Los autores desean dar las gracias al Sr. Richard Zink y Todd Wiernicki para la formación metodológica y orientación ensayo. También agradecemos a John Paul Spence para lectura cuidadosa y sugerencias editoriales. Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de Salud MH 060397, Brain and Behavior Research Foundation, y Eli Lilly and Company a través del Programa de Premios de Investigación Lilly (LRAP).

1. Expansión y Criopreservación de Células de Ensayo Ready <ol><li> Cultivo de CHO-K1-DRD 2L células (CHO-D 2L) en una célula plato de 15 cm 2 cultura en medio F12 de Ham suplementado con 1,0 mM de L-glutamina, 800 mg / l de G418, 300 mg / l de higromicina, 100 U / l penicilina, 100 mg / l de estreptomicina y suero bovino fetal al 10% (FBS). </li><li> Se incuban las células a 37 ° C en un incubador humidificado con 5% de CO 2 hasta que las células son 90-95% de confluencia. Lavar las células con 10 l tampón fosfato salino (PBS), y cosechar las células mediante la adición de 3 l de tampón de disociación celular durante 5 min a 37 ° C. Resuspender las células por medio de 12 l de los medios de cultivo y contar las células mediante exclusión con azul de tripano. </li><li> Centrifugar la suspensión de células a 500 xg durante 5 min a temperatura ambiente. Aspirar el sobrenadante y resuspender el sedimento de células en 5 l de medio de congelación (10% de sulfóxido de dimetilo, 90% de FBS). Diluir la suspensión de células para conseguir la concentración celular deseada (por ejemplo, 1-20 x 10 6 células / l). </li><li> Alícuota de 1,0 l de solución de células a cada criovial. Incubar los crioviales en un recipiente de congelación de células a -80 ° C durante la noche. Transfiera los crioviales a un tanque de N2 líquido para almacenamiento a largo plazo. </li></ol> 2. Plating ensayo Células Ready (y Opción transfección inversa) <ol><li> Rápidamente descongelar un criovial congelado de las células en un 37 ° C baño de agua. Una vez que las células se descongelan, transferir las células a un tubo cónico de 15 l que contiene 9 l de Opti-MEM, y mezclar invirtiendo el tubo 3-5x. </li><li> Centrifugar las células a 500 xg durante 5 min a temperatura ambiente. Aspirar el sobrenadante y resuspender las células en 1 l de Opti-MEM. </li><li> Contar las células mediante exclusión con azul de tripano para determinar la viabilidad celular y diluir las células viables como sea necesario (por ejemplo,. 3 x 10 5 células / l de concentración) enOpti-MEM. Placa 10 l / pocillo de células en un cultivo de tejido tratado placa de 384 pocillos usando una pipeta multicanal. </li><li> Hacer diluciones en serie de AMPc en Opti-MEM para generar una curva patrón para la estimación de la producción de AMPc por las células (de acuerdo con recomendaciones de los fabricantes - véase la Sección 7). Añadir 10 l / pocillo de los patrones de AMPc a la placa Nota:. Una sola curva estándar se puede preparar en una placa separada o pocillos de blanco en una de las placas de ensayo. </li><li> Centrifugar la placa a 100 xg durante 15 segundos a temperatura ambiente, y se incuba a 37 ° C en un incubador humidificado con 5% de CO 2 durante 1 hora. </li></ol> 3. Invertir Opción transfección siRNA * Esta sección es opcional y relevante a la figura 3. <ol><li> Preparar una solución de siRNA en ddH RNasa libre 2 O (por ejemplo, 0,4 pmol / l). Añadir 5 l a pocillos individuales de la placa de 384 pocillos, y centrifugar la placa a 100 g durante 15 síC a temperatura ambiente. </li><li> Diluir Lipofectamine 2000 en Opti-MEM por un factor de 0.006 (por ejemplo, añadir 6 l de Lipofectamina 2000 a 1000 l de Opti-MEM), y mezclar pipeteando arriba y abajo. </li><li> Incubar la solución de Lipofectamine 2000/Opti-MEM durante 5 min a temperatura ambiente. Añadir 5 l de la solución Lipofectamine 2000/Opti-MEM diluido a pocillos individuales de la placa de 384 pozos que ya contiene siRNA. Centrifugar la placa a 100 xg durante 15 segundos a temperatura ambiente. </li><li> Incubar