Damos las gracias a Melissa Griffin y Jenna Rozacky para su cuidado de los peces experto. PDM gracias EGN para escribir la asistencia, la generosidad y la paciencia. Este trabajo fue apoyado por el NIH / NIDCR R01DE020884 a JKE.

1. Ganadería y mutante alelos <ol><li> Levante y criar el pez cebra como se describe 21. </li><li> Alelos mutantes de pez cebra utilizados en este estudio fueron 16 PDGFRA B1059, B1100 Smad5 22, y B577 SMO 23. Las fuentes de estas cepas de pez cebra son ZIRC. </li></ol> 2. Preparación de las soluciones e Implementos Nota: Todas las soluciones y los instrumentos se pueden hacer con antelación y se almacenan para su uso futuro. <ol><li> Hacer medios embrión (EM) como se ha descrito previamente 21. </li><li> Hacer 4 g / L MS-222 (tricaína). Disolver 4 g de fosfato disódico (Na 2 HPO 4) en 450 ml de agua estéril. Añadir 2 g de MS-222 a la solución. Ajustar el pH a 7,0-7,2 dentro. Añadir agua estéril hasta un volumen total de 500 ml. </li><li> Opcional: Hacer 4 g / L de aceite de clavo. Pesar 0,2 g de aceite de clavo de olor puro en un tubo cónico de 50 ml. Añadir EM hasta un volumen total de 50 ml. Almacenar a 4 ° C. </li><li> Hacer 3% methylcelluloSE. Llevar 50 ml de EM + 0,1 M HEPES a ebullición. Retire del fuego. Revuelva en 1,5 g de metilcelulosa hasta que la solución sea homogénea. Almacenar a 4 ° C. </li><li> Hacer 0,2% de agarosa. Añadir 0,1 g de agarosa a 50 ml de EM. Traiga EM a hervir en el microondas o en una placa calefactora y verificar que la agarosa se disuelva. Alícuota en 500 volúmenes mu l en tubos de microcentrífuga y se almacenan a 4 ° C. Nota: Los volúmenes se pueden ajustar según sea necesario. </li><li> Hacer atizadores capilares. Coloca una gota de pegamento en el interior de un tubo capilar 0,9 mm ID. Inserte una longitud de 4-5 cm de 6 libras prueba de línea de monofilamento de pesca dentro del tubo capilar de manera que aproximadamente 3-4 mm de la línea se extiende más allá del extremo del tubo. </li><li> Haga dos cubreobjetos puenteados por espécimen. Super-cola 22 x 22-1 vidrio cubierta en cada extremo de una cubierta de vidrio de 24 x 60-1 dejando a la libre medio. Hacer singles (1 pequeña cubierta de vidrio por fin) para los embriones de menos de un día de edad, se duplica (2 vasos pequeños de la cubierta en la parte superior de uno al otro por fin) para los embriones tres y cincuenta y nueve days de edad, o triples (3 vasos pequeños de la cubierta en la parte superior de uno al otro por fin) para embriones cinco días o de más edad. </li><li> Llene una jeringa de 10 ml con grasa de alto vacío. Nota: la grasa de vacío sirve como un sellante para prevenir la deshidratación de los especímenes durante largos períodos de tiempo, y tiene bajo potencial de toxicidad en comparación con los selladores más volátiles. </li></ol> 3. Montaje de embriones de pez cebra para Microscopía Confocal (Ver Figura 1) <ol><li> Preparar medio anestésico. Derrita una alícuota de 0,2% de agarosa en el microondas en intervalos de 20 segundos hasta que esté completamente líquida. Mezclar 8 l de EM-222 en 192 l de 0,2% de agarosa o de 5 l de 4 g / L de aceite de clavo en 195 l de 0,2% de agarosa. Mantener en un bloque de calentamiento de 42 ° C. Nota: La exposición prolongada a MS-222 provoca retrasos en el desarrollo más fuerte que el aceite de clavo hace en embriones de pez cebra 24. </li><li> Si es necesario: dechorionate manualmente embriones transgénicos no eclosionados a analizar sólo antes del análisis. Con unas pinzas, poco a poco tear el corion abierta hasta que se libera el embrión. </li><li> Anestesie los embriones de pez cebra. Añadir 1 ml de una 4 g / L de stock de MS-222-24 ml de medio de embriones. Por otra parte, añadir 390 l de 4 g / L de aceite de clavo de 24 ml de agua de pescado 24. Nota: El aceite de clavo actúa lentamente para realizar este paso por lo menos 15 a 20 minutos antes de la microscopía de lapso de tiempo. </li><li> Coloque una gota de grasa de vacío alrededor del espacio central de un cubreobjetos puente que mira hacia arriba. Empujar lentamente la grasa de vacío fuera de la jeringa, haciendo un cordón suave y continua que es adyacente a y en el interior de los puentes y el borde del cubreobjetos. </li><li> Corre un círculo de 4% de metilcelulosa en el medio de la cubreobjetos puente usando un aplicador de madera. </li><li> Transferencia del embrión en ser fotografiado. Cuando se anestesia el embrión dibuja para arriba en una pipeta de vidrio. Mantener la pipeta verticalmente para permitir que el embrión se hunda hasta el fondo del líquido en la pipeta. Mueva la pipeta en la solución de agarosa y permitir que el embrión caigaen la agarosa. No expulsar el líquido. </li><li> Coloque la muestra. Dibuje un poco de solución de agarosa y el embrión en la pipeta. Expulsar el embrión en una gota de solución de agarosa en la parte superior de la metilcelulosa. Utilice un póquer capilar para empujar el embrión hacia abajo sobre la metilcelulosa y orientar el embrión como se desee para formación de imágenes. </li><li> Selle la muestra. <ol><li> Coloque un cubreobjetos de puente en la parte superior de la montados uno, que mira hacia abajo. Aplicar una presión uniforme en ambos lados de los cubreobjetos intercaladas hasta que los puentes hacen contacto directo y los sellos de gota de agarosa a ambos cubreobjetos. Verifique que el embrión está bien