המחברים מבקשים להודות לכל החברים במעבדה Dumenil, במיוחד סלקתי סילבה לקריאה ביקורתית של כתב היד. מחלקת הכירורגית בHôpital Europeen ז&#39;ורז&#39; פומפידו-(HEGP), ד&quot;ר דוד Maladry. מיכאל Hivelin וד&quot;ר פטריק Bruneval, פתולוגיה המחלקה בHEGP. מתקן בעלי החיים בPARCC, בראשותו של אליזבת איק. עבודה זו נתמכה על ידי סוכנויות המענק הבאות: אחוות מארי קירי IEF לא. 273,223 (KM), ATIP-Avenir גרנט מINSERM, מענק ציוד CODDIM (Ile de France אזור), FRM (Fondation לשפוך la משוכלל ונדיר médicale) מענק ציוד, המעבדה IBEID של קונסורציום מצוינות, ANR (סוכנות הידיעות Nationale לשפוך משוכלל ונדיר לה) מענק &quot; באגס-בזרימה &quot;. היו הממנים שום תפקיד בעיצוב מחקר, איסוף נתונים וניתוח, החלטה לפרסם, או הכנה של כתב היד.

<ol>
	<li>Davis, C. E., Arnold, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+meningococcal+endotoxin+in+Meningococcal+purpura.">Role of meningococcal endotoxin in Meningococcal purpura.</a> J. Exp. Med. 140, 159-171 (1974).</li><li>Mairey, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+microcirculation+shear+stress+levels+determine+Neisseria+meningitidis+attachment+sites+along+the+blood-brain+barrier.">Cerebral microcirculation shear stress levels determine Neisseria meningitidis attachment sites along the blood-brain barrier.</a> J. Exp. Med. 203, 1939-1950 (2006).</li><li>Brandtzaeg, P., van Deuren, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Classification+and+pathogenesis+of+meningococcal+infections.">Classification and pathogenesis of meningococcal infections.</a> Methods Mol. Biol. 799, 21-35 (2012).</li><li>Guarner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+and+diagnosis+of+human+meningococcal+disease+using+immunohistochemical+and+PCR+assays.">Pathogenesis and diagnosis of human meningococcal disease using immunohistochemical and PCR assays.</a> Am. J. Clin. Pathol. 122, 754-764 (2004).</li><li>Hill, W. R., Kinney, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cutaneous+lesions+in+acute+meningococcemia;+a+clinical+and+pathologic+study.">The cutaneous lesions in acute meningococcemia; a clinical and pathologic study.</a> J. Am. Med. Assoc. 134, 513-518 (1947).</li><li>Capecchi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neisseria+meningitidis+NadA+is+a+new+invasin+which+promotes+bacterial+adhesion+to+and+penetration+into+human+epithelial+cells.">Neisseria meningitidis NadA is a new invasin which promotes bacterial adhesion to and penetration into human epithelial cells.</a> Mol. Microbiol. 55, 687-698 (2005).</li><li>Merz, A. J., Enns, C. A., So, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+IV+pili+of+pathogenic+Neisseriae+elicit+cortical+plaque+formation+in+epithelial+cells.">Type IV pili of pathogenic Neisseriae elicit cortical plaque formation in epithelial cells.</a> Mol. Microbiol. 32, 1316-1332 (1999).</li><li>Morand, P. C., Tattevin, P., Eugene, E., Beretti, J. L., Nassif, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+adhesive+property+of+the+type+IV+pilus-associated+component+PilC1+of+pathogenic+Neisseria+is+supported+by+the+conformational+structure+of+the+N-terminal+part+of+the+molecule.">The adhesive property of the type IV pilus-associated component PilC1 of pathogenic Neisseria is supported by the conformational structure of the N-terminal part of the molecule.</a> Mol. Microbiol. 40, 846-856 (2001).</li><li>Taha, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neisseria+meningitidis+induces+the+expression+of+the+TNF-alpha+gene+in+endothelial+cells.">Neisseria meningitidis induces the expression of the TNF-alpha gene in endothelial cells.</a> Cytokine. 12, 21-25 (2000).</li><li>Kirchner, M., Meyer, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+PilC+adhesin+of+the+Neisseria+type+IV+pilus-binding+specificities+and+new+insights+into+the+nature+of+the+host+cell+receptor.">The PilC adhesin of the Neisseria type IV pilus-binding specificities and new insights into the nature of the host cell receptor.</a> Mol. Microbiol. 56, 945-957 (2005).</li><li>Mikaty, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+bacterial+pathogen+induces+host+cell+surface+reorganization+to+resist+shear+stress.">Extracellular bacterial pathogen induces host cell surface reorganization to resist shear stress.</a> PLoS Pathog. 5, (2009).</li><li>Johansson, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD46+in+meningococcal+disease.">CD46 in meningococcal disease.</a> Science. 301, 373-375 (2003).</li><li>Kirchner, M., Heuer, D., Meyer, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD46-independent+binding+of+Neisserial+type+IV+pili+and+the+major+pilus+adhesin,+PilC,+to+human+epithelial+cells.">CD46-independent binding of Neisserial type IV pili and the major pilus adhesin, PilC, to human epithelial cells.</a> Infect. Immun. 73, 3072-3082 (2005).</li><li>Noinaj, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+iron+piracy+by+pathogenic+Neisseria.">Structural basis for iron piracy by pathogenic Neisseria.</a> Nature. 483, 53-58 (2012).</li><li>Schryvers, A. B., Gonzalez, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptors+for+transferrin+in+pathogenic+bacteria+are+specific+for+the+host's+protein.">Receptors for transferrin in pathogenic bacteria are specific for the host's protein.</a> Can. J. Microbiol. 36, 145-147 (1990).</li><li>Oftung, F., Lovik, M., Andersen, S. R., Froholm, L. O., Bjune, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+utilising+human+transferrin+to+study+protection+against+Neisseria+meningitidis+serogroup+B+induced+by+outer+membrane+vesicle+vaccination.">A mouse model utilising human transferrin to study protection against Neisseria meningitidis serogroup B induced by outer membrane vesicle vaccination.</a> FEMS Immunol. Med. Microbiol. 26, 75-82 (1999).</li><li>Zarantonelli, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+mice+expressing+human+transferrin+as+a+model+for+meningococcal+infection.">Transgenic mice expressing human transferrin as a model for meningococcal infection.</a> Infect. Immun. 75, 5609-5614 (2007).</li><li>Melican, K., Michea Veloso, P., Martin, T., Bruneval, P., Dumenil, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+of+Neisseria+meningitidis+to+dermal+vessels+leads+to+local+vascular+damage+and+purpura+in+a+humanized+mouse+model.">Adhesion of Neisseria meningitidis to dermal vessels leads to local vascular damage and purpura in a humanized mouse model.</a> PLoS Pathog. 9, (2013).</li><li>Murray, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+T-cell-mediated+destruction+of+allogeneic+dermal+microvessels+in+a+severe+combined+immunodeficient+mouse.">Human T-cell-mediated destruction of allogeneic dermal microvessels in a severe combined immunodeficient mouse.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 9146-9150 (1994).</li><li>Nassif, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigenic+variation+of+pilin+regulates+adhesion+of+Neisseria+meningitidis+to+human+epithelial+cells.">Antigenic variation of pilin regulates adhesion of Neisseria meningitidis to human epithelial cells.</a> Mol. Microbiol. 8, 719-725 (1993).</li><li>Geoffroy, M. C., Floquet, S., Metais, A., Nassif, X., Pelicic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+analysis+of+the+meningococcus+genome+by+gene+disruption:+resistance+to+complement-mediated+lysis.">Large-scale analysis of the meningococcus genome by gene disruption: resistance to complement-mediated lysis.</a> Genome Res. 13, 391-398 (2003).</li><li>Ho, M., Hickey, M. J., Murray, A. G., Andonegui, G., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+Plasmodium+falciparum-endothelium+interactions+in+human+microvasculature:+mimicry+of+leukocyte+recruitment.">Visualization of Plasmodium falciparum-endothelium interactions in human microvasculature: mimicry of leukocyte recruitment.</a> J. Exp. Med. 192, 1205-1211 (2000).</li></ol>

