Este trabajo fue parcialmente financiado por el NIH subvención K99EB009096-01A1 a JM-M.

1. Preparación <ol><li> Hacer EGM-2 medianas (500 ml) <ul><li> Añadir 100 ml de suero fetal bovino (SFB) a 395 ml de medio basal endotelial (EBM-2). </li><li> Añadir 5 ml de 100x-Glutamina solución de penicilina-estreptomicina (GPS). </li><li> Agregue todos los 2 EGM-SingleQuots suplementos a excepción de hidrocortisona (es decir, VEGF, hFGF B, R-IGF-1, hEGF, heparina, ácido ascórbico, y GA-1000). </li><li> Esterilizada por filtración con un filtro de 0,2 micras de poro-vacío de tamaño. </li></ul></li><li> Haz medio MSCGM (500 ml) <ul><li> Añadir 5 ml de GPS 100x a 440 ml de medio basal de células madre mesenquimales (MSCBM). </li><li> Añadir todo el contenido del kit MSCGM SingleQuots. </li><li> Añadir hFGF-B alícuota del EGM-2 suplementos SingleQuots. </li><li> Esterilizada por filtración con un filtro de 0,2 micras de poro-vacío de tamaño. </li></ul></li><li> Haz medio DMEM (500 ml) <ul><li> Agregar 50 ml de suero fetal bovino (FBS) a 440 ml de 1x altos de glucosa en medio Dulbecco Eagle modificado (DMEM). </li><li> Añadir 5 ml de GPS 100x. </li><li> Añadir 5 ml de solución de aminoácidos no esenciales. </li><li> Esterilizada por filtración con un filtro de 0,2 micras de poro-vacío de tamaño. </li></ul></li><li> Producir colágeno / fibronectina solución (3,6 ml; día hizo misma de la inyección) <ul><li> Añadir 0,4 ml de DMEM 10 veces a 150 l de agua destilada H 2 O. </li><li> Añadir 100 ml de HEPES 1M (25 mM final). </li><li> Con cuidado, añadir 2,4 ml de colágeno bovino (5 mg / ml, 3 mg / ml final) y mezclar suavemente sobre el hielo. </li><li> Ajustar el pH a neutro mediante la adición de solución de NaOH 1N (aproximadamente 30 l). </li><li> Utilice el indicador rojo fenol para evaluar pH neutro; alternativa, utilice papel pH para controlar el pH. </li><li> Añadir 120 l de fibronectina humana (1 mg / ml, 30 mg / ml final) </li><li> Añadir 0,4 ml de FBS (10% final) </li><li> mantener la solución en hielo hasta su uso. </li></ul></li><li> Hacer una solución de fibrinógeno (1 ml; día hizo misma de la inyección) <ul><li> Añadir 30 mg de fibrinógeno en polvo a 1 ml de 0.9N NaCl (pH 7,4) solución (30 mg / ml final). </li><li> Antes de su uso, incubar la solución de fibrinógeno a 37 ° C durante 30 minutos. </li><li> Mezclar suavemente, sin agitación, antes de su adición al gel de colágeno / fibronectina. </li></ul></li><li> Hacer una solución de trombina (200 ml) <ul><li> Añadir una KU de la trombina en polvo a 200 ml de solución salina al 0,9% NaCl normal (50 U / mL). </li><li> Esterilizada por filtración con un filtro de 0,2 micras de poro-jeringa tamaño y guardar a -20 ° C hasta su uso. </li><li> Antes de su uso, diluir con solución salina de NaCl al 0,9% normal a una concentración final de 10 U / mL. </li></ul></li><li> Haz solución al 1% de gelatina (500 ml) <ul><li> Añadir 5 g de gelatina en polvo y 500 ml de fosfato de Dulbecco (PBS). </li><li> Autoclave a 121 ° C durante 30 min. </li><li> Esterilizada por filtración con un filtro de 0,2 micras de poro-vacío de tamaño. </li></ul></li><li> Capa de 100 mm placas de cultivo con una solución de revestimiento de 1% de gelatina <ul><li> Agregar 10 ml de solución al 1% de gelatina a cada placa de tejido de 100 mm de la cultura. </li><li> Incubar las placas a 37 ° C durante 60 min. </li><li> Antes de su uso, eliminar la solución de gelatina y lavar los platos una vez con PBS. </li></ul></li></ol> 2. Cultura de cordón umbilical humano derivados de la sangre endoteliales formadoras de colonias-Cells (ECFCs) Este protocolo supone el congelamiento de ECFC están disponibles en el laboratorio antes de este experimento. ECFC puede ser aislada de la fracción de células mononucleares de la sangre del cordón umbilical o la sangre o adultos periféricos como se describió previamente 7. <ol><li> Descongelar un vial de ECFCs (normalmente de 0,5 1x10 6 células en 1 ml de medio de congelación) tomada desde el tanque de nitrógeno de almacenamiento de líquidos y de inmediato diluir su contenido en un tubo cónico de 15 ml que contienen 10 ml de medio DMEM. Giran a 1200 rpm durante 5 min. Quitar el sobrenadante y resuspender el botón celular en 10 ml de agua tibia EGM-2 medio. </li><li> Añadir los 10 ml de suspensión ECFC en un 1% de gelatina con cubierta de 100 mm de la placa de cultivo de tejidos. Colocar la placa en un incubador humidificado a 37 º C y 5% CO 2. Al día siguiente, suavemente aspire a cabo las células no unidas y medianas empresas, y alimentar las células vinculado con 10 ml de agua dulce EGM-2 medio. </li><li> Alimentar la placa de cada 2-3 días con EGM-2 medio. Permiten a las células para expandir de manera que la placa está cubierto por una monocapa celular confluente. En la confluencia, la subcultura de las células de la siguiente manera: </li><li> Aspirar el medio de cultivo y lavar las células con 10 ml de PBS. </li><li> Quitar PBS y añadir 2 ml de tripsina-EDTA solución a cada placa de 100 mm. Agite suavemente las placas para distribuir uniformemente la solución de tripsina-EDTA. Se incuba a 37 ° C y 5% de CO 2 durante 3-5 minutos. Golpear suavemente la placa para ver las celdas separadas en suspensión bajo un microscopio invertido. </li><li> Cuando las células totalmente separar, añadir 8 ml de EGM-2 medio y recoger la solución de célulasción en un tubo cónico de 15 ml. Tomar 10 l para contar las células en un hemocitómetro y se calculará la cantidad total de células recolectadas. </li><li> Placa de las células recubiertas de gelatina al 1% placas de cultivo a una densidad de siembra de 5.000 células / cm 2 con EGM-2 medio. Coloque las placas en la incubadora y darles de comer cada 2-3 días con EGM-2 medio. </li></ol> Repita este procedimiento para los pasajes siguientes. Mantenga un registro del número pasaje como la población de células se expande. ECFCs será utilizado entre los pasos 4-8. 