orientada. </li><li> Frote un aplicador de madera a lo largo del vidrio para suavizar las grietas y huecos en el cordón de grasa de vacío. Limpie el exceso de grasa de los bordes. </li></ol></li></ol> 4. Time-lapse confocal de imágenes de pez cebra transgénico embriones (Este protocolo ha sido optimizado para un microscopio confocal Zeiss LSM 710 nosción de imágenes de software ZEN, y puede ser modificado para su uso con otros sistemas.) <ol><li> Activar el equipo. Encienda el microscopio confocal y los dispositivos láser externos. Encienda el ordenador conectado a un microscopio confocal. Software de imagen confocal Abrir y seleccione &quot;Sistema de Inicio&quot; para activar los controles de adquisición de imágenes. </li><li> Preparar el escenario climatizada. Baje la plataforma de montaje del microscopio confocal y mover las lentes del objetivo de su posición. Vuelva a colocar el escenario por defecto con una etapa electrónica climatizada. Encienda el controlador para la etapa de calefacción y la temperatura de 29.5 ° C. </li><li> Coloque la muestra en el campo de visión. Coloque la muestra montada en el escenario. Mueva la lente objetivo de 20X en su posición y elevar la plataforma puesta en escena. Activar el emisor de luz visible y mirar a través de los oculares. Centro de la cabeza del embrión en el campo de visión. </li><li> Definir la configuración del experimento. <ol><li> Activar canales de fluorescencia seleccionandola longitud de onda fluorescente para detectar y seleccionar tablas de búsqueda de color (LUT) para cada canal. Si es necesario, utilice los controles manuales en el software para activar el láser necesarios (por ejemplo, 561 nm para RFP). Para cada canal de fluorescencia, ajuste la intensidad del láser a 10,0 y el voltaje del fotomultiplicador (HV o ganancia) entre 600-700. Establezca el promedio a 4 y la profundidad de bits a 16 bits. </li><li> Activar los módulos de la serie Z-stack y hora. Ajuste el ojo de aguja para una resolución Z 5 micras o menor, y establecer el Z-intervalo a la distancia óptima sugerido. Nota: Por lo general, 5 micras Z-resolución permite que cada imagen pila Z a recoger lo suficientemente rápido para una &quot;instantánea&quot; del embrión en un momento particular, a la vez que la resolución de las células individuales. La reducción de la promediación también reduce la cantidad de tiempo por imagen. </li><li> Defina el intervalo de tiempo deseado entre las imágenes (por lo general 10 a 20 minutos) y la duración total del experimento. </li></ol></li><li> Ajuste de posicióninformación. <ol><li> Gire la cámara en el modo en vivo. Ajuste el enfoque y aumentar la intensidad del láser, si es necesario para ver la fluorescencia. Ajuste el zoom digital de 0,6 para una visión más amplia, si se desea. </li><li> Coloque el escenario de tal manera que todas las estructuras de interés son visibles y no hay espacio en el campo de visión para dorsalmente consecuencia y anterior. Enfoque a través del embrión a los límites superior e inferior de la fluorescencia. Establezca la primera y última posiciones rebanada Z-stack al menos 100 micras o más allá de estos límites. </li></ol></li><li> Optimizar la intensidad de fluorescencia. <ol><li> Establezca la LUT de visualización para variar indicador. Estructuras fluorescentes deben ahora aparecen de color blanco, y el resto del campo de visión debe ser de color azul (sin detección) o negro. </li><li> Aumentar HV / ganancia a un nivel justo por debajo de donde aparecen saturado (rojo) píxeles. Si es necesario, ajuste la compensación por lo que la mayoría de los antecedentes no se detecta (azul). Nota: Menor diámetro del agujero de alfiler y el aumento de la intensidad del láser tanto mejorar la imagen defnición, pero la intensidad del láser debe mantenerse baja para preservar los tejidos vivos. Aumento de HV / ganancia y el diámetro del agujero de alfiler (&lt;5 micras) son generalmente preferibles a una mayor intensidad del láser. </li><li> Mantenga el diámetro del agujero de alfiler lo suficientemente amplia como para recoger las imágenes en el momento oportuno, con un promedio de sets a 4. El intervalo Z debe estar siempre a la distancia óptima sugerido para el diámetro del agujero de alfiler. Realizar exploraciones cortas (de promedio = 1) con diferentes configuraciones, y utilizar la intensidad del láser mínimo que alcanza la resolución deseada. </li></ol></li><li> Ejecutar el experimento para la longitud deseada de tiempo. Después, retire embrión desde la etapa climatizada y lentamente separar los cubreobjetos. Sumergir el portaobjetos y el embrión en EM en un 30 mm placa de Petri. Usando una pipeta de vidrio lavar suavemente el embrión fuera del cubreobjetos y retire el cubreobjetos de la placa de Petri. Coloque el embrión en una incubadora de 28,5 ° C a seguir desarrollándose. </li><li> Comparar el crecimiento. Al final del experimento, tomar individuo Zsimágenes de la tachuela de embriones de hermanos de agarosa-montado que se representaban de manera similar a la muestra en el comienzo del experimento, pero se suscitaron en EM en un incubador de 28,5 ° C. </li><li> Mida arcos faríngeos, según sea necesario. Las mediciones pueden realizarse en algunas suites de software confocal. Las mediciones que se encuentran aquí se realizaron con Fiji25 importando y Z-proyectar archivos. LSM de fotogramas individuales. </li></ol>

