Este trabajo fue apoyado por una beca de CIHR (MOP394808) y una Cátedra de Investigación de Canadá para CMCEWO era el beneficiario de una Beca de Postgrado de NSERC.

Nota: Este protocolo es ampliamente compatible con varios modelos monocapa chapado célula / tejido de cultivo, los regímenes de tratamiento de drogas, y las metas en materia de etiquetado. Así, en el uso real, muchos parámetros específicos variarán según el diseño experimental. Aquí, las referencias a estos parámetros definidos por el usuario son genéricos. Condiciones de ejemplo, tal como se utiliza para obtener los resultados representativos, se incluyen en cursiva. 1. Soluciones <ol><li> Preparar tampón de lavado mediante la mezcla de 0,1 M Tris-Buffered hipertónica (300 mM) solución salina y 0,05% de polisorbato 20; pH 7,4 a TA. </li><li> Preparar tampón de bloqueo. Para 0,05 M Tris-Buffered hipertónica (300 mM) Saline añadir 0,05% de polisorbato 20, 3% albúmina de suero bovino (BSA) y 0,1% de gelatina de pescado fría piel y ajustar el pH a 7,4 a temperatura ambiente. </li><li> Preparar diluyente de anticuerpo mediante la adición de 0,05% de polisorbato 20, 1% BSA, 0,1% gelatina de piel de pescado fría a 0,05 M Tris-Buffered hipertónica (300 mM) Saline y ajustar el pH a 7,4 a 4 o C. Nota: El pH de tampones Tris es dependiente de la temperatura. Es decir, un cambio en la temperatura cambiará el pH de la solución. Por consistencia, estos tampones deben ser siempre pH se ajustó-a la temperatura a la que se van a utilizar. </li></ol> 2. Cultivo Celular Nota: Los protocolos de cultivo de células apropiadas variarán en función del tipo (s) celular utilizado. Estos procedimientos deben ser optimizados por separado. Metodologías detalladas de cultivo celular son fácilmente disponibles, incluyendo 16. Un procedimiento similar se utilizó para obtener los resultados representativos, con las notables diferencias: <ol><li> Dorsales Cultura neuronas de los ganglios de la raíz de los animales adultos como se describe 12. Utilice un medio de crecimiento de adultos-neurona para cultivar las células. Reducir la densidad celular glial por preplating, en lugar de glutamato. Esto se traduce en una cultura neuronal glial mixto crecido en cubreobjetos de vidrio de 12 asaltos con por lo menos 30 a 60 neuronas por placa y acompañan células gliales crecido hasta approximatEly 40% de confluencia. Cabe señalar que las neuronas en un cultivo primario no se replicarán y será empujado fuera de la placa por co-cultivadas glia si la glia se les permite crecer en exceso. Con el fin de evitar afectar las neuronas, la reducción física de números gliales es preferible a los métodos farmacológicos químicos /. Nota: Para los fines de este protocolo, se supone que las células de interés se cultivan a su experimentalmente deseada por el estado y monocapa chapado. Encontramos que chapado en cubreobjetos de vidrio de 12 asaltos en placas de 24 pocillos sea más conveniente. Todos los volúmenes y los procedimientos descritos son apropiados para un cubreobjetos en un pocillo de una placa de 24 pocillos. </li></ol> 3. Tratamiento de Drogas de las células cultivadas Nota: secuencial múltiple o de solapamiento, los tratamientos farmacológicos son posibles. Los fármacos, dosis / concentraciones y duraciones de exposición utilizado dependerá del experimento específico. <ol><li> Retire el medio de cultivo original de 16 </sup&gt; y reemplazarlo con un medio que contiene el fármaco (s) de interés a la concentración (s) elegido. En este caso, utilice 10 M de morfina solubiliza en solución salina o utiliza solución salina como control. Nota: Es importante que cada réplica independiente (generalmente un solo cultivo en placa de 24 pocillos) contiene la misma condición de control común. Esto permitirá la normalización de los datos a través de repeticiones, que corrige la variabilidad inter-ensayo. </li><li> Se incuban las células en las condiciones de crecimiento originales 16 para 48 hr. </li><li> Para los tratamientos farmacológicos posteriores, repita los pasos 3.1 y 3.2 con deltorfina 1 M, SNC 80 1 M, o vehículo y se incuba durante 60 min 12. Solubilizar deltorfina II en agua y solubilizar SNC 80 a 10 mM en 40 mM HCl y sonicado, diluido a 1 mM en agua. Nota: Este protocolo asume el fármaco (s) han sido solubilizado de tal manera que se pueden disolver a la concentración deseada (s) en el medio de crecimiento elegido. Procedimientos adecuados paratales solubilización puede variar dependiendo de la droga en cuestión y debe ser optimizado por separado. </li><li> Lavar las células suavemente, tres veces, con ~ 1 ml de tampón de lavado por lavado. Realizar cada lavado aspirando suavemente el líquido del pozo, luego rápidamente, y suavemente, rellenar el pozo con solución fresca, según se desee (en este caso con tampón de lavado). </li></ol> 4. Fijación y inmunocitoquímica Nota: Los objetivos específicos de etiquetado variarán según el experimento. En nuestro uso, etiquetamos receptores opioides delta (DOR) y Rab5, Rab 11, y LAMP1, como se discute. Los anticuerpos específicos utilizados dependerá del experimento específico. Condiciones de etiquetado óptimas dependen de la anticuerpo específico (s) usados. Una discusión mucho más completa de este tema está por debajo. <ol><li> Fijar las células por inmersión en ~ 300 l 4% de paraformaldehído en 0,1 M tampón fosfato salino durante 10 min a 37 ºC. Nota: Es importante que el 4% de paraformaldehído estar recién preparado debido a la autofluorescencia causada por el uso de paraformaldehído previamente