המחברים מצהירים שום אינטרסים כלכליים מתחרים.

מודלים של בעלי החיים חשובים באופן קריטי למחקר פתוגנזה של חיידקים. אי אפשר לחקות את הסביבה vivo בתרבית תאים באופן מלא וזה הופך להיות ברור כי האינטראקציה המאכסן לפתוגן מושפעת מגורמים דינמיים רבים. הייחוד האנושי של כמה פתוגנים חשובים קליני, כגון נ meningitidis, HIV, HCV, Plasmodium falciparum, חיידקי ליסטריה, וסלמונלה typhi הגביל את השימוש במודלי vivo לזיהומים אלה. עם זאת, כפי שאנו מתחילים להבין שצעדי זיהומיות מעורבים בסגולי, מודלים אנושיים מפותחים. הפרוטוקול המתואר כאן הוא הפגנה של זה עם ההקדמה של microvessels האנושי בעכברים, המאפשר נרחב בזיהום vivo עם נ &#39; meningitidis, וכתוצאה מכך לנזק בכלי דם ולעתים ההתפתחות של פריחות purpuric. שימוש במודל זה,אנחנו כבר יכולים להגדיר שמאפייני ההדבקה של פריון הכולל מעורבים בהתישבות בכלי הדם בvivo באמצעות מוטציות בקטריאלי וכי הנזק בכלי הדם מופחת בהיעדר ההידבקות 18. בעבר, מוצרי חיידקים במחזור היו מעורבים בנזק הזה, אבל התוצאות שלנו מצביעות על תפקיד מכריע בהדבקה מקומית וקולוניזציה של כלי דם. זו פותחת אפשרויות חדשות לפיתוח של מטרות טיפול חדשני. אם הידבקות של חיידקים פתוגניים יכולה להיחסם pharmaceutically זה אולי יכול למנוע ההתפתחות של נגעי עור ולהוביל לתוצאות טובות יותר עבור ניצולי קרום מוח במונחים של נמק רקמות, הטרייה וקטיעות. העבודה הוכיחה גם את המורכבות של הזיהום ואת מעורבותם של התגובה החיסונית ומפל קרישה. זיהינו איתות ציטוקינים אדם בסרום של עכברים נגועים למרות הכמות הקטנה יחסית של האנדותל הווה האנושי 18.זה היה רמז לתגובת ציטוקינים משמעותי, יחד עם החדירה של אוכלוסיות תאים חיסוניים עכבר לאזור. מודלים של בעלי חיים כמובן לא יכולים לשכפל באופן מלא מחלות של בני אדם וכל התוצאות זכו מהם יש לקחת בחשבון עם זה בחשבון. לדוגמא, במודל זה הדם ותאים במחזור הם ממוצא עכבר ולא ניתן לשלול כי הם עשויים להתנהג באופן שונה לתאים אנושיים. יתרון של זה עם זאת, כפי שמודגם בפרסום האחרון שלנו 18, הוא היכולת להבחין שמקורו איתות מהאנדותל האנושי מזה של תאי עכבר במחזור. רקע החיסון של העכברים משמשים במודל זה גם יאפשר את העברת allogenic של אוכלוסיות תאי חיסון אנושיות, והוסיף היבט &#39;האנשה&#39; נוסף. רקע החיסון של העכברים עשוי עם זאת להסוות תפקיד לנ&quot;ח, T או תאי B, אשר כולם חסרים או פגום במודל זה. שור יחסיתזמן t (24hr) המשמש במודל זה בעיקר נוגע לתגובה המולדת, אך לזיהומים לטווח ארוך והפיתוח של אפשרויות אחרות חסינות ייתכן שיצטרך להיחקר. העור הוא אתר זיהום חשוב לנ meningitidis אלא שיש כמות קטנה יחסית של כלי אנושיים גם אומר שחיוץ הנתונים לזיהום מערכתי הכולל איברים רבים הוא קשה. בעוד מודל זה מאפשר לחקר התפתחות נגע עורי, צעדים חשובים של זיהום קרום המוח כגון מעבר אפיתל ודם למוח אינם כלולים. יש צורך בפיתוח נוסף של המודלים אנושיים האלה כדי לטפל בהיבטים שונים של זיהום. עם זאת מודל זה מציע פוטנציאל גדול לפתוגנים רבים אדם ספציפיים, במיוחד אלה המתמקדים בכלי הדם.