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Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Time-lapse microscopía confocal es una poderosa herramienta para el análisis del desarrollo. Aquí, nos demuestran la utilidad del método en el estudio de la morfogénesis arco faríngeo en el pez cebra, que son mutantes para importantes vías de señalización que utilizan un transgénico que marca las células de la cresta neural. Además de los análisis a nivel de los tejidos, los análisis de lapso de tiempo también son aplicables a los análisis a escala celular 28. Muchos métodos de pez cebra ampl...

Morfogénesis craneofacial es un proceso de varios pasos complejos que requiere la interacción coordinada entre múltiples tipos de células. La mayoría del esqueleto craneofacial se deriva de células de la cresta neural, muchos de los cuales deben migrar desde la dorsal del tubo neural en estructuras transitorias llamados arcos faríngeos 1. Al igual que con muchos tejidos, la morfogénesis del esqueleto craneofacial es más complicado que puede ser entendido por imágenes estáticas de embriones en puntos específicos de tiempo de desarrollo. A pesar de que es mucho tiempo para llevar a cabo, in vivo microscopía de lapso de tiempo proporciona una apariencia continua en las células y tejidos de un embrión en desarrollo. Cada imagen en una serie de lapso de tiempo le da contexto a los otros, y ayuda a un movimiento hacia el investigador deducir por qué se produce un fenómeno en lugar de deducir lo que está ocurriendo en ese momento. Imágenes in vivo es por tanto una herramienta descriptiva poderosa para enfoques experimentales paradeconstruir las vías que guían la morfogénesis. El pez cebra Danio rerio es un modelo genético popular de desarrollo embrionario de los vertebrados, y es particularmente adecuada para formación de imágenes in vivo de la morfogénesis. Moderno, métodos convenientes para la transgénesis y la modificación genómica están avanzando rápidamente el número de herramientas disponibles para los investigadores de pez cebra. Estas herramientas mejoran los métodos ya firmes para la manipulación genética y la microscopía. Imágenes in vivo de casi cualquier tejido en casi cualquier contexto genética deseada se acerca más a la realidad que la fantasía. Movimientos morfogenéticos de los arcos faríngeos se guían por señales interacciones entre la cresta neural y el epitelio adyacente, tanto ectodermo y endodermo. Hay numerosas moléculas de señalización expresadas por los epitelios que son necesarios para conducir la morfogénesis de los elementos esqueléticos craneofaciales. Entre estas moléculas de señalización, Sonic Hedgehog (Shh) es de importancia crítica fo el desarrollo craneofacial 2-8. Shh se expresa tanto por el ectodermo oral y faríngea endodermo 2,6,9,10. La expresión de Shh en el endodermo regula los movimientos morfogenéticos de los arcos 10, el patrón de la cresta neural dentro de los arcos 10, y el crecimiento del esqueleto craneofacial 11. Bmp señalización también es de vital importancia para el desarrollo craneofacial 12 y puede alterar la morfogénesis de los arcos faríngeos. Bmp señalización regula dorsal / ventral del patrón de cresta dentro de los arcos faríngeos 13,14. La interrupción de Smad5 en el pez cebra provoca graves defectos palatinos y un fracaso de los cartílagos de Meckel fusionar adecuadamente en la línea media 15. Además, los mutantes también muestran reducciones y de fusión en los elementos de cartílago ventral, con la 2 ª, 3 ª, y a veces elementos de arco 4 ª faríngea fusionados en la línea media 15. Estas fusiones sugieren fuertemente que la señalización de BMP dirige la morfogénesis de estos elementos faríngeas. Señalización de PDGF es necesario para el desarrollo craneofacial, pero tiene funciones desconocidas en arco faríngeo morfogénesis. Tanto el ratón y el pez cebra mutantes PDGFRA tienen profunda fisura del tercio medio facial 16-18. Al menos en el pez cebra esta hendidura mediofacial es debido a un fallo de la adecuada migración de células de la cresta neural 16. Células de la cresta neural siguen expresando PDGFRA después de que hayan entrado en los arcos faríngeos. Además, los ligandos de PDGF se expresan por los epitelios facial y dentro de los arcos faríngeos 16,19,20, por lo tanto la señalización de PDGF también podrían desempeñar un papel en la morfogénesis de los arcos faríngeos siguientes migración. Sin embargo, los análisis de la morfogénesis de los arcos faríngeos en mutantes PDGFRA no han sido realizados. Aquí, nos demuestran en microscopía confocal in vivo de pharynguluna etapa de pez cebra transgénico y describir la morfogénesis de los arcos faríngeos dentro de este período. Además, demuestran comportamientos de tejido que se ven afectados por mutaciones que alteran la Bmp, PDGF, y las vías de señalización de Shh.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="837">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">6 lb. test monofilament line</td>