congelado. </li><li> Lavar las células suavemente, 3 veces, con ~ 1 ml de tampón de lavado por lavado, como se describe en 3.3. </li><li> Se incuban las células en 300 l tampón de bloqueo durante 2 horas a RT. </li><li> Se incuban las células con anticuerpos primarios en 300 l de diluyente de anticuerpo durante 48 horas a 4 ºC. En nuestro uso, anticuerpos primarios contra DOR (de conejo anti-dor) y uno de: Rab5 (ratón anti-Rab5), Rab 11 (ratón anti-Rab11), y LAMP1 (de cabra anti-LAMP1). </li><li> Lavar las células suavemente, tres veces, con ~ 1 ml de tampón de lavado por lavado, como se describe en 3.3. </li><li> Se incuban las células con anticuerpos secundarios conjugados con diferentes fluoróforos (véase la discusión más adelante) en 300 l de diluyente de anticuerpo durante 1 hora a RT. En esto, y todos los pasos subsiguientes, proteger a las células de la luz. Para obtener los resultados representativos, utilice verde emisores de anti-conejo y eith-fluoróforo conjugadoer un fluoróforo conjugado anti-ratón-emisor de rojo o-fluoróforo conjugado de cabra anti-rojo-emisor de luz. </li><li> Lavar las células suavemente, 3 veces, con ~ 1 ml de tampón de lavado por lavado, como se describe en 3.3. </li><li> Quitar los cubreobjetos de 12 asaltos de placas de 24 pocillos dejando ~ 1 ml de tampón de lavado en cada pocillo, la celebración de la placa a ~ 45º y apalancar el cubreobjetos del piso bien utilizando unas pinzas finas. El cubreobjetos vendrá a descansar contra la pared del pozo, desde donde se puede quitar fácilmente utilizando los fórceps. </li><li> Monte el cubreobjetos, célula boca abajo, en el microscopio se desliza con anti-fading medio de montaje. </li></ol> 5. Configuración del microscopio <ol><li> El uso de un objetivo de gran aumento (100X), primero busque una célula representante para ser fotografiado usando epifluorescencia. </li><li> Configure los ajustes de captura de imagen para grabar 8 bits imágenes TIFF sin comprimir de cada canal marcado (para la detección de cada fluoróforo utilizado por ejemplo, 488 nm y 594 nm), a la imagen de cada canal secuencialmente (ya sea por línea o trama), y en un promedio de 4 a 6 exploraciones para la imagen final. Resolución de imagen óptima será microscopio específico, pero 1024 x 1024 produce normalmente buenos resultados. </li><li> Cambie a la ruta de formación de imágenes confocal y se centran a un plano z a través del centro de la célula. </li><li> Optimizar estenopeica (típicamente 1 unidad Airy), la potencia del láser, y el voltaje del tubo fotomultiplicador (ganancia) y el desplazamiento para cada canal. Guardar / registrar estos valores. Utilice la misma configuración de microscopio para obtener imágenes de todas las células marcadas para cualquier par objetivo determinado en la misma réplica. Nota: Este proceso dará lugar generalmente a photobleaching suficiente que esta célula no debe ser fotografiada para su análisis. </li></ol> 6. Imaging <ol><li> El uso de un objetivo de gran aumento (por ejemplo, 100X), primero busque una célula para ser fotografiado usando epifluorescencia. </li><li> Cambie a la ruta de formación de imágenes confocal y se centran a un plano z a través del centro de la célula. YOf disponibles, el uso de software de zoom / cultivo para restringir el área de exploración de la célula de interés. </li><li> Captura de imágenes para cada canal marcado utilizando la configuración previamente establecidos. Repita los pasos 6.1 a 6.3 a la imagen 15 o más células por condición por réplica para garantizar una muestra suficiente. </li></ol> 7. Análisis Colocalización <ol><li> Abra el par de imágenes (por ejemplo, &quot;verde&quot; y &quot;rojo&quot;) de una célula en ImageJ. Usar las Imágenes&gt; Color&gt; Combinar Canales ... comando para generar una imagen RGB. </li><li> Dibuja una selección alrededor de la célula de interés. Utilice el ImageJ plugin &quot;PSC Colocalización&quot; (11; disponible en https://www.cpib.ac.uk/tools-resources/software/psc-colocalization-plugin/) para cuantificar colocalización de los objetivos en la celda seleccionada. </li><li> Registre la medida colocalización deseada (típicamente r de Pearson 17). Repita los pasos 07.01 a 07.03 para cada celda fotografiado. </li></ol&gt; 8. Normalización de datos <ol><li> Calcular la media de los valores registrados de colocalización de las condiciones de control comunes de cada repetición de cada condición de etiquetado. Nota: Por ejemplo, la media de los valores de colocalización de las neuronas en el &quot;vehículo de 48-hr, 60-min vehículo&quot; condición de drogas en cada uno de 3 repeticiones independientes en cada uno de 3 condiciones de etiquetado (receptor y cada uno de los compartimentos 3). </li><li> Multiplicar los medios por (-1) para producir el desplazamiento de cada repetición en cada condición de etiquetado. Agregar el desplazamiento para cada replicar en cada condición de etiquetado para cada valor de colocalización en esa réplica. Nota: Esto normalizar los datos de tal manera que la medida colocalización media para la condición de control común es 0 en cada repetición de cada condición de etiquetado. </li><li> Agrupar los datos de todas las repeticiones de cada condición de etiquetado. Nota: Los cambios en la colocalización ahora se pueden analizar a través de repeticiones. Anal estadísticoanalysis dependerá del diseño experimental, pero se suelen implicar el análisis de varianza (ANOVA) seguido de pruebas apropiadas post-hoc (por ejemplo, Tukey). Para los recursos estadísticos, véase, por ejemplo, 18. </li></ol>