3. La cultura de los huesos humanos derivadas de la médula células madre mesenquimales (MSC) Este protocolo supone el congelamiento de MSC humanos están disponibles en el laboratorio antes de este experimento. MSC se puede aislar de aspirados de médula ósea, como se ha descrito anteriormente 11. <ol><li> Descongelar un vial de MSC (típicamente 0.50-1x10 6 células en 1 ml de medio de congelación) tomada desde el tanque de nitrógeno de almacenamiento de líquidos y de inmediato diluir su contenido en un tubo cónico de 15 ml que contienen 10 ml de medio DMEM. Giran a 1200 rpm durante 5 min. Quitar el sobrenadante y resuspender el botón celular en 10 ml de medio MSCGM caliente. </li><li> Añadir los 10 ml de la suspensión de MSC en un sin recubrimiento de 100 mm de la placa de cultivo de tejidos. Colocar la placa en un incubador humidificado a 37 º C y 5% CO 2. Al día siguiente, suavemente aspire a cabo las células no unidas y medianas empresas, y alimentar las células vinculado con 10 ml de medio MSCGM fresco. </li><li> Alimentar la placa de cada 2-3 días con medio MSCGM. Permiten a las células para expandir de manera que la placa alcanza el 80% de monocapa celular confluente. El 80% de confluencia, la subcultura de las células de la siguiente manera: </li><li> Aspirar el medio de cultivo y lavar las células con 10 ml de PBS. </li><li> Quitar PBS y añadir 2 ml de tripsina-EDTA solución a cada placa de 100 mm. Agite suavemente las placas para distribuir uniformemente la solución de tripsina-EDTA. Se incuba a 37 ° C y 5% CO2 durante 3-5 minutos. Golpear suavemente la placa para ver las celdas separadas en suspensión bajo un microscopio invertido. </li><li> Cuando las células totalmente separar, añadir 8 ml de medio MSCGM y recoger la solución de células en un tubo cónico de 15 ml. Tomar 10 l para contar las células en un hemocitómetro y se calculará la cantidad total de células recolectadas. </li><li> Placa de las células sin recubrimiento en placas de cultivo a una densidad de siembra de 10.000 células / cm 2 utilizando un medio de MSCGM. Coloque las placas en la incubadora y darles de comer cada 2-3 días con medio MSCGM. </li></ol> Repita este procedimiento para los pasajes siguientes. Mantenga un registro del número pasaje como la población de células se expande. MSC se utilizarán entre los pasos 4-8. 4. Resuspensión de las células en la solución de colágeno / fibronectina / fibrinógeno (día 0) Antes del experimento, asegúrese de que hay suficiente ECFCs y MSC en la cultura; 0.8x10 6 ECFCs y 1.2x10 MSC 6 se requerirá para cada implante y el ratón. <ol><li> Aspirar el medio de cada placa de cultivo y lavar las células con 10 ml de PBS. Quitar PBS y añadir 2 ml de tripsina-EDTA solución a cada placa de 100 mm. Agite suavemente las placas para distribuir uniformemente la solución de tripsina-EDTA. Incubar durante 3-5 minutos. Golpear suavemente la placa para ver las celdas separadas en suspensión bajo un microscopio invertido. </li><li> Cuando las células totalmente separar, añadir 8 ml de medio DMEM y recoger la solución de células en un tubo cónico de 15 ml. Tomar 10 l para contar las células en un hemocitómetro y se calculará la cantidad total de ECFCs y cosechada MSC. </li><li> Transferencia de 4x10 6 ECFCs (5x 0.8x10 6 células) y 6x10 6 PSM (5x 1.2x10 6 células) para formar un solo de 50 ml tubo cónico. Esta es la cantidad total de células necesarias para cinco implantes individuales y ratones. Centrifugar a 1200 rpm y eliminar el sobrenadante. </li><li> Suavemente, agregar 100 uL de solución de fibrinógeno a 0,9 ml de solución de colágeno / fibronectina (3 mg / ml la concentración de fibrinógeno final); mantener la mezcla en hielo. </li><li> Resuspender el botón celular en 1 ml de helado de colágeno / fibronectina / fibrinógeno solución, mezclar las células con mucho cuidado para evitar burbujas. Carga la mezcla en una jeringa estéril de 1 ml, y el lugar de una aguja de calibre 26 con la tapa en la punta de la jeringa. Mantenga la jeringa cargada en hielo hasta la inyección. </li></ol> 5. La inyección en ratones inmunodeficientes Nude (día 0) Todos los experimentos con animales se llevará a cabo con el desnudo de 6 semanas de edad atímicos (nu / nu) ratones. <ol><li> Antes de la inyección, los ratones inmunodeficientes anestesiar colocándolos en una cámara de gas la entrega de isoflurano. Permitir que los ratones inhalan el isoflurano durante unos 2 minutos hasta que estén anestesiados y no responde a una pizca dedo (monitorear su corazón late por la inspección). </li><li> Para cada ratón, se inyectan 50 l de solución de trombina (10 U / mL) por vía subcutánea en la región dorsal superior con una aguja de calibre 26. </li><li&gt; En el mismo lugar donde se inyectó la trombina, se inyectan 200 uL de la mezcla de células con una aguja de calibre 26. Gel de colágeno se a 37 ° C y el fibrinógeno se forma de gel de fibrina en la presencia de trombina. Como resultado, el implante debe formar un pequeño pero apreciable, un golpe debajo de la piel. </li><li> Después de la inyección, coloque el ratón sobre una capa de gasa para el confort y la