Los autores agradecen a los miembros pasados ​​y presentes de nuestros laboratorios que ayudaron a desarrollar estas técnicas. Parte de la financiación proporcionada al DE por una subvención del Instituto de California para la Medicina Regenerativa / CIRM (RN1-00538).

1. Pez cebra Cría, generación de embriones, y Tratamiento <ol><li> Llevar a cabo los siguientes protocolos de pez cebra, bajo la guía de un cuidado de los animales y el uso comité institucional (IACUC) y dentro de las pautas de cuidado de animales de la NIH u otros organismos / directrices reguladoras. </li><li> Cepas de pez cebra que expresan proteínas fluorescentes en tejidos específicos, células u órganos están disponibles en el Centro Internacional de Recursos de pez cebra (ZIRC). Por ejemplo, la Tg (KDR: EGPF) s843 expresar EGFP en células endoteliales vasculares 6, que se pueden usar para producir estructuras vasculares 3D completos como se muestra en este protocolo. Otras líneas de pez cebra transgénico están disponibles en ZIRC. </li><li> Casa pez cebra adulto en un sistema de acuicultura apropiada que monitoriza el pH, la salinidad, la temperatura, el oxígeno disuelto, la luz y otros factores ambientales 7. El pez cebra muestra aquí fueron alojados en un sistema de Aquaneering Inc. (San Diego, CA) a 28,5 ° C con un lig 14 horasoscuridad ciclo ht/10 horas. Alimente adultos de pez cebra con una dieta equilibrada de artemia y NRD 4.6 Alimentos para peces (Artemia directo, Ogden, Utah). </li><li> Varón adulto y el pez cebra hembra en edad reproductiva deben ser alojados por separado para aumentar el éxito de apareamiento. </li><li> Estimular la puesta de huevos y la fertilización mediante la colocación de las hembras (2-4) y los varones (4-6) juntos en un contenedor de acoplamiento que tiene un fondo de malla con agujeros lo suficientemente grandes como para que los huevos caen a través de, pero era demasiado pequeña para los adultos de pez cebra para pasar . Configure apareamientos la noche antes; huevos se ponen cerca de la madrugada, por lo general, mientras que el ciclo de luz diurna aumenta lentamente en intensidad (amanecer). Entrada para los huevos en la parte inferior del recipiente de apareamiento cada 15-30 minutos. </li><li> Recoger los huevos usando un colador de malla y limpia con tampón E3 (NaCl 5 mM, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl 2, 0,33 mM MgSO4). La transferencia de los huevos a 100 mm placas de cultivo llenos de buffer de E3 y almacenar en una incubadora de 28 ° C. </li><li> Para estudiar los productos químicos que alteran CERebrovascular ramificación agregar concentraciones químicas deseadas. Por ejemplo ramificación neovasular puede ser inducida con inhibidor de la γ-secretasa (GSI IX/DAPT/N- [N-(3,5-Difluorophenacetyl-L-alanil)] éster-S-phenylglycinet-butil) solubilizado en DMSO al 4, comenzando 24 horas después de la fecundación (HPF). En aquel tiempo los embriones puntos siguen estando dentro del corion, y muchas sustancias químicas pueden pasar a través de él 8. Si una condición de tratamiento tiene neuronales o motoras efectos que perjudiquen la capacidad de los embriones de liberarse del corion, a continuación, los embriones deben ser-chorionated des entre 24 y 48 HPF, que se pueden hacer con fórceps de pronasa 2. Los embriones que se muestran en las imágenes proporcionadas fueron dechorionated agarrando suavemente el corion con dos pinzas afiladas y lagrimeo abierto. </li><li> Si es necesario / deseado, la formación de pigmento puede ser inhibida por la adición de 0,003% de N-feniltiourea (PTU) a la memoria intermedia de E3 a 24 HPF. </li></ol> 2. Confocal de Cerebrovascular Structdas en fijo embriones de pez cebra <ol><li> Sacrificio embriones en 250 mg / L tricaína metanosulfonato, y luego arreglarlos por inmersión en 2-4% de paraformaldehído la noche a 4 ° C. Los contenedores con embriones fluorescentes deben ser envueltos en papel de aluminio. Una vez fijado, los embriones deben ser almacenados en PBS a 4 ° C hasta fotografiado - intensidad de la fluorescencia de EGFP se vuelve menos resuelto después de una semana, pero la morfología (como se ve en campo claro) se conserva mucho más tiempo. </li><li> Preparar para montar el embrión mediante la eliminación de primero un ojo usando una aguja de tungsteno afilado. Cortar alrededor del tejido que conecta el ojo primero y luego cortar los músculos, y finalmente cortar el nervio óptico para desplazar el ojo. (Nota: Si quita proyección de imagen los dos lados se desea ambos ojos.) </li><li> Una vez que se retira el ojo, montar el embrión en un cubreobjetos usando una gota de 3% de metilcelulosa. Orientar