著者は、原稿の重要な読書のためのDumenilラボのすべてのメンバー、特にジルケ·シルバに感謝したいと思います。マホソットヨーロジョルジュ·ポンピドゥー（HEGP）での手術部門、デビッドMaladry。マイケルHivelin博士パトリックBruneval、HEGPの病理部。エリザベスユック率いるPARCCの動物施設、。この作品は、次のgrant機関によってサポートされていました：マリー·キュリーのIEFの交わりがない。 273223（KM）、INSERMからATIP-アベニールグラントは、CODDIM機器の助成金（イル=ド=フランス地方）、FRM機器の助成金、優秀コンソーシアムのIBEID研究所（財団はLA RECHERCHEmédicaleを注ぐ）、ANR助成金」（通信社国立ラ·ルシェルシュを注ぐ）バグ·イン·フロー」。資金提供者は、研究デザイン、データ収集と分析、公開することを決定、または原稿の準備に何の役割がありませんでした。

1。リスクと権限<ol><li> 地元の倫理委員会は、すべての動物のプロトコルを承認する必要があります。このプロトコルは、フランスやヨーロッパの実験動物の管理と使用に関する規制（Décrets87から848、2001から464、2001から486及び2001から131とによって確立されたガイドラインに基づいて実施された欧州指令2010/63/UE）とローカル倫理委員化委員会D&#39;ETHIQUEエンマチエールD&#39;実験ANIMALE、大学パリデカルト 、パリ、フランスで承認した。いいえ：CEEA34.GD.002.11ん。 </li><li>人間の肌のために、書面による通知を患者の同意を得て、すべての手順は、フランス国のガイドラインに従って実施し、地域の倫理委員会、 化委員会D&#39;評価ETHIQUEドゥINSERM IRB 00003888 FWA 00005881、パリ、フランス世論によって承認された：11から048 。 </li><li> 髄膜炎菌は、潜在的に有害な人間の病原体であるとORGAを取り扱う際に必要なすべての予防措置が取られなければならないNISM。これらの注意事項は、ワクチン接種が含まれており、バイオセーフティレベル2の条件の下で働く。 </li></ol> 2。皮膚移植<ol><li>できるだけ時間をグラフトに近い人間の皮膚を収集します。本研究では、皮膚の大部分は、腹部領域に関連する整形手術操作から来ている。乳房、脚、さらには顔の他のソースは、成功を収めて使用されている。 </li><li>好ましい流フードの下で、70％エタノールで皮膚表面を洗浄し、十分に洗浄された表面上に平らに横たわっによりヒト皮膚のサンプルを準備します。 </li><li>プリセット厚さの皮膚分節を用いて皮膚の上から200〜400程度のスライスをスライス。 </li><li>短期保存のための10％血清（3-12時間で、すぐにまたはDMEM中で4℃、グラフト化する場合には整合性のために、皮膚のスライスを確認し、2センチメートル×2センチメートルの正方形に切ると、（二価の陽イオンを含まない）PBS中に置く）。 </li><li>ケタミン（100 mg / kgの）およびキシラジン（10 mg / kg）の麟蹄で6〜8週齢のSCID.bgマウス（約20g）を麻酔しCTED IP </li><li>マウスを麻酔した後、つま先のピンチ、痛みの反射を確立するための標準的な方法を実行することによって、疼痛反応をチェック。角膜の乾燥を防ぎ、移植片が配置される肩の後ろに動物の左側を剃ることを目にゲルを適用します。作業中はヒートパッド上でマウスを暖かく保つ。 </li><li>手術のためにマウスを準備中した後、70％EtOHで剃毛エリアを清掃してください。 </li><li>移植部位（Tronothane）に局所局所麻酔を適用し、慎重に湾曲したハサミでマウスの皮膚の表層を除去することにより、移植部位を準備します。基礎となる血管系を破壊しないように注意してください。 </li><li>人間の皮膚切片の面積より少し小さい面積で皮膚を取り除きます。 </li><li> PBS（またはDMEM）から肌のスライスを削除し、移植床の上に置いて、表皮側が上を向いている保証されます。ステップ2.8から2.10に移植床が乾燥しない確実に、可能な限り迅速に行うべきである。 </li><li> 1角を合わせまたはEDGEおよび組織接着剤で固定します。慎重にエッジの周りに組織接着剤の少量を配置し、移植床に皮膚スライスの残りに合う。いつものサイズに、ヒトの皮膚をトリミングではなく、移植床を大きくしてください。 </li><li>マウスの皮膚は非常に柔軟であるとして移植床の上にきつすぎる肌を引っ張らないでください。 </li><li>移植片は各コーナーにおける組織接着剤で固定されていることを確認します。 </li><li>ヨウ素溶液で領域をきれいにします。 </li><li>移植片の上にクッション面積でバンドエイドを適用します。バンドエイドが企業が、タイトではなく、動物の呼吸に影響を与えないことを確認してください。 </li><li>ドレッシングテープでバンドエイドを修正します。 </li><li>動物は暖かい表面に回復することができます。 </li><li>目を覚ましたら、そのケージに動物を返します。動物はケージ当たり2-3に収容されている。 </li><li>痛みや苦痛の徴候のための回復中に定期的にマウスを確認してください。 10〜14日、移植後、移植片を破壊しないように注意しながら、バンドエイドを削除します。我々の経験では、術後の痛みはミニですMAL。それにもかかわらず、動物は操作の後、数日、特に毎日監視する必要があります。痛みや苦痛の基準は以下の通りである。 <ul><li> 10パーセント以上の重量の損失</li><li>物理的な外観、毛皮、せむしの位置、目</li><li>増加呼吸や心臓の料金</li><li>減少または異常な動き。 </li><li>体温の上昇</li><li>場合、疼痛の兆候が検出されたparacetamoleが（300 mg / kgを、4時間毎）を経口投与する。痛みが続く場合は人道的なエンドポイントは厳密に接着されている。 </li></ul></li><li>移植片が乾燥して見える場合はしなやかな肌を保つために2〜3日ごとにベビーオイルを適用します。 </li><li>移植片は、実験21日後に移植のための準備ができています。 </li></ol> 3。感染<ol><li>感染の前日には、適切な抗生物質を含むGCB寒天プレート上にストリークした細菌株を準備します。 5％CO 2中で37℃で一晩増殖させる。 </li><li> 細菌の準備 <ol&gt; <li> OD 600は0.05〜10％血清を有するヒト内皮SFM培地5mlのにReinoculate細菌。 </li><li>緩い蓋をインキュベーターで2時間（37℃、5％のCO 2）振とうしながら、約OD 600 0.1の細菌密度まで、インキュベートする。 </li><li> 3分15,000 rpmで細菌を遠心分離する。 </li><li> PBS中の上清と再懸濁を削除し、再度遠心する。 </li><li>二回の洗浄ステップ（2.2.4-2.2.5）を繰り返します。 </li><li> PBSに細菌ペレットを再懸濁します。 </li><li> OD 600を測定します。 </li><li> OD 600 0.1（10 8 CFU / ml）のいずれかの培養物、またはOD 600 1.0（10 9 CFU / ml）を作る。この既知の濃度から、10 7 CFU / mlに希釈する。できるだけ噴射時間に近い細菌を準備してみてください。 </li></ol></li><li> マウス <ol><li>マウスを秤量する。 </li><li>ケタミン（100 mg / kg）を、およびキシラジンでマウスを麻酔し（10 mg / kg）を腹腔内注射</li><li>一度眠って、C一体その疼痛反応は、熱パッドで暖かくマウスを保ち、乾燥を防ぐために眼軟膏を入れ、つま先のピンチによっては存在しない。 </li><li>各マウスに食塩水またはPBSに再懸濁ヒトトランスフェリン8mgのを与える、腹腔内注射</li><li>尾からの血液の小滴を取り、血液が感染前に滅菌されているチェックする寒天プレート上に広げた。 </li><li>静脈内に後眼窩または尾静脈から100μlを10 7 CFU / mlの細菌培養（10 6 CFUの合計）を注入。 5分後に注射を取っCFUの測定値に関係なく、注射部位に一致している。 </li><li>数分後、尾の端を切り取ると、すぐに感染後の血中のCFUを確立するための1 10倍希釈して、適切な抗生物質を含む寒天プレート上に血液サンプルを広げた。 </li><li>組織接着剤で尾を封印。 </li><li>注入後、細菌接種を希釈し、CFUを確立するために、適切な抗生物質を含む寒天プレート上に広げた。 </li><li>マウスを許可する彼らが移動になるまでヒートパッド上で回復さ</li><li> 6時間感染後に、尾部から少量の血液を引き出す希釈し、6時間後にCFUを確立するためにプレート。 </li><li> CO 2で一晩5％で37℃で、すべての寒天プレートをインキュベートする。 </li></ol></li></ol> 4。犠牲<ol><li>感染の選択された時に、ケタミン（100 mg / kg）をおよびキシラジンでマウスを麻酔した（10mg / kg）を腹腔内注射</li><li>眠っていると、熱パッドでマウスを暖かく保つ。 </li><li>痛みの反射が（つま先のピンチを）行っているときは、尾の先端を切り取ると血を引く。 </li><li>適切な抗生物質を含む寒天プレート上に血液を広め、5μlの直接およびCFUを確立するために、10μlの1:10希釈。 </li><li>頚椎脱臼によりマウスを生け贄に捧げる。 </li><li>すべての関連機関および倫理指針に従ってマウスを犠牲にした後に、ハートビートの欠如によって死亡が確認された。正中切開を行い、胸郭を切って、聞くに切開するT。 </li><li>滅菌チューブの心臓/胸腔と場所からできるだけ多くの血液を採取する。 </li><li>無菌プレートに臓器（ 例えば 、肝臓、脾臓、脳）を取り外します。 </li><li>無菌プレートに皮膚移植およびマウスの皮膚のセクションを削除します。 </li><li>マウス本体を処分。 </li><li>採取した血液を15分間凝固させされた後、3,000 rpmで15分間遠心分離して。 </li><li> ELISAまたはFACSベースの方法によるサイトカインの検出については、例えば、後の分析のために-80℃で、血液やストアから血漿を除去。 </li></ol> 5。臓器CFU計数<ol><li>各生検の前のサンプルを取ることに500μlのPBSを含む管を均質化量る。 </li><li>無菌の生検パンチを使用して各組織から4mmの生検サンプルを取る。 </li><li> 500μlのPBSを含む予め秤量均質化チューブに置いて生検。他の臓器には小さいビーズを使用し、2mmのビーズを用いて皮膚試料をホモジナイズする。 </li><li>残りのTを配置顕微鏡検査のために4℃で4％パラホルムアルデヒド（PFA）およびストア内の問題（以下参照）。 </li><li> （CFU / mgの組織のそれ以降の計算のために）生検の重量を確立するための生検を含むチューブを均質化量る。 </li><li>サンプルを均質化する。 <ol><li> 30秒間6,000 rpmで、肝臓、脾臓および脳を均質化する。 </li><li> 30秒間6,000 rpmで皮膚サンプルを均質化し、必要に応じて繰り返します。 </li></ol></li><li>寒天プレート上に各均質化チューブから希釈液を広げ、器官CFUカウントを確立するために、5％CO 2中で37℃で一晩増殖する。 </li></ol> 6。組織学/免疫組織化学<ol><li> 固定 <ol><li> 4℃で一晩4％PFA中の組織を修正しました。固定工程は長くなる場合があり、長期間保存するには、0.25％PFAで組織を配置した場合。 </li><li> PBSに組織を洗い流してから、20％ショ糖溶液中に置き、一晩または組織が溶液中に沈んするまで4℃に戻ります。 </li><li> （組織型の中で、またはベースボードに接着さのいずれか）のサイズと10月溶液中の場所にカットし、PBS中で組織を洗浄します。 </li><li>すぐに液体窒素中に浮遊するペトリ皿上で組織を凍結する。 </li><li>凍結後、保存のために-80℃に移す前に、ドライアイスの上に組織を置く。 </li></ol></li><li> スライシング <ol><li> -80°Cから組織を取り出して、クライオスタットに-20℃に平衡化させる。 </li><li>スライス約10〜15ミクロンの厚さの組織とは、コーティングされた顕微鏡スライド上に配置します。 </li><li>必要になるまでストアは-20℃でスライドさせる。 </li></ol></li><li> 染色 <ol><li>スライドを室温に戻します。 </li><li>疎水性のペンでスライド上のスライスを中心に描く。 5〜10分待ちます。 </li><li> 5分間PBS中/洗浄スライスを再水和、二回繰り返します。 </li><li> 10分間、PBS中0.1％トリトンにおける透過処理スライス。 </li><li> 5分間、PBS 2〜3倍に洗浄します。 </li><li> PBS中のブロック10〜60分の間で使用される抗体又は汚れに応じて0.1％トリトン1％BSA。 </li><li>ブロッキングバッファー外し、ブロックバッファに必要に応じて希釈した一次抗体を加える。決められた時間インキュベートする。 （多くの場合、室温で1時間、または一晩4℃）。 </li><li> 5分間、PBS 2〜3倍に洗浄します。 </li><li>ボックバッファ内の適切に希釈した二次抗体を適用し、DAPIは、一般的に、このステップに含まれています。暗闇の中で、決められた時間、多くの場合、1〜2時間室温でインキュベート。 </li><li> 5分間、PBS 2〜3倍に洗浄します。 </li><li>マニキュアでカバーガラスとシールで封入剤を保護するフェードインマウント。 </li><li> 4℃でのイメージ染色スライド直ちにまたはストア</li><li>使用蛍光団への適切なフィルター/レーザーを使用して設定または共焦点蛍光顕微鏡で撮影を行う。 </li></ol></li><li> 組織学 <ol><li>スライドを室温になるまで組織学のために使用することができます。 </li><li>として使用して染色スライドtandardヘマトキシリン​​/エオシン染色プロトコル。 <ol><li>スライドラックにスライドを置きます。 </li><li>次の順序でソリューション間のスライドラックを移す。 </li><li>水道水に2秒。 </li><li>フィルタリングヘマトキシリン​​溶液中で3分。 </li><li>流水に10秒。 </li><li>蒸留水に10秒。 </li><li>エタノール100パーセントに10秒。 </li><li>フィルタリングエオシンに2秒。 </li><li>流水に10秒。 </li><li>エタノール100パーセントに10秒</li><li>キシレン×3（バスI、II、III）に2分。 </li><li>すぐに転送して、各スライド上にトップの上に置いてカバースリップを固定接着剤を数滴を追加し、気泡を除去、数時間乾燥させます。 </li><li>画像は、標準的な白色光顕微鏡下でスライドする。 </li></ol></li></ol></li></ol>