calidez y observar hasta que se convierten ambulatoria. Luego, después, observar a los ratones al día durante los primeros tres días. </li></ol> 6. La cosecha (día 7) <ol><li> Una semana después de las inyecciones, la eutanasia a los ratones, colocándolos en una cámara de gas comprimido entrega de gas CO 2. </li><li> Una vez sacrificados, corte la piel cerca del área de la inyección y la cirugía quite el tapón de gel. Fotografías digitales de los tapones de gel obtenido con una escala se recomienda. </li><li> Coloque los tapones de gel cosechadas en casetes histológicos y profundo que en 10% neutros formalina tamponada durante la noche a temperatura ambiente. </li><li> Después de la fijación, lavar el 10% de formol tamponado neutro de distancia con H 2 O destilada y colocar los casetes histológicos a 4 ° C en PBS hasta que la evaluación histológica. </li></ol> 7. Evaluación: Histología (H &amp; E) e inmunohistoquímica (hCD31) <ol><li> Para la evaluación histológica, los implantes se incluyeron en parafina y se seccionaron (7 micras de espesor secciones) utilizando los procedimientos histológicos. </li><li> Cuantificar la densidad de los microvasos de la evaluación de Hematoxilina y Eosina (H &amp; E) manchadas secciones tomadas de la parte media de los implantes. Protocolos estándar para la tinción H &amp; E se puede encontrar en otros lugares. Microvasos se pueden identificar las estructuras luminal contiene glóbulos rojos. Informe microvasos densidad como el número promedio de glóbulos rojos llenos de microvasos de los campos analizados y se expresa como vasos / mm 2. </li><li> Para demostrar la naturaleza humana de los vasos microvascular, las secciones del implante debe ser recuperada mediante inmunohistoquímica manchadas con CD31 humano específico (hCD31) anticuerpos por medio de protocolos estándar de tinción. Se recomienda utilizar el ratón monoclonal anti-CD31 humano de anticuerpos de DakoCytomation (Clon JC70A;. Cat # M0823) a una dilución 1:100. La especificidad de este anticuerpo humano ha sido confirmado por la reacción negativa obtenida con una diversidad de secciones de tejido de ratón que se tiñeron en paralelo 7,11. Es de destacar que los vasos sanguíneos del ratón se ven a menudo en el interior de los implantes (especialmente alrededor de la frontera), pero los vasos del ratón no se tiñen positivamente con este anticuerpo. Además, la presencia de MSC humanos pueden ser detectados por tinción inmunohistoquímica con anticuerpos específicos para humanos contra CD90 o α-actina de músculo liso (α-SMA). MSC humanos se encuentran tanto en la región perivascular de los vasos sanguíneos recién formados y intersticial en todo el implante 11. </li></ol> 8. Resultados representante <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3065/3065fig1.jpg" /> Figura 1. Aspecto típico de las culturas y ECFC MSC. Microfotografías de contraste de fase que muestra el aspecto típico de ECFCs y MSC en la cultura. (A) monocapas de derivados de la sangre del cordón ECFCs mostrando la característica adoquines morfología de las células endoteliales. (B) huesos humanos derivadas de la médula MSC mostrando una morfología forma de huso. Escalador bares, 200 um. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3065/3065fig2.jpg" /> Figura 2. Aparición de tapones explantados en el día 7. Derivados de la sangre de cordón umbilical humano ECFCs y médula ósea procedentes de MSC fueron incorporados en el colágeno / fibronectina / gel de fibrina y se implantaron subcutáneamente en ratones desnudos como se describe en el texto. (A) Después de 7 días, una vez que el ratón se ha sacrificado, corte la piel cerca del área de la inyección y exponer el tapón de células / gel moviendo de un tirón en la piel. (B) Aparición de la clavija de la extirpación quirúrgica del ratón y antes de la fijación en formol. El color rojo del implante es una indicación de la vascularización. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3065/3065fig3.jpg" /> Figura 3. Identificación histológica de la red vascular en los enchufes explantados. Hematoxilina y eosina (H &amp; E) secciones teñidas tomado de la parte central de los tapones explantados. (A) bajo aumento (10x) Microfotografía que muestra el implante (marcado por una línea amarilla discontinua) en el contexto de los tejidos del huésped circundante (es decir, el tejido adiposo y el músculo esquelético). (B) de gran aumento (40x) Micrografía mostrando múltiples microvasos (punta de flecha amarilla que apunta a algunos de ellos) en el interior del enchufe y microvasculatura pueden ser identificados como estructuras luminal contienen los glóbulos rojos. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3065/3065fig4.jpg" /> Figura 4. Identificación inmunohistoquímica de los derechos humanoslúmenes. inmunohistoquímica las secciones teñidas tomado de la parte central de los tapones explantados. La tinción se llevó a cabo utilizando un ratón monoclonal anti-CD31 humano (hCD31) de anticuerpos de DakoCytomation (Clon JC70A;. Cat # M0823) a una dilución 1:100; núcleos celulares fueron contrastados con hematoxilina. (A) bajo aumento (10x) Microfotografía que muestra el implante (delimitada por una línea discontinua negro) en el contexto de los tejidos circundantes de acogida. Humano específico, CD31-positivo microvasos se tiñen de color marrón (tinción con peroxidasa). (B) de gran aumento (40x) Micrografía mostrando múltiples microvasos humanos (negro flecha que apunta en algún lúmenes hCD31-positivo) dentro del enchufe.