el embrión de manera que el lado con el ojo extraído se enfrenta el cubreobjetos y es lo más cercano al vidrio como sea posible. Cubrir todo el embrión con metillcellulose para evitar la desecación durante la exploración. </li><li> Imagen del embrión montado inmediatamente utilizando un microscopio confocal invertido equipado con una alta calidad de objetivo de 20x Plan de Apo (apertura numérica = 0.75 o superior). Esta configuración es preferible un microscopio no invertida que requeriría intercalando el embrión entre dos planos de vidrio, y presionando el embrión contra el cristal superior. </li><li> Recoger rebanadas ópticos en 1 m incrementos mediante un ajuste de la abertura mediana o grande. Pasos más grandes de 2,5 m también se pueden utilizar, pero puede ser más difícil para determinar el orden espacial de los objetos más pequeños. Las aberturas pequeñas producen detalle más agudo, pero las exploraciones más largos requeridos pueden blanquear EGFP y también limitar la profundidad de formación de imágenes en el embrión que se puede lograr. Un microscopio confocal permite la formación de imágenes a mitad de camino a través de un embrión. </li><li> Si se desea la formación de imágenes de todo el pescado, retire los dos ojos al principio (véase la nota en el paso 3.2), gire el embrión después imaging un lado y repita los pasos 2.3 a 2.5 para el lado opuesto. </li></ol> 3. Reconstrucción 3D de Embryonic pez cebra cerebrovasculatura <ol><li> Utilice la distribución Fiji 3 de ImageJ código abierto (http://fiji.sc), que está optimizado para representaciones en 3D, de forma gratuita, y es compatible con PC, Mac y Linux. </li><li> Importar pilas confocal a Fiji por ir a Plugins&gt; LOCI&gt; BioFormats Importador 9 a continuación, seleccione el archivo confocal, por ejemplo name.ids para pilas de Nikon (Figura 2A). Seleccione Ver pila con el modo HyperStack, color: escala de grises, compruebe autoescala, compruebe canales divididos. </li><li> Estas selecciones se abrirán cuatro paneles de canales separados; para EGFP único se necesitarán, por lo general el tercero hacia abajo. Cierre los otros tres paneles (rojo, azul y alfa) dejando la imagen de 16 bits con un nombre largo, seguido de C = 1 (Figura 2A). </li><li> Ajuste de umbral en los escaneos aunque la imagen utilizando el desplazamiento tab en la parte inferior para encontrar un sector que tiene la región o estructura de interés, a continuación, ir a Imagen&gt; Ajustar&gt; Umbral (Figura 2 C). </li><li> En el panel que aparece, deslice la barra superior (nivel de negro) a la izquierda de modo que la estructura se puede ver bastante bien sobre el fondo, y dejar la corredera inferior (nivel de blanco) donde es (Figura 2D). Seleccione B &amp; W, seleccione Fondo oscuro. No seleccione Umbral calcular para cada imagen a menos que se requieren diferentes ajustes para cada sector, seleccione fondo Negro. Este proceso crea una nueva imagen de 8 bits. </li><li> ADVERTENCIA: El umbral no se puede deshacer o guardado en ImageJ, por lo que la pila confocal tendrá que volver a cargar cada vez que se necesita un cambio. Anote los números y probar diferentes configuraciones hasta conseguir el resultado deseado. </li><li> Ir a Plugins&gt; 3D Visor&gt; Umbral 0, Remuestreo factor de 1 (mejor) o 2 (bueno), anule la selección de los cuadros de color rojo y azul para hacer una salida de 3D verde - de lo contrario, will producir una representación blanco - seleccione Aplicar (no automático) (Figura 2E). </li><li> Girar, girar y ampliar o reducir la imagen 3D con el ratón y los controles del teclado (Figura 2F). </li><li> Guardar imágenes fijas en cualquier momento mediante el uso de la opción de captura en el menú. El tamaño del cuadro de imagen en la pantalla dicta dimensiones en píxeles de la imagen producida por lo que si una imagen de alta resolución se desea hacer la caja más grande, arrastre la esquina inferior derecha. </li><li> Crear una película que hace girar 3D seleccionando Ver&gt; Registro de la rotación de 360 grados (Figura 2G). Incumplimientos de rotación a 2 grados por paso, pero se puede cambiar a los 5 grados, por ejemplo, lo que creará tamaños de archivos mucho más pequeños, pero pueden agregar sacudidas a la animación. </li><li> Guarde el archivo en uno de los varios formatos disponibles para su posterior visualización con los reproductores multimedia, subir a Internet, o utilizar en presentaciones de PowerPoint. La fuente reproductor multimedia abierto, VLC ( <a href="http://www.videolan.org/vlc/index.html">ht</a>tp :/ / www.videolan.org / vlc / index.html), es gratuita y se ocupa de estos videos muy bien. </li></ol>