<ol>
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Cell Biol. 172 (1), 9-18 (2006).</li><li>Zinchuk, V., Zinchuk, O., Okada, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+colocalization+analysis+of+multicolor+confocal+immunofluorescence+microscopy+images:+pushing+pixels+to+explore+biological+phenomena.">Quantitative colocalization analysis of multicolor confocal immunofluorescence microscopy images: pushing pixels to explore biological phenomena.</a> Acta Histochem. Cytochem. 40 (4), 101-111 (2007).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Hemos optimizado el protocolo para el análisis de cultivos primarios de neuronas adultas ganglionares de la raíz dorsal (neuronas sensoriales primarias). También se puede utilizar, con poca o ninguna modificación, para células cultivadas en monocapa chapado ampliamente. El análisis colocalizational también es posible en cortes de tejido y otros tales preparaciones 11, sin embargo los componentes de tratamiento de drogas y la fijación del tejido / de preparación no sería apropiado. <p class="jove...

Los receptores, en particular receptores acoplados a proteínas G (GPCRs), son objeto de tráfico rutinaria intracelularmente, hacia y desde la superficie de la célula 1. Estos procesos complejamente orquestadas y estrechamente controlados dictan complementos del receptor de células disponibles &#39;y regulan la actividad del receptor temporal, la desensibilización y resensibilización 2-4. Es importante destacar que estos procesos son sensibles a ambientes celulares, incluyendo la actividad del receptor inducida por fármacos o inactividad. Es decir, las acciones de los ligandos en los receptores pueden alterar el tráfico intracelular de estos receptores, alterando así la capacidad de respuesta celular. De esta manera, los ligandos externos ejercen aún más efectos sobre la función celular, incluso más allá clásicos cascadas-mensajero-efector a 5,6. Examinar los cambios en el tráfico del receptor inducida es difícil. Todas las técnicas disponibles implican limitaciones. Ensayos de protección de biotina se han utilizado para monitor receptores superficiales poblaciones. Estos receptores están biotinilados y un timecourse de inmunoprecipitaciones se realiza para cuantificar la reducción en los receptores de biotina en el tiempo. Esta técnica esencialmente supervisa la degradación gradual de una inicial, marcado, la población de los receptores 7, y es muy útil en la construcción de cursos de tiempo de este proceso. Por desgracia, este ensayo no es capaz de controlar cualquier procedimiento distinto de la degradación de la piscina original de receptores, tales como la internalización, reciclado o nuevos receptores. También, la adición de un anticuerpo en el rango de 150 kDa a un receptor en la gama de 50 kDa puede alterar el tráfico del receptor de 8,9, y esta técnica puede ser difícil de usar con receptores de baja a nivel de expresión. Otros procedimientos utilizan diversos métodos para identificar los compartimentos intracelulares de trata (por ejemplo, endosomas, etc.) y evaluar su colocalización con los receptores de interés. Esto incluye los EE.UU.e de los sistemas heterólogos que expresan la proteína fluorescente etiquetada-construcciones quiméricas de los receptores y los marcadores de compartimentos (GTPasas por ejemplo, Rab-familiares). Potencialmente, esto permite el uso de imágenes de células vivas, la eliminación de los problemas relacionados con la fijación y permeabilización. Mientras potente, una estrategia de este tipo adolece de las mismas limitaciones de los sistemas heterólogos en general: efectos de la etiqueta y el nivel de expresión en el tráfico de comportamiento y la incompatibilidad con los tipos de células fisiológicamente más representativos. Más popularmente, colorantes se utilizan para etiquetar fácilmente compartimentos intracelulares (por ejemplo, lisosomas, ostensiblemente) 10. Tintes, sin embargo, pueden carecer de especificidad (todos los organelos ácidos en el caso de los tintes para lisosomas) y no evaluar el tráfico a través de otros compartimentos. Sin embargo, estas técnicas permiten un control considerable sobre el sistema y las condiciones experimentales y pueden beneficiarse de los métodos de análisis de colocalización presentados aquí, a continuación. El método we aquí presentes refina el seguimiento del tráfico de receptores por colocalización. Utilizando inmunocitoquímica (CPI) para etiquetar marcadores apropiados, es posible identificar múltiples compartimentos intracelulares distintas. Esto también permite el uso de cultivos celulares primarios fisiológicamente relevantes en lugar de sistemas heterólogos. Este protocolo CPI implica la fijación de las células de interés antes de etiquetado; esto permite que el etiquetado en una punto de tiempo específico después del