Los autores agradecen al Dr. Kent Seeley, Director del Centro para el Descubrimiento de Medicamentos e Innovación (CDDI) Facilidad de Proteómica de la Universidad del Sur de Florida para el uso de este servicio. Este trabajo fue apoyado por la beca NIH / NIDCD R01 DC004295 a BHAS

Declaración de Ética Los experimentos con tejido de ratones fueron aprobados por la Universidad del Sur de Florida Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comisión (Protocolos 3931R, 3482R) como se establece en virtud de las directrices de los Institutos Nacionales de Salud. 1. Extracción de proteínas <ol><li> Aislar epitelio sensorial coclear de 16 a 30 días de edad (P30) CBA / J ratones y almacenar a -80 ° C. </li><li> En el día del experimento, lavar el tejido con 500 l de 1x tampón fosfato salino (PBS). Se centrifuga durante 3 minutos a 1.000 xg, y eliminar el sobrenadante. Repita la operación para un total de tres lavados. </li><li> Tejido Someter a ultrasonidos durante 30 segundos en hielo en 100 l de tampón de lisis que contiene 50 mM de Tris-HCl, pH 8,0, NaCl 120 mM, NaF 50 mM, EDTA 5 mM, 500 mg / ml de AEBSF, 10 mg / ml de leupeptina, 100 g / ml de pepstatina, 2 mg / ml de aprotinina, y 0,5 mg / ml utilizando un microcistina Dismembrator sónica (Modelo 100; Thermo Fisher). Lisado Enfriar en hielodurante 1 min entre cada sonicación. Sonicar un total de 3 veces. </li><li> Centrifugar la solución a 750 xga 4 ° C durante 2 min y separar el sobrenadante a un nuevo microtubo. Extraer el precipitado en 50 l de tampón de lisis por sonicación durante 30 segundos en hielo. Centrifugar la solución a 750 xga 4 º C durante 2 min. Combinar ambos lisados ​​y centrifugar a 28.600 xga 4 º C durante 60 min. Eliminar el sobrenadante a un nuevo microtubo y añadir tampón de lisis 20 l que contiene 0,1% de ASB-14 al sedimento. Vortex durante 1 min y se incuba durante 60 min a 4 ° C. </li><li> Calentar la muestra a 95 ° C durante 5 min, luego se enfría a 4 ° C durante 60 min. Siga con centrifugación a 16.000 xg a 25 º C durante 10 min. Se recoge el sobrenadante y transferir a un tubo nuevo. </li><li> Centrifugar la suspensión a 16.000 xg a 4 ° C durante 5 min y retener el sobrenadante para la digestión. </li></ol> 2. Doble digestión de la proteína trípticos de Todo el lisado Usando FASP <ol><li> Añadir un 30 μl alícuota (≤ 400 g) de extracto de proteína coclear, que contiene 4% de dodecil sulfato de sodio (SDS), 100 mM de Tris-HCl, pH 7,6 y 0,1 M de ditiotreitol (DTT) directamente a un filtro giratorio 30K y mezclar con 200 l de 8 M de urea en Tris-HCl. Se centrifuga a 14.000 xg durante 15 min. </li><li> Diluir el concentrado con 200 l de solución de urea 8 M y se centrifuga a 14.000 xg durante 15 min. </li><li> Añadir 10 l de 10x yodoacetamida (IAA) en solución 8 M de urea al concentrado en el filtro y agitar durante 1 min. Incubar el filtro de centrifugado durante 20 min a temperatura ambiente (TA) en la oscuridad, seguido por centrifugación a 14.000 xg durante 10 min. </li><li> Añadir 100 l de solución 8 M de urea al concentrado en la unidad de filtro y se centrifuga a 14.000 xg durante 15 min. Repita este paso 2x. Añadir 100 l de bicarbonato de amonio 50 mM de solución (ABC) a la unidad de filtro y se centrifuga a 14.000 xg durante 10 min. Repita este paso 2x. </li><li> Añadir 0,4 g / l de tripsina en 1:100 (w / w) de la enzima a--Ratio proteína y se incuba durante la noche (O / N) a 37 ° C. </li><li> Después de la incubación, añadir 40 l de 50 mM de solución de ABC para filtrar unidad y se centrifuga a 14.000 xg durante 10 min. Repita este paso 1x. </li><li> Añadir 50 l de solución 0,5 M de NaCl para el filtro giratorio y se centrifuga a 14.000 xg durante 10 min. Transferir el filtrado que contiene los péptidos trípticos a un microtubo fresco y acidificar con ácido fórmico (FA) al 1,0% para detener la digestión. </li><li> Lavar la unidad de filtro con 40 l de 8 M de urea, y luego se lava 2 veces con 40 l 18 MΩ agua. </li><li> Lave el filtro de la unidad 3 veces con 100 l de 50 mM solución ABC. Después del lavado final añadir 0,4 g / l de tripsina en 1:100 (w / w) Relación de enzima a proteína e incubar O / N a 37 ° C. </li><li> Eluir péptidos trípticos de la segunda digerir mediante la adición de 40 l de solución mM ABC 50 a la unidad de filtro y se centrifuga a 14.000 xg durante 10 min. Repita este paso 1x. </li><li> Añadir 50 l de solución de NaCl 0,5 M a launidad de filtro y se centrifuga a 14.000 xg durante 10 min. Transferir el filtrado que contiene los péptidos trípticos a un microtubo nuevo y se acidifica con FA a 1,0%. </li><li> Las muestras se pueden cuantificar utilizando el ensayo colorimétrico de microplacas utilizando BSA como estándar. </li></ol> 3. Endoproteinasa LysC y tríptica Proteína La digestión de Whole lisado Usando FASP <ol><li> Añadir una alícuota de 30 l (≤ 400 g) de extracto de proteína coclear que contiene 4% de SDS, Tris-HCl 100, pH 7,6 y 0,1 M DTT directamente a un filtro giratorio 30K y mezclar con 200 l de urea 8 M en Tris-HCl . Se centrifuga a 14.000 xg durante 15 min. </li><li> Diluir el concentrado con 200 l de solución de urea 8 M y se centrifuga a 14.000 xg durante 15 min. </li><li> Añadir 10 l de 10x IAA en solución 8 M de urea al concentrado en el filtro y agitar durante 1 min. Incubar el filtro de centrifugado durante 20 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad y luego se centrifuga a 14000 × g durante 10 min. </li><li> Añadir 100 l de sol 8 M urealución al concentrado en la unidad de filtro y se centrifuga a 14.000 xg durante 15 min. Repita este paso 2x. Añadir 100 l de 100 mM de solución de ABC a la unidad de filtro y se centrifuga a 14.000 xg durante 10 min. Repita este paso 2x. </li><li> Añadir 0,1 g / l de endoproteinasa LysC en un 01:50 (w / w) Relación de enzima a proteína y se incuban O / N a 30 ° C. </li><li> Después de la incubación, añadir 40 l de 100 mM de solución de ABC a la unidad de filtro y se centrifuga a 14.000 xg durante 10 min. Repita este paso 1x. </li><li> Añadir 50 l de solución 0,5 M de NaCl para el filtro giratorio y se centrifuga a 14.000 xg durante 10 min. Transferir el filtrado que contiene los péptidos lysC a un microtubo fresco y acidificar con FA a 1,0% para detener la digestión. </li><li> Lavar la unidad de filtro con 40 l de 8 M de urea, y luego se lava 2 veces con 40 l 18 MΩ agua. </li><li> Lave el filtro de la unidad 3 veces con 100 l de 50 mM solución ABC. Después del lavado final, se añadirán 0,4 g / l de tripsina 1:100 en-enzima-a Prorelación de proteína e incubar O / N a 37 ° C. </li><li> Eluir péptidos trípticos mediante la adición de 40 l de solución mM ABC 50 a la unidad de filtro y se centrifuga a 14.000 xg durante 10 min. Repita este paso 1x. </li><li> Añadir 50 l de solución 0,5 M de NaCl a la unidad de filtro y se centrifuga a 14.000 xg durante 10 min. Transferir el filtrado que contiene los péptidos trípticos a un microtubo nuevo y se acidifica con 1,0% FA. </li><li> La muestra puede ser cuantificada usando el ensayo colorimétrico de microplacas con BSA como estándar. </li></ol> 4. Péptidos desalado el uso de columnas de Spin <ol><li> Activar una columna C 18 MacroSpin mediante la adición de 500 l de acetonitrilo (ACN) y se centrifuga a 1100 xg durante 1 min. Deseche el flujo continuo después de la centrifugación. </li><li> Equilibrar la columna con 500 l de 0,1% FA y centrifugar a 1100 xg durante 1 min. Deseche el filtrado y repita este paso 1x. </li><li> Agregue hasta 500 l de péptido digerir a la de una columnad centrifugar a 1100 xg durante 1 min. Si el volumen de la muestra es superior a 500 l continuación, repita este paso. </li><li> Lavar la columna con 500 l de 0,1% FA y centrifugar a 1100 xg durante 1 min. Deseche el flujo directo. Repita este paso 1x. </li><li> Añadir 250 l de una relación de 90:10 a-ACN-a agua a la columna y centrifugar a 1100 xg durante 1 min. Recoger el eluyente que contiene los péptidos desalado y traslado a un microtubo fresco. Repita este paso 1x. </li><li> Secar la muestra de péptido desalado en una centrífuga de vacío y evitar que la muestra se seque por completo. </li></ol> 5. Cromatografía de intercambio iónico <ol><li> Inyectar 50-100 g de muestra de proteína digerida en un 200 x 2,1 mm, columna SCX m 5 (Polysulfoethyl