la placa durante 30 min a temperatura ambiente. </li><li> Células listos ensayo de placa como se describe anteriormente (Sección 2). Centrifugar la placa a 100 xg durante 15 segundos a temperatura ambiente. </li><li> Vuelva placa de ensayo para humidificado incubadora a 37 ° C (5% de CO 2) por 48 a 96 horas según lo determinado por génica dirigida tumbar (véase el debate). </li></ol> 4. Screening de moléculas pequeñas <ol><li> Se diluye el fármaco de interés (por ejemplo, los inhibidores de la. Molécula pequeña) en Opti-MEM a 6x las concentraciones finales deseadas. Las diluciones en serie se puede completar utilizando pipetas de mano o una estación de tratamiento de líquidos. </li><li> Añadir 2,5 l / pocillo del compuesto de ensayo o tampón que contiene vehículo (por ejemplo, DMSO) para el lado de los pocillos utilizando una pipeta multicanal. </li><li> Centrifugar la placa a 100 xg durante 15 segundos a temperatura ambiente (de incubación es opcional). </li></ol> 5. Tratamiento Agonist persistente <ol><li> Preparar un 600 nM (es decir. 6 veces la concentración final deseada de 100 nM) solución de quinpirol en Opti-MEM. </li><li> Añadir 2,5 l / pocillo de la solución quinpirol nM 600 para el lado de los pocillos utilizando una pipeta multicanal. </li><li> Centrifugar la placa a 100 xg durante 15 segundos a temperatura ambiente, y se incuba a 37 ° C en un incubador humidificado con 5% de CO 2 durante 2 horas. </li></ol> 6. Estimulación de la acumulación de AMPc <ol><li> Durante la incubación de 2 horas, se preparan los stimulatien solución en Opti-MEM. La solución estimulación se compone de 40 forskolina M, 2 M 3-isobutil-1-methyxanthine (IBMX), y 4 M espiperona (todas las concentraciones en el paso 6 se 4x la concentración final deseada). </li><li> Añadir 5 l / pocillo de la solución de estimulación para el lado de los pocillos utilizando una pipeta multicanal. </li><li> Centrifugar la placa a 100 xg durante 15 segundos a temperatura ambiente, y se incuba a temperatura ambiente durante 1 h. </li></ol> 7. Temple y Estimación de la acumulación de AMPc <ol><li> La producción de AMPc por las células se midió usando el kit de cAMP dinámica 2 de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, reconstituir anti-AMPc-criptato y cAMP-D2 en agua destilada. Congele alícuotas a -20 ° C para el almacenamiento a corto plazo. </li><li> Diluir una alícuota de anti-AMPc-criptato y una alícuota de AMPc-D2 por separado en el tampón de lisis de acuerdo con las instrucciones del fabricante para hacer soluciones de trabajo. </li><li> Ladd 10 l / pocillo de la solución de trabajo anti-cAMP criptato y 10 l / pocillo de la solución de trabajo cAMP-d2 a la placa de 384 pocillos utilizando una pipeta multicanal. </li><li> Centrifugar la placa a 100 xg durante 15 segundos a temperatura ambiente, y se incuba a temperatura ambiente durante 1 h. </li><li> Leer la placa en un lector de placas de fluorescencia (ajuste de escala automática de la sensibilidad), utilizando una excitación de 337 nm y medir las emisiones a 620 nm y 665 nm por las instrucciones del fabricante. </li><li> Aplicar el análisis radiométrico para evaluar la curva patrón de AMPc por las instrucciones del fabricante. Utilizando los valores resultantes, extrapolar la acumulación de cAMP estimada en los pozos de prueba utilizando el software de análisis de datos. </li></ol>

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Los autores no tienen nada que revelar.

En un esfuerzo para facilitar los estudios de sensibilización heteróloga, que ampliamente hemos modificado nuestro método anterior logrando un ágil &quot;mezcla y leer&quot; formato que es modificable a la detección y el mecanismo de examen de acción de alto rendimiento. Las principales modificaciones a nuestro protocolo se pueden resumir de la siguiente manera: 1) el uso de células crioconservadas como reactivos de ensayo &quot;-listo&quot;; 2) la miniaturización del ensayo en formato de 384 pocillos, y 3) la u...