אלח דם קרום המוח הוא זיהום בדם נולד לעתים קרובות קטלני הנגרם על ידי meningitidis Neisseria פתוגן החיידקים. חולי אלח דם קרום מוח לעתים קרובות בהווה עם פריחה petechial או purpuric על העור שלהם שהעבר היה קשור להרס של כלי דם נגרמים על ידי חיידקים במחזור ומוצרי חיידקי 1. ביופסיות עור של חולים קליניים מראות חיידקים הקשורים microvessels, לעתים קרובות ממלאים את כלי 2. מלבד דליפת חיידקים, פקקת נרחב, קרישה, גודש כלי דם ונראה באזורי purpuric 3-5. נזק בכלי דם זה יכול להוביל לנימק נרחב של העור ורקמות הסובבות, וכתוצאה מהטריה ואפילו קטיעה בניצולי קרום מוח. הבנה כיצד זיהום גורם לניזק בכלי דם זה חשוב כדי לייעל את אסטרטגיות מניעה וטיפול. רוב המחקר על אלח דם קרום המוח שבוצע במבחנה עלשורות תאים אנושיות בשל הייחוד האנושי של נ &#39; meningitidis. היבטים של זיהום רבים כבר למדו במבחנה כולל הידבקות חיידקים, תגובת תא מארחת, כמו גם תגובת ציטוקינים 6-9. פילי סוג IV (פריון כולל) היו מעורבים כאברון הידבקות הגדול לנ &#39; meningitidis משני תאי אפיתל ואנדותל 10. זה גם הוכח שהידבקות של נ &#39; meningitidis לארח תאים הוא מאמץ גזירה תלוי ולכן הוא חשב להיות קשור לשיעורי זרימת דם בנימי הדם 11. הדבר מצביע על הלחצים הדינמיים החיידקים להתמודד in vivo הם קריטיים להיווצרות מחלה. זה אולם קשה מאוד למודל המיקרו של כלי דם קטנים במבחנה. קולט ההידבקות לNeisseria הפריון כולל עדיין אינו ידוע, ולכן לא ניתן בחזון אסטרטגיות לדפוק בלהשיג הידבקות חיידקים במודל חיה בשלב זה. CD46 הוצע להיות קולט הפריון כולל ובעלי החיים מהונדסים יוצרו לפעול כמודלים עכבר. עם זאת, זיהום בבעלי החיים אלה אינו מוביל לזיהום נרחב או לפריחת 12,13 פיתוח. מודלים של בעלי חיים אחרים, שתוארו להיבט קטרמיה של זיהום Neisseria לקחת בחשבון את העדפת החיידקים לtransferrin אנושי כמקור ברזל 14,15. כך או להשלים transferrin אדם או להביע אותו מתוצאות transgene בעומס חיידקים גדל בזרם הדם על פני תקופת זמן ממושכת, אבל מודל זה לא מראה הידבקות חיידקים או התפתחות הפריחה 16,17. בפרוטוקול זה, אנו מתארים מודל עכבר אנושי שבו עור אדם, כולל נימי דם עורי, הוא הושתל על עכברי מדוכאי חיסון 18,19. התוצאה היא כלי אנושי פונקציונלי, perfused עם מחזור העכבר. , מ &#39;בשילוב עם תוספי transferrin האנושי הזהאודל מהווה לפחות שני ההיבטים הספציפיים האדם של נ &#39; meningitidis, כלומר האנדותל אנושי וtransferrin אדם, בסביבה בvivo. נ meningitidis הציג לווריד למודל זה לדבוק במיוחד כדי האנדותל האנושי, ייצור פתולוגיה כי הוא דומה למה שדווח בחולים קליניים, כוללים נזק בכלי דם והתפתחות הפריחה purpuric 18.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="693">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">DMEM</td>
			<td style="width:161px;">Gibco Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">31885-023</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td style="width:161px;">Gibco Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">10010-056</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Ketamine 500</td>
			<td style="width:161px;">Virbac France&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">LOT N&#176;VAL4243</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Xylazine</td>
			<td rowspan="2" style="width:161px;">Bayer Healthcare</td>
			<td rowspan="2" style="width:119px;">AMM N&#176; FR/8146715 2/1980</td>
			<td rowspan="2" style="width:167px;">LOT N&#176; KPO809S</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">(Rompun 2%)</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:247px;">Optigel&#160;&#160;&#160;</td>
			<td rowspan="2" style="width:161px;">Europhta</td>
			<td rowspan="2" style="width:119px;">Medicament autoris&#233; N&#176;3400933521134</td>
			<td rowspan="2" style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Lacrigel&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Tronothane</td>
			<td style="width:161px;">Lisa Pharma</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="40" rowspan="2" style="height:40px;width:247px;">GC agar Base</td>
			<td rowspan="2" style="width:161px;">Conda</td>
			<td rowspan="2" style="width:119px;">1106</td>
			<td rowspan="2" style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Human endothelium SFM media</td>
			<td style="width:161px;">Gibco Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">11111</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:161px;">P A A</td>
			<td style="width:119px;">A15-101</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Human transferrin</td>
			<td style="width:161px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T3309</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">UEA lectin - rhodamine</td>
			<td style="width:161px;">Vector Labs</td>
			<td style="width:119px;">RL-1062</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Hematoxylin</td>
			<td style="width:161px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H9627</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Eosin</td>
			<td style="width:161px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">E4009&#160;</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Xylene</td>
			<td style="width:161px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">534056</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;"></td>
			<td style="width:161px;">Humeca BV, Holland</td>
			<td style="width:119px;">4.SB01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Equiptment Name</td>
			<td style="width:161px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalogue Number</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Sober Hand Dermatome</td>
			<td style="width:161px;">Humeca BV, Holland</td>
			<td style="width:119px;">4.SB01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Animal housing</td>
			<td style="width:161px;">Innovive</td>
			<td style="width:119px;">M-BTM-C8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Biopsy punch (4 mm)</td>
			<td style="width:161px;">Dominic Dutscher</td>
			<td style="width:119px;">30737</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Fast-Prep lysing matrix M tubes</td>
			<td style="width:161px;">MP Bio</td>
			<td style="width:119px;">116923050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">MagNA Lyzer Green Beads</td>
			<td style="width:161px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">3358941001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">MagNA Lyzer</td>
			<td style="width:161px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">3358976001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Vectashield mounting media</td>
			<td style="width:161px;">Vector Labs</td>
			<td style="width:119px;">H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Vetbond</td>
			<td style="width:161px;">3M</td>
			<td style="width:119px;">1469SB</td>
			<td>Tissue Glue</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">OCT tissue tek</td>
			<td style="width:161px;">Sakura</td>
			<td style="width:119px;">4583</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