A) para separar los péptidos. </li><li> Utilice un gradiente de 2-40% de B durante 50 min con una velocidad de flujo de 250 l / min. El disolvente A es formiato de amonio 5 mM, pH 3,0 en 25% de acetonitrilo y 75% ddH 2 O. Disolvente B es formiato de amonio 500 mM, pH6,0 en el 25% y el 75% ACN ddH 2 O. </li><li> Monitorear las fracciones de péptidos a 280 nm y recoger las fracciones en intervalos de 2 min utilizando un colector de fracciones. </li><li> Fracciones secas en un concentrador de vacío y resuspender en 500 l de acetonitrilo al 50% en ddH2O contiene 5% de FA para ayudar en la extracción de sal. </li><li> Fracciones resecar y almacenarlos a -80 ° C hasta su utilización para el análisis LC-MS/MS nano. </li></ol> 6. Precipitación con acetona Antes de la separación GELFrEE el sobrenadante proteína coclear tiene que ser desalada. Precipitación con acetona se puede utilizar para desalar y concentrar las proteínas. <ol><li> Añadir tres volúmenes de acetona helada al sobrenadante coclear. Agite suavemente y se incuba a 20 ° CO / N. </li><li> Centrifugar la mezcla de la muestra a 15.000 xg durante 15 min a 4 ° C y retirar el sobrenadante. </li><li> Lavar el 3x proteína de pellets con acetona fría y se centrifuga a 14.000 xg durante 5 min a 4° C. </li><li> Aire secar el pellet y se disuelven en 112 l de 18 MΩ agua. </li><li> Determinar la concentración de proteína usando el ensayo colorimétrico de microplacas. </li></ol> 7. GELFrEE Fraccionamiento de coclear sensorial Epitelio <ol><li> Añadir 30 l de 5x tampón de muestra (0,25 M de Tris-HCl, pH 6,8, 10% (w / v) SDS, 50% de glicerol, 0,5% (w / v) de azul de bromofenol) a la proteína desalada en suspensión en 112 l de 18 MΩ agua. </li><li> Añadir 8 l de DTT 1 M y se calienta a 95 ° C durante 5 minutos para reducir los enlaces disulfuro de la proteína. Después de calentar permitir enfriar a temperatura ambiente. </li><li> Añadir 8 ml de tampón de depósito de ánodo, 150 l de tampón de probar la cámara de recolección, y 6 ml de tampón de depósito de cátodo. </li><li> Retire cualquier búfer que puede haber fluido en la cámara de muestra de carga utilizando una pipeta. </li><li> Carga 150 l (≤ 1 mg) de la mezcla de proteínas coclear, en la cámara de muestra de carga utilizando un 8% Tres-acetato de cartucho con un intervalo de masa de 3,5 a 150 kDa. </li><li> Electrodos más bajas y la tapa del instrumento para iniciar la carrera. </li><li> En el primer tiempo de pausa en el instrumento añadir 2 ml de tampón al depósito catódico y reanudar plazo. </li><li> En cada intervalo de pausa en el instrumento, recoger la muestra de la cámara de recolección de la muestra con una pipeta y añadir a un microtubo recién etiquetados. Lávese las 2x cámara colección con 150 l de tampón y deseche. </li><li> Añadir 150 l de tampón dulce corriente a la cámara de recogida de muestras y reanudar la ejecución. Reunir las fracciones de proteína durante un periodo de tiempo de 2,6 horas en un volumen total de 150 l / fracción. </li></ol> 8. Gel Electroforesis 1D de GELFrEE fracciones Electroforesis en gel de 1D puede utilizarse para visualizar los resultados de GELFrEE fraccionamiento antes de la digestión enzimática y el análisis de MS. Fracciones de proteína GELFrEE se pueden separar en un gel de Tris-HCl 4-15%. </p&gt; <ol><li> Mezcle una alícuota de 5 l de cada fracción GELFrEE con 5 l de muestra de tampón de dilución (DTT 350 mM en tampón de muestra). </li><li> Calentar las muestras a 95 ° C durante 3 min. </li><li> Muestras de enfriar a ta. </li><li> De carga 10 l de cada fracción GELFrEE en carriles de gel individuales y de carga 5 l de estándar de peso molecular en el último carril no utilizado. </li><li> Correr el gel a 125 V durante 1,5 horas o hasta que el frente del colorante llega a la parte inferior del gel. </li><li> Retire con cuidado el gel y teñir con Silver Stain Plus para visualizar la separación de proteínas. </li></ol> 9. Proteína La digestión de las fracciones GELFrEE Uso FASP Un procedimiento FASP modificado se utiliza para la eliminación del detergente y la digestión de las fracciones GELFrEE. <ol><li> Añadir cada fracción individual directamente a una unidad de filtro de 30K; mezclar con 200 l de urea 8 M en Tris-HCl y se centrifuga a 14.000 xg durante 25 min. </li><li> Diluir el concentrado con 200 l de solución de ureay se centrifuga a 14.000 xg durante 12 min. Repita este paso 1x. </li><li> Añadir 10 l de 10x IAA en solución de urea al concentrado en cada unidad de filtro, de vórtice durante 1 min, y se incuba durante 30 min a TA en la oscuridad. </li><li> Añadir 100 l de solución de urea al concentrado en las unidades de filtro y centrifugar a 14.000 xg durante 15 min. Repita este paso 2x. Añadir 100 l de 100 mM de solución de ABC para las unidades de filtro y centrifugar a 14.000 xg durante 10 min. Repita este paso 2x. </li><li> Añadir 0,1 g / l de LysC para un 1:50 (W / W) Relación de enzima a la proteína a las unidades de filtro y se incuba O / N a 30 º C. </li><li> Después de la incubación, añadir 40 l de 100 mM de solución de ABC para los filtros de spin y se centrifuga a 14.000 xg durante 10 min. Repita este paso 1x. </li><li> Añadir 50 l de solución 0,5 M de NaCl a los filtros de spin y se centrifuga a 14.000 xg durante 10 min. Transferir el filtrado que contiene los péptidos LysC de cada filtro de selección para un microtubo nuevo y se acidifica con trifluoroacácido etic (TFA). </li><li> Lavar los filtros de spin con 40 l de urea 8 M, luego se lava 2 veces con 40 l 18 MΩ agua. </li><li> Lavar los filtros de spin 3 veces con 100 l de 50 mM solución ABC. Después del lavado final añadir 0,4 g / l de tripsina en un 1:100 (w / w) Relación de enzima a proteína e incubar O / N a 37 ° C. </li><li> Eluir péptidos trípticos de cada unidad de filtro mediante la adición de 40 l de 50 mM de solución de ABC y se centrifuga a 14.000 xg durante 10 min. Repita este paso 1x. </li><li> Añadir 50 l de solución 0,5 M de NaCl a las unidades de filtro y centrifugar a 14.000 xg durante 10 min. Transferir el filtrado que contiene los péptidos trípticos de cada unidad de filtro a un microtubo fresco y acidificar con TFA. </li><li> Seque todas las digestiones en un concentrador de vacío. </li></ol> 10. Preparación de muestras para LC-MS/MS <ol><li> LysC Reconstituir seca y péptido tríptico digiere fracciones en 20 l de 0,1% FA y agitar. </li><li> Centrifugar las muestras a 20.000 xg durante 10min y retirar el 95% superior de la muestra a un nuevo vial de muestra. </li><li> Inyectar 5 l de cada fracción de péptido en una trampa 100 micras muestra x 25 mm para eliminar las sales y contaminantes y realizar la separación cromatográfica en una columna de 75 m 18 × 10 cm C. </li><li> Utilice un gradiente de 2-40% de B durante 100 min con una velocidad de flujo de 200 nl / min. El disolvente A es 95% ddH2O y acetonitrilo 5% que contiene 0,1% FA. Disolvente B es 80% de ACN y 20% ddH2O que contiene 0,1% FA. </li><li> Recoge diez espectros de masas en tándem para cada MS escanear en un espectrómetro de masas de alta resolución. Un espectrómetro de masas LTQ Orbitrap se utilizó en este experimento. </li></ol> 11. Identificación de proteínas <ol><li> Identificar las proteínas utilizando la base de datos del ratón UniProt contiene tanto avance y retroceso secuencias de proteínas y contaminantes comunes. Software MaxQuant con motor de búsqueda MASCOTA se utiliza para buscar en la base de datos de proteínas. </li><li> Los parámetros de búsqueda que se pueden utilizar incluyen; MODIFIC fijoación de Carbamidomethyl de cisteína, modificaciones variables de la oxidación de la metionina, la proteína acetilación N-terminal, máximo de 2 perdió la escisión. El péptido de longitud mínima para considerar para su identificación son 6 aminoácidos. Introduzca un error de concentración de masa de péptido ± 8 ppm y una tolerancia de masa fragmento de 1,2 Da (error de masa depende de la espectrómetro de masas que se utiliza). </li><li> En el software MaxQuant, use un falso descubrimiento tasa del 1% (FDR) para la identificación de péptidos y proteínas. Identificación de proteínas está en la lista con el número de péptidos emparejados, la cobertura de secuencia por ciento de proteína, y las secuencias de péptidos. </li></ol>