			<td style="width:189px;">Cortland Line Company</td>
			<td style="width:185px;">SLB16</td>
			<td style="width:220px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Agarose I</td>
			<td style="width:189px;">Amresco</td>
			<td style="width:185px;">0710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Argon laser</td>
			<td style="width:189px;">LASOS Lasertechnik GmbH</td>
			<td style="width:185px;">LGN 3001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Calcium chloride</td>
			<td style="width:189px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">C8106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Capillary tubing, 100 mm, 0.9 mm ID</td>
			<td style="width:189px;">FHC</td>
			<td style="width:185px;">30-31-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Clove oil</td>
			<td style="width:189px;">Hilltech Canada, Inc.</td>
			<td style="width:185px;">HB-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">High vacuum grease</td>
			<td style="width:189px;">Dow Corning</td>
			<td style="width:185px;">2021846-0807</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Isotemp dry-bath incubator</td>
			<td style="width:189px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:185px;">2050FS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Laser scanning microscope</td>
			<td style="width:189px;">Carl Zeiss AG</td>
			<td style="width:185px;">LSM 710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Magnesium sulfate hexahydrate</td>
			<td style="width:189px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">230391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Microscope cover glass, 22x22-1</td>
			<td style="width:189px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:185px;">12-542-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Microscope cover glass, 24x60-1</td>
			<td style="width:189px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:185px;">12-545-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Potassium chloride</td>
			<td style="width:189px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:185px;">M-11321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Potassium phosphate dibasic</td>
			<td style="width:189px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">P3786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:189px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:185px;">M-11624</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Sodium phosphate dibasic</td>
			<td style="width:189px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">S7907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">TempController 2000-2</td>
			<td style="width:189px;">PeCon GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Tricaine-S</td>
			<td style="width:189px;">Western Chemical, Inc.</td>
			<td style="width:185px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyzing craniofacial morphogenesis in zebrafish using 4d confocal microscopy

Proyección de imagen de lapso de tiempo es una técnica que permite la observación directa del proceso de morfogénesis, o la generación de la forma. Debido a su claridad óptica y la susceptibilidad a la manipulación genética, el embrión de pez cebra se ha convertido en un organismo modelo muy popular con el que se realiza un análisis cronológico de la morfogénesis en embriones vivos. De formación de imágenes confocal de un embrión de pez cebra en vivo requiere que un tejido de interés se persistentemente marcado con un marcador fluorescente, tal como un transgén o medio de contraste inyectado. El proceso exige que el embrión se anestesia y se mantiene en su lugar de tal manera que el desarrollo saludable continúa normalmente. Parámetros para la formación de imágenes se deben configurar para tener en cuenta para el crecimiento tridimensional y para equilibrar las exigencias de la solución de células individuales al obtener fotos instantáneas de desarrollo. Nuestros resultados demuestran la capacidad de realizar a largo plazo de imágenes in vivo de embriones de pez cebra marcados con fluorescencia y para detectar variadas conductas de tejido enla cresta neural craneal que causan anomalías craneofaciales. Retrasos en el desarrollo causados ​​por la anestesia y el montaje son mínimos, y los embriones son sanos y salvos por el proceso. Embriones Time-lapse fotografiados pueden devolverse al medio líquido y posteriormente reflejados o se fijan en los puntos posteriores en el desarrollo. Con una abundancia cada vez mayor de líneas de pez cebra transgénico y suerte de cartografía bien caracterizado y técnicas de trasplante, las imágenes de cualquier tejido que se desea es posible. Como tal, time-lapse de imágenes in vivo combina fuerza con métodos genéticos de pez cebra, incluyendo los análisis de los embriones mutantes y microinyectados.