tratamiento (s) de drogas. Esto produce una &quot;instantánea&quot; de las asociaciones mundiales receptor de compartimentos en ese punto de tiempo. Con múltiples puntos de tiempo, un timecourse de los cambios de tráfico también puede ser construido. Brevemente, las células se etiquetan para el receptor y el compartimento intracelular de interés tratados con fármaco,, confocal fotografiado, y las fotomicrografías se analizan para cuantificar matemáticamente colocalización del receptor y el compartimiento 11. En nuestro uso, hemos examinado la colocalización de un receptor con Rab5, Rab11 y lisosomal-asociado proteína de membrana 1 (LAMP1). Estos marcadores identifican endosomas tempranos, endosomas de reciclaje, y lisosomas, respectivamente. Estas medidas colocalización actúan como sustitutos de los procesos generales de la internalización, el reciclaje y la degradación 12. Al igual que con todas las técnicas, algunas limitaciones deben ser considerados. Debido a la necesidad de imagen cada neurona individual analizada, esta técnica puede llegar a ser bastante mano de obra en función del número de condiciones y puntos de tiempo implicados. Todo immunolabeling también debe lidiar con los efectos sobre la ultraestructura celular, localización de la proteína, y la accesibilidad epítopo causados ​​por la fijación y permeabilización 13. Aunque originalmente optimizada para su uso con cultivos primarios de neuronas sensoriales primarias, este método es ampliamente compatible con otros modelos de cultivo en monocapa-plateado. El uso de un measur matemáticamente cuantificadoe de colocalización es, sobre todo, mucho más metodológicamente rigurosa que las técnicas anteriores utilizadas para evaluar los cambios de tráfico de los receptores, que a menudo se han basado en medidas subjetivas, vagas tales como superposiciones de varios canales visualmente inspeccionadas-14. Esta técnica es particularmente útil para su amplia compatibilidad con intervenciones in vivo (antes de la generación de cultivo primario), intervenciones in vitro (durante el crecimiento del cultivo), y varios etiquetado objetivos 15. Como tal, se puede adaptar a muchas preguntas de investigación diferentes.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Trizma Base</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T1503-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9888-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td align="right">258148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin from Bovine Serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7906-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from cold water fish skin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G7041-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar Cell Culture Plates: 24-well</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td align="right">720084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 circle Microscope Cover Glass</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td align="right">1254580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqua/Poly-Mount</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>18606-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Monobasic</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9638-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Dibasic</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9763-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>00380-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps - Standard/Dumoxel</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-DOR antibody</td>
			<td>MyBioSource</td>
			<td>MBS316175</td>
			<td>Used at 1:1500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-Rab5 antibody</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R7904</td>
			<td>Used at 1:750</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-Rab11 antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>05-853</td>
			<td>Used at 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-LAMP1 antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC8098</td>
			<td>Used at 1:750</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-rabbit Alexa 488 conjugated antibody</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A-21206</td>
			<td>Used at 1:200 to 1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse Alexa 594 conjugated antibody</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A-11005</td>
			<td>Used at 1:200 to 1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-goat Alexa 594 conjugated antibody</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A-11058</td>
			<td>Used at 1:200 to 1:2000</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tracking drug-induced changes in receptor post-internalization trafficking by colocalizational analysis

