Aquí demostramos un ensayo de tráfico de receptores de alto contenido que es compatible con la preparación de cultivo neuronal primario. Este método etiqueta por separado la superficie de un receptor entre sótanos de neuronas fijas. Permitir la presentación de datos como una relación de superficie normalizada o densidad de receptores internalizados a la densidad general de ese receptor.
El ensayo de alto contenido y tráfico de receptores proporciona un medio realizado para medir los cambios masivos en los perfiles de tráfico de receptores dentro de una red neuronal en respuesta a varios factores. Consumir mucho menos tiempo y materiales que los métodos alternativos. Las interrupciones y el tráfico de preceptores se han relacionado con múltiples trastornos neurológicos, y se consideran objetivos atractivos para la terapia farmacológica.
Por ejemplo, los estudios han demostrado que uno de los primeros signos de la enfermedad de Alzheimer es la pérdida sináptica y la disminución de las piscinas sinápticas y preceptores. Esta técnica requiere muchos pasos diferentes de dificultad variable. Sobre todo porque manipular la placa de 96 pozos y manipular los pozos puede resultar difícil para alguien sin experiencia.
Y debido a que los resultados del experimento son muy sensibles al manejo incorrecto, es útil ver los diversos pasos que se están realizando. Instructor Para comenzar, alimentar las neuronas en la placa de 96 pozos mediante la eliminación de 100 microlitros de los medios preexistentes de cada pozo. Y reemplazándolo con 100 microlitros de medios precalegados a 37 grados Celsius.
Cada tres o cuatro días. Un día in vitro 14, utilice un multi-pipet para eliminar 100 microlitros de medios de cada pozo y agrupar los medios. Agregue dos microlitros de la solución TTX Stock a un mililitro de los medios acondicionados agrupados para crear una solución de cuatro micromolares de TTX.
Tratar las neuronas en cada pozo con 100 microlitros de cuatro micromolares TTX solución. Si no hay suficientes medios de condición agrupados, agregue algunos de los medios almacenados anteriormente. Incubar en una incubadora de 5%CO2 a 37 grados centígrados durante cuatro horas.
Después de esto, retire los medios que contienen TTX existentes y añada 200 microlitros de medios neuronales precaleados e incubar la microplaca a temperatura ambiente durante quince minutos. Primero retire el medio neuronal de la microplaca. Añadir cincuenta microlitros de la solución de anticuerpos anti gluA1 o anti gluA2 a los pozos correspondientes de la microplaca.
Añadir cincuenta microlitros de medios neuronales al anticuerpo secundario sólo controlar los pozos. Incubar a temperatura ambiente durante veinte minutos para permitir la unión de anticuerpos. Después de esto, elimine los medios existentes de los pozos.
Lave la microplaca tres veces con 100 microlitros de medios neuronales a temperatura ambiente por pozo para eliminar cualquier anticuerpo no anzado. A continuación, añadir 100 microlitros 100 micromolar de DHPG solución de stock a cada pozo. Incubar en una incubadora de dióxido de carbono al 5% a 37 grados centígrados durante diez minutos.
A continuación, retire la solución DHPG y agregue 100 microlitros de medios neuronales a cada pozo. Repita este proceso una segunda vez. Luego incubar en la incubadora de dióxido de carbono del 5% a 37 grados centígrados durante cinco minutos.
El día del experimento prepara una solución de 4%paraformaldehído y 4%de BNPs de sacarosa. Retire el soporte de cada pozo y reemplácelo con 100 microlitros de la solución de paraformaldehído y sacarosa. Repita este proceso para cada punto de tiempo de adición.
Incubar la microplaca a 4 grados centígrados durante veinte minutos. A continuación, retire el fijador y agregue 100 microlitros de DPBS a cada pozo. Retire el DPBS y agregue 150 microlitros de búfer de bloqueo a cada pozo.
Incubar a temperatura ambiente durante noventa minutos. Retire el tampón de bloqueo y añada 50 microlitros de la solución de anticuerpos secundarios a cada pozo. Incubar a temperatura ambiente durante sesenta minutos manteniendo la placa protegida de la luz.
Retire la solución de anticuerpos y añada 100 microlitros de TBS a cada pozo. Incubar a temperatura ambiente durante cinco minutos. Repita este proceso, eliminando los medios de los pozos añadiendo TBS e incubando a temperatura ambiente cuatro veces más.
Después de esto, retire el TBS de la micro placa. Añadir 100 microlitros de una solución de 4%paraformaldehído y 4%sacarosa en PBS a cada pozo. Incubar a temperatura ambiente durante quince minutos.
Retire la solución de paraformaldehído y agregue 100 microlitros de TBS en cada pozo, e incubar a temperatura ambiente durante cinco minutos. Repita este paso dos veces adicionales. En primer lugar preparar una solución de TBS que contenga 2%saponina y vórtice la solución brevemente para disolver completamente el polvo de saponina.