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	<li>Melero-Martin, J. M., Bischoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+13.+An+in+vivo+experimental+model+for+postnatal+vasculogenesis.">Chapter 13. An in vivo experimental model for postnatal vasculogenesis.</a> Methods Enzymol. 445, 303-329 (2008).</li><li>Koike, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+engineering:+creation+of+long-lasting+blood+vessels.">Tissue engineering: creation of long-lasting blood vessels.</a> Nature. 428, 138-139 (2004).</li><li>Schechner, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+formation+of+complex+microvessels+lined+by+human+endothelial+cells+in+an+immunodeficient+mouse.">In vivo formation of complex microvessels lined by human endothelial cells in an immunodeficient mouse.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 97, 9191-9196 (2000).</li><li>N&amp;ouml, r., E, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+and+characterization+of+functional+human+microvessels+in+immunodeficient+mice.">Engineering and characterization of functional human microvessels in immunodeficient mice.</a> Lab Invest. 81, 453-463 (2001).</li><li>Lin, Y., Weisdorf, D. J., Solovey, A., Hebbel, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origins+of+circulating+endothelial+cells+and+endothelial+outgrowth+from+blood.">Origins of circulating endothelial cells and endothelial outgrowth from blood.</a> J Clin Invest. 105, 71-77 (2000).</li><li>Ingram, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+novel+hierarchy+of+endothelial+progenitor+cells+using+human+peripheral+and+umbilical+cord+blood.">Identification of a novel hierarchy of endothelial progenitor cells using human peripheral and umbilical cord blood.</a> Blood. 104, 2752-2760 (2004).</li><li>Melero-Martin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+vasculogenic+potential+of+human+blood-derived+endothelial+progenitor+cells.">In vivo vasculogenic potential of human blood-derived endothelial progenitor cells.</a> Blood. 109, 4761-4768 (2007).</li><li>Au, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+in+vivo+potential+of+endothelial+progenitor+cells+from+human+umbilical+cord+blood+and+adult+peripheral+blood+to+form+functional+long-lasting+vessels.">Differential in vivo potential of endothelial progenitor cells from human umbilical cord blood and adult peripheral blood to form functional long-lasting vessels.</a> Blood. 111, 1302-1305 (2008).</li><li>Yoder, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redefining+endothelial+progenitor+cells+via+clonal+analysis+and+hematopoietic+stem/progenitor+cell+principals.">Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals.</a> Blood. 109, 1801-1809 (2007).</li><li>Traktuev, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+Functional+Vascular+Network+Formation+In+Vivo+by+Cooperation+of+Adipose+Progenitor+and+Endothelial+Cells.">Robust Functional Vascular Network Formation In Vivo by Cooperation of Adipose Progenitor and Endothelial Cells.</a> Circ Res. 104, 1410-1420 (2009).</li><li>Melero-Martin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+robust+and+functional+vascular+networks+in+vivo+with+human+adult+and+cord+blood-derived+progenitor+cells.">Engineering robust and functional vascular networks in vivo with human adult and cord blood-derived progenitor cells.</a> Circ Res. 103, 194-202 (2008).</li><li>Melero-Martin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+Myeloid+Cells+Are+Necessary+for+Creating+Bioengineered+Human+Vascular+Networks+In+Vivo.">Host Myeloid Cells Are Necessary for Creating Bioengineered Human Vascular Networks In Vivo.</a> Tissue Eng Part A. 16, 2457-2466 (2010).</li></ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Este es un modelo experimental de la bioingeniería vascular redes humanas. Las principales características de este modelo son: 1) microvasos se forman a partir de células humanas aisladas de tejidos post-natal (es decir, la sangre y la médula ósea), 2) microvasos se forman en un animal adulto, y 3) microvasos no surgen de la pre -existente (host) los buques, sino que se forman, de novo, a partir de células individuales suspendidas en un gel adecuado. La angiogénesis juega un papel importante en este ensayo ya que las conexiones a la vasculatura murinos son necesarios para alcanzar las células rojas de la sangre llena de vasos, uno de los funcionales de lectura en este ensayo. Además, las células huésped mieloide son reclutados para el implante en el post-trasplante primeros días, y que son necesarios para la formación de la nueva cama vascular 12. Este modelo experimental ofrece un sistema versátil, modelo cuantificables, y relativamente sencillo para el estudio post-natal formación de redes humanas vascular in vivo. Además, este ensayo es fácil de realizar y no requiere una incisión o cirugía. El modelo podría ser utilizado para estudiar el potencial vasculogénica de diferentes fuentes de células endoteliales humanas y perivascular. El modelo podría ser utilizado para la detección de anti-y / o compuestos pro-vasculogénica. Por último, el modelo puede ser utilizado para estudiar el papel (s) de genes específicos en la formación y función de una red vascular compuesto por endotelio humano.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre del reactivo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentarios (opcional) </th></tr><tr><td> Medio basal endotelial, EBM-2 </td><td> Lonza </td><td> CC-3156 </td><td></td></tr><tr><td> EGM-2 suplementos SingleQuot </td><td> Lonza </td><td> CC-3162 </td><td></td></tr><tr><td> Glutamina solución de penicilina-estreptomicina, 100 x GPS </td><td> Mediateca, Inc. </td><td> 30 a 009-CI </td><td></td></tr><tr><td> Celular madre mesenquimales crecimiento BulletKit Medio, MSCBM / MSCGM </td><td> Lonza </td><td> PT-3001 </td><td></td></tr><tr><td> Elevados de glucosa en la Dulbecco Modificado Medio Eagle, 1x DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11995-073 </td><td></td></tr><tr><td> MEM no esenciales solución de aminoácidos, 100x AANE </td><td> Invitrogen </td><td> 11140-050 </td><td></td></tr><tr><td> Elevados de glucosa en Dulbecco Eagle modificado, polvo DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 12100-046 </td><td></td></tr><tr><td> Solución tampón HEPES </td><td> Invitrogen </td><td> 15630-080 </td><td></td></tr><tr><td> Cultrex colágeno bovino que solución </td><td> Trevigen </td><td> 3442-050-01 </td><td></td></tr><tr><td> Cultrex Humanos fibronectina </td><td> Trevigen </td><td> 3420-001-01 </td><td></td></tr><tr><td> Fibrinógeno del plasma bovino </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> F8630-1G </td><td></td></tr><tr><td> Gelatina </td><td> Pescador </td><td> DF0143-17-9 </td><td></td></tr><tr><td> Fosfato de Dulbecco solución salina tamponada, PBS </td><td> Invitrogen </td><td> 14190-250 </td><td></td></tr><tr><td> Tripsina-EDTA, 1x </td><td> Invitrogen </td><td> 25300-054 </td><td></td></tr><tr><td> Isoflurano, líquido para inhalación </td><td> Buxter Healthcare Corporation </td><td> NDC 10019-360-40 </td><td></td></tr><tr><td> Trombina a partir de plasma bovino </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T4648-1KU </td><td></td></tr><tr><td> Solución de formalina, Neutral Buffered </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> HT501128 </td><td></td></tr><tr><td> Monoclonal Mouse Anti-Human CD31 anticuerpos </td><td> DakoCytomation </td><td> M0823 </td><td> Clon JC70A </td></tr></tbody></table>