The intracellular trafficking of receptors is a collection of complex and highly controlled processes. Receptor trafficking modulates signaling and overall cell responsiveness to ligands and is, itself, influenced by intra- and extracellular conditions, including ligand-induced signaling. Optimized for use with monolayer-plated cultured cells, but extendable to free-floating tissue slices, this protocol uses immunolabelling and colocalizational analysis to track changes in intracellular receptor trafficking following both chronic/prolonged and acute interventions, including exogenous drug treatment. After drug treatment, cells are double-immunolabelled for the receptor and for markers for the intracellular compartments of interest. Sequential confocal microscopy is then used to capture two-channel photomicrographs of individual cells, which are subjected to computerized colocalizational analysis to yield quantitative colocalization scores. These scores are normalized to permit pooling of independent replicates prior to statistical analysis. Representative photomicrographs may also be processed to generate illustrative figures. Here, we describe a powerful and flexible technique for quantitatively assessing induced receptor trafficking.

Usando esta técnica, es posible cuantificar los cambios en el tráfico de receptor post-internalización siguientes ambos tratamientos crónicos / prolongada y agudas de drogas. Después de los tratamientos farmacológicos, la fijación y el etiquetado, de alta resolución microfotografías de dos canales son capturados de cada célula de interés. Imágenes representativas pueden combinarse con colocalización de color falso para generar figuras ilustrativas (Figura 1). Colocalizational análisis subs...

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Tracking Drug-induced Changes in Receptor Post-internalization Trafficking by Colocalizational Analysis

El tráfico del receptor modula la señalización celular y la capacidad de respuesta a ligandos y es, en sí, que responda a las condiciones celulares, incluyendo la señalización inducida por ligando. A continuación, describimos una técnica poderosa y flexible para evaluar cuantitativamente el tráfico del receptor inducida por fármacos usando immunolabeling y análisis colocalizational.

Seguimiento de cambios inducidos por fármacos en los receptores post-internalización Trata de Análisis Colocalizational

The intracellular trafficking of receptors is a collection of complex and highly controlled processes. Receptor trafficking modulates signaling and ...

tracking-drug-induced-changes-receptor-post-internalization

Research

JoVE Journal

Biology

8.7K vistas.  University of California Irvine.  El tráfico del receptor modula la señalización celular y la capacidad de respuesta a ligandos y es, en sí, que responda a las condiciones celulares, incluyendo la señalización inducida por ligando. A continuación, describimos una técnica poderosa y flexible para evaluar cuantitativamente el tráfico del receptor inducida por fármacos usando immunolabeling y análisis colocalizational. 

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Tracking Dynamics of Muscle Engraftment in Small Animals by In Vivo Fluorescent Imaging

Muscular dystrophies are a group of degenerative muscle diseases characterized by progressive loss of contractile muscle cells. Currently, there is no curative treatment available. Recent advances in stem cell biology have generated new hopes for the development of effective cell based therapies to treat these diseases. Transplantation of various types of stem cells labeled with fluorescent proteins into muscles of dystrophic animal models has been used broadly in the field. A non-invasive technique with the capability to track the transplanted cell fate longitudinally can further our ability to evaluate muscle engraftment by transplanted cells more accurately and efficiently.
In the present study, we demonstrate that in vivo fluorescence imaging is a sensitive and reliable method for tracking transplanted GFP (Green Fluorescent Protein)-labeled cells in mouse skeletal muscles. Despite the concern about background due to the use of an external light necessary for excitation of fluorescent protein, we found that by using either nude mouse or eliminating hair with hair removal reagents much of this problem is eliminated. Using a CCD camera, the fluorescent signal can be detected in the tibialis anterior (TA) muscle after injection of 5 x 105 cells from either GFP transgenic mice or eGFP transduced myoblast culture. For more superficial muscles such as the extensor digitorum longus (EDL), injection of fewer cells produces a detectable signal. Signal intensity can be measured and quantified as the number of emitted photons per second in a region of interest (ROI). Since the acquired images show clear boundaries demarcating the engrafted area, the size of the ROI can be measured as well. If the legs are positioned consistently every time, the changes in total number of photons per second per muscle and the size of the ROI reflect the changes in the number of engrafted cells and the size of the engrafted area. Therefore the changes in the same muscle over time are quantifiable. In vivo fluorescent imaging technique has been used primarily to track the growth of tumorogenic cells, our study shows that it is a powerful tool that enables us to track the fate of transplanted stem cells.

