Las respuestas celulares a los estímulos externos dependen en gran medida del conjunto de proteínas que se expresan en la superficie celular en un momento dado. En consecuencia, el número, la localización subcelular y la composición de subunidades de estas proteínas se controlan dinámicamente. Aquí, utilizaremos un enfoque de alimentación de anticuerpos para cuantificar el nivel de receptores expresados en superficie en cultivos celulares, siempre y cuando se reanude la internalización y el reciclaje.
Este es un protocolo muy versátil, que proporciona información mecanicista de la regulación de las proteínas expresadas en superficie. En nuestro ejemplo, estudiaremos los receptores de glutamina en las neuronas hipocampales primarias. Este protocolo se puede adaptar a cualquier proteína que posea un epilátopo extracelular anagénico, si no hay anticuerpos disponibles, la transvección de construcciones etiquetadas puede ser útil tanto para el etiquetado como para el estudio de mutaciones específicas.
En nuestros ejemplos, utilizamos anticuerpos contra GluA1 endógenos, y etiquetado Glu12 B.To comenzar este procedimiento, transferir la cubierta desliza el lado de la célula a una bandeja cubierta de película de parafina, para guardar reactivos y facilitar la manipulación. Guarde y mantenga los medios acondicionados a 37 grados centígrados para la incubación y los pasos de lavado. Incubar las células con anticuerpos primarios diluidos en medios acondicionados, a temperatura ambiente, durante 15 minutos.
Después de esto, utilice una pipeta de vacío para aspirar cuidadosamente el anticuerpo que contiene medios, y lave las células tres veces con medios acondicionados. Si estudia la superficie frente a la expresión del receptor intracelular, corrija las células con paraformaldehído después de este paso, como se describe en el protocolo de texto. Mantener las células en medios condicionados sin anticuerpos, y devolverlas a la incubadora a 37 grados Celsius para permitir la internalización.
Si estudia el proceso de internalización, corrija las celdas con paraformaldehído después de este paso, como se describe en el protocolo de texto. Para bloquear los epítopos en el anticuerpo primario unido a la superficie expresó receptores que no han sido internalizados, incubar células con fragmentos de anticuerpos Anti-IgG Fab no conjurados diluidos en medios condicionados, durante 20 minutos a temperatura ambiente. Después de esto, lave las células tres veces con medios acondicionados.
Incubar los pozos lavados con medios acondicionados que contengan 80 micras de 80 micromolares Dynasore, a 37 grados centígrados, para permitir el reciclaje de receptores internalizados. Después de terminar las modificaciones en células vivas, lave las células una vez con PBS plus. Añadir una solución de 4%paraformaldehído y 4%sacarosa en PBS a las células, e incubar en una campana de humo a temperatura ambiente durante siete a ocho minutos, para fijar las células.
Luego lave las células tres veces con PBS regular. Añadir una solución de 10%Normal Goat Serum en PBS a las células, e incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos, para bloquear sitios de unión no específicos. A continuación, incubar las células con anticuerpos secundarios con etiqueta fluorescente diluidos en 3%NGS en PBS a temperatura ambiente durante una hora, para etiquetar los receptores primarios de la etiqueta de anticuerpos.
Después de esto, lave las células tres veces con PBS. Para comenzar a etiquetar los receptores intracelulares, añadir una solución de 0.25%TritonX en PBS, e incubar a temperatura ambiente durante cinco a 10 minutos, para permeabilizar las células. A continuación, bloquee con 10%NGS a temperatura ambiente durante 30 minutos.
Si estudia la superficie frente al total, incubar las células con el mismo anticuerpo primario utilizado anteriormente, diluidas con 3%NGS en PBS, a temperatura ambiente durante una hora, para etiquetar los receptores intracelulares. A continuación, lave las células tres veces con PBS. Etiqueta con segundo anticuerpo secundario con etiqueta fluorescente, diluido en 3%NGS en PBS, a temperatura ambiente durante una hora.
Después de esto lavar las células tres veces con PBS. En primer lugar coloque suavemente los resbalones de la cubierta, el lado de la celda hacia abajo, en 12 a 15 microlitros del medio de montaje adecuado para montar las células. A continuación, imagine las celdas en el microscopio confocal adecuado y analice las celdas como se describe en el protocolo de texto.
Este protocolo para estudiar el tráfico de receptores de glutamato se basa en el etiquetado diferencial de los receptores, expresado en la superficie celular, y los expresados en las membranas internas. Después de adquirir imágenes confocales, la señal fluorescente se puede cuantificar fácilmente para mostrar un aumento en la expresión superficial, en relación con la población intracelular, después de LTP químico. No se puede obtener ninguna señal para PSD-95 en células no permeabilizadas, lo que demuestra la integridad de la membrana plasmática.
Esto indica que la señal obtenida para la superficie GluA1 corresponde efectivamente a los receptores expresados en superficie. Es importante destacar que se puede observar una señal mínima para GluA1 internalizado en condiciones no permeabilización, lo que demuestra que todos los epítopos de la superficie están ocupados por la ronda inicial de etiquetado de anticuerpos. A continuación, se identifican los receptores que se han interiorizado.
Este ejemplo destaca que la fosforilación GluN2B en S1480 promueve la internalización del receptor. Como el mutante fosfomimético S1480E mostró una relación de internalización mucho mayor en comparación con los receptores de tipo salvaje. Como era de esperar, no se obtiene ninguna señal para los receptores internalizados en el control.
A continuación, se identifican los receptores reciclados y los receptores internalizados. La relación de reciclaje generada muestra que GluN2B S1480E no tiene ningún efecto en el reciclaje NMDAR. En el control, se puede observar una señal fuerte para la superficie expresada GluN2B en ausencia de bloqueo Fab.
Esta señal desaparece en los cultivos tratados con Fab, demostrando que el protocolo de bloqueo es suficiente para bloquear completamente la superficie expresada epítopos, y que las señales superficiales observadas después del reciclaje corresponden efectivamente a los receptores traficados de vuelta a la membrana plasmática. El protocolo actual es sólo uno de los métodos disponibles para estudiar la regulación de las proteínas expresadas en superficie. Se pueden tomar otros enfoques para ampliar o verificar los datos obtenidos aquí.
Estos incluyen métodos bioquímicos, como biotinilación, técnicas de imagen de vida o enfoques funcionales, como electrofisiología o imágenes de calcio. Utilizamos PFA para congelar la localización de receptores, sin embargo PFA es un carcinógeno conocido, por lo que es crucial realizar pasos usando PFA bajo una campana de humo, mientras usa el EPP adecuado.