<ol>
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No hay nada que revelar.

Los métodos descritos aquí proporcionan una base para los estudios visuales del sistema vascular en el desarrollo de pez cebra. Los especímenes vivos se pueden utilizar para evaluar los parámetros fisiológicos, tales como la frecuencia cardíaca y el volumen sistólico del corazón, mientras que las muestras fijas se pueden utilizar para la formación de imágenes confocal de alta resolución. Drosophila y C. elegans permite la formación de imágenes de todo el cuerpo, pero el pez cebra son vertebrados y proporcionan un modelo útil para los tejidos de vertebrados, incluyendo un sistema vascular de células forrado endotelial. Estos estudios pueden incorporar líneas transgénicas importantes y recursos genómicos de la comunidad de investigación de pez cebra. Reconstrucción 3D y renderizado de imágenes de confocal de embriones de pez cebra, tal como se describe aquí, permitir un enfoque de la biología de sistemas para la ramificación vascular y la densidad de los vasos sanguíneos que no es posible con los modelos animales más grandes, como las ratas y los ratones. Además, como amniotas pez cebra se desarrollan en un entorno modificable (tampón E3), donde se puede agregar fácilmente chemicals que inhiben las enzimas específicas u otros procesos que afectan al desarrollo vascular. La concentración y el tiempo de entrega de productos químicos pueden ser alterados, lo que permite al investigador condiciones de tratamiento para afinar. 1. Modificaciones y solución de problemas Las modificaciones de este sistema puede incorporar líneas transgénicas de pez cebra que expresan proteínas fluorescentes EGFP o otros en una variedad de tejidos, de órganos o región patrones específicos 10. Además, el análisis de los cambios neovasculares de la retina de pez cebra recientemente se ha publicado 5. Problemas con la pigmentación en embriones de pez cebra adultos mayores y pueden ser compensadas por el cruce con líneas transgénicas que no producen pigmentos escala o pigmentario de la retina. Problemas con fluorescencia disminuida resultan típicamente de fijación de condiciones inapropiadas. El paraformaldehído (4%) durante 1 día es el óptimo, pero fijadores más fuertes, tales como glutaraldehído, tetróxido de osmio o alcohol, mayodestruir EGFP fluorescencia. Después de la fijación, los embriones deben mantenerse en PBS a 4 ° C y siempre protegidos de la luz directa del sol. 2. Limitaciones de esta técnica La calidad y la resolución de representaciones en 3D producidas con este protocolo dependen de la calidad de las imágenes generadas. Penetración de la luz a través de estos embriones se limita al plano sagital medial utilizando un microscopio confocal estándar. Este aspecto de la imagen limita la profundidad de las imágenes en los embriones de más edad y los adultos, pero los sistemas de microscopía multifotónica más avanzados permiten la proyección de imagen a mayores profundidades. 3. Importancia con respecto a los métodos existentes Este protocolo proporciona un enfoque para el análisis de redes de vasos sanguíneos en un nivel de sistemas que puede incorporar un animal entero. Representaciones anteriores de tales datos a menudo se basaban en serie de imágenes dispuestas juntos, pero 3D proporciona una mejor resolución de la relación espacialciones implicadas. 4. Las futuras aplicaciones Nuevos avances en la formación de imágenes y procesamiento de tejidos ofrecerá muchas nuevas aplicaciones para estos métodos que pueden incluir hacer embriones de más edad o adultos transparente 11-14. Mayor transparencia aumentará en gran medida la penetración del tejido por los láseres confocal y multi-fotón. Además, como la velocidad de las cámaras y los tubos fotomultiplicadores aumentar pronto podría ser posible producir representaciones en 3D de peces en tiempo real, proporcionando una 4 ª dimensión de análisis. 5. Los pasos críticos Un paso crítico en este protocolo es la preparación para la formación de imágenes, que incluye la fijación adecuada. Imaging se debe hacer lo más pronto posible después de la fijación de los objetivos de alta calidad que tienen las mejores aperturas numéricas disponibles. Resolución depende del sistema de imagen utilizado, por lo que los sistemas de alta calidad son generalmente mejores. La generación de representaciones en 3D requiere mucha memoriaPorque de esta manera nuevos, computadoras de alta gama con una gran cantidad de memoria y buenos procesadores gráficos son recomendables. El sistema de la biología visual descrito aquí ha sido optimizado para el pez cebra transgénico que expresan EGFP en células endoteliales vasculares, aunque estos métodos se pueden adaptar a los embriones transgénicos que expresan la GFP, o de otras proteínas fluorescentes, en las poblaciones de neuronas, músculos, glándulas o de cualquier número de otras células. La principal ventaja de trabajar con este sistema es la posibilidad de estudiar lo que está sucediendo en todo el embrión en cualquier momento durante este período de desarrollo, en los animales fijos y / o en vivo.

El pez cebra proporciona un potente sistema para estudiar la biología del desarrollo, y la transparencia relativa de sus embriones es susceptible a los estudios basados ​​en la imagen 1. El pez cebra ahora se ha utilizado como un modelo para el desarrollo de vertebrados durante décadas. Teleósteos, incluyendo el pez cebra, tienen un sistema vascular vertebrados simplificado que no tiene homólogo razonable en los invertebrados. La sangre es bombeada desde la cámara anterior de un corazón de dos cámaras a través de las branquias, donde se oxigena. La sangre de las branquias converge en la aorta dorsal y pasa a través de las arterias que se ramifican en vasos más pequeños y más pequeños, eventualmente capilares alcance en tejidos de órganos. Dentro de oxígeno capilares se libera y el dióxido de carbono es absorbido. En el lado venoso de los capilares de la sangre fluye hacia las venas más grandes y más grandes y finalmente se introduce en la cámara posterior del corazón, donde el ciclo se repite. Un pez cebra adulta puede poner 200 o más huevos a la vez, y once fertilizado, se desarrollan rápidamente 2. Dentro de un día al eje del cuerpo está bien desarrollada, incluyendo los músculos que se contraen y se mueven al embrión por el interior de la membrana coriónica. De 2-7 días después de la fertilización (dpf) la mayoría de los sistemas del cuerpo a desarrollar, incluyendo los ojos y el sistema nervioso central que puede coordinar a nadar hacia la comida o lejos de la luz brillante. Hasta 7 embriones dpf son lo suficientemente pequeños para permitir la visualización con microscopia. Las líneas transgénicas que expresan proteínas fluorescentes se pueden obtener imágenes con microscopía confocal o de fluorescencia. Confocal de imágenes se puede combinar con el software de código abierto 3 para crear representaciones en 3D de estructuras vasculares completos en embriones de pez cebra que ofrecen una perspectiva de la biología de sistemas del desarrollo vascular. Estudios relacionados con los cambios en la complejidad vascular y cerebrovascular se beneficiarán de este protocolo, ya que permite un análisis a nivel de sistemas de redes vasculares 4,5. Una compilación de los métodos y recursos son proporcionard para permitir una fácil adopción y de estas técnicas para los estudios que requieren de formación de imágenes de estructuras vasculares en embriones de pez cebra. La eficiencia de costes del pez cebra como un modelo animal es la combinación con tecnologías de la imagen emergentes para proporcionar nuevas plataformas con las que evaluar los efectos angiogénicos de vías moleculares en el desarrollo de vertebrados y la homeostasis.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="889">
	<tbody>
		<tr>
			<td>N &#8211; Phenylthiourea&#160;</td>
			<td>Alfa Aesar, catalog #41972</td>
			<td></td>
			<td>0.2 M in E3 buffer, kept at 4oC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E3 buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td>5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>D-EclipseC1 on a Nikon TE-2000U</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dishes</td>
			<td>Mat-Tek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GSI IX/DAPT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>N-[N-(3,5-Difluorophenacetyl-L-alanyl)]-S-phenylglycinet-butyl ester EMD Biosciences</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plates&#160;</td>
			<td>Becton-Dickinson, cat# 351147</td>
			<td></td>
			<td>BD Falcon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipettes&#160;</td>
			<td>VWR,&#160; cat #414004-001</td>
			<td></td>
			<td>VWR disposable transfer pipets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl-cellulose&#160;</td>
			<td>Alfa Aesar, cat#43146</td>
			<td></td>
			<td>3% in E3 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NRD 4/6 Fish food&#160;</td>
			<td>Brine Shrimp Direct</td>
			<td></td>
			<td>Dried</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brine shrimp</td>
			<td>Brine Shrimp Direct</td>
			<td></td>
			<td>Live</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tungsten wire&#160;</td>
			<td>Small Parts # TW-016-60</td>
			<td></td>
			<td>0.016&#8221; OD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine</td>
			<td>VWR # 101107-950</td>
			<td></td>
			<td>Tricaine methanesulfonate 250 mg/L in E3 buffer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging and 3d reconstruction of cerebrovascular structures in embryonic zebrafish