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著者らは、競合する経済的利益を宣言していません。

動物モデルは、細菌の病原性の研究に非常に重要である。それは完全に細胞培養におけるin vivo環境を模倣することは不可能であり、それは、宿主-病原体相互作用は、多くの動的要因によって影響されることが明らかになってきている。このようなNのようないくつかの臨床的に重要な病原体の人間の特異性髄膜炎は 、HIV、HCV、 熱帯熱マラリア原虫、リステリア·モノサイトゲネス、及びチフス菌は、これらの感染症のためのin vivoモデルの使用が制限されている。我々は、感染ステップが、特異に関与しているかを理解し始めるように、しかし、ヒト化モデルが開発されている。ここで説明するプロトコルは、Nの生体内感染で豊富を考慮して、マウスへのヒト微小血管の導入に伴い、このデモで髄膜炎は 、血管損傷、時には紫斑発疹の開発をもたらし。 このモデルを用いて、我々のTfpの接着性細菌の変異体を使用し、血管損傷、接着18の非存在下で減少することが、インビボでの血管コロニー形成に関与していることを定義することができた。以前は、循環細菌産物は、この損傷に関与しているが、我々の結果は、地元密着性と血管コロニー形成のために決定的な役割を示唆している。これは新たな治療ターゲットの開発のための新しい可能性を開きます。病原性細菌の付着は、薬学的にブロックすることができれば、それはおそらく皮膚病変の発症を予防し、組織の壊死、壊死組織切除および切断の点で髄膜炎菌の生存者のためのより良い成果につながる可能性があります。仕事はまた、感染の複雑さと、免疫応答および凝固カスケードの関与を実証しています。我々は、本ヒト内皮18の比較的少量にもかかわらず、感染したマウスの血清中のヒトサイトカインシグナル伝達を同定した。これは、領域内にマウスの免疫細胞集団の浸透に伴って、有意なサイトカイン応答を示した。 動物モデルは、もちろん完全にヒトの疾患を複製することはできませんし、すべての結果はこのことを考慮して検討する必要があり、そこから集めました。例えば、このモデルでは、血液や循環細胞は、マウス由来のものであり、私たちは、彼らが人間の細胞に異なる挙動を示すことが軽視することはできません。この利点は、しかしながら、我々の最近の刊行物18に示されているように、循環するマウス細胞とは、ヒト内皮から発信シグナリング分化する能力である。このモデルで用いたマウスの免疫無防備状態のバックグラウンドは、さらに「ヒト化」局面を添加し、ヒト免疫細胞集団の同種転写を可能にするであろう。マウスの免疫不全の背景には、しかし、このすべてのモデルに欠けや不良NK、TまたはB細胞の役割をマスクすることができる。比較的ショアこのモデルで使用されるTの時間枠（24時間）は、主に生得的反応に関係しますが、長期的な感染症や免疫、その他のオプションの開発のために検討される必要があるかもしれない。 皮膚はNのための重要な感染部位である髄膜炎菌が、ヒトの血管の比較的少量を有し、また、多数の器官が関与する全身感染にデータを外挿することは困難であることを意味する。このモデルは、皮膚病変の開発の研究を可能にしながら、このような上皮および血液脳交差点などの髄膜炎菌感染症の重要なステップが含まれていません。これらのヒト化モデルのさらなる開発は、感染のこれらの他の側面に対処するために必要とされる。それにもかかわらず、このモデルでは、多数のヒトの特定の病原体、血管をターゲットに、特にそれらのための大きな可能性を提供しています。