humanized mouse model to study bacterial infections targeting the microvasculature

Neisseria meningitidis גורם לאלח דם חמור, לעתים קרובות קטלני כאשר הוא נכנס לזרם הדם של בני האדם. זיהום גורם לנזק נרחב של כלי הדם וכתוצאה מכך הדליפה של כלי דם, ההתפתחות של פריחות purpuric ונימק רקמות סופו של דבר. לומד בפתוגנזה של זיהום זה היה מוגבל בעבר על ידי האדם ספציפי של החיידקים, מה שהופך במודלי vivo קשה. בפרוטוקול זה, אנו מתארים מודל אנושי לזיהום זה שבו עור אנושי, המכיל microvessels עורי, הוא מורכבים על עכברי מדוכאי חיסון. כלים אלה anastomose עם מחזור העכבר תוך שמירה על התכונות האנושיות שלהם. ברגע שהציג למודל, נ &#39;זה meningitidis לדבוק אך ורק לכולים האנושיים, וכתוצאה מכך לנזק רב בכלי דם, דלקת ובמקרים מסוימים להתפתחות של הפריחה purpuric. פרוטוקול זה מתאר את שלבי השתלה, זיהום והערכה של מודל זה בקונטהXT של נ &#39; זיהום meningitidis. הטכניקה עשויה להיות מיושמת לפתוגנים ספציפיים אדם רבים כי להדביק את זרם הדם.