El pez cebra son una poderosa herramienta para estudiar la biología del desarrollo y la patología en vivo. El pequeño tamaño y la transparencia relativa de embriones de pez cebra los hacen particularmente útiles para el examen visual de los procesos tales como el corazón y el desarrollo vascular. En varios estudios recientes pez cebra transgénico que expresan EGFP en las células endoteliales vasculares se utilizaron para la imagen y analizar las redes vasculares complejas en el cerebro y la retina, utilizando microscopía confocal. Las descripciones se proporcionan a preparar, tratar y la imagen embriones de pez cebra que expresan mayor proteína verde fluorescente (EGFP), y luego generar representaciones 3D integrales del sistema cerebrovascular. Los protocolos incluyen el tratamiento de embriones, la imagen confocal, y protocolos de fijación que preservan la fluorescencia de EGFP. Además, se proporcionan consejos útiles sobre la obtención de imágenes de alta calidad de las estructuras vasculares cerebrales, como la eliminación del ojo sin dañar el tejido neural cercano. Peligros potencialescon la imagen confocal se discuten, junto con los pasos necesarios para generar reconstrucciones en 3D de pilas de imágenes confocal utilizando software de código abierto disponible gratuitamente.

La reconstrucción 3D de estructuras vasculares proporciona una perspectiva global y visualmente interesante de desarrollo del pez cebra. Figuras métodos 1 y 2 muestran ya que normalmente realizan. Figura 3 muestra varios ángulos de estructuras vasculares en un 6 dpf embrión de pez cebra que expresa EGFP en células endoteliales. Con un color verde o blanco sólido que puede ser difícil de apreciar intensidad de la señal; seudo-coloración proporcionar intensidad de la imagen de una tabla de consulta y permite una mejor percepción de la profundidad cuando las estructuras se superponen. Un ejemplo de una imagen en 3D pseudo-color de la vasculatura en un 6 dpf pez cebra se proporciona en la Figura 4. Fluorescencia de formación de imágenes de embriones vivos se puede utilizar para estudiar las características fisiológicas que incluyen el ojo y el movimiento del cuerpo, y la actividad cardíaca. Figuras 3 y 4 mostrar resultados representativos obtenidos con estos métodos, utilizando la línea de pez cebra transgénico<html> descrito. Imágenes de resolución depende de las características de microscopio, pero el brillo de la señal de EGFP es suficiente para una buena calidad de imagen con la mayoría de los sistemas comerciales. Reconstrucción y rendición de representaciones en 3D, es consistente y opciones dentro de este software de código abierto proporcionan consistentemente buenos resultados. <img alt="Figura 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50417/50417fig1highres.jpg" width="600" /> Figura 1. Eliminación de ojos. A) Un embrión 3 dpf fija con una necesidad de tungsteno situado al lado del ojo. El tejido se cortó alrededor del ojo a partir de esta posición. B) El ojo es cae y los músculos oculares subyacentes y el nervio óptico se cortan. La cuenca vacía está indicado con el círculo de trazos. C) El mismo embrión se dio la vuelta y montado con metil-celulosa, con el ojo intacto hacia arriba.<html> hres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. <img alt="Figura 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50417/50417fig2highres.jpg" width="600" /> Figura 2. Paso a paso la reconstrucción 3D de una pila de imagen confocal. A) Abrir el archivo (4104.1.ids) cargado en Fiji usando Plugins&gt; LOCI&gt; BIOFORMAT seleccionar. B) Después de encontrar un sector con la región de interés, se selecciona el ajuste de umbral como se muestra. C) Threshold se ajusta al 214 utilizando la parte superior se selecciona slider y aplicar. espectador D) 3D se llama como se muestra. E) La reconstrucción 3D se muestra de un pez cebra con el ojo intacto, para la orientación. F) La imagen ha sido ampliada y se hace girar. G) Una película de la rotación de 360 grados se hace como se muestra.<html> res.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. <img alt="Figura 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50417/50417fig3highres.jpg" width="600" /> Figura 3. Perspectivas de la reconstrucción 3D. A) perspectiva medial de 6 embriones dpf reflejado con objetivo de 10x, la boca está a la derecha, no branquias dentro de la boca. B) lateral del mismo embrión, nota aleta es un bucle en el medio. C) El mismo embrión reflejado con objetivo 20x, perspectiva medial, la resolución de enmalle nota. D) La perspectiva lateral de 20x de imagen objetivo. La aleta está en el borde derecho del panel. E) vista antero medial de 20x de imagen objetivo, branquias nota dentro de la boca. F) Abdomen del mismo embrión fotografiado con un objetivo de 20x, la cabeza hacia la derecha. Nota vasculatura en el saco de la yema en la parte inferior derecha.jove.com/files/ftp_upload/50417/50417fig3highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. <img alt="Figura 4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50417/50417fig4highres.jpg" width="600" /> Figura 4. Diferencias de intensidad en 6 dpf embrión. Imagen de una reconstrucción 6 dpf usando un look-up-tabla pseudocolor para la intensidad de la señal. Boca, el cerebro, branquias y saco vitelino están etiquetados para la orientación. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50417/50417fig4highres.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="La figura 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50417/Zfish_still.jpg" width="500" /> Figura 5. Película del sistema vascular reconstruida en un pez cebra 4 dpf. El pescado fue fotografiada en el 2,5 micras. Las imágenes erande imagen una media del embrión. Comparar las estructuras vasculares con estructuras en un pez cebra tratados-GSI proporcionadas en la Figura 6. Tenga en cuenta la menor densidad de los vasos sanguíneos en la cabeza y branquias más grandes. (Consulte el archivo complementario &quot;Zfish_spin.avi&quot; zona de descargas) <img alt="La figura 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50417/Zfish_still1.jpg" width="500" /> Figura 6. 3D Movie del sistema vascular en el embrión tratado-GSI en 4 dpf. El pescado fue fotografiada en el 2,5 micras a través de lateral a la línea media. Comparar las estructuras vasculares con el control 4 dpf peces se muestra en la Figura 5. La espalda arqueada y el tamaño más pequeño son típicos en los embriones tratados con este producto químico. (Ver la &quot;GSI-treated_4dpf_fish.avi&quot; archivo suplementario en Descargas)

