistance+by+preferential+activation+of+the+DNA+damage+response.">Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response.</a> Nature. 444, 756-760 (2006).</li><li>Singh, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+human+brain+tumour+initiating+cells.">Identification of human brain tumour initiating cells.</a> Nature. 432, 396-401 (2004).</li><li>Beier, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD133(+)+and+CD133(-)+glioblastoma-derived+cancer+stem+cells+show+differential+growth+characteristics+and+molecular+profiles.">CD133(+) and CD133(-) glioblastoma-derived cancer stem cells show differential growth characteristics and molecular profiles.</a> Cancer Res. 67, 4010-4015 (2007).</li><li>Joo, K. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gliosarcoma+stem+cells+undergo+glial+and+mesenchymal+differentiation+in+vivo.">Gliosarcoma stem cells undergo glial and mesenchymal differentiation in vivo.</a> Stem Cells. 28, 181-190 (2010).</li><li>Azari, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+expansion+of+human+glioblastoma+multiforme+tumor+cells+using+the+neurosphere+assay.">Isolation and expansion of human glioblastoma multiforme tumor cells using the neurosphere assay.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li><li>Laks, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurosphere+Formation+Is+an+Independent+Predictor+of+Clinical+Outcome+in+Malignant+Glioma.">Neurosphere Formation Is an Independent Predictor of Clinical Outcome in Malignant Glioma.</a> Stem Cells. 27, 980-987 (2009).</li><li>Vescovi, A. L., Galli, R., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+tumour+stem+cells.">Brain tumour stem cells.</a> Nat. Rev. Cancer. 6, 425-436 (2006).</li><li>Gunther, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioblastoma-derived+stem+cell-enriched+cultures+form+distinct+subgroups+according+to+molecular+and+phenotypic+criteria.">Glioblastoma-derived stem cell-enriched cultures form distinct subgroups according to molecular and phenotypic criteria.</a> Oncogene. 27 (20), 2897-2909 (2007).</li><li>Fael Al-Mayhani, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+method+for+derivation+and+propagation+of+glioblastoma+cell+lines+that+conserves+the+molecular+profile+of+their+original+tumours.">An efficient method for derivation and propagation of glioblastoma cell lines that conserves the molecular profile of their original tumours.</a> J. Neurosci. Methods. 176, 192-199 (2009).</li><li>Pollard, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioma+stem+cell+lines+expanded+in+adherent+culture+have+tumor-specific+phenotypes+and+are+suitable+for+chemical+and+genetic+screens.">Glioma stem cell lines expanded in adherent culture have tumor-specific phenotypes and are suitable for chemical and genetic screens.</a> Cell Stem cell. 4, 568-580 (2009).</li><li>Ozawa, T., James, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+Intracranial+Brain+Tumor+Xenografts+With+Subsequent+Analysis+of+Tumor+Growth+and+Response+to+Therapy+using+Bioluminescence+Imaging.">Establishing Intracranial Brain Tumor Xenografts With Subsequent Analysis of Tumor Growth and Response to Therapy using Bioluminescence Imaging.</a> J. Vis. Exp. (41), (2010).</li><li>Leder, K., Holland, E. C., Michor, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+therapeutic+implications+of+plasticity+of+the+cancer+stem+cell+phenotype.">The therapeutic implications of plasticity of the cancer stem cell phenotype.</a> PLoS One. 5, (2010).</li><li>Pietras, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells+in+tumor+heterogeneity.">Cancer stem cells in tumor heterogeneity.</a> Adv. Cancer Res. 112, 255-281 (2011).</li><li>Lomonaco, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+induction+of+autophagy+by+gamma-radiation+contributes+to+the+radioresistance+of+glioma+stem+cells.">The induction of autophagy by gamma-radiation contributes to the radioresistance of glioma stem cells.</a> Int. J. Cancer. 125, 717-722 (2009).</li><li>Reynolds, B. A., Rietze, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cells+and+neurospheres--re-evaluating+the+relationship.">Neural stem cells and neurospheres--re-evaluating the relationship.</a> Nat. Methods. 2, 333-336 (2005).</li><li>Singec, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+actual+sensitivity+and+specificity+of+the+neurosphere+assay+in+stem+cell+biology.">Defining the actual sensitivity and specificity of the neurosphere assay in stem cell biology.</a> Nat. Methods. 3, 801-806 (2006).</li></ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