Un adenililciclasa adaptativo (AC) de señalización de respuesta conocido como heterólogo o sensibilizantes fue descubierto en el laboratorio del premio Nobel, el Dr. Marshall Nirenberg. Dr. Nirenberg propuso que el aumento de la capacidad de respuesta de CA observado después de la activación del receptor opioide δ crónica era un mecanismo implicado en la tolerancia y dependencia de opiáceos 1. Además de la activación del receptor opioide δ crónica, esta respuesta neuroadaptativos de la señalización de AC también se produce tras la activación persistente de varios otros receptores / o acoplados a Gai 2. En particular, muchos de estos receptores se asocian con el dolor, los trastornos neuropsiquiátricos y neurológicos, e incluyen opioide μ / κ, D 2/4 de dopamina, 5HT 1A, y M 2/4 receptores muscarínicos 2. Además de los descubrimientos del Dr. Nirenberg, un gran cuerpo de evidencia existe vinculación de la sensibilización de la señalización de CA a la activación del receptor opioide crónica tanto <em&gt; in vitro e in vivo 3-7. Sensibilización de CA también se ha asociado con una variedad de enfermedades que implican los receptores de dopamina D 2-como incluyendo la esquizofrenia y la enfermedad de Parkinson (para una revisión véase la referencia 2). A pesar de la importancia potencial de sensibilización, el mecanismo exacto (s) asociado con la activación persistente Gai / o-receptor acoplado a que conduce a un aumento de la capacidad de respuesta de CA permanece en gran medida desconocido. Estos estudios proporcionan la justificación para el examen de los mecanismos para la sensibilización de la guanilato ciclasa como un objetivo importante neurobiológica. Igualmente, el relevancia fisiológico AC señalización 8 e importancia que isoformas AC individuales sostienen este respuesta adaptativa deberían reconocerse 2,9,10. En el contexto de nuestra investigación, las características generales asociados con la sensibilización heteróloga de las isoformas recombinantes de AC son paralelas a las características described para el estudio de las isoformas endógenas de CA. En concreto, la investigación anterior ha encontrado que la activación de las proteínas Gai / O y subunidades posterior liberación / reordenamiento βγ son requisitos importantes para la sensibilización del receptor inducida de todas las isoformas de CA. Además, varios estudios sugieren que la señalización de las proteínas quinasas y subunidades Gβγ están involucrados en la sensibilización 2,11-13. CCAA individuales también muestran patrones de sensibilización únicas y distintas 12. Por ejemplo, la exposición persistente de los receptores D2 de agonistas se asocia con la sensibilización de AC1 y AC8 a Ca 2 + estimulación / calmodulina 14,15, mientras que el AC3 estrechamente relacionada no está sensibilizado 2. AC2, AC4, y AC7 están estrechamente relacionados, sin embargo, sólo la actividad AC2 estimulado PKC-se sensibiliza con firmeza después de la exposición prolongada de los receptores D2 de agonistas 7,14,16,17. Además, AC5 y AC6 muestran un notable grado de hetersensibilización ologous a gas y la acumulación de AMPc estimulada por forskolina después de la activación de los receptores D 2 14,18-20, pero parecen diferir en su requisito para Gβγ subunidad-CA interacciones 21. Aunque la mayoría de los estudios de la sensibilización de CA han utilizado líneas celulares de modelo (por ejemplo, células HEK293 que expresan isoformas individuales AC), parece que estos resultados se traducen en modelos de células neuronales nativos 4,22. Más recientemente, los efectos de la selectivos inhibidores de moléculas pequeñas de isoformas de CA identificados en células HEK293 que expresan isoformas de CA también se pueden traducir in vivo para estudios de comportamiento 23. La falta de un mecanismo molecular identificado para la sensibilización heteróloga probablemente refleja la complejidad de la respuesta adaptativa, así como las propiedades reguladoras únicas de la persona de CA isoformas 12. Desentrañar esta complejidad se complica aún más por el uso de engorrosos metodología tsombrero ha limitado los investigadores académicos de emplear imparciales enfoques. Por ejemplo, nuestros estudios mecanísticos anteriores implicaban el uso de modelos celulares cultivadas continuamente usando 24 - y 48-así formato de cultivo de tejidos 15. Las células cultivadas se cultivan normalmente durante 48 horas y después se sometieron a tratamiento farmacológico agonista (2-18 hr) seguido de una serie de lavados e incubaciones de células (Figura 1). Protocolos de la acumulación de AMPc específica de CA-isoforma fueron entonces emplea seguido de la medición de la acumulación de AMPc utilizando un laborioso y consume mucho tiempo [3 H] AMPc metodología 15,24 unión. La duración de principio a fin para cada ensayo general, se requiere un total de cuatro a cinco días a partir de planchas de células para el análisis de datos (Figura 1). La aplicación de nuevas tecnologías y la automatización ha llevado a mejoras notables para los estudios de sensibilización en el entorno industrial y el centro de HTS. Por ejemplo, un grupo de trabajo con el Centro Nacional de ChemiCal Genómica informó de un dos días HTS procedimiento de ensayo para identificar inhibidores de moléculas pequeñas de receptor opioide μ sensibilización inducida en formato de 1.536 pocillos 25. El presente artículo describe nuestros esfuerzos para desarrollar un ensayo HTS para los estudios de sensibilización heteróloga utilizando tecnologías que están disponibles en la mayoría de las instituciones de investigación académica. Esta estrategia se llevó a cabo mediante la incorporación de la utilización de células criopreservadas de modelos celulares heteróloga que expresa el receptor de dopamina D 2 en combinación con isoformas de adenilato ciclasa recombinantes endógenos o individuales (CHO-D 2L o HEK-CA6 / D 2 L). Para mejorar nuestro rendimiento, hemos rediseñado nuestro ensayo de sensibilización de 48 pocillos (ca.