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Imaging and 3D Reconstruction of Cerebrovascular Structures in Embryonic Zebrafish

Imágenes del desarrollo cerebrovascular en larvas de pez cebra se describe. También se proporcionan técnicas para facilitar la proyección de imagen 3D y modificar desarrollo cerebrovascular el uso de tratamientos químicos.

Imágenes y Reconstrucción 3D de Estructuras Embrionarias cerebrovasculares en pez cebra

Zebrafish are a powerful tool to study developmental biology and pathology in vivo.  The small size and relative transparency of zebrafish embryos make ...

imaging-3d-reconstruction-cerebrovascular-structures-embryonic

Research

JoVE Journal

Biology

14.7K vistas.  Western University of Health Sciences.  Imágenes del desarrollo cerebrovascular en larvas de pez cebra se describe. También se proporcionan técnicas para facilitar la proyección de imagen 3D y modificar desarrollo cerebrovascular el uso de tratamientos químicos. 

Video: Imaging and 3D Reconstruction of Cerebrovascular Structures in Embryonic Zebrafish

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the developing zebrafish brain (Gutzman et al, 2008). Such analysis affords a new understanding of the underlying cell biology required for development of the 3D structure of the vertebrate brain, and significantly increases our ability to study neural tube morphogenesis. The embryonic zebrafish brain is shaped beginning at 18 hours post fertilization (hpf) as the ventricles within the neuroepithelium inflate. By 24 hpf, the initial steps of neural tube morphogenesis are complete. Using the method described here, embryos at the one cell stage are injected with mRNA encoding membrane-targeted green fluorescent protein (memGFP). After injection and incubation, the embryo, now between 18 and 24 hpf, is mounted, inverted, in agarose and imaged by confocal microscopy. Notably, the zebrafish embryo is transparent making it an ideal system for fluorescent imaging. While our analyses have focused on the midbrain-hindbrain boundary and the hindbrain, this method could be extended for analysis of any region in the zebrafish to a depth of 
80-100 &mu;m.

In this video, we demonstrate a method by which to analyze the developing vertebrate brain in live zebrafish embryos at single cell resolution by confocal microscopy. This includes the method by which we inject the single-cell zebrafish embryo and subsequently mount and image the developing brain.

Imágenes en vivo del cerebro del embrión de pez cebra mediante microscopía confocal

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

Investigación

Biología

Tissue Targeted Embryonic Chimeras: Zebrafish Gastrula Cell Transplantation

Certain fundamental questions in the field of developmental biology can only be answered when cells are placed in novel environments or when small groups of cells in a larger context are altered.  Watching how one cell interacts with and behaves in a unique environment is essential to characterizing cell functions.  Determining how the localized misexpression of a specific protein influences surrounding cells provides insightful information on the roles that protein plays in a variety of developmental processes.  Our lab uses the zebrafish model system to uniquely combine genetic approaches with classical transplantation techniques to generate genotypic or phenotypic chimeras.  We study neuron-glial cell interactions during the formation of forebrain commissures in zebrafish. This video describes a method that allows our lab to investigate the role of astroglial populations in the diencephalon and the roles of specific guidance cues that influence projecting axons as they cross the midline. Due to their transparency zebrafish embryos are ideal models for this type of ectopic cell placement or localized gene misexpression. Tracking transplanted cells can be accomplished using a vital dye or a transgenic fish line expressing a fluorescent protein. We demonstrate here how to prepare donor embryos with a vital dye tracer for transplantation, as well as how to extract and transplant cells from one gastrula staged embryo to another.  We present data showing ectopic GFP+ transgenic cells within the forebrain of zebrafish embryos and characterize the location of these cells with respect to forebrain commissures.  In addition, we show laser scanning confocal timelapse microscopy of Alexa 594 labeled cells transplanted into a GFP+ transgenic host embryo.  These data provide evidence that gastrula staged transplantation enables the targeted positioning of ectopic cells to address a variety of questions in Developmental Biology.