La disociación enzimática apropiada de la célula del tumor es un paso crítico en este protocolo. El tejido deberá ser picado bien antes de la incubación en solución de disociación celular a 37 °C bajo rotación, durante un mínimo de 30 min, cuando el tejido deba ser triturado mecánicamente y verificada la extensión de la disociación. Dependiendo del grado de cohesión del tejido, la incubación se puede extender durante 15-30 minutos adicionales, según sea necesario para completar la disociación en células individuales. No se recomienda la incubación en solución de disociación durante más de 1 hora debido a la disminución de la viabilidad celular. Aunque la cantidad óptima de tejido que comienza sea magnesio 200-500, este protocolo ha llevado a las culturas acertadas de la neuroesfera de tan poco como el magnesio 50 del tejido del tumor.
El NMGF sin suero es un medio selectivo, y un porcentaje de células neoplásicas que comprenden la mayor parte del tumor, así como las células huésped, no sobrevivirá, mientras que otras se unirán al matraz tratado cultivo de tejidos después del revestimiento. Es fundamental que las neuroesferas que se formarán durante 1-3 semanas(Figuras 1B-E)se transfieran a matraces frescos, para separar de las células tumorales diferenciadas y los restos.
Las células GBM disociadas enzimáticamente y nunca cultivadas (paso 1.10) pueden ser criopreservadas como fuente de respaldo de células para cultivar en medios alternativos, en caso de que el cultivo de la neuroesfera falle. Hemos obtenido con éxito cultivos de neuroesfera de tales poblaciones congeladas, así como células monocapa que crecen en 2% FBS / NMGF.
Conceptualmente, la "célula madre cancerosa" es un trabajo en progreso y este campo emergente se beneficiará de una clarificación adicional, ya que las implicaciones clínicas son considerables, particularmente en la generación de heterogeneidad tumoral, plasticidad y resistencia a la terapia19,20. Además de ser vitales para generar modelos animales de GBM específicos para cada paciente, los cultivos de neuroesfera también son valiosos para estudios in vitro como la alteración en la señalización celular y la expresión génica en respuesta a factores de crecimiento, hipoxia y agentes farmacológicos11,21. Hemos optado por utilizar secciones transversales de neuroesferas fijas de formol y parafina incrustadas, preservando la arquitectura 3D, para estudiar la expresión de proteínas y las modificaciones postraduccionales por inmunohistoquímica11,debido a la localización subcelular superior en relación con el método más común de etiquetado e imagen de toda la esfera.
Se ha demostrado que no todas las células dentro de las neuroesferas derivadas del cerebro de mamíferos adultos son células madre22. Del mismo modo, las neuroesferas cultivadas a partir de tumores GBM probablemente no son clonales, debido a la presencia de células progenitoras cancerosas más diferenciadas y la autoa agregación, que se sabe que ocurren a altas densidades celulares23,lo que es considerado una limitación de este método por algunos. Para favorecer el enriquecimiento de las células madre autorrenovadoras a largo plazo, a diferencia de los progenitores que pueden crecer transitoriamente como neuroesferas22,las neuroesferas primarias se disocian para la formación de la neurosfera secundaria, y se pasan por un mínimo de 10 pasajes, aproximadamente equivalentes a 2 meses en cultivo continuo, lo que es una indicación de una población enriquecida en células madre22. En nuestra experiencia, las culturas de la neurosfera de GBM que alcanzan esa marca pueden continuar siendo ampliadas como neuroesferas indefinidamente. El grado tumoral importa, ya que hemos obtenido cultivos exitosos de GBMs y astrocitomas anaplásicos, grado IV y III de la OMS, respectivamente, pero no de gliomas de grado inferior.
El método más prevalente de cultivo de células de glioblastoma, en el medio de crecimiento tradicional complementado con FBS al 10%, conduce a una considerable divergencia genómica y fenotípica de los tumores originales 4. Por otro lado, los cultivos de neuroesfera son una fuente estable y a largo plazo de células que presentan el fenotipo4de células madre cancerosas. El método de la neuroesfera se ha vuelto cada vez más popular para el enriquecimiento de CSC en cultivos a largo plazo para modelos de xenoinjerto de ratón ortotópico, a pesar de no tener éxito para todas las muestras de astrocitomas de alto grado, lo que representa la principal debilidad de este método. Los estudios para entender cómo las características moleculares de los tumores parentales pueden afectar a la formación de la neurosfera están en curso. Se concede la exploración de métodos alternativos prácticos para cultivar gliomas de alto grado, seguida de una validación exhaustiva, dadas las ventajas trascendentales de tener modelos de GBM específicos para el paciente, a medida que avanzamos hacia una era de medicina personalizada, alimentada por la accesibilidad de la información "ómica" y el aumento del número de terapias dirigidas potenciales.