En los embriones de tipo salvaje, a raíz de la población de la cresta neural, los arcos faríngeos se alargan a lo largo de los ejes ventral anterior / posterior y dorsal / mientras se mueve en una dirección rostral (Película 1). En 30 horas después de la fertilización (HPF), la longitud anterior / posterior de la primera arco faríngeo es entre 1.8 a 1.9 veces su dorsal / ventral altura. Dorsal / elongación ventral avanza de manera constante, más rápido que la extensión anterior / posterior h...

Watch this Scientific Journal Video about Analyzing Craniofacial Morphogenesis in Zebrafish Using 4D Confocal Microscopy at JoVE.com

Analyzing Craniofacial Morphogenesis in Zebrafish Using 4D Confocal Microscopy

Imagen confocal Time-lapse es una técnica de gran alcance útil para caracterizar el desarrollo embrionario. Aquí se describe la metodología y caracterizamos la morfogénesis craneofacial de tipo salvaje, así como PDGFRA, Smad5 y smo embriones mutantes.

Analizando Craneofacial en la morfogénesis de pez cebra Utilizando 4D Microscopía Confocal

Time-lapse imaging is a technique that allows for the direct observation of the process of morphogenesis, or the generation of shape. Due to their optical ...

analyzing-craniofacial-morphogenesis-zebrafish-using-4d-confocal

Research

JoVE Journal

Biology

10.9K vistas.  The University of Texas at Austin.  Imagen confocal Time-lapse es una técnica de gran alcance útil para caracterizar el desarrollo embrionario. Aquí se describe la metodología y caracterizamos la morfogénesis craneofacial de tipo salvaje, así como PDGFRA, Smad5 y smo embriones mutantes. 

Video: Analyzing Craniofacial Morphogenesis in Zebrafish Using 4D Confocal Microscopy

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo. Here we describe a method to mount zebrafish embryos for long-term imaging and demonstrate how to automate the capture of time-lapse images using a confocal microscope. We also describe a method to create controlled, precise damage to individual branches of peripheral sensory axons in zebrafish using the focused power of a femtosecond laser mounted on a two-photon microscope. The parameters for successful two-photon axotomy must be optimized for each microscope. We will demonstrate two-photon axotomy on both a custom built two-photon microscope and a Zeiss 510 confocal/two-photon to provide two examples.

Zebrafish trigeminal sensory neurons can be visualized in a transgenic line expressing GFP driven by a sensory neuron specific promoter 1. We have adapted this zebrafish trigeminal model to directly observe sensory axon regeneration in living zebrafish embryos. Embryos are anesthetized with tricaine and positioned within a drop of agarose as it solidifies. Immobilized embryos are sealed within an imaging chamber filled with phenylthiourea (PTU) Ringers. We have found that embryos can be continuously imaged in these chambers for 12-48 hours. A single confocal image is then captured to determine the desired site of axotomy. The region of interest is located on the two-photon microscope by imaging the sensory axons under low, non-damaging power. After zooming in on the desired site of axotomy, the power is increased and a single scan of that defined region is sufficient to sever the axon. Multiple location time-lapse imaging is then set up on a confocal microscope to directly observe axonal recovery from injury.

Here we describe a method for mounting zebrafish embryos for long-term imaging, two-photon imaging and tissue-damage techniques, and time-lapse confocal imaging.

De dos fotones axotomía y de lapso de tiempo de imagen confocal en embriones de pez cebra en vivo

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Investigación

Biología

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the developing zebrafish brain (Gutzman et al, 2008). Such analysis affords a new understanding of the underlying cell biology required for development of the 3D structure of the vertebrate brain, and significantly increases our ability to study neural tube morphogenesis. The embryonic zebrafish brain is shaped beginning at 18 hours post fertilization (hpf) as the ventricles within the neuroepithelium inflate. By 24 hpf, the initial steps of neural tube morphogenesis are complete. Using the method described here, embryos at the one cell stage are injected with mRNA encoding membrane-targeted green fluorescent protein (memGFP). After injection and incubation, the embryo, now between 18 and 24 hpf, is mounted, inverted, in agarose and imaged by confocal microscopy. Notably, the zebrafish embryo is transparent making it an ideal system for fluorescent imaging. While our analyses have focused on the midbrain-hindbrain boundary and the hindbrain, this method could be extended for analysis of any region in the zebrafish to a depth of 
80-100 &mu;m.

In this video, we demonstrate a method by which to analyze the developing vertebrate brain in live zebrafish embryos at single cell resolution by confocal microscopy. This includes the method by which we inject the single-cell zebrafish embryo and subsequently mount and image the developing brain.