Zebrafish cell transplantation enables the combination of genetics and embryology to generate tissue specific chimeras. This video demonstrates gastrula staged cell transplantations that have allowed our lab to investigate the roles of astroglial populations and specific guidance cues during commissure formation in the forebrain.

Tejido diana quimeras embrionarias: pez cebra Gástrula Trasplante de células

Certain fundamental questions in the field of developmental biology can only be answered when cells are placed in novel environments or when small groups ...

Microdissection of Zebrafish Embryonic Eye Tissues

Zebrafish is a popular animal model for research on eye development because of its rapid ex utero development and good fecundity. By 3 days post fertilization (dpf), the larvae will show the first visual response. Many genes have been identified to control a proper eye development, but we are far from a complete understanding of the underlying genetic architecture. Whole genome gene expression profiling is a useful tool to elucidate genetic regulatory network for eye development. However, the small size of the embryonic eye in zebrafish makes it challenging to obtain intact and pure eye tissues for expression analysis. For example, the anterior-posterior length of the eye between day 2 and 3 is only approximately 200-300 &mu;m, while the diameter of the lens is less 100 &mu;m. Also, the retinal pigment epithelium (RPE) underlying the retina is just a single-layer epithelium. While gene expression profiles can be obtained from the whole embryo, they do not accurately represent the expression of these tissues. Therefore pure tissue must be obtained for a successful gene expression profiling of eye development. To address this issue, we have developed an approach to microdissect intact retina and retina with RPE attached from 1-3 dpf, which cover major stages of eye morphogenesis. All procedures can be done with fine forceps and general laboratory supplies under standard stereomicroscopes. For retinal dissection, the single-layer RPE is removed and peeled off by brushing action and the preferential adherence of the RPE remnants to the surface of the culture plate for dissection. For RPE-attached retinal dissection, the adherence of RPE to the dissection plate is removed before the dissection so that the RPE can be completely preserved with the retina. A careful lifting action of this tissue can efficiently separate the presumptive choroid and sclera. The lens can be removed in both cases by a chemically etched tungsten needle. In short, our approach can obtain intact eye tissues and has been successfully utilized to study tissue-specific expression profiles of zebrafish retina1, 2 and retinal pigment epithelium3.

This article describes an approach to microdissect zebrafish retinas with and without retinal pigment epithelium attached, from one to three days postfertilization embryos.

Microdisección de los tejidos del ojo de pez cebra embrionarias

Zebrafish is a popular animal model for research on eye development because of its rapid ex utero development and good fecundity. By 3 days post ...

Immunostaining of Dissected Zebrafish Embryonic Heart

Zebrafish embryo becomes a popular in vivo vertebrate model for studying cardiac development and human heart diseases due to its advantageous embryology and genetics 1,2. About 100-200 embryos are readily available every week from a single pair of adult fish. The transparent embryos that develop ex utero make them ideal for assessing cardiac defects 3. The expression of any gene can be manipulated via morpholino technology or RNA injection 4. Moreover, forward genetic screens have already generated a list of mutants that affect different perspectives of cardiogenesis 5. 
Whole mount immunostaining is an important technique in this animal model to reveal the expression pattern of the targeted protein to a particular tissue 6. However, high resolution images that can reveal cellular or subcellular structures have been difficult, mainly due to the physical location of the heart and the poor penetration of the antibodies. 
 Here, we present a method to address these bottlenecks by dissecting heart first and then conducting the staining process on the surface of a microscope slide. To prevent the loss of small heart samples and to facilitate solution handling, we restricted the heart samples within a circle on the surface of the microscope slides drawn by an immEdge pen. After the staining, the fluorescence signals can be directly observed by a compound microscope. 
Our new method significantly improves the penetration for antibodies, since a heart from an embryonic fish only consists of few cell layers. High quality images from intact hearts can be obtained within a much reduced procession time for zebrafish embryos aged from day 2 to day 6. Our method can be potentially extended to stain other organs dissected from either zebrafish or other small animals.

A rapid way to conduct immunostaining of zebrafish embryonic heart is described. Compared to the whole mount immunostaining approach, this method dramatically increases the penetration of the antibodies, which allows obtaining high resolution images that reveal cellular/subcellular structures in the heart within a much reduced processing time.

Inmunotinción de Disección del corazón embrionario de pez cebra

Zebrafish embryo becomes a popular in vivo vertebrate model for studying cardiac development and human heart diseases due to its advantageous embryology ...