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T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry:+Bottom-up+or+top-down.">Mass spectrometry: Bottom-up or top-down.</a> Science. 314, 65-66 (2006).</li><li>Aebersold, R., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry-based+proteomics.">Mass spectrometry-based proteomics.</a> Nature. 422, 198-207 (2003).</li><li>Reid, G. E., McLuckey, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Top+down'+protein+characterization+via+tandem+mass+spectrometry.">Top down' protein characterization via tandem mass spectrometry.</a> J. Mass. Spectrom. 37, 663-675 (2002).</li><li>Han, X., Aslanian, A., Yates, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+for+proteomics.">Mass spectrometry for proteomics.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 12, 483-490 (2008).</li><li>Thalmann, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inner+ear+proteomics:+A+fad+or+hear+to+stay.">Inner ear proteomics: A fad or hear to stay.</a> Brain Res. 1091, 103-112 (2006).</li><li>Lang, F., Vallon, V., Knipper, M., Wangemann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+significance+of+channels+and+transporters+expressed+in+the+inner+ear+and+kidney.">Functional significance of channels and transporters expressed in the inner ear and kidney.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 293, (2007).</li><li>Wisniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+sample+preparation+method+for+proteome+analysis.">Universal sample preparation method for proteome analysis.</a> Nat. Meth. 6, 359-362 (2009).</li><li>Wisniewski, J. R., Zielinska, D. F., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+ultrafiltration+units+for+proteomic+and+N-glycoproteomic+analysis+by+the+filter-aided+sample+preparation+method.">Comparison of ultrafiltration units for proteomic and N-glycoproteomic analysis by the filter-aided sample preparation method.</a> Anal. Biochem. 410, 307-309 (2011).</li><li>Darville, L. N., Sokolowski, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-depth+Proteomic+Analysis+of+Mouse+Cochlear+Sensory+Epithelium+by+Mass+Spectrometry.">In-depth Proteomic Analysis of Mouse Cochlear Sensory Epithelium by Mass Spectrometry.</a> J Proteome Res. 12 (8), 3620-3630 (2013).</li><li>Vizcaino, J. A., Cote, R. G., Csordas, A., Dianes, J. A., Fabregat, A., Foster, J. M., Griss, J., Alpi, E., Birim, M., Contell, J., O'Kelly, G., Schoenegger, A., Ovelleiro, D., Perez-Riverol, Y., Reisinger, F., Rios, D., Wang, R., Hermjakob, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+PRoteomics+IDEntifications+(PRIDE)+database+and+associated+tools:+status+in+2013.">The PRoteomics IDEntifications (PRIDE) database and associated tools: status in 2013.</a> Nucleic Acids Res. 41, 1063-1069 (2013).</li></ol>