El glioblastoma (GBM), un astrocitoma de grado IV de la OMS, es el tumor cerebral primario más prevalente y agresivo. Diversos fenotipos de desarrollo son adoptados por las células tumorales GBM, incluyendo células que exhiben características de "células madre cancerosas" (CSC), como la expresión de marcadores de células madre neurales (NSC), auto-renovación a largo plazo, y el potencial de dar lugar a células más diferenciadas que expresan marcadores astrocíticos y forman la mayor parte del tumor1-3. Mientras que la clarificación todavía es necesaria con respecto a identidad molecular de CSC e implicaciones clínicas, el foco del actual trabajo está en la definición operacional de CSC: la uno mismo-renovación de largo plazo in vitro y la capacidad de distinguir y de reproducir el tumor original sobre la implantación orthotopic en roedores immunocompromised.
Las células del glioblastoma se han cultivado durante décadas en el medio tradicional que contiene el suero bovino fetal del 10% (FBS) y varias variedades de células del GBM cultivadas suero del suero del alto paso comercial son tumorigenic en roedores immunocompromised, pero hay considerable divergencia genomic y molecular del tumor original4,limitando su uso como modelos clínico relevantes. Más recientemente, se identificaron células con fenotipo madre/progenitor sensible al EGF y al bFGF en los GBMs2. Posteriormente, se cultivaron muestras de tumores gbm disociados en un medio libre de suero3,originalmente formulado para la selección y expansión de células madre neurales del cerebro de mamífero adulto5. Estas condiciones de cultivo dificultan el crecimiento de la mayoría de las poblaciones de células tumorales no neoplásicas y más diferenciadas, a la vez que favorecen el crecimiento de células madre y progenitoras como esferoides multicelulares flotantes, o neuroesferas3,imitando el comportamiento de las células madre neurales de mamíferos adultos5. La comparación completa lado a lado de las células primarias de GBM cultivadas en cualquier medio de la neuroesfera complementado con factores de crecimiento (NMGF) o en el medio de crecimiento tradicional complementado con FBS del 10%, reveló que las neuroesferas de GBM eran tumorigenic, presentaron potencial de la diferenciación del multilineage, y preservaron el genotipo del tumor original, en contraste con las culturas del 10% FBS que no eran tumorigenic en los pasos bajos y divergieron considerablemente de los tumores originales en los últimos pasajes4.
También se ha propuesto el aislamiento de CSC de tumores de GBM disociados por clasificación celular basada en la expresión del supuesto marcador CSC CD1336,7,pero trabajos posteriores indicaron que el fenotipo CSC no está definitivamente asociado a la expresión de talesmarcadores 8-10,disminuyendo el entusiasmo inicial por esta estrategia, mientras que nuevos marcadores aún están siendoprobados 10. La indisponibilidad hasta la fecha de un conjunto validado de marcadores que definen CSC, junto con el objetivo de la amplificación a gran escala de estas células para estudios preclínicos, hace que el uso de la clasificación celular sea poco práctico para los cultivos rutinarios enriquecidos con CSC. Las células GBM seleccionadas por la capacidad de crecer como neuroesferas en NMGF invariablemente expresan marcadores de células madre neurales. Hemos observado que Sox2 y nestin se expresan ubicuamente en cultivos de neuroesfera, mientras que la proteína CD133 está presente en un subconjunto de las neuroesferas GBM (datos inéditos y referencia11).
Varios laboratorios están persiguiendo cultivos de neuroesfera de tumores de glioblastoma utilizando el mismo enfoque general de disociación enzimática y cultivo en medio libre de suero complementado con factores de crecimiento3,4,11-14,mientras que otros colegas han reportado intentos de cultivar cultivos de neurosfera a largo plazo a partir de muestras de GBM sin éxito. El método general para la disociación enzimática y la cultura de la neuroesfera de los gliomas de alto grado presentados aquí es similar a qué se ha delineado en las publicaciones antedichos. Hemos optimizado el protocolo basado en nuestra experiencia de disociación y cultivo de más de 100 muestras GBM. La eficiencia de la obtención de cultivos de neuroesfera a largo plazo a partir de muestras frescas de GBM aplicando el protocolo aquí presentado es superior al 40%, similar a los pocos informes que muestran datos de eficiencia3,15,lo que lleva a la exploración de protocolos alternativos como el cultivo de células de forma continua o intermitente en medio sérico en presencia de EGF y bFGF como monocapas en superficies recubiertas con proteína ECM16,17. Los cultivos de neuroesfera siguen siendo el enfoque más validado y cada vez más popular para preservar las características moleculares de los tumores GBM y el potencial tumorigenic3,4,11-14,por lo tanto, nuestro enfoque es intentar los cultivos de neuroesferas primero, mientras que concomitantemente probamos métodos alternativos para cultivar células GBM que no pueden formar neuroesferas autorrenuentes a largo plazo(Figura 1),para aumentar la representación de los tumores GBM que se pueden utilizar en modelos animales. Aquí presentamos un protocolo para el cultivo de neuroesferas a partir de GBMs. Para las células que no logran formar neuroesferas, mostramos una modificación simple en el medio de crecimiento, como el primer intento de cultivar células tumorígenas de la no neuroesfera formando GBMs, con resultados prometedores y aún en proceso de validación extensa.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="644">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM/F12</td>
			<td style="width:143px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">11330-032</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypsin - EDTA 0.05%</td>
			<td style="width:143px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">Hank&#8217;s Balanced Salt Solution, calcium- and magnesium-free</td>
			<td style="width:143px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">14170-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">Hank&#8217;s Balanced Salt Solution, with calcium and magnesium&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">24020-117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Collagenase Type 4</td>
			<td style="width:143px;">Worthington</td>
			<td style="width:119px;">5004188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypsin Inhibitor</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T7659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DNase I</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D4527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">N2 Supplement (100x)</td>
			<td style="width:143px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Albumin from Bovine Serum, cell culture grade</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A4919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gentamicin Reagent Solution</td>
			<td style="width:143px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15710-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Antibiotic/Antimycotic</td>
			<td style="width:143px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Recombinant Human FGF-basic</td>
			<td style="width:143px;">PeproTech</td>
			<td style="width:119px;">100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Recombinant Human EGF</td>
			<td style="width:143px;">PeproTech</td>
			<td style="width:119px;">AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Lympholyte-Mouse</td>
			<td style="width:143px;">Cedarlane Laboratories Ltd.</td>
			<td style="width:119px;">CL5031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Recovery Cell Culture Freezing Medium</td>
			<td style="width:143px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">12648-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sterile Cell Strainer, 40 &#956;m</td>
			<td style="width:143px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">22363547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline (DPBS), no calcium and no magnesium</td>
			<td style="width:143px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:143px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">26140-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypan Blue Stain, 0.4%</td>
			<td style="width:143px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Neutral Buffered Formalin</td>
			<td style="width:143px;">Protocol</td>
			<td style="width:119px;">245-684</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Histoplex Tissue Cassettes</td>
			<td style="width:143px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">22-146-426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Rotator</td>
			<td style="width:143px;">Miltenyi BioTec</td>
			<td style="width:119px;">130-090-753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GlutaMAX&#160;Supplement</td>
			<td style="width:143px;">Life Technologies</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">KnockOut D-MEM/F12</td>
			<td style="width:143px;">Life Technologies</td>
			<td>12660-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stem Pro Neural Supplement&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Life Technologies</td>
			<td>A1058-01</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimization of high grade glioma cell culture from surgical specimens for use in  clinically relevant animal models and 3d immunochemistry

Los glioblastomas, la forma más común y agresiva de astrocitoma, son refractarios a la terapia y molecularmente heterogéneos. La capacidad de establecer cultivos celulares que preserven el perfil genómico de los tumores parentales, para su uso en modelos in vitro e in vivo específicos para pacientes, tiene el potencial de revolucionar el desarrollo preclínico de nuevos tratamientos para el glioblastoma adaptados a las características moleculares de cada tumor.
Comenzando con los tumores frescos del astrocytoma de alto grado disociados en solas células, utilizamos el análisis de la neurosfera como método del enriquecimiento para las células que presentan fenotipo de la célula madre del cáncer, incluyendo la expresión de los marcadores de los nervios de la célula madre, la uno mismo-renovación a largo plazo in vitro,y la capacidad de formar tumores orthotopic del xenograft. Este método ha sido propuesto previamente, y ahora está en uso por varios investigadores. De acuerdo con nuestra experiencia de disociar y de cultivar 125 especímenes del glioblastoma, llegamos al protocolo detallado que presentamos aquí, conveniente para el cultivo rutinario de la neurosfera de astrocytomas de alto grado y la extensión en grande de células tumorigenic para los estudios preclínicos. Divulgamos sobre la eficacia de culturas a largo plazo acertadas usando este protocolo y sugerimos alternativas asequibles para cultivar las células disociadas del glioblastoma que no pueden crecer como neuroesferas. También describimos en detalle un protocolo para preservar la arquitectura 3D de las neuroesferas para la inmunohistoquímica. Los cultivos celulares enriquecidos en CSCs, capaces de generar modelos de xenoinjerto ortotópicos que preservan las firmas moleculares y la heterogeneidad de los GBMs, son cada vez más populares para el estudio de la biología de los GBMs y para el diseño mejorado de las pruebas preclínicas de terapias potenciales.