Imágenes en vivo del cerebro del embrión de pez cebra mediante microscopía confocal

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

Electroporation of Craniofacial Mesenchyme

Electroporation is an efficient method of delivering DNA and other charged macromolecules into tissues at precise time points and in precise locations. For example, electroporation has been used with great success to study neural and retinal development in Xenopus, chicken and mouse 1-10. However, it is important to note that in all of these studies, investigators were not targeting soft tissues. Because we are interested in craniofacial development, we adapted a method to target facial mesenchyme.
When we searched the literature, we found, to our surprise, very few reports of successful gene transfer into cartilaginous tissue. The majority of these studies were gene therapy studies, such as siRNA or protein delivery into chondrogenic cell lines, or, animal models of arthritis 11-13. In other systems, such as chicken or mouse, electroporation of facial mesenchyme has been challenging (personal communications, Dept of Craniofacial Development, KCL). We hypothesized that electroporation into procartilaginous and cartilaginous tissues in Xenopus might work better. In our studies, we show that gene transfer into the facial cartilages occurs efficiently at early stages (28), when the facial primordium is still comprised of soft tissue prior to cartilage differentiation.
Xenopus is a very accessible vertebrate system for analysis of craniofacial development. Craniofacial structures are more readily visible in Xenopus than in any other vertebrate model, primarily because Xenopus embryos are fertilized externally, allowing analyses of the earliest stages, and facilitating live imaging at single cell resolution, as well as reuse of the mothers 14. Among vertebrate models developing externally, Xenopus is more useful for craniofacial analysis than zebrafish, as Xenopus larvae are larger and easier to dissect, and the developing facial region is more accessible to imaging than the equivalent region in fish. In addition, Xenopus is evolutionarily closer to humans than zebrafish (&tilde;100 million years closer) 15. Finally, at these stages, Xenopus tadpoles are transparent, and concurrent expression of fluorescent proteins or molecules will allow easy visualization of the developing cartilages. We anticipate that this approach will allow us to rapidly and efficiently test candidate molecules in an in vivo model system.

Craniofacial cartilages develop in close contact with other tissues and are difficult to manipulate in live animals. We are using electroporation to deliver molecular tools during growth of the craniofacial skeleton while bypassing early embryonic effects. This approach will allow us to efficiently test candidate molecules in vivo.

Electroporación de mesénquima craneofacial

Electroporation is an efficient method of delivering DNA and other charged macromolecules into tissues at precise time points and in precise locations. ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to replenish depleted endoplasmic reticulum (ER) or sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ stores1,2. Since Ca2+ is a ubiquitous second messenger, it is not surprising to see that SOCE plays important roles in a variety of cellular processes, including proliferation, apoptosis, gene transcription and motility. Due to its wide occurrence in nearly all cell types, including epithelial cells and skeletal muscles, this pathway has received great interest3,4. However, the heterogeneity of SOCE characteristics in different cell types and the physiological function are still not clear5-7.
The functional channel properties of SOCE can be revealed by patch-clamp studies, whereas a large body of knowledge about this pathway has been gained by fluorescence-based intracellular Ca2+ measurements because of its convenience and feasibility for high-throughput screening. The objective of this report is to summarize a few fluorescence-based methods to measure the activation of SOCE in monolayer cells, suspended cells and muscle fibers5,8-10. The most commonly used of these fluorescence methods is to directly monitor the dynamics of intracellular Ca2+ using the ratio of F340nm and F380nm (510 nm for emission wavelength) of the ratiometric Ca2+ indicator Fura-2. To isolate the activity of unidirectional SOCE from intracellular Ca2+ release and Ca2+ extrusion, a Mn2+ quenching assay is frequently used. Mn2+ is known to be able to permeate into cells via SOCE while it is impervious to the surface membrane extrusion processes or to ER uptake by Ca2+ pumps due to its very high affinity with Fura-2. As a result, the quenching of Fura-2 fluorescence induced by the entry of extracellular Mn2+ into the cells represents a measurement of activity of SOCE9. Ratiometric measurement and the Mn+2 quenching assays can be performed on a cuvette-based spectrofluorometer in a cell population mode or in a microscope-based system to visualize single cells. The advantage of single cell measurements is that individual cells subjected to gene manipulations can be selected using GFP or RFP reporters, allowing studies in genetically modified or mutated cells. The spatiotemporal characteristics of SOCE in structurally specialized skeletal muscle can be achieved in skinned muscle fibers by simultaneously monitoring the fluorescence of two low affinity Ca2+ indicators targeted to specific compartments of the muscle fiber, such as Fluo-5N in the SR and Rhod-5N in the transverse tubules9,11,12.

The extent of store-operated Ca2+ entry (SOCE) can be monitored using fluorescent Ca2+ indicators. Mn2+ quenching of such indicators assays SOCE in cultured cells and skeletal muscle fibers. A technique allowing spatial and temporal resolution of SOCE by confocal imaging of mechanically skinned muscle fibers is also described.