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

<html> Los pasos clave para maximizar la identificación de proteínas a partir del epitelio sensorial coclear son: 1) el uso de múltiples endoproteinasas para la digestión, 2) uso de múltiples técnicas de separación, y 3) la utilización de un espectrómetro de masas de alta resolución. La aplicación de múltiples enzimas aumenta el número de péptidos y mejora la cobertura de secuencia de la proteína, por lo tanto, mejorar el número de proteínas identificadas a partir del tejido coclear. Tripsina, la proteas...

La proteómica es el estudio de sistemas biológicos complejos mediante el análisis de la expresión de proteínas, la función, las modificaciones y las interacciones 1. Varios métodos han sido utilizados para el análisis del proteoma del oído interno, incluyendo el anticuerpo de microarrays 2, electroforesis bidimensional en gel de 3-5, y DIGE 6. Sin embargo, sólo un número limitado de proteínas se han identificado y caracterizado 2,7-10, en comparación con los más de 10.000 genes y las etiquetas de secuencias expresadas (EST) identificados en el oído interno 11,12, MS es la técnica más utilizada integral y en proteómica para la caracterización de proteínas. Análisis de muestras proteómicos complejas, tales como la cóclea, puede ser un reto. Sin embargo, la combinación de múltiples técnicas de separación con MS permite la identificación de un mayor número de péptidos y proteínas, debido a un mayor rango dinámico y la capacidad de concentración pico 13. Cro MultidimensionalPHY reduce mezclas de proteínas altamente complejas, al permitir el uso de diferentes mecanismos de adsorción. Hay dos enfoques de análisis MS proteoma de uso común, la escopeta y la proteómica de abajo hacia arriba. En proteómica escopeta, una mezcla de proteínas intactas se digiere enzimáticamente y se separó mediante cromatografía multidimensional con fuerte cromatografía de intercambio catiónico (SCX), seguido de cromatografía líquida en fase inversa (RPLC) 14,15. Los péptidos separados son sometidas a tándem MS y base de datos de búsqueda 15. Una ventaja principal de esta técnica es que miles de proteínas pueden ser identificadas en un solo análisis y la técnica es más adecuada para las proteínas de membrana. En el enfoque de abajo arriba, la mezcla de proteínas se separa, por lo general por una o electroforesis de dos dimensiones, y las bandas de proteínas individuales o puntos cortado y digerido con una enzima tal como tripsina, por lo general resulta en múltiples péptidos. Sin embargo, otra más recientely desarrolló enfoque electroforética, utilizado en la proteómica de abajo hacia arriba, es GELFrEE. Esta técnica fracciona muestras de proteínas en fase líquida y los hace menos complejo antes del análisis. Esta técnica es reproducible, ofrece una alta recuperación de proteína, y reduce la distribución de las proteínas abundantes altas en las muestras de proteínas complejas 16. Péptidos derivados de proteínas separadas, se analizan por EM, mediante el uso de huellas másicas de péptidos o MS en tándem (MS / MS), para crear etiquetas de secuencia para la búsqueda de base de datos 17-19. Algunas de las principales ventajas de utilizar el enfoque de abajo hacia arriba son la capacidad de obtener separaciones de alta resolución y cobertura de la proteína completa. Proteómica abajo hacia arriba es la técnica más utilizada en proteómica 20, por lo tanto, varias herramientas bioinformáticas disponibles. Además, las proteínas se pueden separar en una mezcla compleja antes de la digestión, por lo que hay una mayor probabilidad de identificación. Uno de los principales retosen el uso de el oído interno para el análisis proteómico es su pequeño tamaño, accesibilidad restringida, y el tipo de células diversidad 21. Además, las proteínas clave que distinguen su funcionalidad, tales como los canales iónicos, transportadores y receptores, son proteínas de membrana, que pueden ser difíciles de aislar 22. Por lo tanto, la preparación de muestras de filtro asistido (FASP) es ventajoso para los análisis proteómicos de tejidos que están limitados para la extracción de la proteína y que requieren detergentes para solubilizar las membranas 23. Este filtrado permite el análisis de MS de membrana y proteínas solubles y para la capacidad de aislar péptidos a partir de los contaminantes de bajo peso molecular 23,24. El presente protocolo describe enfoques proteómicos comúnmente utilizados que se combinan y modificar para analizar proteínas tanto solubles y de membrana y para maximizar el número de ID de la proteína a partir del epitelio sensorial coclear. Vamos a describir el uso de la proteómica escopeta con FASP múltiples digeririónico, cromatografía de intercambio iónico, MS de alta resolución, y el análisis de datos. Además, vamos a describir la proteómica de abajo hacia arriba con GELFrEE, FASP multi-digestión, MS de alta resolución, y el análisis de datos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="749">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:264px;">8% Tris-acetate cartridge&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Protein Discovery</td>
			<td style="width:133px;">42103</td>
			<td style="width:193px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>179124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetonitrile</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>015-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">AEBSF</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>101500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ammonium formate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC16861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Aprotinin</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>616370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ASB-14&#160;</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>182750-5GM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bovine serum albumin</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>500-0112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">C18 column&#160;</td>
			<td>New Objective</td>
			<td>A25112</td>
			<td>75 &#956;m &#215; 10 cm&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DC Protein Assay</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>500-0116</td>
			<td>Microplate Assay Protocol</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Endoproteinase Lys-C</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FASP Protein Digestion Kit</td>
			<td>Protein Discovery</td>
			<td>44250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Formic acid&#160;</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>94318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GELFrEE Fractionation System</td>
			<td>Protein Discovery</td>
			<td>42001</td>
			<td>GELFrEE 8100</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Leupeptin</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>108975</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MacroSpin Column</td>
			<td>The Nest Group</td>
			<td>SMM SS18V</td>
			<td>Silica C18</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microcystin</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>475815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pepstatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Polysulfoethyl A Column</td>
			<td>The Nest Group</td>
			<td>202SE0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sonic Dismembrator&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15-338-53</td>
			<td>Model 100</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trypsin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6567</td>
			<td>Proteomics Grade</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bottom-up and shotgun proteomics to identify a comprehensive cochlear proteome