&gt; 20 pasos más de 4-5 días) a una de cinco pasos, ensayo de un solo día en formato de 384 pocillos que era esencialmente &quot;mezclar y leer&quot;. El nuevo formato utiliza un disponible en el mercado el tiempo homogéneo de fluorescencia resuelta (HTRF) de ensayo para medir cAMP accumulation en células intactas con un lector de placa de modo multi. El ensayo es robusto y pueden someterse a cribado molécula pequeña, y se puede aplicar de manera efectiva para la detección de inhibidores de la sensibilización heteróloga. Además, se ofrecen datos que permiten la utilización de este ensayo con invertir transfección de siRNA para la selección de la biblioteca siRNA amplia dirigida o genomas con sólo una pequeña modificación del planteamiento general.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="695">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">CHO-K1-DRD2L cells</td>
			<td style="width:144px;">DiscoveRx</td>
			<td style="width:148px;">930579C2</td>
			<td style="width:199px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">Ham&#8217;s F12 media</td>
			<td style="width:144px;">VWR</td>
			<td style="width:148px;">SH30026fs</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:144px;">VWR</td>
			<td style="width:148px;">SH3007003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">G418</td>
			<td style="width:144px;">Sigma</td>
			<td style="width:148px;">A1720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">Hygromycin</td>
			<td style="width:144px;">Fisher</td>
			<td style="width:148px;">50-230-5556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">Penicillin/ streptomycin</td>
			<td style="width:144px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:148px;">15070063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">15 cm dishes</td>
			<td style="width:144px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:148px;">353025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">DMSO</td>
			<td style="width:144px;">Sigma</td>
			<td style="width:148px;">D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">Cell dissociation buffer</td>
			<td style="width:144px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:148px;">13150016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">Phosphate Buffered Saline</td>
			<td style="width:144px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:148px;">10010-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">Cryovials</td>
			<td style="width:144px;">Fisher</td>
			<td style="width:148px;">976171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">Opti-MEM</td>
			<td style="width:144px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:148px;">31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">TC treated 384 well plates</td>
			<td style="width:144px;">Perkin-Elmer</td>
			<td style="width:148px;">6007688</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="66">
			<td height="66" style="height:66px;width:205px;">HTRF cAMP Dynamic 2 kit</td>
			<td style="width:144px;">Cisbio Bioassays</td>
			<td style="width:148px;">62AM4PEB</td>
			<td style="width:199px;">http://www.htrf.com/camp-cell-based-assay</td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">Synergy 4</td>
			<td style="width:144px;">Biotek</td>
			<td style="width:148px;">H4MLFPTAD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">Prism 6</td>
			<td style="width:144px;">GraphPad Software</td>
			<td style="width:148px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">3-Isobutyl-1-methylxanthine</td>
			<td style="width:144px;">Sigma</td>
			<td style="width:148px;">I5879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">(&#177;)Quinpirole</td>
			<td style="width:144px;">Sigma</td>
			<td style="width:148px;">Q111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">Spiperone</td>
			<td style="width:144px;">Sigma</td>
			<td style="width:148px;">S7395</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">Clozapine</td>
			<td style="width:144px;">Sigma</td>
			<td style="width:148px;">C6305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">Haloperidol</td>
			<td style="width:144px;">Sigma</td>
			<td style="width:148px;">H1512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">S-(-)Sulpiride</td>
			<td style="width:144px;">Sigma</td>
			<td style="width:148px;">S112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="55">
			<td height="55" style="height:55px;width:205px;">Lipofectamine2000 transfection reagent</td>
			<td style="width:144px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:148px;">11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">Trypan blue</td>
			<td style="width:144px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:148px;">T10282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">Water, DNase, RNase-free</td>
			<td style="width:144px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:148px;">821739</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">Gas siRNA</td>
			<td style="width:144px;">Dharmacon</td>
			<td style="width:148px;">custom siRNA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">Non-targeting siRNA control</td>
			<td style="width:144px;">Dharmacon</td>
			<td style="width:148px;">D-001206-14-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">siGlo Red</td>
			<td style="width:144px;">Dharmacon</td>
			<td style="width:148px;">D-001630-02</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

