Los autores desean agradecer al Dr. Rick Padgett (Waksman Institute, la Universidad de Rutgers, Nueva Jersey) por el don de la DBL-1 cDNA y el Dr. Christopher Rongo (Waksman Institute, la Universidad de Rutgers, Nueva Jersey) por un marcador de la inyección. El laboratorio del Dr. Barth Grant realizó el bombardeo de pistola de genes para la integración de bajo número de copias de la GFP-etiquetados-1 dbl construcción. El laboratorio de René García brindó asistencia técnica durante la creación de texIs100. El René García, Lints Robyn, y Hongmin Qin laboratorios proporcionó asesoramiento productivo. Este trabajo fue financiado por la puesta en marcha de fondos del Departamento de TAMHSC de Medicina Molecular y Celular. El ámbito de aplicación compuesto y confocal de disco giratorio fueron comprados con fondos proporcionados por el departamento y el Colegio TAMHSC de la Oficina de Medicina del Decano.

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No tenemos nada que revelar.

El método de cribado ARNi presentado aquí permite un análisis sensible y rápido de los productos de genes necesarios para una normal (o transgénicos) fenotipo postembrionario. El ejemplo que se muestra es una pantalla de genes implicados en la localización subcelular de una proteína fluorescente etiquetados. Sin embargo, este protocolo puede ser modificado para identificar los genes que afectan a otros fenotipos postembrionario de interés. Este método tiene la ventaja de un enfoque ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> NGM agar </td><td> Nematodos medio de crecimiento </td><td> MIP Scientific, Inc </td><td> Se puede preparar siguiendo el protocolo de agar NGM 25 </td></tr><tr><td> Medio M9 </td><td> 22mm KH 2 PO 4, 42mm de Na 2 HPO 4, 86mm de NaCl, 1 mM de MgSO 4 </td><td></td><td> 26 </td></tr><tr><td> Agar agar </td><td> EMD Chemicals Inc. </td><td> 1.01614.1000 </td><td> 2% en agua para placas NGM. 4% en agua para almohadillas portaobjetos de microscopio (autoclave inicialmente y microondas para fundir posteriormente). </td></tr><tr><td> Bacto peptona </td><td> Becton Dickinson - Difco CP </td><td> 211677 </td><td> 0,25% </td&gt; </tr><tr><td> IPTG </td><td> Investigación de Productos International Corp. </td><td> I56000-5.0 </td><td> 1 mM de concentración final </td></tr><tr><td> carbenicilina </td><td> Investigación de Productos International Corp. </td><td> C46000-5.0 </td><td> 50 ug / ml de la dilución de trabajo </td></tr><tr><td> LB caldo Lennox </td><td> Becton Dickinson - Difco CP </td><td> 240230 </td><td> 20 g / litro </td></tr><tr><td> tetraciclina </td><td> Sigma </td><td> 268054 </td><td> 12,5 mg / ml de la dilución de trabajo </td></tr><tr><td> hipoclorito de sodio </td><td> Cualquier marca </td><td> 5% de lejía </td><td> Use cloro libre. </td></tr><tr><td> de hidróxido de sodio </td><td> Cualquier marca </td><td> CAS 1310-73-2 </td><td> 5 N de valores </td></tr><tr><td> Medio M9 </td><td> Wormlab Libro de Recetas </td><td> <a href="http://130.15.90.245/wormlab_recipe_book.htm#Commonlab">http://1</a>30.15.90.245/wormlab_recipe_book.htm # Commonlab </td><td> 26 </td></tr><tr><td> levamisol </td><td> Sigma </td><td> 31742 </td><td> 100 mM mM - una dilución de trabajo </td></tr><tr><td> azida de sodio </td><td> Fisher Scientific </td><td> S227 </td><td> 10 mM en M9 dilución de trabajo </td></tr><tr><td> 24-pocillos </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 662160 </td><td> VWR distribuidor </td></tr><tr><td> portaobjetos de microscopio </td><td> Cualquier marca </td><td> 75 x 25 x 1 mm </td><td></td></tr><tr><td> se desliza la cubierta del microscopio </td><td> Cualquier marca </td><td> 22 x 22 mm No.1.5 </td><td> Utilizar el espesor recomendado por el fabricante del microscopio. </td></tr><tr><td> microscopio compuesto </td><td> Carl Zeiss, Inc. </td><td> A1m </td><td> Utilice objetivos y filtros para que coincida con las necesidades del experimento. </td></tr><tr><td> los medios de comunicación de la bomba</td><td> Manostat Varistaltic bomba </td><td> Kate modelo # 72-620-000 </td><td> Use tubería y ajustes adecuados para la máquina </td></tr></tbody></table>

rnai screening to identify postembryonic phenotypes in c. elegans

C. elegans ha demostrado ser un sistema modelo valioso para el descubrimiento y caracterización funcional de muchos genes y 1 vías genéticas. Herramientas más sofisticadas y los recursos para los estudios en este sistema están facilitando continuo descubrimiento de los genes con los fenotipos más sutiles o roles. Aquí se presenta un protocolo generalizado hemos adaptado para la identificación de C. elegans genes con fenotipos postembrionarios de interés utilizando RNAi 2. Este procedimiento se puede modificar fácilmente para ensayar el fenotipo de elección, ya sea por la óptica de luz o de fluorescencia en un microscopio de disección o compuesto. Este protocolo de cribado saca provecho de los activos físicos del organismo y las herramientas moleculares de la C. elegans comunidad de investigación ha producido. Como un ejemplo, se demuestra el uso de un transgén integrado que expresa un producto fluorescente en una pantalla de ARNi para identificar los genes necesarios para la localización normal de esteproducto en las larvas de fase tardía y adultos. En primer lugar, hemos utilizado una biblioteca genómica disponible en el mercado con el RNAi de larga duración en insertos de cDNA. Esta biblioteca facilita la rápida identificación de los múltiples candidatos por la reducción de RNAi el producto del gen candidato. En segundo lugar, hemos generado un transgen integrado que expresa nuestra proteína fluorecently etiquetado de interés en un fondo de RNAi y minúsculas. En tercer lugar, mediante la exposición de los animales nacidos de RNAi, esta pantalla permite la identificación de los productos de los genes que tienen un papel vital embrionaria que podría ocultar un papel post-embrionario en la regulación de la proteína de interés. Por último, esta pantalla utiliza un microscopio compuesto equipado para la resolución de células individuales.

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RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

Se describe un método sensible para identificar a los reguladores postembrionario de expresión de la proteína y su localización en<em&gt; C. elegans</em&gt; Con una pantalla de genómica basada en RNAi y un transgén integrado que expresa una proteína funcional, con fluorescencia etiquetados.

RNAi de detección para identificar fenotipos postembrionarios en C. elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

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Research

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Biology

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

16.9K vistas.  Texas A&M University System Health Science Center. Se describe un método sensible para identificar a los reguladores postembrionario de expresión de la proteína y su localización en C. elegans Con una pantalla de genómica basada en RNAi y un transgén integrado que expresa una proteína funcional, con fluorescencia etiquetados.