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

The pancreas controls vital functions of our body, including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar levels1. Although in the past decade many studies have contributed to a solid foundation for understanding pancreatic organogenesis, important gaps persist in our knowledge of early pancreas formation2. A complete understanding of these early events will provide insight into the development of this organ, but also into incurable diseases that target the pancreas, such as diabetes or pancreatic cancer. Finally, this information will generate a blueprint for developing cell-replacement therapies in the context of diabetes.
 During embryogenesis, the pancreas originates from distinct embryonic outgrowths of the dorsal and ventral foregut endoderm at embryonic day (E) 9.5 in the mouse embryo3,4. Both outgrowths evaginate into the surrounding mesenchyme as solid epithelial buds, which undergo proliferation, branching and differentiation to generate a fully mature organ2,5,6. Recent evidences have suggested that growth and differentiation of pancreatic cell lineages, including the insulin-producing &beta;-cells, depends on proper tissue-architecture, epithelial remodeling and cell positioning within the branching pancreatic epithelium7,8. However, how branching morphogenesis occurs and is coordinated with proliferation and differentiation in the pancreas is largely unknown. This is in part due to the fact that current knowledge about these developmental processes has relied almost exclusively on analysis of fixed specimens, while morphogenetic events are highly dynamic.
 Here, we report a method for dissecting and culturing mouse embryonic pancreatic buds ex vivo on glass bottom dishes, which allow direct visualization of the developing pancreas (Figure 1). This culture system is ideally devised for confocal laser scanning microscopy and, in particular, live-cell imaging. Pancreatic explants can be prepared not only from wild-type mouse embryos, but also from genetically engineered mouse strains (e.g. transgenic or knockout), allowing real-time studies of mutant phenotypes. Moreover, this ex vivo culture system is valuable to study the effects of chemical compounds on pancreatic development, enabling to obtain quantitative data about proliferation and growth, elongation, branching, tubulogenesis and differentiation. In conclusion, the development of an ex vivo pancreatic explant culture method combined with high-resolution imaging provides a strong platform for observing morphogenetic and differentiation events as they occur within the developing mouse embryo.

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

Here, we describe a method for isolation, culture and manipulation of mouse embryonic pancreas. This represents an excellent ex vivo system for studying various aspects of pancreatic development, including morphogenesis, differentiation and growth. Pancreatic bud explants can be cultured for several days and used in a range of different applications, including whole-mount immunofluorescence and live imaging.

Un sistema para la<em&gt; Ex vivo</em&gt; Cultivo de páncreas embrionario

The pancreas controls vital functions of our body,  including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar  levels1. Although in the ...

Laser-inflicted Injury of Zebrafish Embryonic Skeletal Muscle

Various experimental approaches have been used in mouse to induce muscle injury with the aim to study muscle regeneration, including myotoxin injections (bupivacaine, cardiotoxin or notexin), muscle transplantations (denervation-devascularization induced regeneration), intensive exercise, but also murine muscular dystrophy models such as the mdx mouse (for a review of these approaches see 1). In zebrafish, genetic approaches include mutants that exhibit muscular dystrophy phenotypes (such as runzel2 or sapje3) and antisense oligonucleotide morpholinos that block the expression of dystrophy-associated genes4. Besides, chemical approaches are also possible, e.g. with Galanthamine, a chemical compound inhibiting acetylcholinesterase, thereby resulting in hypercontraction, which eventually leads to muscular dystrophy5. However, genetic and pharmacological approaches generally affect all muscles within an individual, whereas the extent of physically inflicted injuries are more easily controlled spatially and temporally1. Localized physical injury allows the assessment of contralateral muscle as an internal control. Indeed, we recently used laser-mediated cell ablation to study skeletal muscle regeneration in the zebrafish embryo6, while another group recently reported the use of a two-photon laser (822 nm) to damage very locally the plasma membrane of individual embryonic zebrafish muscle cells7.
Here, we report a method for using the micropoint laser (Andor Technology) for skeletal muscle cell injury in the zebrafish embryo. The micropoint laser is a high energy laser which is suitable for targeted cell ablation at a wavelength of 435 nm. The laser is connected to a microscope (in our setup, an optical microscope from Zeiss) in such a way that the microscope can be used at the same time for focusing the laser light onto the sample and for visualizing the effects of the wounding (brightfield or fluorescence). The parameters for controlling laser pulses include wavelength, intensity, and number of pulses.
Due to its transparency and external embryonic development, the zebrafish embryo is highly amenable for both laser-induced injury and for studying the subsequent recovery. Between 1 and 2 days post-fertilization, somitic skeletal muscle cells progressively undergo maturation from anterior to posterior due to the progression of somitogenesis from the trunk to the tail8, 9. At these stages, embryos spontaneously twitch and initiate swimming. The zebrafish has recently been recognized as an important vertebrate model organism for the study of tissue regeneration, as many types of tissues (cardiac, neuronal, vascular etc.) can be regenerated after injury in the adult zebrafish10, 11.

The method presented here comprises the precise injury of live zebrafish embryos with high-energy laser pulses and the subsequent analysis of these injuries and their recovery with time. We also show how genetically labeled single or groups of skeletal muscle cells can be tracked during and after laser light induced damage.

Laser-infligido lesiones de músculo esquelético embrionario de pez cebra

Various experimental approaches have been used in mouse to induce muscle injury with the aim to study muscle regeneration, including myotoxin injections ...

Analysis of Embryonic and Larval Zebrafish Skeletal Myofibers from Dissociated Preparations

The zebrafish has proven to be a valuable model system for exploring skeletal muscle function and for studying human muscle diseases. Despite the many advantages offered by in vivo analysis of skeletal muscle in the zebrafish, visualizing the complex and finely structured protein milieu responsible for muscle function, especially in whole embryos, can be problematic. This hindrance stems from the small size of zebrafish skeletal muscle (60 &mu;m) and the even smaller size of the sarcomere. Here we describe and demonstrate a simple and rapid method for isolating skeletal myofibers from zebrafish embryos and larvae. We also include protocols that illustrate post preparation techniques useful for analyzing muscle structure and function. Specifically, we detail the subsequent immunocytochemical localization of skeletal muscle proteins and the qualitative analysis of stimulated calcium release via live cell calcium imaging. Overall, this video article provides a straight-forward and efficient method for the isolation and characterization of zebrafish skeletal myofibers, a technique which provides a conduit for myriad subsequent studies of muscle structure and function.

Zebrafish are an emerging system for modeling human disorders of the skeletal muscle. We describe a fast and efficient method to isolate skeletal muscle myofibers from embryonic and larval zebrafish. This method yields a high-density myofiber preparation suitable for study of single skeletal muscle fiber morphology, protein subcellular localization, and muscle physiology.