Tracking Dynamics of Muscle Engraftment in Small Animals by In Vivo Fluorescent Imaging

We describe an in vivo fluorescence imaging protocol to monitor muscle regeneration by GFP-labeled myoblasts after transplantation into skeletal muscles of both healthy and dystrophic mice. This protocol can be adapted to study muscle regeneration by transplantation of other types of cells and in other muscular conditions as well.

Seguimiento de Dinámica de injerto muscular en pequeños animales por En Vivo Fluorescente de imágenes

Muscular dystrophies are a group of degenerative muscle diseases characterized by progressive loss of contractile muscle cells. Currently, there is no ...

Investigación

Biología

Environmentally Induced Heritable Changes in Flax

Some flax varieties respond to nutrient stress by modifying their genome and these modifications can be inherited through many generations. Also associated with these genomic changes are heritable phenotypic variations 1,2. The flax variety Stormont Cirrus (Pl) when grown under three different nutrient conditions can either remain inducible (under the control conditions), or become stably modified to either the large or small genotroph by growth under high or low nutrient conditions respectively. The lines resulting from the initial growth under each of these conditions appear to grow better when grown under the same conditions in subsequent generations, notably the Pl line grows best under the control treatment indicating that the plants growing under both the high and low nutrients are under stress. One of the genomic changes that are associated with the induction of heritable changes is the appearance of an insertion element (LIS-1) 3, 4 while the plants are growing under the nutrient stress. With respect to this insertion event, the flax variety Stormont Cirrus (Pl) when grown under three different nutrient conditions can either remain unchanged (under the control conditions), have the insertion appear in all the plants (under low nutrients) and have this transmitted to the next generation, or have the insertion (or parts of it) appear but not be transmitted through generations (under high nutrients) 4. The frequency of the appearance of this insertion indicates that it is under positive selection, which is also consistent with the growth response in subsequent generations. Leaves or meristems harvested at various stages of growth are used for DNA and RNA isolation. The RNA is used to identify variation in expression associated with the various growth environments and/or t he presence/absence of LIS-1. The isolated DNA is used to identify those plants in which the insertion has occurred.

Growing some flax varieties under nutrient stress results in genomic variation within a subset of the genome and phenotypic variation. A complex insertion at a specific site is associated with growth under various nutrient regimes and with changes in gene expression around this site.

Inducidas por factores ambientales cambios heredables en lino

Some flax varieties respond to nutrient stress by modifying their genome and these modifications can be inherited through many generations. Also ...

Monitoring Equilibrium Changes in RNA Structure by 'Peroxidative' and 'Oxidative' Hydroxyl Radical Footprinting

RNA molecules play an essential role in biology. In addition to transmitting genetic information, RNA can fold into unique tertiary structures fulfilling a specific biologic role as regulator, binder or catalyst. Information about tertiary contact formation is essential to understand the function of RNA molecules. Hydroxyl radicals (&bull;OH) are unique probes of the structure of nucleic acids due to their high reactivity and small size.1 When used as a footprinting probe, hydroxyl radicals map the solvent accessible surface of the phosphodiester backbone of DNA1 and RNA2 with as fine as single nucleotide resolution. Hydroxyl radical footprinting can be used to identify the nucleotides within an intermolecular contact surface, e.g. in DNA-protein1 and RNA-protein complexes. Equilibrium3 and kinetic4 transitions can be determined by conducting hydroxyl radical footprinting as a function of a solution variable or time, respectively. A key feature of footprinting is that limited exposure to the probe (e.g., 'single-hit kinetics') results in the uniform sampling of each nucleotide of the polymer.5
In this video article, we use the P4-P6 domain of the Tetrahymena ribozyme to illustrate RNA sample preparation and the determination of a Mg(II)-mediated folding isotherms. We describe the use of the well known hydroxyl radical footprinting protocol that requires H2O2 (we call this the 'peroxidative' protocol) and a valuable, but not widely known, alternative that uses naturally dissolved O2 (we call this the 'oxidative' protocol). An overview of the data reduction, transformation and analysis procedures is presented.

Monitoring Equilibrium Changes in RNA Structure by &#039;Peroxidative&#039; and &#039;Oxidative&#039; Hydroxyl Radical Footprinting

This protocol describes how to quantify the Mg(II)-dependent formation of RNA tertiary structure by two methods of hydroxyl radical footprinting.