髄膜炎菌性敗血症は、細菌性病原体、髄膜炎菌によって引き起こされ、頻繁に致命的な血液由来感染症です。以前に細菌や細菌産物1を循環させることによって引き起こされる血管の破壊に関連していた彼らの皮膚に点状出血や紫斑発疹と共に存在しばしば髄膜炎菌性敗血症患者。臨床患者から皮膚生検は、多くの場合、血管2を充填、微細血管に関連する細菌を示しています。離れて細菌から、広範な血栓症、凝固、渋滞や血管漏出はプルプルの地域3〜5に見られる。この血管の損傷は、髄膜炎菌の生存者でのデブリードマンおよび切断で、その結果、皮膚や周囲の組織の広範な壊死が引き起こされ得る。感染はこの血管損傷の原因とどのように理解することは、予防と治療戦略を最適化することが重要である。髄膜炎菌性敗血症の研究の大半は上のin vitroで行われているNの人間の特異性に起因するヒト細胞株髄膜炎菌 。感染の多くの側面は、細菌の接着、宿主細胞応答ならびにサイトカイン応答6-9を含むin vitroで研究されている。 IV型線毛（TFP）は、Nの主要な接着細胞小器官として関与している髄膜炎菌は、上皮細胞および内皮細胞の両方で10。またN.の付着が示されている宿主細胞への髄膜炎菌は、せん断応力に依存し、従って、微小血管11内の血流速度に関連すると考えられている。これは、細菌が生体内で直面する動的応力が病因に重要であるを示唆している。これは、 インビトロで小血管の微小環境をモデル化するが非常に困難である。 ナイセリア Tfpのための接着受容体はまだ不明であり、したがって、動物モデルにおける細菌の付着を達成するノックイン戦略は、現時点で想定することはできない。 CD46はTfpの受容体であることが示唆されたトランスジェニック動物は、マウスモデルとして作用するように作製した。しかし、これらの動物における感染は、大規模な感染につながるものではないか、開発12,13発疹する。 ナイセリア感染菌血症の態様に関して記載されている他の動物モデルは、鉄源14,15として考慮ヒトトランスフェリンのための細菌嗜好を取る。ヒトトランスフェリンを補充するか、長時間にわたって血流中の増加した細菌負荷における導入遺伝子の結果からそれを発現するが、このモデルは、細菌の接着または発疹現像16,17を示していないのいずれか。 このプロトコルでは、皮膚の微小血管系を含むヒトの皮膚は、免疫不全マウス18,19に移植されたヒト化マウスモデルを記載している。これは、マウスの循環で灌流機能性ヒト血管になる。ヒトトランスフェリン補充と組み合わせることで、このModelはN.ヒトの特定の側面の少なくとも二つを占める生体内環境における髄膜炎菌、すなわち 、ヒト内皮およびヒトトランスフェリン、。N.髄膜炎は 、血管損傷や紫斑発疹の開発18を含む臨床患者で報告されているものに似ている病理を生産する、人間の内皮に特異的に接着し、このモデルに静脈内に導入された。

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Gibco Invitrogen</td><td>31885-023</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline</td><td>Gibco Invitrogen</td><td>10010-056</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine 500</td><td>Virbac France</td><td></td><td>lot no. VAL4243</td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Bayer Healthcare</td><td>AMM N&amp;deg; FR/8146715 2/1980</td><td>lot no. KPO809S</td></tr><tr><td>Optigel&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Europhta</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lacrigel&amp;nbsp;</td><td>Medicament Autoris&amp;eacute;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tronothane</td><td>Lisa Pharma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GC agar base</td><td>Conda</td><td>1106</td><td></td></tr><tr><td>Human endothelium SFM media</td><td>Gibco Invitrogen</td><td>11111</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>P A A</td><td>A15-101</td><td></td></tr><tr><td>Human transferrin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3309</td><td></td></tr><tr><td>UEA lectin - rhodamine</td><td>Vector Labs</td><td>RL-1062</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxylin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9627</td><td></td></tr><tr><td>Eosin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4009</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>534056</td><td></td></tr><tr><td>Sober Hand Dermatome</td><td>Humeca BV, Holland</td><td>4.SB01</td><td></td></tr><tr><td>Animal housing</td><td>Innovive</td><td>M-BTM-C8</td><td></td></tr><tr><td>Biopsy punch (4 mm)</td><td>Dominic Dutscher</td><td>30737</td><td></td></tr><tr><td>Fast-Prep lysing matrix M tubes</td><td>MP Bio</td><td>116923050</td><td></td></tr><tr><td>MagNA Lyzer Green Beads</td><td>Roche</td><td>3358941001</td><td></td></tr><tr><td>MagNA Lyzer</td><td>Roche</td><td>3358976001</td><td></td></tr><tr><td>VECTASHIELD mounting media</td><td>Vector Labs</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Vetbond</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td>Tissue Glue</td></tr><tr><td>OCT tissue tek</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td></td></tr></tbody></table>

humanized mouse model to study bacterial infections targeting the microvasculature