bioengineering human microvascular networks in immunodeficient mice

El futuro de la ingeniería de tejidos y terapias basadas en células para la regeneración de los tejidos es probable que confiar en nuestra capacidad de generar redes vasculares funcionales in vivo. En este sentido, la búsqueda de modelos experimentales para construir redes de vasos sanguíneos en vivo es de suma importancia 1. La viabilidad de las redes microvasculares bioingeniería en vivo fue mostrado por primera vez el uso de tejidos humanos derivados de células maduras endoteliales (EC) 2-4, sin embargo, como las células endoteliales autólogas presentan problemas para un amplio uso clínico, ya que son difíciles de obtener en cantidades suficientes y requieren la cosecha de la vasculatura existente. Estas limitaciones han promovido la búsqueda de otras fuentes de EC. La identificación de las endoteliales que forman colonias de células (ECFCs) en la sangre presenta una oportunidad para obtener de forma no invasiva EC 05/07. Nosotros y otros autores han demostrado que los adultos y del cordón ECFCs derivados de la sangre tienen la capacidad de formar redes vasculares funcionales in vivo 7-11. Es importante destacar que estos estudios también han demostrado que para obtener las redes vasculares estable y duradera, ECFCs requieren co-implantación de las células perivasculares. El ensayo que aquí describimos ilustra este concepto: se muestra cómo la médula humana derivados de la sangre ECFCs pueden ser combinados con derivados de la médula ósea células madre mesenquimales (MSC) como una suspensión de células individuales en un gel de colágeno / fibronectina / fibrinógeno para formar un funcional humanos red vascular en los 7 días después de la implantación en un ratón inmunodeficiente. La presencia de humanos ECFC forradas lúmenes que contienen los eritrocitos de acogida puede ser visto a través de los implantes que indica no sólo la formación (de novo) de una red vascular, sino también el desarrollo de las anastomosis funcional con el sistema circulatorio de acogida. Este modelo murino de bioingeniería de la red vascular humana es ideal para los estudios sobre los mecanismos celulares y moleculares de la formación humana de la red vascular y para el desarrollo de estrategias para vascularizan tejidos de ingeniería.