Seguimiento de los cambios de equilibrio en la estructura del ARN por &quot;peroxidación&quot; y &quot;oxidativo&quot; Huella de radicales hidroxilo

RNA molecules play an essential role in biology. In addition to transmitting genetic information, RNA can fold into unique tertiary structures fulfilling ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

En Vivo Tracking 4-Dimensional de madre hematopoyéticas y células progenitoras en ratones adultos de calota de Médula Ósea

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, corticotrophin releasing hormone (CRH) is released from the hypothalamus in the brain. This stimulates the release of adrenocorticotrophic hormone (ACTH) from the pituitary gland, which in turn stimulates release of glucocorticoids from the adrenal gland. In horses the glucocorticoid corticosterone is responsible for several adaptations needed to support equine flight behaviour and subsequent removal from the aversive situation. Corticosterone metabolites can be detected in the feces of horses and assessment offers a non-invasive option to evaluate long term patterns of adrenal activity. Fecal assessment offers advantages over other techniques that monitor adrenal activity including blood plasma and saliva analysis. The non-invasive nature of the method avoids sampling stress which can confound results. It also allows the opportunity for repeated sampling over time and is ideal for studies in free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay (EIA) used to assess feces for corticosterone, in addition to the associated biochemical validation.

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. The method offers a non-invasive option to assess long term patterns in both domestic and free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay involved and the associated biochemical validation.

Análisis de glucocorticoides fecales: Monitoreo suprarrenal no invasiva en los équidos

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...

Analysis of SCAP N-glycosylation and Trafficking in Human Cells

Elevated lipogenesis is a common characteristic of cancer and metabolic diseases. Sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs), a family of membrane-bound transcription factors controlling the expression of genes important for the synthesis of cholesterol, fatty acids and phospholipids, are frequently upregulated in these diseases. In the process of SREBP nuclear translocation, SREBP-cleavage activating protein (SCAP) plays a central role in the trafficking of SREBP from the endoplasmic reticulum (ER) to the Golgi and in subsequent proteolysis activation. Recently, we uncovered that glucose-mediated N-glycosylation of SCAP is a prerequisite condition for the exit of SCAP/SREBP from the ER and movement to the Golgi. N-glycosylation stabilizes SCAP and directs SCAP/SREBP trafficking. Here, we describe a protocol for the isolation of membrane fractions in human cells and for the preparation of the samples for the detection of SCAP N-glycosylation and total protein by using western blot. We further provide a method to monitor SCAP trafficking by using confocal microscopy. This protocol is appropriate for the investigation of SCAP N-glycosylation and trafficking in mammalian cells.

Analysis of SCAP N-glycosylation and Trafficking in Human Cells

We describe a modified method for membrane fraction isolation from human cells and sample preparation for the detection of SCAP N-glycosylation and total protein by using western blot. We further introduce a GFP-labeling method to monitor SCAP trafficking using confocal microscopy. This protocol can be used in regular biology laboratories.

Análisis de SCAP<em&gt; N</em&gt; -glycosylation Y el tráfico en las células humanas

Elevated lipogenesis is a common characteristic of cancer and metabolic diseases. Sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs), a family of ...

Live Cell Imaging and 3D Analysis of Angiotensin Receptor Type 1a Trafficking in Transfected Human Embryonic Kidney Cells Using Confocal Microscopy

Live-cell imaging is used to simultaneously capture time-lapse images of angiotensin type 1a receptors (AT1aR) and intracellular compartments in transfected human embryonic kidney-293 (HEK) cells following stimulation with angiotensin II (Ang II). HEK cells are transiently transfected with plasmid DNA containing AT1aR tagged with enhanced green fluorescent protein (EGFP). Lysosomes are identified with a red fluorescent dye. Live-cell images are captured on a laser scanning confocal microscope after Ang II stimulation and analyzed by software in three dimensions (3D, voxels) over time. Live-cell imaging enables investigations into receptor trafficking and avoids confounds associated with fixation, and in particular, the loss or artefactual displacement of EGFP-tagged membrane receptors. Thus, as individual cells are tracked through time, the subcellular localization of receptors can be imaged and measured. Images must be acquired sufficiently rapidly to capture rapid vesicle movement. Yet, at faster imaging speeds, the number of photons collected is reduced. Compromises must also be made in the selection of imaging parameters like voxel size in order to gain imaging speed. Significant applications of live-cell imaging are to study protein trafficking, migration, proliferation, cell cycle, apoptosis, autophagy and protein-protein interaction and dynamics, to name but a few.

Here we present a protocol to image cells expressing green fluorescent protein-tagged angiotensin type 1a receptors during endocytosis initiated by angiotensin II treatment. This technique includes labeling lysosomes with a second fluorescent marker, and then utilizing software to analyze the co-localization of receptor and lysosome in three dimensions over time.