Se ha aplicado el protocolo descrito anteriormente para disociar y cultivar 125 muestras frescas de glioblastoma quirúrgico(Figura 1),88 tumores recién diagnosticados y 37 recurrentes(Tabla 2),con el consentimiento del paciente aprobado y bajo directrices institucionales. La eficiencia del protocolo para el establecimiento de cultivos de neuroesfera a largo plazo fue de 41,6%, y similar para los tumores recién diagnosticados y los tumores recurrentes (Tabla 2). Para algunas muestras de GBM, las neuroesferas se forman en los primeros días (Figuras 1B y 1C), mientras que para otras se requiere un tiempo de cultivo más largo (Figuras 1D y 1E).
La eficiencia de la formación de la neuroesfera no dependió exclusivamente del nivel de necrosis en el tejido, como lo ejemplifican los resultados de un tumor recién diagnosticado con alta densidad celular (GBM1) y un tumor recurrente y necrótico (GBM2) procesado según los Protocolos 1 y 2, ambos produciendo cultivos de neuroesfera(Figura 2).
La prueba del potencial tumorigenic de cada cultura de la neurosfera en ratones immunocompromised es la validación crucial de este acercamiento para el enriquecimiento de CSCs. Usando un protocolo similar a18,GBM1 y GBM2 previamente las neurosferas fueron implantadas en los cerebros de ratones immunocompromised, bajo pautas institucionales y del cuidado animal de IACUC. Los tumores de xenoinjerto presentan características morfológicas de los GBMs, tales como invasión en el parénquima cerebral y necrosis (Figura 2).
Gbm3 fue disociado (Figura 1A) y cultivado en medio de la neuroesfera (Figuras 1D y 1E), y en 2% FBS /NMGF (Figuras 1D, 1G, y 1H). Se disociaron las células monocapa cultivadas en FBS/NMGF al 2% y las células de la neuroesfera cultivadas en NMGF y se implantó el mismo número de células en ratón desnudo, utilizando el mismo procedimiento que en la Figura 2. No se observaron diferencias en la supervivencia, la dinámica del crecimiento tumoral o la morfología entre los dos métodos de cultivo preimplantacional (Figuras 3A-C). Las características del crecimiento del tumor no cambian hasta el último paso probado, P20 para las neuroesferas, y P10 para el 2% FBS/NMGF. Mientras que los marcadores de células madre neurales, incluyendo Sox2, están regulados a la baja en la mayoría de las células primarias gbm cultivadas en 10% FBS 3,4,11,NMGF complementado con 2% FBS permite la retención de la expresión de Sox2(Figura 3D).
Las neuroesferas fueron procesadas de acuerdo con el Protocolo 4, y etiquetadas con H&E(Figura 4A),anticuerpo anti-Sox2, mostrando localización nuclear(Figura 4B),y anticuerpo EGFR, localización de la membrana celular(Figura 4C). Este protocolo se ha aplicado para acceder a alteraciones dependientes de estímulos en la expresión de nestina, GFAP, y el marcador de proliferación Ki6711.
Tabla 2. Eficiencia de derivar cultivos de neuroesfera auto-renovación a largo plazo de GBMs.
<table border="1"><tbody>
<tr>
<td>Patología</td>
			<td>N</td>
			<td>Porcentaje de muestras que producen neuroesferas autorrenonunudas a largo plazo (n)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Glioblastoma - no tratado, primera cirugía</td>
			<td>88</td>
			<td>42.0% (37)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Glioblastoma recidivante</td>
			<td>37</td>
			<td>40.5% (15)</td>
		</tr>
<tr>
<td>total</td>
			<td>125</td>
			<td>41.6% (52)</td>
		</tr>
</tbody></table><img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51088/51088fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51088/51088fig1.jpg"> Figura 1. Cultivo celular a partir de muestras quirúrgicas de glioblastoma fresco. Los tumores frescos se disocian enzimáticamente en células individuales. La interfaz celular nucleada del medio de separación de densidad se platea en NMGF. Las neuroesferas disociadas se platean en NMGF, y típicamente 1 día después de la galjanoplastia hay células muertas, escombros, células individuales unidas y células de división ocasionales en suspensión(A). La formación de la neuroesfera es más rápida para algunos casos (B, C), y más lenta para otros (D, E). Todas las neuroesferas se disocian y se replated para por lo menos 10 pasos, 41.6% GBMs rinden neurosferas auto-renovación a largo plazo. Las células disociadas viables de GBM que no logran crecer como neuroesferas(F)se pueden transferir a condiciones de cultivo alternativas, por ejemplo, 2% FBS/NMGF(G,H). Barra (A), 100 μm, se aplica a todas las imágenes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51088/51088fig1highres.jpg" target="_blank"> Haga clic aquí para ver la imagen más grande.</a>
<img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51088/51088fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51088/51088fig2.jpg"> Figura 2. Generación de la neuroesfera y xenografts orthotopic del ratón de los tumores de GBM. Una muestra tumoral que presentaba alta densidad celular (GBM1) y un tumor con alto contenido necrótico (GBM2) fueron disociados y las neuroesferas cultivadas para 10 pasajes según los Protocolos 1 y 2. Los ratones immunocompromised fueron implantados con 3 x 105 células disociadas de la neuroesfera y sacrificados cuando moribundos. Los cerebros del ratón eran formalina fija y la parafina encajada para la coloración de H&E y la detección immunohistochemistry de marcadores humanos, de mitocondrias humanas (hMit) o de la subunidad importante HLA-A (MHC-I) de la clase I de la histocompatibilidad. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51088/51088fig2highres.jpg" target="_blank"> Haga clic aquí para ver la imagen más grande.</a>
<img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51088/51088fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51088/51088fig3.jpg"> Figura 3. Crecimiento tumoral similar en ratones implantados por vía intracraneal con células GBM3 cultivadas como neuroesferas en NMGF o como monocapas en FBS/NMGF al 2%. (A)Las curvas de supervivencia de Kaplan-Meier para GBM3 cultivadas como neuroesferas en NMGF o monocapas en 2%FBS/NMGF (ambos pasajes <10) no muestran diferencia en la supervivencia (n=10, p=0,7174, prueba de log-rank). (B)El crecimiento tumoral monitoreado por imágenes de bioluminiscencia en vivo (BLI) no muestra diferencias significativas en la dinámica del crecimiento tumoral entre los dos grupos. (C)La morfología tumoral es indistinguible para 4 xenoinjertos GBM3, 2 cultivados en NMGF y 2 cultivados en FBS/NMGF al 2%. Mancha MHC-I como se describe para la Figura 2. Escala, 600 μm. (D)Western blot mostrando la expresión sox2 del fabricante de células madre conservada en cultivos de FBS/NMGF al 2% utilizados para iniciar los tumores de xenoinjerto(A-C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51088/51088fig3highres.jpg" target="_blank"> Haga clic aquí para ver la imagen más grande.</a>
<img alt="Figure 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51088/51088fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51088/51088fig4.jpg"> Figura 4. Análisis de la expresión de proteínas en secciones de neuroesfera por inmunohistoquímica. Las culturas de la neuroesfera eran formalina-fijas y la parafina encajadas según lo descrito en el procedimiento 4, y manchadas con H&E(A),el anticuerpo anti-Sox2(b),y el anticuerpo anti-EGFR(C). Se utilizó sustrato DAB para visualizar(B,C). Barra, 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51088/51088fig4highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen más grande.</a>