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Bioengineering Human Microvascular Networks in Immunodeficient Mice

Aquí se describe una metodología para ofrecer la médula humana derivados de la sangre endoteliales que forman colonias de células (ECFCs) y médula ósea procedentes de células madre mesenquimales (MSC), integrado en un gel de colágeno / fibronectina, por vía subcutánea en ratones inmunodeficientes. Esta combinación de células / gel genera una red humana vascular que conecta con la vasculatura del ratón.

Bioingeniería Humanos redes microvasculares en ratones inmunodeficientes

The future of tissue engineering and cell-based therapies for tissue regeneration will likely rely on our ability to generate functional vascular networks ...

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JoVE Journal

Biology

12.2K vistas.  Harvard Medical School. Aquí se describe una metodología para ofrecer la médula humana derivados de la sangre endoteliales que forman colonias de células (ECFCs) y médula ósea procedentes de células madre mesenquimales (MSC), integrado en un gel de colágeno / fibronectina, por vía subcutánea en ratones inmunodeficientes. Esta combinación de células / gel genera una red humana vascular que conecta con la vasculatura del ratón.

Video: Bioengineering Human Microvascular Networks in Immunodeficient Mice

Using Micro-Electro-Mechanical Systems (MEMS) to Develop Diagnostic Tools

Using Micro-Electro-Mechanical Systems MEMS to Develop Diagnostic Tools

Utilizando Micro-Electro-Mechanical Systems (MEMS) para desarrollar herramientas de diagnóstico

Investigación

Biología

CD4+ T-Lymphocyte Capture Using a Disposable Microfluidic Chip for HIV

CD4 + T-linfocitos capturar usando un chip de microfluidos desechables para el VIH

Title Cell Encapsulation by Droplets

Título encapsulación celular a través de gotitas

Cellular Encapsulation in 3D Hydrogels for Tissue Engineering 

The 3D encapsulation of cells within hydrogels represents an increasingly important and popular technique for culturing cells and towards the development of constructs for tissue engineering. This environment better mimics what cells observe in vivo, compared to standard tissue culture, due to the tissue-like properties and 3D environment. Synthetic polymeric hydrogels are water-swollen networks that can be designed to be stable or to degrade through hydrolysis or proteolysis as new tissue is deposited by encapsulated cells. A wide variety of polymers have been explored for these applications, such as poly(ethylene glycol) and hyaluronic acid. Most commonly, the polymer is functionalized with reactive groups such as methacrylates or acrylates capable of undergoing crosslinking through various mechanisms. In the past decade, much progress has been made in engineering these microenvironments - e.g., via the physical or pendant covalent incorporation of biochemical cues - to improve viability and direct cellular phenotype, including the differentiation of encapsulated stem cells (Burdick et al.).
The following methods for the 3D encapsulation of cells have been optimized in our and other laboratories to maximize cytocompatibility and minimize the number of hydrogel processing steps. In the following protocols (see Figure 1 for an illustration of the procedure), it is assumed that functionalized polymers capable of undergoing crosslinking are already in hand; excellent reviews of polymer chemistry as applied to the field of tissue engineering may be found elsewhere (Burdick et al.) and these methods are compatible with a range of polymer types. Further, the Michael-type addition (see Lutolf et al.) and light-initiated free radical (see Elisseeff et al.) mechanisms focused on here constitute only a small portion of the reported crosslinking techniques. Mixed mode crosslinking, in which a portion of reactive groups is first consumed by addition crosslinking and followed by a radical mechanism, is another commonly used and powerful paradigm for directing the phenotype of encapsulated cells (Khetan et al., Salinas et al.).

Cellular Encapsulation in 3D Hydrogels for Tissue Engineering

We present protocols for the 3-dimensional (3D) encapsulation of cells within synthetic hydrogels. The encapsulation procedure is outlined for two commonly used methods of crosslinking (michael-type addition and light-initiated free radical mechanisms), as well as a number of techniques for assessing encapsulated cell behavior.

La encapsulación celular en hidrogeles 3D para ingeniería de tejidos

The 3D encapsulation of cells within hydrogels represents an increasingly important and popular technique for culturing cells and towards the development ...

Visualization of the Interstitial Cells of Cajal (ICC) Network in Mice

The interstitial cells of Cajal (ICC) are mesenchymal derived "pacemaker cells" of the gastrointestinal (GI) tract that generate spontaneous slow waves required for peristalsis and mediate neuronal input from the enteric nervous system1. Different subtypes of ICC form distinct networks in the muscularis of the GI tract 2,3. Loss or injury to these networks is associated with a number of motility disorders4. ICC cells express the KIT receptor tyrosine kinase on the plasma membrane and KIT immunostaining has been used for the past 15 years to label the ICC network5,6. Importantly, normal KIT activity is required for ICC development5,6. Neoplastic transformation of ICC cells results in gastrointestinal stromal tumor (GIST), that frequently harbor gain-of-function KIT mutations7,8. We recently showed that ETV1 is a lineage-specific survival factor expressed in the ICC/GIST lineage and is a master transcriptional regulator required for both normal ICC network formation and for of GIST tumorigenesis9. We further demonstrate that it cooperates with activating KIT mutations in tumorigenesis. Here, we describe methods for visualization of ICC networks in mice, largely based on previously published protocols10,11. More recently, the chloride channel anoctamin 1 (ANO1) has also been characterized as a specific membrane marker of ICC11,12. Because of their plasma membrane localization, immunofluorescence of both proteins can be used to visualize the ICC networks. Here, we describe visualization of the ICC networks by fixed-frozen cyrosections and whole mount preparations.