drug-induced sensitization of adenylyl cyclase: assay streamlining and miniaturization for small molecule and sirna screening applications

Sensibilización de la adenilato ciclasa de señalización (CA) ha sido implicado en una variedad de trastornos neuropsiquiátricos y neurológicos, por ejemplo el abuso de sustancias y la enfermedad de Parkinson. La activación aguda de / receptores unidos a O Gai inhibe la actividad de CA, mientras que la activación persistente de estos receptores da como resultado la sensibilización heteróloga de CA y aumento de los niveles de AMPc intracelular. Estudios anteriores han demostrado que esta mejora de la capacidad de respuesta de CA se observa tanto in vitro como in vivo después de la activación crónica de varios tipos de receptores / O-ligados Gai incluyendo D 2 de la dopamina y los receptores opioides μ. Aunque la sensibilización heteróloga de AC se informó por primera vez hace cuatro décadas, el mecanismo (s) que subyacen a este fenómeno siguen siendo ampliamente desconocidas. La falta de datos mecanicistas presumiblemente refleja la complejidad implicada con esta respuesta adaptativa, lo que sugiere que los enfoques no sesgada podrían ayudar a identificarción de las vías moleculares implicadas en la sensibilización heteróloga de CA. Estudios previos han implicado a la quinasa y la señalización Gbγ como componentes que regulan la sensibilización heteróloga de AC superpuestos. Identificar objetivos superpuestos únicos y adicionales asociados con la sensibilización de la CA, se requiere el desarrollo y validación de un ensayo de sensibilización cAMP escalable para un mayor rendimiento. Los enfoques anteriores para estudiar la sensibilización son generalmente engorroso que implica el mantenimiento continuo de cultivo de células, así como una metodología compleja para la medición de la acumulación de AMPc que implica múltiples pasos de lavado. Por lo tanto, el desarrollo de un ensayo basado en células robusta que se puede utilizar para la selección de alto rendimiento (HTS) en un formato de 384 pocillos facilitaría los estudios futuros. El uso de dos modelos celulares receptor D2 de la dopamina (por ejemplo. CHO-D 2L y HEK-AC6 / D 2L), hemos convertido nuestro ensayo de sensibilización de 48 pocillos (&gt; 20 pasos 4-5 días) para un período de cinco step, ensayo de un solo día en formato de 384 pocillos. Este nuevo formato es susceptible de cribado molécula pequeña, y demostramos que este diseño de ensayo también se puede utilizar fácilmente para la transfección inversa de ARNip en previsión de selección de la biblioteca siRNA dirigidos.