髄膜炎菌は、ヒトの血流に入る重度の、しばしば致命的な敗血症を引き起こす。感染症は、血管漏出、紫斑発疹および最終的な組織壊死の発症をもたらす血管の甚大な被害をもたらす。この感染症の病因を研究する以前にin vivoモデルを困難にして細菌の人間の特異性によって制限されていました。このプロトコルでは、人間の皮膚、皮膚微小血管を含むが、免疫不全のマウスに移植されているこの感染ヒト化モデルについて説明します。それらのヒトの特徴を維持しながら、これらの血管は、マウスの循環に吻合。このモデルでは、Nに導入されると髄膜炎菌は、広範な血管損傷、炎症や紫斑発疹のいくつかのケースでは、開発中で、その結果、人間の血管に独占的に準拠しています。このプロトコルは、コンテでのこのモデルの移植、感染および評価の手順を説明しますNのXT 髄膜炎菌感染症。技術は、血流に感染する多数のヒト特異的病原体に適用することができる。

CFU計数 N.これらの代表的な結果で使用される髄膜炎菌株は、Nである。にOPC - - 、PilC1 + / PilC2 +20 膜炎 8013クローン12、血清群Cの臨床分離株では、私はSBピリン、オーパクラスを表現する。株は染色体挿入部18から緑色蛍光タンパク質（GFP）を発現するように操作されていた。細菌のコロニー形成単位数を寒天プレート上のコロニーの数を計数し、血液のCFU / mlまたはメッキ既知の容量からの組織のCFU / mgのいずれかを計算することによって確立される。血球数は、5分、10 6 CFUの細菌の静脈注射後に血液中を循環する1.5×10 5 CFU / mLの平均値（ 図1A）があったことを示した。 6時間後にカウントが4.8×10 4 CFU / mlの平均。 24時間別の平均数は、4 CFU / mlのX 10 2.4であったが、10匹のマウスのグループで、5は持っていた検出可能な他の5が比較的高いカウント（ 図1A）を持っていたが、細菌を循環させる。皮膚サンプルから取られたCFU計数は、6時間および24時間（ 図1B）での組織の4.4×10 2 CFU / mgである組織の2.1×10 4 CFU / mgの平均化、人間の皮膚にかなりの数を持つマウスの大部分を示している。反対マウス皮膚試料は、N.のための強い優先性を示す、24時間および6時間で非常に低い数でなく細菌数を示さなかった移植皮膚（ 図1B）における人間の血管への髄膜炎 。一般細菌数では2匹の動物は、彼らが高い循環細菌数（ 図1C）と相関したように、血液からの汚染に起因する可能性を示してカウントをしたが、サンプリングされた他の臓器で検出不能と非常に低かった。モデルはまた、IV型πを、例えば、 インビボでの病原性因子の役割を決定するために使用することができる李。提案Tfpの「付着因子」を欠いている細菌Tfpのを欠損株をもたらしpilD遺伝子 21において定義された変異を有する株だけでなく、pilC1遺伝子 8は 、モデルに導入した。これらの変異は、TFPは、生体内（ 図1D） での接着で再生されている重要な役割を確認し、ヒト皮膚移植片無し細菌の付着が生じた。 免疫組織化学/組織学これらの実験において、我々は、N.使用二次染色を必要とせずに蛍光検出を可能にするために緑色蛍光タンパク質（GFP）を発現する髄膜炎菌株 。ヒト血管は、ヒト内皮細胞のマーカーのいずれかを用いてCD31（PECAM-1）またはレクチンハリエニシダのハリエニシダ凝集素 （UEA）18,22を染色した。 UEAは、一工程染色（ 図2A-C）を可能ローダミンとコンジュゲートした。細胞核を染色することができますDAPIでEDは組織構造（ 図2A-B）を識別するのに役立つ。 組織学は、標準的なヘマトキシリン​​/エオシン染色を用いて行った。皮膚の表皮/真皮境界線は明確に識別した。炎症、血栓症および血管漏出は24時間感染（ 図2D）の後に、この国境に近い血管に濃縮した。血栓症は、多くの場合、渋滞や炎症を伴ういくつかの小さな皮膚血管に見えた。組織への赤血球の漏出うち血管損傷の広範なレベルを示す、見ることができた。非感染マウスでの移植皮膚の組織病 ​​理なしに区別炎症18で正常に見えた。感染の約30％において皮膚の細菌の付着は、肉眼で検出可能な紫斑病（ 図2Eおよび2F）の開発につながる。 <img alt="図1" fo:content-width=<html> SRC = &quot;/ files/ftp_upload/51134/51134fig1highres.jpg&quot; SRC = &quot;/ files/ftp_upload/51134/51134fig1.jpg&quot; /&gt;：FO &quot;5インチ&quot; 図1。 CFUカウントされます。（A）5分、6時間、および24時間後の感染における血液のミリリットル当たりの細菌CFU計数。 （B）細菌CFU 6時間および24時間感染後の両方で、ヒト皮膚（HS）とマウス皮膚（MS）とを比較する皮膚試料からカウントする。 （C）細菌CFUを24時間後に感染を講じ、他の器官からカウントします。野生型N.に感染したマウスから24時間感染後に採取ヒトおよびマウスの皮膚サンプルからの細菌CFUカウントを比較すると（D） 髄膜炎菌 2C43染色（WT）、pilD遺伝子 （pilD）またはpilC1遺伝子 （pilC1）に変異を有する株に変異した株。すべてのグラフは、中央値で生データとして表示されます。図はMelican らから変更されている。18&quot;_blank&quot;&gt;拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。 <img alt="図2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51134/51134fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51134/51134fig2.jpg" /> 図2。真皮（D）表皮（E）の国境に近い、UEAレクチン（赤）で染色したヒト微小血管を示す共焦点スタックの顕微鏡。（A）は、投影。容器は、Nに感染している髄膜炎菌 （緑）2時間後に感染。 （B）の光のスライスとNを示すスライス投影（C） 髄膜炎菌の微小コロニー（緑）感染のヒト血管（UEA -赤）皮膚移植2時間後感染中。 N.で24時間感染させたヒト皮膚移植片の（D）ヘマ ​​トキシリン/エオシン染色髄膜炎菌 。表皮（e）は、真皮（D）の境界線がはっきりと見えると豊富な血栓症およびmicrovessの混雑ですELS（矢印）は、真皮に見られる。炎症およびいくつかの血管漏出（矢頭）も同定することができる。 （E）の感染前に人間の皮膚移植。 （F）Nの（E）の 24時間後に感染と同じ皮膚移植プルプル領域（矢印）を示す膜炎は、 図2（b）は、2D、2E、および2Fは Melican ら 18から変更されている図 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51134/51134fig2highres.jpg" target="_blank">拡大画像を表示するには、ここをクリックし</a> 。