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Optimization of High Grade Glioma Cell Culture from Surgical Specimens for Use in  Clinically Relevant Animal Models and 3D Immunochemistry

Protocolo para la propagación de muestras quirúrgicas de glioma de alto grado disociadas en medio de neuroesfera sin suero para seleccionar células con fenotipo de células madre cancerosas. Para los especímenes que no pueden crecer como neuroesferas, se sugiere un protocolo alternativo. Una técnica de incrustación de la parafina para mantener la arquitectura 3D de la neuroesfera para el immunocytochemistry se describe.

Optimización Del Cultivo Celular De Glioma De Alto Grado De Muestras Quirúrgicas Para Su Uso En Modelos Animales Clínicamente Relevantes E Inmunoquímica 3D

Glioblastomas, the most common and aggressive form of astrocytoma, are refractory to therapy, and molecularly heterogeneous. The ability to establish cell ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

15.0K vistas.  Henry Ford Hospital. Protocolo para la propagación de muestras quirúrgicas de glioma de alto grado disociadas en medio de neuroesfera sin suero para seleccionar células con fenotipo de células madre cancerosas. Para los especímenes que no pueden crecer como neuroesferas, se sugiere un protocolo alternativo. Una técnica de incrustación de la parafina para mantener la arquitectura 3D de la neuroesfera para el immunocytochemistry se describe.

Video: Optimization of High Grade Glioma Cell Culture from Surgical Specimens for Use in  Clinically Relevant Animal Models and 3D Immunochemistry

Use of Animal Model of Sepsis to Evaluate Novel Herbal Therapies

Sepsis refers to a systemic inflammatory response syndrome resulting from a microbial infection. It has been routinely simulated in animals by several techniques, including infusion of exogenous bacterial toxin (endotoxemia) or bacteria (bacteremia), as well as surgical perforation of the cecum by cecal ligation and puncture (CLP)1-3. CLP allows bacteria spillage and fecal contamination of the peritoneal cavity, mimicking the human clinical disease of perforated appendicitis or diverticulitis. The severity of sepsis, as reflected by the eventual mortality rates, can be controlled surgically by varying the size of the needle used for cecal puncture2. In animals, CLP induces similar, biphasic hemodynamic cardiovascular, metabolic, and immunological responses as observed during the clinical course of human sepsis3. Thus, the CLP model is considered as one of the most clinically relevant models for experimental sepsis1-3.
Various animal models have been used to elucidate the intricate mechanisms underlying the pathogenesis of experimental sepsis. The lethal consequence of sepsis is attributable partly to an excessive accumulation of early cytokines (such as TNF, IL-1 and IFN-&gamma;)4-6 and late proinflammatory mediators (e.g., HMGB1)7. Compared with early proinflammatory cytokines, late-acting mediators have a wider therapeutic window for clinical applications. For instance, delayed administration of HMGB1-neutralizing antibodies beginning 24 hours after CLP, still rescued mice from lethality8,9, establishing HMGB1 as a late mediator of lethal sepsis. The discovery of HMGB1 as a late-acting mediator has initiated a new field of investigation for the development of sepsis therapies using Traditional Chinese Herbal Medicine. In this paper, we describe a procedure of CLP-induced sepsis, and its usage in screening herbal medicine for HMGB1-targeting therapies.

Sepsis refers to a systemic inflammatory response syndrome resulting from a microbial infection, and can be simulated by a surgical technique termed cecal ligation and puncture (CLP). Here we describe a method to use CLP-induced animal model to screen medicinal herbs for therapeutic agents.

El uso de modelos animales de sepsis para evaluar nuevas terapias a base de plantas

Sepsis refers to a systemic inflammatory response syndrome resulting from a microbial infection. It has been routinely simulated in animals by several ...