Parte I. Desarrollo de un ensayo de sensibilización bien heterólogo 384 para la identificación de inhibidores de moléculas pequeñas usando un modelo de células disponibles comercialmente. Para el estudio de la sensibilización heteróloga en un modelo celular, hicimos una serie de mejoras que nos permitieron agilizar el ensayo en un formato &quot;mezclar y leer&quot;. Varias de las modificaciones principales se destacan a continuación y se describen con más detalle e...

Watch this Scientific Journal Video about Drug-induced Sensitization of Adenylyl Cyclase: Assay Streamlining and Miniaturization for Small Molecule and siRNA Screening Applications at JoVE.com

Drug-induced Sensitization of Adenylyl Cyclase: Assay Streamlining and Miniaturization for Small Molecule and siRNA Screening Applications

La activación persistente de inhibidores G acoplados a proteínas receptores da como resultado la sensibilización de la señalización de la adenilato ciclasa. Para identificar las vías moleculares esenciales, los enfoques no sesgada son necesarios, sin embargo, esta estrategia requiere el desarrollo de un ensayo de sensibilización cAMP basada en células escalable. Aquí se describe un ensayo para la sensibilización y la detección de moléculas pequeñas siRNA.

Inducido por fármacos Sensibilización de adenilciclasa: Racionalización Ensayo y miniaturización de moléculas pequeñas y siRNA aplicaciones de cribado

Sensitization of adenylyl cyclase (AC) signaling has been implicated in a variety of neuropsychiatric and neurologic disorders including substance abuse ...

drug-induced-sensitization-adenylyl-cyclase-assay-streamlining

Research

JoVE Journal

Bioengineering

12.6K vistas.  Purdue University.  La activación persistente de inhibidores G acoplados a proteínas receptores da como resultado la sensibilización de la señalización de la adenilato ciclasa. Para identificar las vías moleculares esenciales, los enfoques no sesgada son necesarios, sin embargo, esta estrategia requiere el desarrollo de un ensayo de sensibilización cAMP basada en células escalable. Aquí se describe un ensayo para la sensibilización y la detección de moléculas pequeñas siRNA. 

Video: Drug-induced Sensitization of Adenylyl Cyclase: Assay Streamlining and Miniaturization for Small Molecule and siRNA Screening Applications

Cell-based Calcium Assay for Medium to High Throughput Screening of TRP Channel Functions using FlexStation 3

The Molecular Devices' FlexStation 3 is a benchtop multi-mode microplate reader capable of automated fluorescence measurement in multi-well plates. It is ideal for medium- to high-throughput screens in academic settings. It has an integrated fluid transfer module equipped with a multi-channel pipetter and the machine reads one column at a time to monitor fluorescence changes of a variety of fluorescent reagents. For example, FlexStation 3 has been used to study the function of Ca2+-permeable ion channels and G-protein coupled receptors by measuring the changes of intracellular free Ca2+ levels. Transient receptor potential (TRP) channels are a large family of nonselective cation channels that play important roles in many physiological and pathophysiological functions. Most of the TRP channels are calcium permeable and induce calcium influx upon activation. In this video, we demonstrate the application of FlexStation 3 to study the pharmacological profile of the TRPA1 channel, a molecular sensor for numerous noxious stimuli. HEK293 cells transiently or stably expressing human TRPA1 channels, grown in 96-well plates, are loaded with a Ca2+-sensitive fluorescent dye, Fluo-4, and real-time fluorescence changes in these cells are measured before and during the application of a TRPA1 agonist using the FLEX mode of the FlexStation 3. The effect of a putative TRPA1 antagonist was also examined. Data are transferred from the SoftMax Pro software to construct concentration-response relationships of TRPA1 activators and inhibitors.

This video provides a detailed protocol for studying the pharmacological profile of human TRPA1 channels using FlexStation 3. The protocol covers details of cell preparation, dye loading and operation of the microplate reader, FlexStation 3.