Basado en la fluorescencia de medición de la entrada de calcio de la tienda que funciona en las células vivas: a partir de células cancerosas cultivadas de fibra muscular esquelética

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Visualization of Craniofacial Development in the sox10: kaede Transgenic Zebrafish Line Using Time-lapse Confocal Microscopy

Vertebrate palatogenesis is a highly choreographed and complex developmental process, which involves migration of cranial neural crest (CNC) cells, convergence and extension of facial prominences, and maturation of the craniofacial skeleton. To study the contribution of the cranial neural crest to specific regions of the zebrafish palate a sox10: kaede transgenic zebrafish line was generated. Sox10 provides lineage restriction of the kaede reporter protein to the neural crest, thereby making the cell labeling a more precise process than traditional dye or reporter mRNA injection. Kaede is a photo-convertible protein that turns from green to red after photo activation and makes it possible to follow cells precisely. The sox10: kaede transgenic line was used to perform lineage analysis to delineate CNC cell populations that give rise to maxillary versus mandibular elements and illustrate homology of facial prominences to amniotes. This protocol describes the steps to generate a live time-lapse video of a sox10: kaede zebrafish embryo. Development of the ethmoid plate will serve as a practical example. This protocol can be applied to making a time-lapse confocal recording of any kaede or similar photoconvertible reporter protein in transgenic zebrafish. Furthermore, it can be used to capture not only normal, but also abnormal development of craniofacial structures in the zebrafish mutants.

Visualization of experimental data has become a key element in presenting results to the scientific community. Generation of live time-lapse recording of growing embryos contributes to better presentation and understanding of complex developmental processes. This protocol is a step-by-step guide to cell labeling via photoconversion of kaede protein in zebrafish.

Visualización de Desarrollo Craneofacial en los SOX10: Kaede pez cebra transgénico Línea Usando Time-lapse microscopía confocal

Vertebrate palatogenesis is a highly choreographed and complex developmental process, which involves migration of cranial neural crest (CNC) cells, ...

Simultaneous pH Measurement in Endocytic and Cytosolic Compartments in Living Cells using Confocal Microscopy

Intracellular pH is tightly regulated and differences in pH between the cytoplasm and organelles have been reported1. Regulation of cellular pH is crucial for homeostatic control of physiological processes that include: protein, DNA and RNA synthesis, vesicular trafficking, cell growth and cell division. Alterations in cellular pH homeostasis can lead to detrimental functional changes and promote progression of various diseases2. Various methods are available for measuring intracellular pH but very few of these allow simultaneous measurement of pH in the cytoplasm and in organelles. Here, we describe in detail a rapid and accurate method for the simultaneous measurement of cytoplasmic and organellar pH by using confocal microscopy on living cells3. This goal is achieved with the use of two pH-sensing ratiometric dyes that possess selective cellular compartment partitioning. For instance, SNARF-1 is compartmentalized inside the cytoplasm whereas HPTS is compartmentalized inside endosomal/lysosomal organelles. Although HPTS is commonly used as a cytoplasmic pH indicator, this dye can specifically label vesicles along the endosomal-lysosomal pathway after being taken up by pinocytosis3,4. Using these pH-sensing probes, it is possible to simultaneously measure pH within the endocytic and cytoplasmic compartments. The optimal excitation wavelength of HPTS varies depending on the pH while for SNARF-1, it is the optimal emission wavelength that varies. Following loading with SNARF-1 and HPTS, cells are cultured in different pH-calibrated solutions to construct a pH standard curve for each probe. Cell imaging by confocal microscopy allows elimination of artifacts and background noise. Because of the spectral properties of HPTS, this probe is better suited for measurement of the mildly acidic endosomal compartment or to demonstrate alkalinization of the endosomal/lysosomal organelles. This method simplifies data analysis, improves accuracy of pH measurements and can be used to address fundamental questions related to pH modulation during cell responses to external challenges.

Several methods are available for measuring intracellular pH but very few of these allow simultaneous measurement of cytoplasmic and organellar pH. Here, we describe in detail a rapid and accurate methodology to simultaneously measure cytoplasmic and vesicular pH by ratiometric imaging of living cells.

Medición pH simultánea en Endocítica y citosólicas compartimentos en las células vivas usando microscopía confocal

Intracellular pH is tightly regulated and differences in pH between the cytoplasm and organelles have been reported1. Regulation of cellular pH is crucial ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and temporal resolution to study in vivo hematopoiesis using the murine bone marrow transplant experimental model. Genetic combinatorial marking using lentiviral vectors encoding fluorescent proteins (FPs) enabled cell fate mapping through advanced microscopy imaging. Vectors encoding five different FPs: Cerulean, EGFP, Venus, tdTomato, and mCherry were used to concurrently transduce HSPCs, creating a diverse palette of color marked cells. Imaging using confocal/two-photon hybrid microscopy enables simultaneous high resolution assessment of uniquely marked cells and their progeny in conjunction with structural components of the tissues. Volumetric analyses over large areas reveal that spectrally coded HSPC-derived cells can be detected non-invasively in various intact tissues, including the bone marrow (BM), for extensive periods of time following transplantation. Live studies combining video-rate multiphoton and confocal time-lapse imaging in 4D demonstrate the possibility of dynamic cellular and clonal tracking in a quantitative manner.