Visualization of the Interstitial Cells of Cajal ICC Network in Mice

The interstitial cells of Cajal (ICC) are the pacemaker cells of the gastrointestinal (GI) tract. They form complex networks between smooth muscle cells and post-ganglionic neuronal fibers to regulate GI contractility. Here, we present immunofluorescence methods cross-sectional and whole-mount visualization of murine ICC networks.

La visualización de las células intersticiales de Cajal (ICC) de red en ratones

The interstitial cells of Cajal (ICC) are mesenchymal derived "pacemaker cells" of the gastrointestinal (GI) tract that generate spontaneous slow waves ...

Endothelial Cell Co-culture Mediates Maturation of Human Embryonic Stem Cell to Pancreatic Insulin Producing Cells in a Directed Differentiation Approach

Embryonic stem cells (ESC) have two main characteristics: they can be indefinitely propagated in vitro in an undifferentiated state and they are pluripotent, thus having the potential to differentiate into multiple lineages. Such properties make ESCs extremely attractive for cell based therapy and regenerative treatment applications 1. However for its full potential to be realized the cells have to be differentiated into mature and functional phenotypes, which is a daunting task. A promising approach in inducing cellular differentiation is to closely mimic the path of organogenesis in the in vitro setting. Pancreatic development is known to occur in specific stages 2, starting with endoderm, which can develop into several organs, including liver and pancreas. Endoderm induction can be achieved by modulation of the nodal pathway through addition of Activin A 3 in combination with several growth factors 4-7. Definitive endoderm cells then undergo pancreatic commitment by inhibition of sonic hedgehog inhibition, which can be achieved in vitro by addition of cyclopamine 8. Pancreatic maturation is mediated by several parallel events including inhibition of notch signaling; aggregation of pancreatic progenitors into 3-dimentional clusters; induction of vascularization; to name a few. By far the most successful in vitro maturation of ESC derived pancreatic progenitor cells have been achieved through inhibition of notch signaling by DAPT supplementation 9. Although successful, this results in low yield of the mature phenotype with reduced functionality. A less studied area is the effect of endothelial cell signaling in pancreatic maturation, which is increasingly being appreciated as an important contributing factor in in-vivo pancreatic islet maturation 10,11.
The current study explores such effect of endothelial cell signaling in maturation of human ESC derived pancreatic progenitor cells into insulin producing islet-like cells. We report a multi-stage directed differentiation protocol where the human ESCs are first induced towards endoderm by Activin A along with inhibition of PI3K pathway. Pancreatic specification of endoderm cells is achieved by inhibition of sonic hedgehog signaling by Cyclopamine along with retinoid induction by addition of Retinoic Acid. The final stage of maturation is induced by endothelial cell signaling achieved by a co-culture configuration. While several endothelial cells have been tested in the co-culture, herein we present our data with rat heart microvascular endothelial Cells (RHMVEC), primarily for the ease of analysis.

The current study describes a directed differentiation approach in inducing pancreatic differentiation of human embryonic stem cells. Of great significance is the finding that endothelial cell co-culture mediates maturation of human embryonic stem cell derived pancreatic progenitors into insulin expressing cells.

Células endoteliales Co-cultura media la maduración de embriones humanos de células madre a las células productoras de insulina del páncreas en un enfoque de diferenciación dirigida

Embryonic stem cells (ESC) have two main characteristics: they can be indefinitely propagated in vitro in an undifferentiated state and they are ...

RNA-seq Analysis of Transcriptomes in Thrombin-treated and Control Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells

The characterization of gene expression in cells via measurement of mRNA levels is a useful tool in determining how the transcriptional machinery of the cell is affected by external signals (e.g. drug treatment), or how cells differ between a healthy state and a diseased state. With the advent and continuous refinement of next-generation DNA sequencing technology, RNA-sequencing (RNA-seq) has become an increasingly popular method of transcriptome analysis to catalog all species of transcripts, to determine the transcriptional structure of all expressed genes and to quantify the changing expression levels of the total set of transcripts in a given cell, tissue or organism1,2 . RNA-seq is gradually replacing DNA microarrays as a preferred method for transcriptome analysis because it has the advantages of profiling a complete transcriptome, providing a digital type datum (copy number of any transcript) and not relying on any known genomic sequence3.
Here, we present a complete and detailed protocol to apply RNA-seq to profile transcriptomes in human pulmonary microvascular endothelial cells with or without thrombin treatment. This protocol is based on our recent published study entitled "RNA-seq Reveals Novel Transcriptome of Genes and Their Isoforms in Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells Treated with Thrombin,"4 in which we successfully performed the first complete transcriptome analysis of human pulmonary microvascular endothelial cells treated with thrombin using RNA-seq. It yielded unprecedented resources for further experimentation to gain insights into molecular mechanisms underlying thrombin-mediated endothelial dysfunction in the pathogenesis of inflammatory conditions, cancer, diabetes, and coronary heart disease, and provides potential new leads for therapeutic targets to those diseases.
The descriptive text of this protocol is divided into four parts. The first part describes the treatment of human pulmonary microvascular endothelial cells with thrombin and RNA isolation, quality analysis and quantification. The second part describes library construction and sequencing. The third part describes the data analysis. The fourth part describes an RT-PCR validation assay. Representative results of several key steps are displayed. Useful tips or precautions to boost success in key steps are provided in the Discussion section. Although this protocol uses human pulmonary microvascular endothelial cells treated with thrombin, it can be generalized to profile transcriptomes in both mammalian and non-mammalian cells and in tissues treated with different stimuli or inhibitors, or to compare transcriptomes in cells or tissues between a healthy state and a disease state.