Con un filtro de 2 micrómetros, filtre la solución para eliminar cualquier partícula que pueda causar autofluorescencia. Añadir 150 microlitros de esta solución de 2% saponina a cada pozo, e incubar a temperatura ambiente durante quince minutos. A continuación, retire la solución de saponina y agregue 150 microlitros de búfer de bloqueo a cada pozo.
Incubar a temperatura ambiente durante noventa minutos. Después de esto, retire el tampón de bloqueo y añada cincuenta microlitros de la solución de anticuerpos secundarios a cada pozo. Incubar a temperatura ambiente durante sesenta minutos.
A continuación, agregue 100 microlitros de TBS a cada pozo e incubar a temperatura ambiente durante cinco minutos. Repita este proceso añadiendo TBS e incubando a temperatura ambiente cuatro veces más. Usando un sistema de imágenes láser infrarrojo imagen de la micro placa de 96 pozos de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Ajuste la resolución de escaneado a 84 micrómetros. La calidad de escaneado a medio y el desplazamiento de enfoque según la altura base de la micro placa de 96 pozos utilizada. Haga clic en el botón de menú Image Studio, exporte la imagen para medios digitales y exporte las imágenes con una resolución de 300 ppp en formato TIFF.
Abra la imagen en ImageJ Fiji. Divida los canales de color haciendo clic en el menú de la imagen y, a continuación, color, divida los canales. A continuación, abra el gestor de ROI desde analizar, herramientas.
Marque la casilla para las etiquetas en el administrador del ROI, para clasificar los círculos con los números. En el canal 6 80 o rojo, seleccione la región de interés seleccionando la herramienta de círculo y dibujando un círculo que se ajuste con precisión al primer pozo. Luego presione Ctrl más T, arrastrando el círculo al siguiente pozo.
Repita este proceso hasta que todos los pozos estén en círculos. En el administrador de ROI, haga clic en medir. Seleccione los valores que aparecen y cópielos en una hoja de pliegos.
A continuación, haga clic en el canal verde y transponga los ROI seleccionados a la imagen. En el administrador de ROI, haga clic en medir. Seleccione los valores que aparecen y cópielos en una hoja de pliegos.
Después de esto calcule los cambios en la expresión del receptor de superficie como se describe en el protocolo de texto. En este procedimiento, la persistencia del arco en la regulación del tráfico de receptores de ampa se examina utilizando el ensayo y el tráfico de receptores ampa de alto contenido. Las neuronas se tratan con el bloqueador de canales de iones de sodio TTX que inhibe los potenciales de acción y reduce los niveles de arco.
Seguido por DHPG que induce la traducción de arco y la ubiquitinación. Tanto la superficie como la internalización de las piscinas de gluA1 y gluA2 que contienen subunidades del receptor de apa se midieron a los cinco y quince minutos después del lavado de DHPG. Las neuronas ArcKR muestran un aumento de la endositosis gluA1 cuando se tratan con DHPG, en comparación con las neuronas de tipo.
Este efecto no se observa cuando las neuronas se tratan con TTX solamente. La expresión superficial de la subunidad gluA2 aumenta significativamente en puntos de tiempo cortos en comparación con las neuronas de tipo wile. Indicando un posible reemplazo de subunidad.
Asegurar que las células son paraformaldehído fijo ilíquido debe prepararse fresco el día del experimento. Las células deben ser re fijadas después del etiquetado para los receptores de superficie. Otros métodos como la microscopía confocal serán capaces de proporcionar una resolución de una sola célula para caracterizar aún más los cambios relacionados en la estructura neuronal y la localización de los receptores.
La interrupción de la dinámica temporal del arco altera el tráfico de receptores de ampa en respuesta a MgluR mediado LTD. Las instrucciones futuras serán medir el tráfico de receptores de ampa en respuesta a otros estímulos. Este ensayo puede ser adaptable a otros tipos de células, tratamientos y receptores, siempre que el procedimiento se ajuste cuidadosamente y se valide adecuadamente.
Se debe tener cuidado de garantizar que las densidades celulares, los tiempos de tratamiento, los pasos de fijación, los pasos de permeabilización y las selecciones de reactivos se optimicen su sistema de interés. Para completar con éxito y de manera eficiente el ensayo es importante preparar la solución DHPG y el 4%paraformaldehído, 4% solución de sacarosa el día del experimento. Se requiere un control bien tratado con vakeel o TTX para garantizar que los efectos observados sean específicos del tratamiento.
También es fundamental incluir pozos tratados con solo los anticuerpos secundarios para controlar la fluorescencia de fondo producida por la unión no específica.