Investigación

Medicina

Improved Protocol For Laser Microdissection Of Human Pancreatic Islets From Surgical Specimens

Laser microdissection (LMD) is a technique that allows the recovery of selected cells and tissues from minute amounts of parenchyma 1,2. The dissected cells can be used for a variety of investigations, such as transcriptomic or proteomic studies, DNA assessment or chromosomal analysis 2,3. An especially challenging application of LMD is transcriptome analysis, which, due to the lability of RNA 4, can be particularly prominent when cells are dissected from tissues that are rich of RNases, such as the pancreas. A microdissection protocol that enables fast identification and collection of target cells is essential in this setting in order to shorten the tissue handling time and, consequently, to ensure RNA preservation. 
Here we describe a protocol for acquiring human pancreatic beta cells from surgical specimens to be used for transcriptomic studies 5. Small pieces of pancreas of about 0.5-1 cm3 were cut from the healthy appearing margins of resected pancreas specimens, embedded in Tissue-Tek O.C.T. Compound, immediately frozen in chilled 2-Methylbutane, and stored at -80 &deg;C until sectioning. Forty serial sections of 10 &mu;m thickness were cut on a cryostat under a -20 &deg;C setting, transferred individually to glass slides, dried inside the cryostat for 1-2 min, and stored at -80 &deg;C. 
Immediately before the laser microdissection procedure, sections were fixed in ice cold, freshly prepared 70% ethanol for 30 sec, washed by 5-6 dips in ice cold DEPC-treated water, and dehydrated by two one-minute incubations in ice cold 100% ethanol followed by xylene (which is used for tissue dehydration) for 4 min; tissue sections were then air-dried afterwards for 3-5 min. Importantly, all steps, except the incubation in xylene, were performed using ice-cold reagents - a modification over a previously described protocol 6. utilization of ice cold reagents resulted in a pronounced increase of the intrinsic autofluorescence of beta cells, and facilitated their recognition. For microdissection, four sections were dehydrated each time: two were placed into a foil-wrapped 50 ml tube, to protect the tissue from moisture and bleaching; the remaining two were immediately microdissected. This procedure was performed using a PALM MicroBeam instrument (Zeiss) employing the Auto Laser Pressure Catapulting (AutoLPC) mode. The completion of beta cell/islet dissection from four cryosections required no longer than 40-60 min. Cells were collected into one AdhesiveCap and lysed with 10 &mu;l lysis buffer. Each single RNA specimen for transcriptomic analysis was obtained by combining 10 cell microdissected samples, followed by RNA extraction using the Pico Pure RNA Isolation Kit (Arcturus). This protocol improves the intrinsic autofluorescence of human beta cells, thus facilitating their rapid and accurate recognition and collection. Further improvement of this procedure could enable the dissection of phenotypically different beta cells, with possible implications for better understanding the changes associated with type 2 diabetes.

Laser microdissection is a technique that allows the recovery of selected cells from minute amounts of parenchyma. Here we describe a protocol for acquiring human pancreatic islets from surgical specimens to be used for transcriptomic studies. Our protocol improves the intrinsic autofluorescence of human beta cells, thus facilitating their collection.

Protocolo mejorado para microdisección láser de islotes pancreáticos humanos a partir de muestras quirúrgicas

Laser microdissection (LMD) is a technique that allows the recovery of selected cells and tissues from minute amounts of parenchyma 1,2. The dissected ...

High-frequency Ultrasound Imaging of Mouse Cervical Lymph Nodes

High-frequency ultrasound (HFUS) is widely employed as a non-invasive method for imaging internal anatomic structures in experimental small animal systems. HFUS has the ability to detect structures as small as 30 &#181;m, a property that has been utilized for visualizing superficial lymph nodes in rodents in brightness (B)-mode. Combining power Doppler with B-mode imaging allows for measuring circulatory blood flow within lymph nodes and other organs. While HFUS has been utilized for lymph node imaging in a number of mouse&#160; model systems, a detailed protocol describing HFUS imaging and characterization of the cervical lymph nodes in mice has not been reported. Here, we show that HFUS can be adapted to detect and characterize cervical lymph nodes in mice. Combined B-mode and power Doppler imaging can be used to detect increases in blood flow in immunologically-enlarged cervical nodes. We also describe the use of B-mode imaging to conduct fine needle biopsies of cervical lymph nodes to retrieve lymph tissue for histological&#160; analysis. Finally, software-aided steps are described to calculate changes in lymph node volume and to visualize changes in lymph node morphology following image reconstruction. The ability to visually monitor changes in cervical lymph node biology over time provides a simple and powerful technique for the non-invasive monitoring of cervical lymph node alterations in preclinical mouse models of oral cavity disease.

This protocol describes the application of high-frequency ultrasound (HFUS) for imaging mouse cervical lymph nodes. This technique optimizes visualization and quantification of cervical lymph node morphology, volume and blood flow. Image-guided biopsy of cervical lymph nodes and processing of lymph tissue for histological evaluation is also demonstrated.

Alta frecuencia de imágenes por ultrasonido del mouse ganglios linfáticos cervicales

High-frequency ultrasound (HFUS) is widely employed as a non-invasive method for imaging internal anatomic structures in experimental small animal ...

Use of Ultra-high Field MRI in Small Rodent Models of Polycystic Kidney Disease for In Vivo Phenotyping and Drug Monitoring

Several in vivo pre-clinical studies in Polycystic Kidney Disease (PKD) utilize orthologous rodent models to identify and study the genetic and molecular mechanisms responsible for the disease, and are very convenient for rapid drug screening and testing of promising therapies. A limiting factor in these studies is often the lack of efficient non-invasive methods for sequentially analyzing the anatomical and functional changes in the kidney. Magnetic resonance imaging (MRI) is the current gold standard imaging technique to follow autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD) patients, providing excellent soft tissue contrast and anatomic detail and allowing Total Kidney Volume (TKV) measurements.A major advantage of MRI in rodent models of PKD is the possibility for in vivo imaging allowing for longitudinal studies that use the same animal and therefore reducing the total number of animals required. In this manuscript, we will focus on using Ultra-high field (UHF) MRI to non-invasively acquire in vivo images of rodent models for PKD. The main goal of this work is to introduce the use of MRI as a tool for in vivo phenotypical characterization and drug monitoring in rodent models for PKD.