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Humanized Mouse Model to Study Bacterial Infections Targeting the Microvasculature

髄膜炎菌は、血管に感染するヒト特異的病原体である。このプロトコルでは、ヒト微小血管は、免疫不全マウスにヒト皮膚を移植することによってマウスに導入される。細菌は、典型的には、ヒトの場合に観察紫斑発疹の血管損傷と発展につながる、人間の血管に広く付着する。

微小血管系を対象に細菌感染を研究するためのヒト化マウスモデル

Neisseria meningitidis causes a severe, frequently fatal sepsis when it enters the human blood stream. Infection leads to extensive damage of the blood ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

14.8K ビュー.  Paris Cardiovascular Research Centre.  髄膜炎菌は、血管に感染するヒト特異的病原体である。このプロトコルでは、ヒト微小血管は、免疫不全マウスにヒト皮膚を移植することによってマウスに導入される。細菌は、典型的には、ヒトの場合に観察紫斑発疹の血管損傷と発展につながる、人間の血管に広く付着する。 

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Real-time Imaging of Heterotypic Platelet-neutrophil Interactions on the Activated Endothelium During Vascular Inflammation and Thrombus Formation in Live Mice

Interaction of activated platelets and leukocytes (mainly neutrophils) on the activated endothelium mediates thrombosis and vascular inflammation.1,2 During thrombus formation at the site of arteriolar injury, platelets adherent to the activated endothelium and subendothelial matrix proteins support neutrophil rolling and adhesion.3 Conversely, under venular inflammatory conditions, neutrophils adherent to the activated endothelium can support adhesion and accumulation of circulating platelets. Heterotypic platelet-neutrophil aggregation requires sequential processes by the specific receptor-counter receptor interactions between cells.4 It is known that activated endothelial cells release adhesion molecules such as von Willebrand factor, thereby initiating platelet adhesion and accumulation under high shear conditions.5 Also, activated endothelial cells support neutrophil rolling and adhesion by expressing selectins and intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), respectively, under low shear conditions.4 Platelet P-selectin interacts with neutrophils through P-selectin glycoprotein ligand-1 (PSGL-1), thereby inducing activation of neutrophil &beta;2 integrins and firm adhesion between two cell types. Despite the advances in in vitro experiments in which heterotypic platelet-neutrophil interactions are determined in whole blood or isolated cells,6,7 those studies cannot manipulate oxidant stress conditions during vascular disease. In this report, using fluorescently-labeled, specific antibodies against a mouse platelet and neutrophil marker, we describe a detailed intravital microscopic protocol to monitor heterotypic interactions of platelets and neutrophils on the activated endothelium during TNF-&alpha;-induced inflammation or following laser-induced injury in cremaster muscle microvessels of live mice.

Here we report an experimental technique of fluorescence intravital microscopy to visualize heterotypic platelet-neutrophil interactions on the activated endothelium during vascular inflammation and thrombus formation in live mice. This microscopic technology will be valuable to study the molecular mechanism of vascular disease and to test pharmacologic agents under pathophysiological conditions.

生きたマウスにおける血管炎症及び血栓形成の間に活性化内皮上に異型血小板、好中球の相互作用のリアルタイムイメージング

Interaction of activated platelets and leukocytes (mainly neutrophils) on the activated endothelium mediates thrombosis and vascular inflammation.1,2 ...

免疫・感染学

A Mouse Model for Pathogen-induced Chronic Inflammation at Local and Systemic Sites

Chronic inflammation is a major driver of pathological tissue damage and a unifying characteristic of many chronic diseases in humans including neoplastic, autoimmune, and chronic inflammatory diseases. Emerging evidence implicates pathogen-induced chronic inflammation in the development and progression of chronic diseases with a wide variety of clinical manifestations. Due to the complex and multifactorial etiology of chronic disease, designing experiments for proof of causality and the establishment of mechanistic links is nearly impossible in humans. An advantage of using animal models is that both genetic and environmental factors that may influence the course of a particular disease can be controlled. Thus, designing relevant animal models of infection represents a key step in identifying host and pathogen specific mechanisms that contribute to chronic inflammation.
Here we describe a mouse model of pathogen-induced chronic inflammation at local and systemic sites following infection with the oral pathogen Porphyromonas gingivalis, a bacterium closely associated with human periodontal disease. Oral infection of specific-pathogen free mice induces a local inflammatory response resulting in destruction of tooth supporting alveolar bone, a hallmark of periodontal disease. In an established mouse model of atherosclerosis, infection with P. gingivalis accelerates inflammatory plaque deposition within the aortic sinus and innominate artery, accompanied by activation of the vascular endothelium, an increased immune cell infiltrate, and elevated expression of inflammatory mediators within lesions. We detail methodologies for the assessment of inflammation at local and systemic sites. The use of transgenic mice and defined bacterial mutants makes this model particularly suitable for identifying both host and microbial factors involved in the initiation, progression, and outcome of disease. Additionally, the model can be used to screen for novel therapeutic strategies, including vaccination and pharmacological intervention.

Animal models have proven to be invaluable tools in defining host and pathogen specific mechanisms that contribute to the development of chronic inflammation. Here we describe a mouse model of oral infection with the human pathogen Porphyromonas gingivalis and detail methodologies to assess the progression of inflammation at local and systemic sites.

局所および全身所における病原体により誘導される慢性炎症のためのマウスモデル

Chronic inflammation is a major driver of pathological tissue damage and a unifying characteristic of many chronic diseases in humans including ...