La proteómica es un enfoque de uso común que puede proporcionar conocimientos sobre los sistemas biológicos complejos. El epitelio sensorial coclear contiene receptores que transducen la energía mecánica del sonido en una energía electro-química procesada por los sistemas nerviosos periférico y central. Varias técnicas de proteómica se han desarrollado para estudiar el oído interno coclear, tales como la electroforesis bidimensional en gel de diferencia (2D-DIGE), microarrays de anticuerpos, y espectrometría de masas (MS). MS es la herramienta más completa y versátil en proteómica y en conjunto con los métodos de separación puede proporcionar un proteoma en profundidad de las muestras biológicas. Métodos de separación combinadas con EM tiene la capacidad de enriquecer las muestras de proteínas, detección de bajo peso molecular y proteínas hidrofóbicas, y identificar las proteínas de baja abundancia mediante la reducción de la gama dinámica proteoma. Diferentes estrategias de digestión se pueden aplicar a toda lisado o a proteínas de lisado fraccionado para mejorar péptido y proteínascobertura de secuencia. La utilización de diferentes técnicas de separación, incluyendo intercambio catiónico fuerte (SCX), de fase inversa (RP), y la electroforesis en gel de fracción de atrapamiento de líquido-se eluyó (GELFrEE) se puede aplicar para reducir la complejidad de la muestra antes del análisis de MS para la identificación de proteínas.

Para obtener el proteoma más completa del epitelio sensorial coclear, se requiere la disección de tejidos rápida antes de la extracción de proteínas y preparación de la muestra. Dos técnicas de proteómica se pueden utilizar, de escopeta y de abajo hacia arriba la proteómica. Para preparar las muestras para la proteómica de escopeta, se utilizó procedimiento de digestión FASP como se ilustra en la Figura 1. El método permite FASP para la concentración de proteínas, la eliminación de los d...

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Bottom-up and Shotgun Proteomics to Identify a Comprehensive Cochlear Proteome

Análisis del proteoma del epitelio sensorial coclear puede ser un reto debido a su pequeño tamaño y porque las proteínas de membrana son difíciles de aislar e identificar. Tanto la membrana y proteínas solubles se pueden identificar mediante la combinación de múltiples métodos de preparación y técnicas de separación junto con espectrometría de masas de alta resolución.

De abajo hacia arriba y de escopeta Proteómica para identificar una exhaustiva Coclear proteoma

Proteomics is a commonly used approach that can provide insights into complex biological systems. The cochlear sensory epithelium contains receptors that ...

bottom-up-shotgun-proteomics-to-identify-comprehensive-cochlear

Research

JoVE Journal

Biology

18.6K vistas.  University of South Florida.  Análisis del proteoma del epitelio sensorial coclear puede ser un reto debido a su pequeño tamaño y porque las proteínas de membrana son difíciles de aislar e identificar. Tanto la membrana y proteínas solubles se pueden identificar mediante la combinación de múltiples métodos de preparación y técnicas de separación junto con espectrometría de masas de alta resolución. 

Video: Bottom-up and Shotgun Proteomics to Identify a Comprehensive Cochlear Proteome

Isolation and Analysis of Hematopoietic Stem Cells from the Placenta

Hematopoietic stem cells (HSCs) have the ability to self-renew and generate all cell types of the blood lineages throughout the lifetime of an individual. All HSCs emerge during embryonic development, after which their pool size is maintained by self-renewing cell divisions. Identifying the anatomical origin of HSCs and the critical developmental events regulating the process of HSC development has been complicated as many anatomical sites participate during fetal hematopoiesis. Recently, we identified the placenta as a major hematopoietic organ where HSCs are generated and expanded in unique microenvironmental niches (Gekas, et al 2005, Rhodes, et al 2008). Consequently, the placenta is an important source of HSCs during their emergence and initial expansion.
In this article, we show dissection techniques for the isolation of murine placenta from E10.5 and E12.5 embryos, corresponding to the developmental stages of initiation of HSCs and the peak in the size of the HSC pool in the placenta, respectively. In addition, we present an optimized protocol for enzymatic and mechanical dissociation of placental tissue into single-cell suspension for use in flow cytometry or functional assays. We have found that use of collagenase for single-cell suspension of placenta gives sufficient yields of HSCs. An important factor affecting HSC yield from the placenta is the degree of mechanical dissociation prior to, and duration of, enzymatic treatment.
We also provide a protocol for the preparation of fixed-frozen placental tissue sections for the visualization of developing HSCs by immunohistochemistry in their precise cellular niches. As hematopoietic specific antigens are not preserved during preparation of paraffin embedded sections, we routinely use fixed frozen sections for localizing placental HSCs and progenitors.