This protocol presents a complete and detailed procedure to apply RNA-seq, a powerful next-generation DNA sequencing technology, to profile transcriptomes in human pulmonary microvascular endothelial cells with or without thrombin treatment. This protocol is generalizable to various cells or tissues affected by different reagents or disease states.

RNA-seq Análisis de transcriptomes en trombina tratamiento y de control pulmonar humana células endoteliales microvasculares

The characterization of gene expression in cells via measurement of mRNA levels is a useful tool in determining how the transcriptional machinery of the ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs include modeling pathogenesis of human genetic diseases, autologous cell therapy after gene correction, and personalized drug screening by providing a source of patient-specific and symptom relevant cells. However, there are several hurdles to overcome, such as eliminating the remaining reprogramming factor transgene expression after human iPSCs production. More importantly, residual transgene expression in undifferentiated human iPSCs could hamper proper differentiations and misguide the interpretation of disease-relevant in vitro phenotypes. With this reason, integration-free and/or transgene-free human iPSCs have been developed using several methods, such as adenovirus, the piggyBac system, minicircle vector, episomal vectors, direct protein delivery and synthesized mRNA. However, efficiency of reprogramming using integration-free methods is quite low in most cases.
Here, we present a method to isolate human iPSCs by using Sendai-virus (RNA virus) based reprogramming system. This reprogramming method shows consistent results and high efficiency in cost-effective manner.

Here, we present our established method to reprogram human somatic cells into transgene-free human iPSCs with Sendai virus, which shows consistent outcome and enhanced efficiency.

Eficiente generación, por actividad humana células madre pluripotentes de células somáticas humanas con virus Sendai-

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

Determination of Sialic Acids in Liver and Milk Samples of Wild-type and CMAH Knock-out Mice.

CMAH (cytidine monophosphate-N-acetylneuraminic acid hydroxylase) is responsible for the oxidation of cytidine monophosphate-N-acetylneuraminic acids in mammals. However, humans cannot oxidize cytidine monophosphate-N-acetylneuraminic acid to cytidine monophosphate-N-glycolylneuraminic acid due to a primary exon deletion of the CMAH gene. To understand the effects and implications of the lack of CMAH activity in more detail, a Cmah knock-out model in mice is of keen interest in basic and applied research. The analysis method to determine the phenotype of this mouse model is herein described in detail, and is based on the detection of both N-acetylneuraminic acid and N-glycolylenuraminic acid in the liver and milk of wild-type and Cmah knock-out mice. Endogenous sialic acids are released and derivatized with o-phenylenediamine to generate fluorogenic derivatives, which can be subsequently analyzed by HPLC. The presented protocol can be also applied for the analysis of milk and tissue samples from various other origins, and may be of use to investigate the nutritional and health effects of N-glycolylneuraminic acid.

Determination of Sialic Acids in Liver and Milk Samples of Wild-type and CMAH Knock-out Mice.

We describe a HPLC-based method for the determination of N-acetylneuraminic acid and N-glycolylenuraminic acid in mouse liver and milk.

Determinación de ácidos siálicos en hígado y muestras de leche de tipo salvaje y<em&gt; CMAH</em&gt; Ratones knock-out.

CMAH (cytidine monophosphate-N-acetylneuraminic acid hydroxylase) is responsible for the oxidation of cytidine monophosphate-N-acetylneuraminic acids in ...

Quantitative Proteomics Workflow using Multiple Reaction Monitoring Based Detection of Proteins from Human Brain Tissue

The proteomic analysis of the human brain tissue over the last decade has greatly enhanced our understanding of the brain. However, brain related disorders continue to be a major contributor of deaths around the world, necessitating the need for even greater understanding of their pathobiology. Traditional antibody-based techniques like western blotting or immunohistochemistry suffer from being low-throughput besides being labor-intensive and qualitative or semi-quantitative. Even conventional mass spectrometry-based shotgun approaches fail to provide conclusive evidence to support a certain hypothesis. Targeted proteomics approaches are largely hypothesis driven and differ from the conventional shotgun proteomics approaches that have been long in use. Multiple reaction monitoring is one such targeted approach that requires the use of a special mass spectrometer called the tandem quadrupole mass spectrometer or triple quadrupole mass spectrometer. In the current study, we have systematically highlighted the major steps involved in performing a successful tandem quadrupole mass spectrometry-based proteomics workflow using human brain tissue with an aim to introduce this workflow to a broader research community.

The protocol aims to introduce the use of a triple quadrupole mass spectrometer for Multiple Reaction Monitoring (MRM) of proteins from clinical samples. We have provided a systematic workflow starting from sample preparation to data analysis for clinical samples with all the necessary precautions to be taken.

Flujo de trabajo de proteómica cuantitativa utilizando la detección basada en el monitoreo de reacciones múltiples de proteínas del tejido cerebral humano