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of the host depends on the involvement of an adapted immune response against the pathogen1. Immune response is complex and results from interaction of the pathogens and several immune or non-immune cellular types2. In vitro studies cannot characterise these interactions and focus on cell-pathogen interactions. Moreover, in the airway3, particularly in patients with suppurative chronic lung disease or in mechanically ventilated patients, polymicrobial communities are present and complicate host-pathogen interaction. Pseudomonas aeruginosa and Candida albicans are both problem pathogens4, frequently isolated from tracheobronchial samples, and associated to severe infections, especially in intensive care unit5. Microbial interactions have been reported between these pathogens in vitro but the clinical impact of these interactions remains unclear6. To study the interactions between C. albicans and P. aeruginosa, a murine model of C. albicans airways colonization, followed by a P. aeruginosa-mediated acute lung infection was performed.

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

While in vitro study of host-pathogen interactions allow the characterization of specific immune responses, in vivo models are required to observe the effects of complex responses. Using Candida albicans exposure followed by Pseudomonas aeruginosa-mediated lung infection, we established a murine model of microbial interactions involved in ventilator-associated pneumonia pathogenicity.

微生物群集を学びます<em&gt;インビボ</em&gt;：ホスト間の媒介の相互作用のモデル<em&gt;カンジダ</em&gt;と<em&gt;緑膿菌</em&gt;航空で

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of ...

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in vivo is crucial for understanding the molecular basis of leukocyte transendothelial migration and interaction with vascular endothelium. One powerful approach involves intravital microscopy on transgenic mice expressing fluorescent proteins in cells of interest.
Here we present a protocol for imaging monocytes and neutrophils in the CX3CR1gfp/wt mouse i.v. injected with orange dye-labeled neutrophils with an inverted confocal microscope. Time-lapse movies gathered from 30 min&#160;to several hours of imaging allow the analysis of leukocyte behavior in mesenteric veins under both steady state and inflammatory conditions. We also describe the steps to locally induce blood vessel inflammation with TLR2/TLR1 agonist Pam3SK4 and monitor the subsequent recruitment of neutrophils and monocytes.
The presented technique can also be used to monitor other populations of leukocytes and investigate molecules implicated in leukocyte recruitment or trafficking using other stimuli or transgenic mice.

We detail a protocol to monitor the behavior of neutrophils and monocytes in mesenteric veins under steady state and inflammatory conditions using intravital confocal microscopy on anaesthetized mice.

リアルタイムで麻酔したマウスに生体顕微鏡により腸間膜静脈に好中球および単球のイメージング

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

Bioengineering Human Microvascular Networks in Immunodeficient Mice

The future of tissue engineering and cell-based therapies for tissue regeneration will likely rely on our ability to generate functional vascular networks in vivo. In this regard, the search for experimental models to build blood vessel networks in vivo is of utmost importance 1. The feasibility of bioengineering microvascular networks in vivo was first shown using human tissue-derived mature endothelial cells (ECs) 2-4; however, such autologous endothelial cells present problems for wide clinical use, because they are difficult to obtain in sufficient quantities and require harvesting from existing vasculature. These limitations have instigated the search for other sources of ECs. The identification of endothelial colony-forming cells (ECFCs) in blood presented an opportunity to non-invasively obtain ECs 5-7. We and other authors have shown that adult and cord blood-derived ECFCs have the capacity to form functional vascular networks in vivo 7-11. Importantly, these studies have also shown that to obtain stable and durable vascular networks, ECFCs require co-implantation with perivascular cells. The assay we describe here illustrates this concept: we show how human cord blood-derived ECFCs can be combined with bone marrow-derived mesenchymal stem cells (MSCs) as a single cell suspension in a collagen/fibronectin/fibrinogen gel to form a functional human vascular network within 7 days after implantation into an immunodeficient mouse. The presence of human ECFC-lined lumens containing host erythrocytes can be seen throughout the implants indicating not only the formation (de novo) of a vascular network, but also the development of functional anastomoses with the host circulatory system. This murine model of bioengineered human vascular network is ideally suited for studies on the cellular and molecular mechanisms of human vascular network formation and for the development of strategies to vascularize engineered tissues.

Here, we describe a methodology to deliver human cord blood-derived endothelial colony-forming cells (ECFCs) and bone marrow-derived mesenchymal stem cells (MSCs), embedded in a collagen/fibronectin gel, subcutaneously into immunodeficient mice. This cell/gel combination generates a human vascular network that connects with the mouse vasculature.

免疫不全マウスにおける生体工学ヒト微小血管ネットワーク

The future of tissue engineering and cell-based therapies for tissue regeneration will likely rely on our ability to generate functional vascular networks ...

生物学

A Mouse Model to Assess Innate Immune Response to Staphylococcus aureus Infection

Staphylococcus aureus (S. aureus)&#160;infections, including methicillin resistant stains, are an enormous burden on the healthcare system. With incidence rates of S. aureus infection climbing annually, there is a demand for additional research in its&#160;pathogenicity. Animal models of infectious disease advance our understanding of the host-pathogen response and lead to the development of effective therapeutics. Neutrophils play a primary role in the innate immune response that controls S. aureus infections by forming an abscess to wall off the infection and facilitate bacterial clearance; the number of neutrophils that infiltrate an S. aureus skin infection often correlates with disease outcome. LysM-EGFP mice, which possess the enhanced green fluorescent protein (EGFP) inserted in the Lysozyme M (LysM) promoter region (expressed primarily by neutrophils), when used in conjunction with in vivo whole animal fluorescence imaging (FLI) provide&#160;a means of quantifying neutrophil emigration noninvasively and longitudinally into wounded skin. When combined with a bioluminescent S. aureus strain and sequential in vivo whole animal bioluminescent imaging (BLI), it is possible to longitudinally monitor both the neutrophil recruitment dynamics and in vivo bacterial burden at the site of infection in anesthetized mice from onset of infection to resolution or death. Mice are more resistant to a number of virulence factors produced by S. aureus that facilitate effective colonization and infection in humans. Immunodeficient mice provide a more sensitive animal model to examine persistent S. aureus infections and the ability of therapeutics to boost innate immune responses. Herein, we characterize responses in LysM-EGFP mice that have been bred to MyD88-deficient mice (LysM-EGFP&#215;MyD88-/- mice) along with wild-type LysM-EGFP mice to investigate S. aureus skin wound infection. Multispectral simultaneous detection enabled study of neutrophil recruitment dynamics by using in vivo FLI, bacterial burden by using in vivo BLI, and wound healing longitudinally and noninvasively over time.