We have identified the placenta as a major hematopoietic organ during development. We found that hematopoietic stem cells (HSCs) are both generated and expanded in the placenta in unique microenvironmental niches. Here, we describe experimental techniques required for isolation and visualization of HSCs in the mouse placenta.

Aislamiento y análisis de las células madre hematopoyéticas de la placenta

Hematopoietic stem cells (HSCs) have the ability to self-renew and generate all cell types of the blood lineages throughout the lifetime of an individual. ...

Investigación

Biología

Proteomics to Identify Proteins Interacting with P2X2 Ligand-Gated Cation Channels

Ligand-gated ion channels underlie synaptic communication in the nervous system1. In mammals there are three families of ligand-gated channels: the cys loop, the glutamate-gated and the P2X receptor channels2. In each case binding of transmitter leads to the opening of a pore through which ions flow down their electrochemical gradients. Many ligand-gated channels are also permeable to calcium ions3, 4, which have downstream signaling roles5 (e.g. gene regulation) that may exceed the duration of channel opening. Thus ligand-gated channels can signal over broad time scales ranging from a few milliseconds to days. Given these important roles it is necessary to understand how ligand-gated ion channels themselves are regulated by proteins, and how these proteins may tune signaling. Recent studies suggest that many, if not all, channels may be part of protein signaling complexes6. In this article we explain how to identify the proteins that bind to the C-terminal aspects of the P2X2 receptor cytosolic domain.
P2X receptors are ATP-gated cation channels and consist of seven subunits (P2X1-P2X7). P2X receptors are widely expressed in the brain, where they mediate excitatory synaptic transmission and presynaptic facilitation of neurotransmitter release7. P2X receptors are found in excitable and non-excitable cells and mediate key roles in neuronal signaling, inflammation and cardiovascular function8. P2X2 receptors are abundant in the nervous system9 and are the focus of this study. Each P2X subunit is thought to possess two membrane spanning segments (TM1 &amp; TM2) separated by an extracellular region7 and intracellular N and C termini (Fig 1a)7. P2X subunits10 (P2X1-P2X7) show 30-50% sequence homology at the amino acid level11. P2X receptors contain only three subunits, which is the simplest stoichiometry among ionotropic receptors. The P2X2 C-terminus consists of 120 amino acids (Fig 1b) and contains several protein docking consensus sites, supporting the hypothesis that P2X2 receptor may be part of signaling complexes. However, although several functions have been attributed to the C-terminus of P2X2 receptors9 no study has described the molecular partners that couple to the intracellular side of this protein via the full length C-terminus. In this methods paper we describe a proteomic approach to identify the proteins which interact with the full length C-terminus of P2X2 receptors.

We describe a simple protocol to identify brain proteins that bind to the full length C terminus of ATP-gated P2X2 receptors. The extension and systematic application of this approach to all P2X receptors is expected to lead to a better understanding of P2X receptor signaling.

Proteómica para identificar proteínas que interactúan con los canales de cationes P2X2 ligando

Ligand-gated ion channels underlie synaptic communication in the nervous system1. In mammals there are three families of ligand-gated channels: the cys ...

PAR-CliP - A Method to Identify Transcriptome-wide the Binding Sites of RNA Binding Proteins

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ribonucleoprotein complexes (miRNPs) that are often expressed in a cell-type dependently. To understand how the interplay of these RNA-binding factors affects the regulation of individual transcripts, high resolution maps of in vivo protein-RNA interactions are necessary1.
A combination of genetic, biochemical and computational approaches are typically applied to identify RNA-RBP or RNA-RNP interactions. Microarray profiling of RNAs associated with immunopurified RBPs (RIP-Chip)2 defines targets at a transcriptome level, but its application is limited to the characterization of kinetically stable interactions and only in rare cases3,4 allows to identify the RBP recognition element (RRE) within the long target RNA. More direct RBP target site information is obtained by combining in vivo UV crosslinking5,6 with immunoprecipitation7-9 followed by the isolation of crosslinked RNA segments and cDNA sequencing (CLIP)10. CLIP was used to identify targets of a number of RBPs11-17. However, CLIP is limited by the low efficiency of UV 254 nm RNA-protein crosslinking, and the location of the crosslink is not readily identifiable within the sequenced crosslinked fragments, making it difficult to separate UV-crosslinked target RNA segments from background non-crosslinked RNA fragments also present in the sample.
We developed a powerful cell-based crosslinking approach to determine at high resolution and transcriptome-wide the binding sites of cellular RBPs and miRNPs that we term PAR-CliP (Photoactivatable-Ribonucleoside-Enhanced Crosslinking and Immunoprecipitation) (see Fig. 1A for an outline of the method). The method relies on the incorporation of photoreactive ribonucleoside analogs, such as 4-thiouridine (4-SU) and 6-thioguanosine (6-SG) into nascent RNA transcripts by living cells. Irradiation of the cells by UV light of 365 nm induces efficient crosslinking of photoreactive nucleoside-labeled cellular RNAs to interacting RBPs. Immunoprecipitation of the RBP of interest is followed by isolation of the crosslinked and coimmunoprecipitated RNA. The isolated RNA is converted into a cDNA library and deep sequenced using Solexa technology. One characteristic feature of cDNA libraries prepared by PAR-CliP is that the precise position of crosslinking can be identified by mutations residing in the sequenced cDNA. When using 4-SU, crosslinked sequences thymidine to cytidine transition, whereas using 6-SG results in guanosine to adenosine mutations. The presence of the mutations in crosslinked sequences makes it possible to separate them from the background of sequences derived from abundant cellular RNAs.
Application of the method to a number of diverse RNA binding proteins was reported in Hafner et al.18

RNA transcripts are subject to extensive posttranscriptional regulation that is mediated by a multitude of trans-acting RNA-binding proteins (RBPs). Here we present a generalizable method to identify precisely and on a transcriptome-wide scale the RNA binding sites of RBPs.

PAR-Clip - un método para identificar transcriptoma en todo los sitios de unión de las proteínas de unión a ARN

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ...

Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in quantitation, are associated with a high cost, long lead time, and are fraught with drawbacks (e.g. heterophilic antibodies, autoantibody interference, 'hook-effect').1 An alternative technique is affinity enrichment of peptides coupled with quantitative mass spectrometry, commonly referred to as SISCAPA (Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies).2 In this technique, affinity enrichment of peptides with stable isotope dilution and detection by selected/multiple reaction monitoring mass spectrometry (SRM/MRM-MS) provides quantitative measurement of peptides as surrogates for their respective proteins. SRM/MRM-MS is well established for accurate quantitation of small molecules 3, 4 and more recently has been adapted to measure the concentrations of proteins in plasma and cell lysates.5-7 To achieve quantitation of proteins, these larger molecules are digested to component peptides using an enzyme such as trypsin. One or more selected peptides whose sequence is unique to the target protein in that species (i.e. "proteotypic" peptides) are then enriched from the sample using anti-peptide antibodies and measured as quantitative stoichiometric surrogates for protein concentration in the sample. Hence, coupled to stable isotope dilution (SID) methods (i.e. a spiked-in stable isotope labeled peptide standard), SRM/MRM can be used to measure concentrations of proteotypic peptides as surrogates for quantification of proteins in complex biological matrices. The assays have several advantages compared to traditional immunoassays. The reagents are relatively less expensive to generate, the specificity for the analyte is excellent, the assays can be highly multiplexed, enrichment can be performed from neat plasma (no depletion required), and the technique is amenable to a wide array of proteins or modifications of interest.8-13 In this video we demonstrate the basic protocol as adapted to a magnetic bead platform.

Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies (SISCAPA) couples affinity enrichment of peptides with stable isotope dilution mass spectrometry (MRM-MS) to provide quantitative measurement of peptides as surrogates for their respective proteins. Here we describe the protocol using magnetic particles in a partially automated format.

La cuantificación de proteínas mediante el enriquecimiento de inmunoafinidad péptido acoplado a espectrometría de masas

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in ...

Orthogonal Protein Purification Facilitated by a Small Bispecific Affinity Tag

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a demand for general methods that do not require target protein specific optimization1 . To achieve this, purification tags that genetically can be fused to the gene of interest are commonly used2 . The most widely used affinity handle is the hexa-histidine tag, which is suitable for purification under both native and denaturing conditions3 . The metabolic burden for producing the tag is low, but it does not provide as high specificity as competing affinity chromatography based strategies1,2.
Here, a bispecific purification tag with two different binding sites on a 46 amino acid, small protein domain has been developed. The albumin-binding domain is derived from Streptococcal protein G and has a strong inherent affinity to human serum albumin (HSA). Eleven surface-exposed amino acids, not involved in albumin-binding4 , were genetically randomized to produce a combinatorial library. The protein library with the novel randomly arranged binding surface (Figure 1) was expressed on phage particles to facilitate selection of binders by phage display technology. Through several rounds of biopanning against a dimeric Z-domain derived from Staphylococcal protein A5, a small, bispecific molecule with affinity for both HSA and the novel target was identified6 .
The novel protein domain, referred to as ABDz1, was evaluated as a purification tag for a selection of target proteins with different molecular weight, solubility and isoelectric point. Three target proteins were expressed in Escherishia coli with the novel tag fused to their N-termini and thereafter affinity purified. Initial purification on either a column with immobilized HSA or Z-domain resulted in relatively pure products. Two-step affinity purification with the bispecific tag resulted in substantial improvement of protein purity. Chromatographic media with the Z-domain immobilized, for example MabSelect SuRe, are readily available for purification of antibodies and HSA can easily be chemically coupled to media to provide the second matrix.
This method is especially advantageous when there is a high demand on purity of the recovered target protein. The bifunctionality of the tag allows two different chromatographic steps to be used while the metabolic burden on the expression host is limited due to the small size of the tag. It provides a competitive alternative to so called combinatorial tagging where multiple tags are used in combination1,7.

A novel and highly efficient two-step affinity chromatography protocol has been developed and is described in detail. The method is based on a small purification tag with two inherent affinities and is applicable to a wide range of target proteins with different properties.

Purificación de proteínas ortogonales Facilitado por un marcador de afinidad biespecíficos pequeños

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated tools and resources for studies in this system are facilitating continued discovery of genes with more subtle phenotypes or roles. 
Here we present a generalized protocol we adapted for identifying C. elegans genes with postembryonic phenotypes of interest using RNAi2. This procedure is easily modified to assay the phenotype of choice, whether by light or fluorescence optics on a dissecting or compound microscope. This screening protocol capitalizes on the physical assets of the organism and molecular tools the C. elegans research community has produced. As an example, we demonstrate the use of an integrated transgene that expresses a fluorescent product in an RNAi screen to identify genes required for the normal localization of this product in late stage larvae and adults. First, we used a commercially available genomic RNAi library with full-length cDNA inserts. This library facilitates the rapid identification of multiple candidates by RNAi reduction of the candidate gene product. Second, we generated an integrated transgene that expresses our fluorecently tagged protein of interest in an RNAi-sensitive background. Third, by exposing hatched animals to RNAi, this screen permits identification of gene products that have a vital embryonic role that would otherwise mask a post-embryonic role in regulating the protein of interest. Lastly, this screen uses a compound microscope equipped for single cell resolution.

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

We describe a sensitized method to identify postembryonic regulators of protein expression and localization in C. elegans using an RNAi-based genomic screen and an integrated transgene that expresses a functional, fluorescently tagged protein.

RNAi de detección para identificar fenotipos postembrionarios en C. elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the messagefor review see 1. However, it's now widely accepted that synonymous codon usage is the primary cause of non-uniform translational elongation rates1. Synonymous codons are not used with identical frequency. A bias exists in the use of synonymous codons with some codons used more frequently than others2. Codon bias is organism as well as tissue specific2,3. Moreover, frequency of codon usage is directly proportional to the concentrations of cognate tRNAs4. Thus, a frequently used codon will have higher multitude of corresponding tRNAs, which further implies that a frequent codon will be translated faster than an infrequent one. Thus, regions on mRNA enriched in rare codons (potential pause sites) will as a rule slow down ribosome movement on the message and cause accumulation of nascent peptides of the respective sizes5-8. These pause sites can have functional impact on the protein expression, mRNA stability and protein foldingfor review see 9. Indeed, it was shown that alleviation of such pause sites can alter ribosome movement on mRNA and subsequently may affect the efficiency of co-translational (in vivo) protein folding1,7,10,11. To understand the process of protein folding in vivo, in the cell, that is ultimately coupled to the process of protein synthesis it is essential to gain comprehensive insights into the impact of codon usage/tRNA content on the movement of ribosomes along mRNA during translational elongation.
Here we describe a simple technique that can be used to locate major translation pause sites for a given mRNA translated in various cell-free systems6-8. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA. The rationale is that at low-frequency codons, the increase in the residence time of the ribosomes results in increased amounts of nascent peptides of the corresponding sizes. In vitro transcribed mRNA is used for in vitro translational reactions in the presence of radioactively labeled amino acids to allow the detection of the nascent chains. In order to isolate ribosome bound nascent polypeptide complexes the translation reaction is layered on top of 30% glycerol solution followed by centrifugation. Nascent polypeptides in polysomal pellet are further treated with ribonuclease A and resolved by SDS PAGE. This technique can be potentially used for any protein and allows analysis of ribosome movement along mRNA and the detection of the major pause sites. Additionally, this protocol can be adapted to study factors and conditions that can alter ribosome movement and thus potentially can also alter the function/conformation of the protein.