ספירת CFU נ זן meningitidis השתמש בתוצאות הנציג אלה הוא נ meningitidis 8013 שיבוט 12, בודד קליני C serogroup, להביע בכיתה אני pilin SB, אופה -, OPC -, PilC1 + / PilC2 + 20. המתח היה שהונדס חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) מהכנסה כרומוזומליות 18. ספירת יחידות מושבה להרכיב חיידקים נקבעות על ידי ספירת מספר המושבות על הצלחות אגר וחישוב או CFU / מיליליטר של דם או CFU / מ&quot;ג של רקמה מהכרכים הידועים מצופים. ספירת דם הראתה כי 5 דקות לאחר ההזרקה הרביעית של 10 6 חיידקי CFU היו ממוצעת של 1.5 x 10 5 CFU / מיליליטר במחזור הדם (איור 1 א). לאחר 6 שעות בממוצע הספירות 4.8 x 10 4 CFU / מיליליטר. על ידי 24 שעות הספירה הממוצעת היו 2.4 x 10 4 CFU / מיליליטר אבל בקבוצה זו של 10 עכברים, 5 היואין לגילוי חיידקים במחזור ואילו 5 אחר ספירות גבוהות יחסית (איור 1 א). ספירת CFU שנלקחה דגימות העור להראות את רוב העכברים שיש סעיפים רבים בעור האנושי, עם ממוצע של 2.1 x 10 4 CFU / מ&quot;ג של רקמה ב6 שעות ו4.4 x 10 2 CFU / מ&quot;ג של רקמה ב24 שעות (איור 1) . דגימות עור העכבר הנגדית לא הראו ספירת חיידקים ב24 שעות ומספר נמוך מאוד רק בשעה 6, מפגינה ההעדפה החזקה לנ meningitidis לכלי אדם בעור מורכב (איור 1). באופן כללי ספירת חיידקים היו נמוכה מאוד לnondetectable באיברים האחרים שנדגמו למרות 2 חיות עשו ספירה להראות שניתן לייחס לזיהום מהדם, כפי שהם מתואמים עם גבוהים במחזור מספרי חיידקים (איור 1 ג). גם המודל יכול לשמש כדי לקבוע את התפקיד של גורמים ארסי in vivo, למשל pi הסוג IVli. זני חיידקים עם מוטציות מוגדרות בגן pilD 21, וכתוצאה מזן חסר פריון כולל, כמו גם את גן pilC1 8, חסר &#39;adhesin&#39; הפריון הכולל המוצע הוכנסו לתוך המודל. מוטציות אלה לא גרמו להידבקות חיידקים בשתל העור האנושי, המאשרות את התפקיד המכריע פריון הכולל הוא משחק בהידבקות בvivo (1D איור). אימונוהיסטוכימיה / היסטולוגיה בניסויים אלה השתמשנו בנ זני meningitidis המבטאים חלבון ירוק הקרינה (GFP), כדי לאפשר זיהוי ניאון ללא הצורך בצביעה משנית. כלי אדם הוכתמו באמצעות סמן על האנדותל אנושי, או CD31 (PECAM-1) או agglutinin קטיני Ulex europaeus (UEA) 18,22. UEA היה מצומדת לrhodamine מאפשר צביעת צעד אחד (איורים 2A-C). ניתן להכתים גרעין תאאד עם DAPI כדי לסייע בזיהוי מבני רקמות (איורים 2A-B). היסטולוגיה בוצעה באמצעות צביעת hematoxylin / eosin סטנדרטי. גבול אפידרמיס / עורי של העור היה ברור לזיהוי. דליפת דלקת, פקקת וכלי דם היו מרוכזת לכלי קרובים לשעת גבול 24 זה לאחר ההדבקה (איור 2 ד). פקקת היה גלוי לעין בכמה כלי עורי קטנים, לעתים קרובות מלווים בגודש ודלקת. דליפה של כדוריות דם אדומים מתוך לתוך הרקמות ניתן הייתה לראות, המציין רמה נרחבת של נזק כלי שיט. Histopathology של עור מושתל בעכברי noninfected נראה נורמלי ללא דלקת להבחין 18. בעוד כ30% מזיהומי הידבקות חיידקים בעור מובילה להתפתחות של ארגמנת macroscopically לגילוי (2E דמויות ו2F). <img alt="איור 1" fo:content-width=<html> &quot;5in&quot; עבור: src = /&gt; &quot;/ files/ftp_upload/51134/51134fig1highres.jpg&quot; = &quot;/ files/ftp_upload/51134/51134fig1.jpg&quot; src איור 1. ספירת CFU. () ספירת החיידקים CFU לכל מיליליטר של דם בדקות 5, 6 שעות, ו24 הודעה hr זיהום. (ב) בקטריאלי CFU סופר מדגימות עור השוואת עור אנושי (HS) ועור של עכבר (MS) בשתי שעות 6 ו24 הודעה hr זיהום. (ג) בקטריאלי CFU סופר מאיברים אחרים נלקחו 24 הודעה hr זיהום. (ד) השוואה בין ספירות CFU חיידקים מדגימות עור אנושיות ועכבר שצולמו ב24 הודעה hr זיהום מעכברים נגועים בנ הסוג בר כתם meningitidis 2C43 (WT), מתח עם מוטציה בגן pilD (pilD) או מתח עם מוטציה בגן pilC1 (pilC1). כל הגרפים מוצגים כנתונים גולמיים בחציון. איור הוא שונה מMelican et al. 18&quot;_blank&quot;&gt; לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר. <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51134/51134fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51134/51134fig2.jpg" /> איור 2. הקרנה מיקרוסקופית. (א) לערימת confocal מראה microvessel אנושי מוכתם בקטיני UEA (אדום) קרובים לעורי (ד) גבול אפידרמיס (ה). כלי נגוע בנ meningitidis 2 הודעה hr זיהום (ירוק). (ב) פרוסה אופטית והקרנה פרוסה (C) מראה נ זיהום microcolonies meningitidis (ירוק) כלי אנושי (UEA - אדום) בתוך עור שתל 2 הודעה hr זיהום. (ד) מכתים Haematoxylin / Eosin של שתל עור האנושי נגוע עבור שעות 24 עם נ &#39; meningitidis. אפידרמיס (ה), גבול עורי (ד) הוא באופן ברור פקקת וגודש של microvess גלויים ונרחבאלס (חיצים) נתפסת בדרמיס. יכולים גם להיות מזוהה דלקת וכמה דליפה של כלי דם (ראש חץ). (ה) שתל עור אדם לפני ההדבקה. אותו שתל העור כשעה לאחר זיהום (E) 24 עם נ &#39;(F) meningitidis מראה אזורי purpuric (חיצים). איורים 2B, 2D, 2E, ו2F הם שונה מMelican et al. 18 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51134/51134fig2highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Humanized Mouse Model to Study Bacterial Infections Targeting the Microvasculature at JoVE.com

Humanized Mouse Model to Study Bacterial Infections Targeting the Microvasculature

meningitidis Neisseria הוא הפתוגן ספציפי אדם שמדביק את כלי דם. בפרוטוקול זה microvessels אדם מוכנס בעכבר על ידי השתלת עור אנושי על עכברי חיסון. חיידקים לדבוק בהרחבה לכלי האנושי, שהובילו לניזק והתפתחות כלי דם של הפריחה purpuric נצפתה בדרך כלל במקרים של בני אדם.

אנושי עכבר מודל ללמוד זיהומים חיידקיים מיקוד microvasculature

Neisseria meningitidis causes a severe, frequently fatal sepsis when it enters the human blood stream. Infection leads to extensive damage of the blood ...

humanized-mouse-model-to-study-bacterial-infections-targeting

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

14.7K Views.  Paris Cardiovascular Research Centre.  meningitidis Neisseria הוא הפתוגן ספציפי אדם שמדביק את כלי דם. בפרוטוקול זה microvessels אדם מוכנס בעכבר על ידי השתלת עור אנושי על עכברי חיסון. חיידקים לדבוק בהרחבה לכלי האנושי, שהובילו לניזק והתפתחות כלי דם של הפריחה purpuric נצפתה בדרך כלל במקרים של בני ?...