Imágenes de células vivas y análisis 3D del receptor de angiotensina Tipo 1a Tráfico transfectadas en células de riñón embrionarias humanas Utilizando microscopía confocal

Live-cell imaging is used to simultaneously capture time-lapse images of angiotensin type 1a receptors (AT1aR) and intracellular compartments in ...

Detection of Ligand-activated G Protein-coupled Receptor Internalization by Confocal Microscopy

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is an optical imaging technique for high-contrast imaging. It is a powerful approach to visualize fluorescent fusion proteins, such as green fluorescent protein (GFP), to determine their expression, localization, and function. The subcellular localization of target proteins is important for identification, characterization, and functional analyses. Internalization is one of the predominant mechanisms controlling G protein-coupled receptor (GPCR) signaling to ensure the appropriate cellular responses to stimuli. Here, we describe an experimental method to detect the subcellular localization and internalization of GPCR in HEK293 cells with confocal microscopy. In addition, this experiment provides some details about cell culture and transfection. This protocol is compatible with a variety of widely available fluorescent markers and is applicable to the visualization of the subcellular localization of a majority of proteins, as well as of the internalization of GPCR. This technique should enable researchers to efficiently manipulate GPCR gene expression in mammalian cell lines and should facilitate studies on GPCR subcellular localization and internalization.

This protocol describes confocal microscopy detection of G protein-coupled receptor (GPCR) internalization in mammalian cells. It includes the basic cell culture, transfection, and confocal microscopy procedure and provides an efficient and easily interpretable method to detect the subcellular localization and internalization of fusion-expressed GPCR.

La detección de activados por ligando G receptor acoplado a proteína internalización por microscopía confocal

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is an optical imaging technique for high-contrast imaging. It is a powerful approach to visualize fluorescent ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex signaling mechanisms underlying filopodial initiation, elongation and subsequent stabilization or retraction, it is crucial to determine the spatio-temporal protein activity in these dynamic structures. To analyze protein function in filopodia, we recently developed a semi-automated tracking algorithm that adapts to filopodial shape-changes, thus allowing parallel analysis of protrusion dynamics and relative protein concentration along the whole filopodial length. Here, we present a detailed step-by-step protocol for optimized cell handling, image acquisition and software analysis. We further provide instructions for the use of optional features during image analysis and data representation, as well as troubleshooting guidelines for all critical steps along the way. Finally, we also include a comparison of the described image analysis software with other programs available for filopodia quantification. Together, the presented protocol provides a framework for accurate analysis of protein dynamics in filopodial protrusions using image analysis software.

We present a software solution for semi-automated tracking of relative protein concentration along the length of dynamic cellular protrusions.

Una interfaz gráfica de usuario para el seguimiento asistido por software de la concentración de proteínas en protones dinámicos celulares

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

Real Time In Vivo Tracking of Thymocytes in the Anterior Chamber of the Eye by Laser Scanning Microscopy

The purpose of the method being presented is to show, for the first time, the transplant of newborn thymi into the anterior eye chamber of isogenic adult mice for in vivo longitudinal real-time monitoring of thymocytes&#180; dynamics within a vascularized thymus segment. Following the transplantation, laser scanning microscopy (LSM) through the cornea allows in vivo noninvasive repeated imaging at cellular resolution level. Importantly, the approach adds to previous intravital T-cell maturation imaging models the possibility for continuous progenitor cell recruitment and mature T-cell egress recordings in the same animal. Additional advantages of the system are the transparency of the grafted area, permitting macroscopic rapid monitoring of the implanted tissue, and the accessibility to the implant allowing for localized in addition to systemic treatments. The main limitation being the volume of the tissue that fits in the reduced space of the eye chamber which demands for lobe trimming. Organ integrity is maximized by dissecting thymus lobes in patterns previously shown to be functional for mature T-cell production. The technique is potentially suited to interrogate a milieu of medically relevant questions related to thymus function that include autoimmunity, immunodeficiency and central tolerance; processes which remain mechanistically poorly defined. The fine dissection of mechanisms guiding thymocyte migration, differentiation and selection should lead to novel therapeutic strategies targeting developing T cells.

Real Time In Vivo Tracking of Thymocytes in the Anterior Chamber of the Eye by Laser Scanning Microscopy

The goal of the protocol is to show longitudinal intravital real-time tracking of thymocytes by laser scanning microscopy in thymic implants in the anterior chamber of the mouse eye. The transparency of the cornea and vascularization of the graft allows for continuously recording progenitor cell recruitment and mature T-cell egress.

Seguimiento en Vivo de los timocitos en el compartimiento Anterior del ojo mediante láser, microscopía en tiempo real

The purpose of the method being presented is to show, for the first time, the transplant of newborn thymi into the anterior eye chamber of isogenic adult ...