Use of Ultra-high Field MRI in Small Rodent Models of Polycystic Kidney Disease for In Vivo Phenotyping and Drug Monitoring

The use of ultra-high field MRI as a non-invasive way to obtain phenotypic information of rodent models for polycystic kidney disease and to monitor interventions is described. Compared with the traditional histological approach, MRI images can be acquired in vivo, allowing for longitudinal follow-up.

El uso de ultra-alta MRI Field en Modelos pequeño roedor de la enfermedad renal poliquística para<em&gt; En Vivo</em&gt; Fenotipificación de Drogas y Vigilancia

Several in vivo pre-clinical studies in Polycystic Kidney Disease (PKD) utilize orthologous rodent models to identify and study the genetic and molecular ...

Implementation of In Vitro Drug Resistance Assays: Maximizing the Potential for Uncovering Clinically Relevant Resistance Mechanisms

Although targeted therapies are initially effective, resistance inevitably emerges. Several methods, such as genetic analysis of resistant clinical specimens, have been applied to uncover these resistance mechanisms to facilitate follow-up care. Although these approaches have led to clinically relevant discoveries, difficulties in attaining the relevant patient material or in deconvoluting the genomic data collected from these specimens have severely hampered the path towards a cure. To this end, we here describe a tool for expeditious discovery that may guide improvement in first-line therapies and alternative clinical management strategies. By coupling preclinical in vitro or in vivo drug selection with next-generation sequencing, it is possible to identify genomic structural variations and/or gene expression alterations that may serve as functional drivers of resistance. This approach facilitates the spontaneous emergence of alterations, enhancing the probability that these mechanisms may be observed in the patients. In this protocol we provide guidelines to maximize the potential for uncovering single nucleotide variants that drive resistance using adherent lines.

Implementation of In Vitro Drug Resistance Assays: Maximizing the Potential for Uncovering Clinically Relevant Resistance Mechanisms

Drug resistance to targeted therapeutics is widespread and the need to identify mechanisms of resistance--prior to or following clinical onset--is critical for guiding alternative clinical management strategies. Here, we present a protocol to couple derivation of drug-resistant lines in vitro with sequencing to expedite discovery of these mechanisms.

Implementación de<em&gt; In Vitro</em&gt; Droga Resistencia Ensayos: Maximizar el Potencial de Descubrimiento clínicamente relevantes mecanismos de resistencia

Although targeted therapies are initially effective, resistance inevitably emerges. Several methods, such as genetic analysis of resistant clinical ...

Surgical Models of Gastroesophageal Reflux with Mice

Multiple surgical procedures have been reported to induce gastroesophageal reflux in animals. Herein, we report three surgical models with mice aiming to induce reflux of gastric contents, duodenal contents or mixed contents. Surgical procedures and general principles have been described in detail. A researcher with surgical experience should be able to grasp the technique after a short period of practice. After surgery, most mice can survive and develop reflux esophagitis similar to that in humans. However, it should be noted that histological differences between mouse and human esophagus are the inherent limitations of these surgical models. If used for research on Barrett&#8217;s esophagus and adenocarcinoma, these procedures may need to be combined with genetic modifications.

This article demonstrates surgical procedures of gastroesophageal reflux with mice. These models are useful tools for research on mechanisms and treatment of gastroesophageal reflux disease and potentially Barrett&#8217;s esophagus and esophageal adenocarcinoma.

Modelos quirúrgicos de reflujo gastroesofágico con ratones

Multiple surgical procedures have been reported to induce gastroesophageal reflux in animals. Herein, we report three surgical models with mice aiming to ...

Cutaneous Surgical Denervation:  A Method for Testing the Requirement for Nerves in Mouse Models of Skin Disease

Cutaneous somatosensory nerves function to detect diverse stimuli that act upon the skin. In addition to their established sensory roles, recent studies have suggested that nerves may also modulate skin disorders including atopic dermatitis, psoriasis and cancer. Here, we describe protocols for testing the requirement for nerves in maintaining a cutaneous mechanosensory organ, the touch dome (TD). Specifically, we discuss methods for genetically labeling, harvesting and visualizing TDs by whole-mount staining, and for performing unilateral surgical denervation on mouse dorsal back skin. Together, these approaches can be used to directly compare TD morphology and gene expression in denervated as well as sham-operated skin from the same animal. These methods can also be readily adapted to examine the requirement for nerves in mouse models of skin pathology. Finally, the ability to repeatedly sample the skin provides an opportunity to monitor disease progression at different stages and times after initiation.

This article includes detailed protocols for genetic labeling of mouse skin, surgical denervation, skin biopsy and visualizing labeled epithelia by whole-mount &#946;-galactosidase staining. These methods can be used to test the requirement for nerves in mouse models of normal and pathological skin.

La denervación quirúrgica cutánea: Un método para probar el requisito de nervios en el ratón modelos de enfermedad de la piel

Cutaneous somatosensory nerves function to detect diverse stimuli that act upon the skin. In addition to their established sensory roles, recent studies ...