Video: Humanized Mouse Model to Study Bacterial Infections Targeting the Microvasculature

Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes. In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific immune cell types, viral pathogens, parasites and bacteria can be followed in real-time within living animals 1-2. Application of bioluminescence imaging to the study of pathogens has advantages as compared to conventional strategies for analysis of infections in animal models3-4. Infections can be visualized within individual animals over time, without requiring euthanasia to determine the location and quantity of the pathogen. Optical imaging allows comprehensive examination of all tissues and organs, rather than sampling of sites previously known to be infected. In addition, the accuracy of inoculation into specific tissues can be directly determined prior to carrying forward animals that were unsuccessfully inoculated throughout the entire experiment. Variability between animals can be controlled for, since imaging allows each animal to be followed individually. Imaging has the potential to greatly reduce animal numbers needed because of the ability to obtain data from numerous time points without having to sample tissues to determine pathogen load3-4.
This protocol describes methods to visualize infections in live animals using bioluminescence imaging for recombinant strains of bacteria expressing luciferase. The click beetle (CBRLuc) and firefly luciferases (FFluc) utilize luciferin as a substrate5-6. The light produced by both CBRluc and FFluc has a broad wavelength from 500 nm to 700 nm, making these luciferases excellent reporters for the optical imaging in living animal models7-9. This is primarily because wavelengths of light greater than 600 nm are required to avoid absorption by hemoglobin and, thus, travel through mammalian tissue efficiently. Luciferase is genetically introduced into the bacteria to produce light signal10. Mice are pulmonary inoculated with bioluminescent bacteria intratracheally to allow monitoring of infections in real time. After luciferin injection, images are acquired using the IVIS Imaging System. During imaging, mice are anesthetized with isoflurane using an XGI-8 Gas Anethesia System. Images can be analyzed to localize and quantify the signal source, which represents the bacterial infection site(s) and number, respectively. After imaging, CFU determination is carried out on homogenized tissue to confirm the presence of bacteria. Several doses of bacteria are used to correlate bacterial numbers with luminescence. Imaging can be applied to study of pathogenesis and evaluation of the efficacy of antibacterial compounds and vaccines.

Methods for bioluminescence imaging of bacterial infections in living animals are decribed. Pathogens are modified to express luciferase allowing optical whole body imaging of infections in live animals. Animal models can be infected with luciferase expressing pathogens and the resulting course of disease visualized in real-time by bioluminescence imaging.

שימוש בלוציפראז לזיהומים חיידקיים תמונה ב עכברים

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes.  In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

היכרות עם מתח שאר בחקר הדבקה חיידקית

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Using the BLT Humanized Mouse as a Stem Cell based Gene Therapy Tumor Model

Small animal models such as mice have been extensively used to study human disease and to develop new therapeutic interventions. Despite the wealth of information gained from these studies, the unique characteristics of mouse immunity as well as the species specificity of viral diseases such as human immunodeficiency virus (HIV) infection led to the development of humanized mouse models. The earlier models involved the use of C. B 17 scid/scid mice and the transplantation of human fetal thymus and fetal liver termed thy/liv (SCID-hu) 1, 2 or the adoptive transfer of human peripheral blood leukocytes (SCID-huPBL) 3. Both models were mainly utilized for the study of HIV infection.
One of the main limitations of both of these models was the lack of stable reconstitution of human immune cells in the periphery to make them a more physiologically relevant model to study HIV disease. To this end, the BLT humanized mouse model was developed. BLT stands for bone marrow/liver/thymus. In this model, 6 to 8 week old NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) immunocompromised mice receive the thy/liv implant as in the SCID-hu mouse model only to be followed by a second human hematopoietic stem cell transplant 4. The advantage of this system is the full reconstitution of the human immune system in the periphery. This model has been used to study HIV infection and latency 5-8.
We have generated a modified version of this model in which we use genetically modified human hematopoietic stem cells (hHSC) to construct the thy/liv implant followed by injection of transduced autologous hHSC 7, 9. This approach results in the generation of genetically modified lineages. More importantly, we adapted this system to examine the potential of generating functional cytotoxic T cells (CTL) expressing a melanoma specific T cell receptor. Using this model we were able to assess the functionality of our transgenic CTL utilizing live positron emission tomography (PET) imaging to determine tumor regression (9).
The goal of this protocol is to describe the process of generating these transgenic mice and assessing in vivo efficacy using live PET imaging. As a note, since we use human tissues and lentiviral vectors, our facilities conform to CDC NIH guidelines for Biosafety Level 2 (BSL2) with special precautions (BSL2+). In addition, the NSG mice are severely immunocompromised thus, their housing and maintenance must conform to the highest health standards (<a href="http://jaxmice.jax.org/research/immunology/005557-housing.html" target="_blank">http://jaxmice.jax.org/research/immunology/005557-housing.html</a>).

The generation and characterization of tumor specific T cells using humanized mice is described here. Human thymic tissue and genetically modified human hematopoietic stem cells are transplanted into immunocompromised mice. This results in the reconstitution of an engineered human immune system allowing for in vivo examination of anti-tumor immune responses.

שימוש בעכבר האנושי של BLT כמודל לתאי גזע מבוסס Gene Therapy גידול

Small animal models such as mice have been extensively used to study human  disease and to develop new therapeutic interventions. Despite the wealth of  ...