A Mouse Model to Assess Innate Immune Response to Staphylococcus aureus Infection

An approach is described for real-time detection of the innate immune response to cutaneous wounding and Staphylococcus aureus infection of mice. By comparing LysM-EGFP mice (which possess fluorescent neutrophils) with a LysM-EGFP crossbred immunodeficient mouse strain, we advance our understanding of infection and the development of approaches to combat infection.

マウスのモデルを評価する生得の免疫反応黄色ブドウ球菌感染症

Staphylococcus aureus (S. aureus)&#160;infections, including methicillin resistant stains, are an enormous burden on the healthcare system. With incidence ...

Isolation of Splenic Microvesicles in a Murine Model of Intraperitoneal Bacterial Infection

Microvesicles (MVs) are submicron fragments released from the plasma membrane of activated cells that act as proinflammatory and procoagulant cellular effectors. In rats, spleen MVs (SMVs) are surrogate markers of pathophysiological conditions. Previous in vitro studies demonstrated that Porphyromonas gingivalis (P. gingivalis), a major periodontal pathogen, enables&#160;the endothelial shedding and apoptosis while lipopolysaccharide (LPS) favors the shedding of splenocyte-derived microvesicles (SMVs). In vivo studies showed the feasibility of pharmacological control of SMV shedding. The present protocol establishes a standardized procedure for isolating splenic SMVs from the P. gingivalis acute murine infection model.&#160;P. gingivalis infection was induced in young C57BL/6 mice by intraperitoneal injection (three injections of 5 x 107 bacteria/week). After two weeks, the spleens were collected, weighed, and the splenocytes were counted. SMVs were isolated and quantified by protein, RNA, and prothrombinase assays. Cell viability was assessed by either propidium iodide or trypan blue exclusion dyes. Following splenocyte extraction, neutrophil counts were obtained by flow cytometry after 24 h of splenocyte culture. In P. gingivalis-injected mice, a 2.5-fold increase in spleen weight and a 2.3-fold rise in the splenocyte count were observed, while the neutrophils count was enhanced by 40-folds. The cell viability of splenocytes from P. gingivalis-injected mice ranged from 75%-96% and was decreased by 50% after 24 h of culture without any significant difference compared to unexposed controls. However, splenocytes from injected mice shed higher amounts of MVs by prothrombinase assay or protein measurements. The data demonstrate that the procoagulant SMVs are reliable tools to assess an early spleen response to intraperitoneal&#160;P. gingivalis infection.

Microvesicles shed from the plasma membrane act as cellular effectors. Spleen microvesicles (SMVs) are surrogate markers of pathophysiological conditions. In rats and mice, SMV content and properties characterize aging or inflammation and are altered by cytoprotective treatments, making them a valuable yet abundant monitoring tool for preclinical research.

Microvesicles (MVs) are submicron fragments released from the plasma membrane of activated cells that act as proinflammatory and procoagulant cellular ...

Monitoring Neutrophil Recruitment Dynamics and Bacterial Burden at the Infection Site in a Murine Model

Source: Anderson, L. S., et al. <a href="https://app.jove.com/v/59015">A Mouse Model to Assess Innate Immune Response to Staphylococcus aureus Infection.</a> J. Vis. Exp. (2019).
This video demonstrates in vivo imaging to study the neutrophil recruitment dynamics at an infection site in an immunocompromised, transgenic mouse with GFP-expressing neutrophils. It involves injecting luminescent bacteria to cause an infection. This leads to neutrophil recruitment to the infection site, whose tracking is done by imaging.

マウスモデルにおける感染部位における好中球動員動態と細菌負荷のモニタリング

Source: Anderson, L. S., et al. A Mouse Model to Assess Innate Immune Response to Staphylococcus aureus Infection. J. Vis. Exp. (2019).
This video ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

免疫学

免疫反応

ホスト防御メカニズム

A Murine Skin Wound Infection Model to Study the Immune Response against a Bacterial Pathogen

Source: Anderson, L. S., et al. <a href="https://app.jove.com/v/59015">A Mouse Model to Assess Innate Immune Response to Staphylococcus aureus Infection.</a> J. Vis. Exp. (2019).
This video demonstrates a technique to generate a murine model of skin wound infection. Upon infecting mice &#8212; engineered to express a fluorescent protein in neutrophils &#8212; with a genetically modified bioluminescent Staphylococcus aureus &#8212; a pathogenic bacteria. The bacterial burden at the infection site and the neutrophil recruitment dynamics can be studied using whole animal imaging.

細菌性病原体に対する免疫応答を研究するためのマウス皮膚創傷感染モデル

免疫病理学

宿主-病原体相互作用モデル

Intravital Microscopy to Analyze Blood Cell-Endothelial Interactions in an Inflammation Mouse Model

Source: Herr, N. et al., <a href="https://app.jove.com/v/53077">Intravital Microscopy of Leukocyte-endothelial and Platelet-leukocyte Interactions in Mesenterial Veins in Mice.</a> J. Vis. Exp. (2015)
In this video, we demonstrate the real-time visualization of blood cell-endothelial interactions in the mesenterial veins of a mouse model injected intraperitoneally with lipopolysaccharide.

炎症マウスモデルにおける血球-内皮相互作用を分析するための生体内顕微鏡法

Source: Herr, N. et al., Intravital Microscopy of Leukocyte-endothelial and Platelet-leukocyte Interactions in Mesenterial Veins in Mice. J. Vis. Exp. ...