A Model to Simulate Clinically Relevant Hypoxia in Humans

In case of apnea, arterial partial pressure of oxygen (pO2) decreases, while partial pressure of carbon dioxide (pCO2) increases. To avoid damage to hypoxia sensitive organs such as the brain, compensatory circulatory mechanisms help to maintain an adequate oxygen supply. This is mainly achieved by increased cerebral blood flow. Intermittent hypoxia is a commonly seen phenomenon in patients with obstructive sleep apnea. Acute airway obstruction can also result in hypoxia and hypercapnia. Until now, no adequate model has been established to simulate these dynamics in humans. Previous investigations focusing on human hypoxia used inhaled hypoxic gas mixtures. However, the resulting hypoxia was combined with hyperventilation and is therefore more representative of high altitude environments than of apnea. Furthermore, the transferability of previously performed animal experiments to humans is limited and the pathophysiological background of apnea induced physiological changes is poorly understood. In this study, healthy human apneic divers were utilized to mimic clinically relevant hypoxia and hypercapnia during apnea. Additionally, pulse-oximetry and Near Infrared Spectroscopy (NIRS) were used to evaluate changes in cerebral and peripheral oxygen saturation before, during, and after apnea.

Hypoxia simulation in humans has usually been performed by inhaling hypoxic gas mixtures. For this study, apneic divers were used to simulate dynamic hypoxia in humans. Additionally, physiological changes in desaturation and re-saturation kinetics were evaluated with non-invasive tools such as Near-Infrared-Spectroscopy (NIRS) and peripheral oxygenation saturation (SpO2).

Un modelo para simular la hipoxia clínicamente relevantes en seres humanos

In case of apnea, arterial partial pressure of oxygen (pO2) decreases, while partial pressure of carbon dioxide (pCO2) increases. To avoid damage to ...

Assessment of the Anticoagulant and Anti-inflammatory Properties of Endothelial Cells Using 3D Cell Culture and Non-anticoagulated Whole Blood

In vivo, endothelial cells are crucial for the natural anticoagulation of circulating blood. Consequently, endothelial cell activation leads to blood coagulation. This phenomenon is observed in many clinical situations, like organ transplantation in the presence of pre-formed anti-donor antibodies, including xenotransplantation, as well as in ischemia/reperfusion injury. In order to reduce animal experimentation according to the 3R standards (reduction, replacement and refinement), in vitro models to study the effect of endothelial cell activation on blood coagulation would be highly desirable. However, common flatbed systems of endothelial cell culture provide a surface-to-volume ratio of 1 - 5 cm2 of endothelium per mL of blood, which is not sufficient for natural, endothelial-mediated anticoagulation. Culturing endothelial cells on microcarrier beads may increase the surface-to-volume ratio to 40 - 160 cm2/mL. This increased ratio is sufficient to ensure the &#34;natural&#34; anticoagulation of whole blood, so that the use of anticoagulants can be avoided. Here an in vitro microcarrier-based system is described to study the effects of genetic modification of porcine endothelial cells on coagulation of whole, non-anticoagulated human blood. In the described assay, primary porcine aortic endothelial cells, either wild type (WT) or transgenic for human CD46 and thrombomodulin, were grown on microcarrier beads and then exposed to freshly drawn non-anticoagulated human blood. This model allows for the measurement and quantification of cytokine release as well as activation markers of complement and coagulation in the blood plasma. In addition, imaging of activated endothelial cell and deposition of immunoglobulins, complement- and coagulation proteins on the endothelialized beads were performed by confocal microscopy. This assay can also be used to test drugs which are supposed to prevent endothelial cell activation and, thus, coagulation. On top of its potential to reduce the number of animals used for such investigations, the described assay is easy to perform and consistently reproducible.

We present an in vitro model which allows the study and analysis of coagulation in whole, non-anticoagulated blood. Anticoagulation in the system depends on the natural anticoagulation effect of healthy endothelial cells and endothelial cell activation will result in clotting.

Evaluación de las propiedades anticoagulantes y antiinflamatorias de las células endoteliales mediante cultivo celular 3D y sangre no anticoagulada

In vivo, endothelial cells are crucial for the natural anticoagulation of circulating blood. Consequently, endothelial cell activation leads to blood ...

Isolation and Culture of Resident Cardiac Macrophages from the Murine Sinoatrial and Atrioventricular Node

Resident cardiac macrophages have been demonstrated to facilitate the electrical conduction in the heart. The physiologic heart rhythm is initiated by electrical impulses generated in sinoatrial node (SAN) and then conducted to ventricles via atrioventricular node (AVN). To further study the role of resident macrophages in cardiac conduction system, a proper isolation of resident macrophages from SAN and AVN is necessary, but it remains challenging. Here, we provide a protocol for the reliable microdissection of the SAN and AVN in murine hearts followed by the isolation and culture of resident macrophages.
Both, SAN which is located at the junction of the crista terminalis with the superior vena cava, and AVN which is located at the apex of the triangle of Koch, are identified and microdissected. Correct location is confirmed by histologic analysis of the tissue performed with Masson's trichrome stain and by anti-HCN4.
Microdissected tissues are then enzymatically digested to obtain single cell suspensions followed by the incubation with a specific panel of antibodies directed against cell-type specific surface markers. This allows to identify, count, or isolate different cell populations by fluorescent activated cell sorting. To differentiate cardiac resident macrophages from other immune cells in the myocardium, especially recruited monocyte-derived macrophages, a delicate devised gating strategy is needed. First, lymphoid lineage cells are detected and excluded from further analysis. Then, myeloid cells are identified with resident macrophages being determined by high expression of both CD45 and CD11b, and low expression of Ly6C. With cell sorting, isolated cardiac macrophages can then be cultivated in vitro over several days for further investigation. We, therefore, describe a protocol to isolate cardiac resident macrophages located within the cardiac conduction system. We discuss pitfalls in microdissecting and digesting SAN and AVN, and provide a gating strategy to reliably identify, count and sort cardiac macrophages by fluorescence-activated cell sorting.

The protocol presented here provides a step-by-step approach for the isolation of cardiac resident macrophages from the sinoatrial node (SAN) and atrioventricular node (AVN) region of mouse hearts.

Aislamiento y cultivo de macrófagos cardíacos residentes del nódulo sinoauricular y auriculoventricular murino

Resident cardiac macrophages have been demonstrated to facilitate the electrical conduction in the heart. The physiologic heart rhythm is initiated by ...