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

Combinatorial 5 fluorescent proteins marking of hematopoietic stem and progenitor cells allows in vivo clonal tracking via confocal and two-photon microscopy, providing insights into bone marrow hematopoietic architecture during regeneration. This method allows non-invasive fate mapping of spectrally-coded HSPCs-derived cells in intact tissues for extensive periods of time following transplantation.

En Tracking Clonal vivo de madre hematopoyéticas y células progenitoras Marcado por cinco proteínas fluorescentes utilizando confocal y Microscopía Multifotónica

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

4D Microscopy of Yeast

The goal of this protocol is to characterize how membrane compartments form and transform in live cells of budding yeast. Many intracellular compartments in yeast are dynamic, and a full understanding of their properties requires time-lapse imaging. Multi-color 4D confocal fluorescence microscopy is a powerful method for tracking the behavior and composition of an intracellular compartment on a time scale of 5-15 min. Rigorous analysis of compartment dynamics requires the capture of thousands of optical sections. To achieve this aim, photobleaching and phototoxicity are minimized by scanning rapidly at very low laser power, and the pixel dimensions and Z-step intervals are set to the largest values that are compatible with sampling the image at full resolution. The resulting 4D data sets are noisy but can be smoothed by deconvolution. Even with high quality data, the analysis phase is challenging because intracellular structures are often numerous, heterogeneous, and mobile. To meet this need, custom ImageJ plugins were written to array 4D data on a computer screen, identify structures of interest, edit the data to isolate individual structures, quantify the fluorescence time courses, and make movies of the projected Z-stacks. 4D movies are particularly useful for distinguishing stable compartments from transient compartments that turn over by maturation. Such movies can also be used to characterize events such as compartment fusion, and to test the effects of specific mutations or other perturbations.

This protocol describes the analysis of fluorescently labeled intracellular compartments in budding yeast using multi-color 4D (time-lapse 3D) confocal microscopy. The imaging parameters are chosen to capture adequate signals while limiting photodamage. Custom ImageJ plugins allow labeled structures to be tracked and quantitatively analyzed.

Microscopía 4D de levadura

The goal of this protocol is to characterize how membrane compartments form and transform in live cells of budding yeast. Many intracellular compartments ...

Visualizing Lymph Node Structure and Cellular Localization using Ex-Vivo Confocal Microscopy

Lymph nodes (LNs) are organs spread within the body, where the innate immune responses can connect with the adaptive immunity. In fact, LNs are strategically interposed in the path of the lymphatic vessels, allowing intimate contact of tissue antigens with all resident immune cells in the LN. Thus, understanding the cellular composition, distribution, location and interaction using ex vivo whole LN imaging will add to the knowledge on how the body coordinates local and systemic immune responses. This protocol shows an ex vivo imaging strategy following an in vivo administration of fluorescent-labeled antibodies that allows a very reproducible and easy-to-perform methodology by using conventional confocal microscopes and stock reagents. Through subcutaneous injection of antibodies, it is possible to label different cell populations in draining LNs without affecting tissue structures that can be potentially damaged by a conventional immunofluorescence microscopy technique.

This protocol describes a technique to image different cell populations in draining lymph nodes without alterations in the organ structure.

Visualización de la estructura de los ganglios linfáticos y la localización celular mediante la microscopía confocal Ex-Vivo

Lymph nodes (LNs) are organs spread within the body, where the innate immune responses can connect with the adaptive immunity. In fact, LNs are ...

Analyzing the &alpha;-Actinin Network in Human iPSC-Derived Cardiomyocytes Using Single Molecule Localization Microscopy

The maturation of iPSC-derived cardiomyocytes is a critical issue for their application in regenerative therapy, drug testing and disease modeling. Despite the development of multiple differentiation protocols, the generation of iPSC cardiomyocytes resembling an adult-like phenotype remains challenging. One major aspect of cardiomyocytes maturation involves the formation of a well-organized sarcomere network to ensure high contraction capacity. Here, we present a super resolution-based approach for semi-quantitative analysis of the &#945;-actinin network in cardiomyocytes. Using photoactivated localization microscopy a comparison of sarcomere length and z-disc thickness of iPSC-derived cardiomyocytes and cardiac cells isolated from neonatal tissue was performed. At the same time, we demonstrate the importance of proper imaging conditions to obtain reliable data. Our results show that this method is suitable to quantitatively monitor the structural maturity of cardiac cells with high spatial resolution, enabling the detection of even subtle changes of sarcomere organization.

Analyzing the &amp;#945;-Actinin Network in Human iPSC-Derived Cardiomyocytes Using Single Molecule Localization Microscopy

The formation of a proper sarcomere network is important for the maturation of iPSC-derived cardiomyocytes. We present a super resolution-based approach that allows for the quantitative evaluation of the structural maturation of stem cell derived cardiomyocytes, to improve culture conditions promoting cardiac development.

Análisis de la red α-Actinin en cardiomiocitos humanos derivados de iPSC mediante microscopía de localización de molécula única

The maturation of iPSC-derived cardiomyocytes is a critical issue for their application in regenerative therapy, drug testing and disease modeling. ...