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

A technique to identify translational pause sites on mRNA is described. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA, followed by the size analysis of the nascent chains using a denaturing gel electrophoresis.

El aislamiento de los ribosomas polipéptidos nacientes Bound<em&gt; In vitro</em&gt; Para la identificación de sitios de traslación pausa a lo largo del ARNm

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

Many organisms localize mRNAs to specific subcellular destinations to spatially and temporally control gene expression. Recent studies have demonstrated that the majority of the transcriptome is localized to a nonrandom position in cells and embryos. One approach to identify localized mRNAs is to biochemically purify a cellular structure of interest and to identify all associated transcripts. Using recently developed high-throughput sequencing technologies it is now straightforward to identify all RNAs associated with a subcellular structure. To facilitate transcript identification it is necessary to work with an organism with a fully sequenced genome. One attractive system for the biochemical purification of subcellular structures are egg extracts produced from the frog Xenopus laevis. However, X. laevis currently does not have a fully sequenced genome, which hampers transcript identification. In this article we describe a method to produce egg extracts from a related frog, X. tropicalis, that has a fully sequenced genome. We provide details for microtubule polymerization, purification and transcript isolation. While this article describes a specific method for identification of microtubule-associated transcripts, we believe that it will be easily applied to other subcellular structures and will provide a powerful method for identification of localized RNAs.

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

We describe the collection of unfertilized Xenopus tropicalis eggs and production of a meiosis II-arrested egg extract. This egg extract can be used to purify microtubules and microtubule-associated RNAs.

Producción de<em&gt; Xenopus tropicalis</em&gt; Huevos Extrae para identificar los ARN asociada a los microtúbulos

Many  organisms localize mRNAs to specific subcellular destinations to spatially and  temporally control gene expression. Recent studies have demonstrated ...

Dithranol as a Matrix for Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Imaging on a Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometer

Mass spectrometry imaging (MSI) determines the spatial localization and distribution patterns of compounds on the surface of a tissue section, mainly using MALDI (matrix&#160;assisted laser desorption/ionization)-based analytical techniques. New matrices for small-molecule MSI, which can improve the analysis of low-molecular weight (MW) compounds, are needed. These matrices should provide increased analyte signals while decreasing MALDI background signals. In addition, the use of ultrahigh-resolution instruments, such as Fourier transform ion cyclotron resonance (FTICR) mass spectrometers, has&#160;the ability to resolve analyte signals from matrix signals, and this can partially overcome many problems associated with the background originating from the MALDI matrix. The reduction in the intensities of the metastable matrix clusters by FTICR MS can also help to overcome some of the interferences associated with matrix peaks on other instruments. High-resolution instruments such as the FTICR mass spectrometers are advantageous as they can produce distribution patterns of many compounds simultaneously while still providing confidence in chemical identifications. Dithranol (DT; 1,8-dihydroxy-9,10-dihydroanthracen-9-one) has previously been reported as a MALDI matrix for tissue imaging. In this work, a protocol for the use of DT for MALDI imaging of endogenous lipids from the surfaces of mammalian tissue sections, by positive-ion MALDI-MS, on an ultrahigh-resolution hybrid quadrupole FTICR instrument has been provided.

Dithranol (DT; 1,8-dihydroxy-9,10-dihydroanthracen-9-one) has previously been reported as a MALDI matrix for tissue imaging of small molecules; protocols for the use of DT for the MALDI imaging of endogenous lipids on the surface of tissue sections&#160;by positive-ion MALDI-MS on an ultrahigh-resolution quadrupole-FTICR instrument are provided here.

El ditranol como una matriz para láser asistida por matriz de desorción / ionización de imágenes en una transformada de Fourier de iones de resonancia de ciclotrón Espectrómetro de Masas

Mass spectrometry imaging (MSI) determines the spatial localization and distribution patterns of compounds on the surface of a tissue section, mainly ...

Capture Compound Mass Spectrometry - A Powerful Tool to Identify Novel c-di-GMP Effector Proteins

Considerable progress has been made during the last decade towards the identification and characterization of enzymes involved in the synthesis (diguanylate cyclases) and degradation (phosphodiesterases) of the second messenger c-di-GMP. In contrast, little information is available regarding the molecular mechanisms and cellular components through which this signaling molecule regulates a diverse range of cellular processes. Most of the known effector proteins belong to the PilZ family or are degenerated diguanylate cyclases or phosphodiesterases that have given up on catalysis and have adopted effector function. Thus, to better define the cellular c-di-GMP network in a wide range of bacteria experimental methods are required to identify and validate novel effectors for which reliable in silico predictions fail.
We have recently developed a novel Capture Compound Mass Spectrometry (CCMS) based technology as a powerful tool to biochemically identify and characterize c-di-GMP binding proteins. This technique has previously been reported to be applicable to a wide range of organisms1. Here we give a detailed description of the protocol that we utilize to probe such signaling components. As an example, we use Pseudomonas aeruginosa, an opportunistic pathogen in which c-di-GMP plays a critical role in virulence and biofilm control. CCMS identified 74% (38/51) of the known or predicted components of the c-di-GMP network. This study explains the CCMS procedure in detail, and establishes it as a powerful and versatile tool to identify novel components involved in small molecule signaling.

The ubiquitous second messenger c-di-GMP controls growth and behavior of many bacteria. We have developed a novel Capture Compound Mass Spectrometry based technology to biochemically identify and characterize c-di-GMP binding proteins in virtually any bacterial species.