The Insect Galleria mellonella as a Powerful Infection Model to Investigate Bacterial Pathogenesis

The study of bacterial virulence often requires a suitable animal model. Mammalian models of infection are costly and may raise ethical issues. The use of insects as infection models provides a valuable alternative. Compared to other non-vertebrate model hosts such as nematodes, insects have a relatively advanced system of antimicrobial defenses and are thus more likely to produce information relevant to the mammalian infection process. Like mammals, insects possess a complex innate immune system1. Cells in the hemolymph are capable of phagocytosing or encapsulating microbial invaders, and humoral responses include the inducible production of lysozyme and small antibacterial peptides2,3. In addition, analogies are found between the epithelial cells of insect larval midguts and intestinal cells of mammalian digestive systems. Finally, several basic components essential for the bacterial infection process such as cell adhesion, resistance to antimicrobial peptides, tissue degradation and adaptation to oxidative stress are likely to be important in both insects and mammals1. Thus, insects are polyvalent tools for the identification and characterization of microbial virulence factors involved in mammalian infections.
Larvae of the greater wax moth Galleria mellonella have been shown to provide a useful insight into the pathogenesis of a wide range of microbial infections including mammalian fungal (Fusarium oxysporum, Aspergillus fumigatus, Candida albicans) and bacterial pathogens, such as Staphylococcus aureus, Proteus vulgaris, Serratia marcescens Pseudomonas aeruginosa, Listeria monocytogenes or Enterococcus faecalis4-7. Regardless of the bacterial species, results obtained with Galleria larvae infected by direct injection through the cuticle consistently correlate with those of similar mammalian studies: bacterial strains that are attenuated in mammalian models demonstrate lower virulence in Galleria, and strains causing severe human infections are also highly virulent in the Galleria model8-11. Oral infection of Galleria is much less used and additional compounds, like specific toxins, are needed to reach mortality.
G. mellonella larvae present several technical advantages: they are relatively large (last instar larvae before pupation are about 2 cm long and weight 250 mg), thus enabling the injection of defined doses of bacteria; they can be reared at various temperatures (20 &deg;C to 30 &deg;C) and infection studies can be conducted between 15 &deg;C to above 37 &deg;C12,13, allowing experiments that mimic a mammalian environment. In addition, insect rearing is easy and relatively cheap. Infection of the larvae allows monitoring bacterial virulence by several means, including calculation of LD5014, measurement of bacterial survival15,16 and examination of the infection process17. Here, we describe the rearing of the insects, covering all life stages of G. mellonella. We provide a detailed protocol of infection by two routes of inoculation: oral and intra haemocoelic. The bacterial model used in this protocol is Bacillus cereus, a Gram positive pathogen implicated in gastrointestinal as well as in other severe local or systemic opportunistic infections18,19.

The Insect Galleria mellonella as a Powerful Infection Model to Investigate Bacterial Pathogenesis

Oral and intra haemocolic infection of larvae of the greater wax moth Galleria mellonella is described. This insect can be used to study virulence factors of entomopathogenic as well as mammalian opportunistic bacteria. Rearing of the insects, methods of infection and examples of in vivo analysis are described.

החרקים<em&gt; גלרית mellonella</em&gt; כדגם זיהום רב עצמה כדי לחקור פתוגנזה קטריאלי

The study of bacterial virulence often requires a suitable animal model. Mammalian models of infection are costly and may raise ethical issues. The use of ...

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

Coinfections naturally occur due to the geographic overlap of distinct types of pathogenic organisms. Concurrent infections most likely modulate the respective immune response to each single pathogen and may thereby affect pathogenesis and disease outcome. Coinfected patients may also respond differentially to anti-infective interventions. Coinfection between tuberculosis as caused by mycobacteria and the malaria parasite Plasmodium, both of which are coendemic in many parts of sub-Saharan Africa, has not been studied in detail. In order to approach the challenging but scientifically and clinically highly relevant question how malaria-tuberculosis coinfection modulate host immunity and the course of each disease, we established an experimental mouse model that allows us to dissect the elicited immune responses to both pathogens in the coinfected host. Of note, in order to most precisely mimic naturally acquired human infections, we perform experimental infections of mice with both pathogens by their natural routes of infection, i.e. aerosol and mosquito bite, respectively.

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

Tuberculosis and malaria are two of the most prevalent infections in humans and major causes of morbidity and mortality in impoverished populations in the tropics. We established an experimental model system to study outcome of malaria-tuberculosis coinfection in mice after challenge with both pathogens via their natural route of infection.

מודל ניסיוני לחקר המלריה שחפת-coinfection על הילוכים טבעיים של חפת Mycobacterium ו Berghei Plasmodium</i

Coinfections naturally occur due to the geographic overlap of distinct types of pathogenic organisms. Concurrent infections most likely modulate the ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence factors, which can subvert and manipulate key host functions. The study of host/pathogen interactions is therefore extremely important to understand bacterial infections and develop alternative strategies to counter infectious diseases. This approach however, requires the development of new high-throughput assays for the unbiased, automated identification and characterization of bacterial virulence determinants. Here, we describe a method for the generation of a GFP-tagged mutant library by transposon mutagenesis and the development of high-content screening approaches for the simultaneous identification of multiple transposon-associated phenotypes. Our working model is the intracellular bacterial pathogen Coxiellaburnetii, the etiological agent of the zoonosis Q fever, which is associated with severe outbreaks with a consequent health and economic burden. The obligate intracellular nature of this pathogen has, until recently, severely hampered the identification of bacterial factors involved in host pathogen interactions, making of Coxiella the ideal model for the implementation of high-throughput/high-content approaches.

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Coxiella burnetii is an obligate intracellular Gram-negative bacterium responsible for the zoonotic disease Q fever. Here we describe methods for the generation of Coxiella fluorescent transposon mutants as well as the automated identification and analysis of the resulting internalization, replication and cytotoxic phenotypes.

דור והקרנה גבוהה תוכן רב-פנוטיפי של<em&gt; Burnetii Coxiella</em&gt; מוטאנטים טרנספוזון

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the shear stress of flowing blood.
To identify the bacterial and host factors that contribute to vascular adhesion of microorganisms, appropriate models that study these interactions under physiological shear conditions are needed. Here, we describe an in vitro flow chamber model that allows to investigate bacterial adhesion to different components of the extracellular matrix or to endothelial cells, and an intravital microscopy model that was developed to directly visualize the initial adhesion of bacteria to the splanchnic circulation in vivo. These methods can be used to identify the bacterial and host factors required for the adhesion of bacteria under flow. We illustrate the relevance of shear stress and the role of von Willebrand factor for the adhesion of Staphylococcus aureus using both the in vitro and in vivo model.