Análisis de embriones y larvas de pez cebra esqueléticas miofibras de Preparativos disociadas

The zebrafish has  proven to be a valuable model system for exploring skeletal muscle function and  for studying human muscle diseases. Despite  the many ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, we use the salivary glands of live mice since they provide several advantages. First, they can be easily exposed to enable access to the optics, and stabilized to facilitate the reduction of the motion artifacts due to heartbeat and respiration. This significantly facilitates imaging and tracking small subcellular structures. Second, most of the cell populations of the salivary glands are accessible from the surface of the organ. This permits the use of confocal microscopy that has a higher spatial resolution than other techniques that have been used for in vivo imaging, such as two-photon microscopy. Finally, salivary glands can be easily manipulated pharmacologically and genetically, thus providing a robust system to investigate biological processes at a molecular level.
In this study we focus on a protocol designed to follow the kinetics of the exocytosis of secretory granules in acinar cells and the dynamics of the apical plasma membrane where the secretory granules fuse upon stimulation of the beta-adrenergic receptors. Specifically, we used a transgenic mouse that co-expresses cytosolic GFP and a membrane-targeted peptide fused with the fluorescent protein tandem-Tomato. However, the procedures that we used to stabilize and image the salivary glands can be extended to other mouse models and coupled to other approaches to label in vivo cellular components, enabling the visualization of various subcellular structures, such as endosomes, lysosomes, mitochondria, and the actin cytoskeleton.

Intravital microscopy is a powerful tool that enables imaging various biological processes in live animals. In this article, we present a detailed method for imaging the dynamics of subcellular structures, such as the secretory granules, in the salivary glands of live mice.

Microscopia intravital para formar imágenes de estructuras subcelulares en ratones vivos que expresan proteínas fluorescentes

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Simultaneous Multicolor Imaging of Biological Structures with Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy

Localization-based super resolution microscopy can be applied to obtain a spatial map (image) of the distribution of individual fluorescently labeled single molecules within a sample with a spatial resolution of tens of nanometers. Using either photoactivatable (PAFP) or&#160;photoswitchable (PSFP) fluorescent proteins fused to proteins of interest, or organic dyes conjugated to antibodies or other molecules of interest, fluorescence photoactivation localization microscopy (FPALM) can simultaneously image multiple species of molecules within single cells. By using the following approach, populations of large numbers (thousands to hundreds of thousands) of individual molecules are imaged in single cells and localized with a precision of ~10-30 nm. Data obtained can be applied to understanding the nanoscale spatial distributions of multiple protein types within a cell. One primary advantage of this technique is the dramatic increase in spatial resolution: while diffraction limits resolution to ~200-250 nm in conventional light microscopy, FPALM can image length scales more than an order of magnitude smaller. As many biological hypotheses concern the spatial relationships among different biomolecules, the improved resolution of FPALM can provide insight into questions of cellular organization which have previously been inaccessible to conventional fluorescence microscopy. In addition to detailing the methods for sample preparation and data acquisition, we here describe the optical setup for FPALM. One additional consideration for researchers wishing to do super-resolution microscopy is cost: in-house setups are significantly cheaper than most commercially available imaging machines. Limitations of this technique include the need for optimizing the labeling of molecules of interest within cell samples, and the need for post-processing software to visualize results. We here describe the use of PAFP and PSFP expression to image two protein species in fixed cells. Extension of the technique to living cells is also described.

We demonstrate the use of fluorescence photo activation localization microscopy (FPALM) to simultaneously image multiple types of fluorescently labeled molecules&#160;within cells. The techniques described yield the localization of thousands to hundreds of thousands of individual fluorescent labeled proteins, with a precision of tens of nanometers&#160;within single cells.

Localization-based super resolution microscopy can be applied to obtain a spatial map (image) of the distribution of individual fluorescently labeled ...

Live Cell Imaging and 3D Analysis of Angiotensin Receptor Type 1a Trafficking in Transfected Human Embryonic Kidney Cells Using Confocal Microscopy

Live-cell imaging is used to simultaneously capture time-lapse images of angiotensin type 1a receptors (AT1aR) and intracellular compartments in transfected human embryonic kidney-293 (HEK) cells following stimulation with angiotensin II (Ang II). HEK cells are transiently transfected with plasmid DNA containing AT1aR tagged with enhanced green fluorescent protein (EGFP). Lysosomes are identified with a red fluorescent dye. Live-cell images are captured on a laser scanning confocal microscope after Ang II stimulation and analyzed by software in three dimensions (3D, voxels) over time. Live-cell imaging enables investigations into receptor trafficking and avoids confounds associated with fixation, and in particular, the loss or artefactual displacement of EGFP-tagged membrane receptors. Thus, as individual cells are tracked through time, the subcellular localization of receptors can be imaged and measured. Images must be acquired sufficiently rapidly to capture rapid vesicle movement. Yet, at faster imaging speeds, the number of photons collected is reduced. Compromises must also be made in the selection of imaging parameters like voxel size in order to gain imaging speed. Significant applications of live-cell imaging are to study protein trafficking, migration, proliferation, cell cycle, apoptosis, autophagy and protein-protein interaction and dynamics, to name but a few.

Here we present a protocol to image cells expressing green fluorescent protein-tagged angiotensin type 1a receptors during endocytosis initiated by angiotensin II treatment. This technique includes labeling lysosomes with a second fluorescent marker, and then utilizing software to analyze the co-localization of receptor and lysosome in three dimensions over time.

Imágenes de células vivas y análisis 3D del receptor de angiotensina Tipo 1a Tráfico transfectadas en células de riñón embrionarias humanas Utilizando microscopía confocal