Este protocolo es significativo porque se puede utilizar para estudiar la presencia de biomarcador de glioma mediante un método que preserva la estructura 3D de las neuroesferas tumorales. La principal ventaja de este protocolo es que la morfología de las neuroesferas se mantiene en comparación con el método de citospino en el que las células son sometidas a una manipulación estresante y se aplanan. Este método se puede aplicar a cualquier otro sistema de cultivo de tejido en el que las células se cultivan en 3D y el mantenimiento de la estructura es importante.
Para empezar, el cultivo de neuroesferas tumorales o NS en un matraz T-25 hasta que las células son confluentes. Elija el tumor NS en un tubo cónico de 15 mililitros. Impellear el NS a 300 Gs durante cinco minutos.
Después de esto, vuelva a suspender el pellet en un mililitro de 10%formalina e incubar el tubo a temperatura ambiente durante 10 minutos. Agregue cinco mililitros de HBSS al NS re-suspendido. Impellear las células como se describió anteriormente. Coloque el tubo que contiene el pellet sobre hielo.
Vuelva a suspender el pellet NS lavado en 500 microlitros de agarosa líquida caliente dos por ciento. Y mezcle con un suave pipeteo o agitación. Coloque la agarosa incrustada en el hielo hasta que la agarosa se polimerice.
A continuación, retire el trozo de agarosa, sosteniendo el NS. Coloque la pieza de agarosa en un casete para el procesamiento de tejidos. Ponga un baño de agua a 42 grados centígrados. E inserte cuidadosamente la cuchilla en el microtoma.
A continuación, coloque el bloque de parafina en el microtoma. Con una mano, presione hacia abajo en la palanca que controla el grosor de cada sección situada en el lado izquierdo de la máquina. Presione la palanca en la segunda parada para ajustar el microtoma a un espesor de 30 micrómetros.
Gire la rueda de mano gruesa para comenzar a recortar el bloque. Una vez que la superficie de la muestra está casi expuesta, ajuste la palanca que controla el espesor a cinco o 10 micrómetros. Deje de recortar cuando se alcance la superficie de la muestra.
Llene una caja de hielo con hielo y suficiente agua para proteger el bloque de parafina de tocar directamente el hielo. Deseche la hoja de microtomo antigua e inserte una nueva para el seccionamiento. Seque el bloque de parafina con gasa y colóquelo en el microtome.
Gire la rueda de mano gruesa para comenzar a sedar la parafina. A continuación, utilice un pincel húmedo para transferir la cinta de parafina al baño de agua Celsius de 42 grados. Usando la curva de los fórceps, coloque los fórceps entre dos secciones de parafina y empuje las secciones separados suavemente.
Utilice el pincel húmedo para empujar las secciones separadas sobre las diapositivas del microscopio de adhesión cargadas positivamente. Primero, derrite la parafina incubando los portaobjetos en un estante metálico a 60 grados Celsius durante 20 minutos. A continuación, desparafinar los portaobjetos a través de la incubación en un tren de rehidratación a temperatura ambiente de acuerdo con el protocolo de texto.
Almacene los portaobjetos en agua del grifo para evitar la unión de anticuerpos no específica. Después de esto, incubar los portaobjetos en tampón de citrato a 125 grados Celsius durante 30 segundos y 90 grados Celsius durante 10 segundos. Deje que los portaobjetos se enfríen antes de enjuagarlos cinco veces con agua destilada.
A continuación, incubar los portaobjetos a temperatura ambiente en 0,3% de peróxido de hidrógeno durante 20 minutos. A continuación, lave los portaobjetos durante cinco minutos, tres veces en el tampón de lavado con agitación suave. Incubar los portaobjetos durante la noche en una cámara humidificada establecida en cuatro grados Celsius con anticuerpo primario diluido.
Después de esto, lave los portaobjetos tres veces durante cinco minutos con una agitación suave. A continuación, incubar los portaobjetos en anticuerpos secundarios biotinilados diluidos a temperatura ambiente durante una hora. Lave los portaobjetos tres veces durante cinco minutos en el tampón de lavado con agitación suave.
Luego, incubar los toboganes en el complejo de peroxidasa de rábano picante avidin-biotinilo a temperatura ambiente en la oscuridad durante una hora. Repita el lavado como se describió anteriormente. Después de esto, incubar los portaobjetos con marcas de sustrato de peróxido de hidrógeno DAB durante dos a cinco minutos a temperatura ambiente.
Enjuague los portaobjetos con agua del grifo y sumerja los portaobjetos en la solución de hematoxilina para contrarrestarlos. A continuación, enjuague bien los portaobjetos en agua del grifo hasta que el agua quede limpia. Deshidrate las diapositivas según el protocolo de texto.
Por último, cubra los portaobjetos con un medio de montaje a base de xileno y déjelos secar sobre una superficie plana a temperatura ambiente. En este protocolo, NS son fijos e incrustados en la agarosa y la parafina. Y luego se tiñen para biomarcadores específicos de glioma.
El nivel de expresión de ATRX, una proteína de chaperón que media la estructura de la cromatina, es bajo. Ki67, un biomarcador de proliferación celular, es positivo en el glioma NS. Por último, el NS también es positivo para OLIG2, un factor de transcripción que media la diferenciación de oligodendrocitos. Lo más importante a recordar es re-suspender bien las células en la agarosa caliente antes de transferirse al hielo, para asegurar una distribución uniforme de las neuroesferas.