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

To study the interaction of bacteria with the blood vessels under shear stress, a flow chamber and an in vivo mesenteric intravital microscopy model are described that allow to dissect the bacterial and host factors contributing to vascular adhesion.

במבחנת in vivo המודל ללמוד הידבקות חיידקים לכלי השיט וול תנאי זרימה תחת

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the ...

Human Placental and Decidual Organ Cultures to Study Infections at the Maternal-fetal Interface

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is imperative to design experiments using human cells and tissues. An advantage of organ culture is maintenance of three-dimensional (3D) structural organization and extracellular matrix. The goal of the method described here is successful establishment of ex vivo human gestational tissue organ cultures and their healthy culture maintenance for 72-96 hr. The protocol details the immediate processing of research-consented, placental and decidual specimens fresh from the operating suite. These are abundant specimens that would otherwise be discarded. Detailed instructions on the sterile collection of these samples, including morphologic details on how to select appropriate tissues to establish 3D organ cultures, is provided. Placental villous and decidual tissues are microdissected into 2-3 mm3 pieces and placed separately on matrix-lined transwell filters and cultured for several days. Villous and decidual organ cultures are well suited for the study of human host-pathogen interaction. As compared to other model organisms, these human cultures are particularly advantageous to examine mechanism of infection for pathogens that demonstrate variable patterns of host specificity. As an example, we demonstrate infection of placental and decidual organ cultures with the clinically relevant, facultative intracellular bacterial pathogen Listeria monocytogenes.

A simple method to establish primary human placental (villous) and decidual organ cultures is described. Villous and decidual organ cultures are invaluable tools for studying pathogenesis at the human maternal-fetal interface. Infection with the facultative intracellular bacterium Listeria monocytogenes is demonstrated.

שלית Decidual אדם תרבויות איברים ללמוד זיהומים בבית הממשק האם והעובר

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is ...

Methods to Study Lipid Alterations in Neutrophils and the Subsequent Formation of Neutrophil Extracellular Traps

Lipid analysis performed by high performance thin layer chromatography (HPTLC) is a relatively simple, cost-effective method of analyzing a broad range of lipids. The function of lipids (e.g., in host-pathogen interactions or host entry) has been reported to play a crucial role in cellular processes. Here, we show a method to determine lipid composition, with a focus on the cholesterol level of primary blood-derived neutrophils, by HPTLC in comparison to high performance liquid chromatography (HPLC). The aim was to investigate the role of lipid/cholesterol alterations in the formation of neutrophil extracellular traps (NETs). NET release is known as a host defense mechanism to prevent pathogens from spreading within the host. Therefore, blood-derived human neutrophils were treated with methyl-&#946;-cyclodextrin (M&#946;CD) to induce lipid alterations in the cells. Using HPTLC and HPLC, we have shown that M&#946;CD treatment of the cells leads to lipid alterations associated with a significant reduction in the cholesterol content of the cell. At the same time, M&#946;CD treatment of the neutrophils led to the formation of NETs, as shown by immunofluorescence microscopy. In summary, here we present a detailed method to study lipid alterations in neutrophils and the formation of NETs.

Lipids are known to play an important role in cellular functions. Here, we describe a method to determine the lipid composition of neutrophils, with emphasis on the cholesterol level, by using both HPTLC and HPLC to gain a better understanding of the underlying mechanisms of neutrophil extracellular trap formation.

שיטות לחקר ליפידים שינויים נויטרופילים ואת הגיבוש העוקב של נויטרופילים תאיים מלכוד

Lipid analysis performed by high performance thin layer chromatography (HPTLC) is a relatively simple, cost-effective method of analyzing a broad range of ...

The WinCF Model - An Inexpensive and Tractable Microcosm of a Mucus Plugged Bronchiole to Study the Microbiology of Lung Infections

Many chronic airway diseases result in mucus plugging of the airways. Lungs of an individual with cystic fibrosis are an exemplary case where their mucus-plugged bronchioles create a favorable habitat for microbial colonization. Various pathogens thrive in this environment interacting with each other and driving many of the symptoms associated with CF disease. Like any microbial community, the chemical conditions of their habitat have a significant impact on the community structure and dynamics. For example, different microorganisms thrive in differing levels of oxygen or other solute concentrations. This is also true in the CF lung, where oxygen concentrations are believed to drive community physiology and structure. The methods described here are designed to mimic the lung environment and grow pathogens in a manner more similar to that from which they cause disease. Manipulation of the chemical surroundings of these microbes is then used to study how the chemistry of lung infections governs its microbial ecology. The method, called the WinCF system, is based on artificial sputum medium and narrow capillary tubes meant to provide an oxygen gradient similar to that which exists in mucus-plugged bronchioles. Manipulating chemical conditions, such as the media pH of the sputum or antibiotics pressure, allows for visualization of the microbiological differences in those samples using colored indicators, watching for gas or biofilm production, or extracting and sequencing the nucleic acid contents of each sample.

The mucus plugged airways of cystic fibrosis (CF) patients are an ideal environment for microbial pathogens to thrive. The manuscript describes a novel method for studying the CF lung microbiome in an environment that mimics where they cause disease and how alterations of chemical conditions can drive microbial dynamics.

מודל ה- WinCF - מיקרוסקוס הזול והבלתי נסבל של ברונכייל מחובר ריר לחקר המיקרוביולוגיה של זיהומי ריאות

Many chronic airway diseases result in mucus plugging of the airways. Lungs of an individual with cystic fibrosis are an exemplary case where their ...