Basados ​​en células de calcio de ensayo para el medio a cribado de alto rendimiento de las funciones del PRT canal utilizando FlexStation 3

The Molecular Devices' FlexStation 3 is a benchtop multi-mode microplate reader capable of automated fluorescence measurement in multi-well plates.  It is ...

Investigación

Bioingeniería

Wideband Optical Detector of Ultrasound for Medical Imaging Applications

Optical sensors of ultrasound are a promising alternative to piezoelectric techniques, as has been recently demonstrated in the field of optoacoustic imaging. In medical applications, one of the major limitations of optical sensing technology is its susceptibility to environmental conditions, e.g. changes in pressure and temperature, which may saturate the detection. Additionally, the clinical environment often imposes stringent limits on the size and robustness of the sensor. In this work, the combination of pulse interferometry and fiber-based optical sensing is demonstrated for ultrasound detection. Pulse interferometry enables robust performance of the readout system in the presence of rapid variations in the environmental conditions, whereas the use of all-fiber technology leads to a mechanically flexible sensing element compatible with highly demanding medical applications such as intravascular imaging. In order to achieve a short sensor length, a pi-phase-shifted fiber Bragg grating is used, which acts as a resonator trapping light over an effective length of 350 &#181;m. To enable high bandwidth, the sensor is used for sideway detection of ultrasound, which is highly beneficial in circumferential imaging geometries such as intravascular imaging. An optoacoustic imaging setup is used to determine the response of the sensor for acoustic point sources at different positions.

Optical detection of ultrasound is impractical in many imaging scenarios because it often requires stable environmental conditions. We demonstrate an optical technique for ultrasound sensing in volatile environments with miniaturization and sensitivity levels appropriate for optoacoustic imaging in restrictive scenarios, e.g. intravascular applications.

Banda ancha Detector óptico de ultrasonido para aplicaciones de imágenes médicas

Optical sensors of ultrasound are a promising alternative to piezoelectric techniques, as has been recently demonstrated in the field of optoacoustic ...

Porous Silicon Microparticles for Delivery of siRNA Therapeutics

Small interfering RNA (siRNA) can be used to suppress gene expression, thereby providing a new avenue for the treatment of various diseases. However, the successful implementation of siRNA therapy requires the use of delivery platforms that can overcome the major challenges of siRNA delivery, such as enzymatic degradation, low intracellular uptake and lysosomal entrapment. Here, a protocol for the preparation and use of a biocompatible and effective siRNA delivery system is presented. This platform consists of polyethylenimine (PEI) and arginine (Arg)-grafted porous silicon microparticles, which can be loaded with siRNA by performing a simple mixing step. The silicon particles are gradually degraded over time, thereby triggering the formation of Arg-PEI/siRNA nanoparticles. This delivery vehicle provides a means for protecting and internalizing siRNA, without causing cytotoxicity. The major steps of polycation functionalization, particle characterization, and siRNA loading are outlined in detail. In addition, the procedures for determining particle uptake, cytotoxicity, and transfection efficacy are also described.

Delivery remains the main challenge for the therapeutic implementation of small interfering RNA (siRNA). This protocol involves the use of a multifunctional and biocompatible siRNA delivery platform, consisting of arginine and polyethylenimine grafted porous silicon microparticles.

Silicio Poroso micropartículas para la entrega de siRNA Terapéutica

Small interfering RNA (siRNA) can be used to suppress gene expression, thereby providing a new avenue for the treatment of various diseases. However, the ...

A Rapid and Quantitative Fluorimetric Method for Protein-Targeting Small Molecule Drug Screening

We demonstrate a new drug screening method for determining the binding affinity of small drug molecules to a target protein by forming fluorescent gold nanoclusters (Au NCs) within the drug-loaded protein, based on the differential fluorescence signal emitted by the Au NCs. Albumin proteins such as human serum albumin (HSA) and bovine serum albumin (BSA) are selected as the model proteins. Four small molecular drugs (e.g., ibuprofen, warfarin, phenytoin, and sulfanilamide) of different binding affinities to the albumin proteins are tested. It was found that the formation rate of fluorescent Au NCs inside the drug loaded albumin protein under denaturing conditions (i.e., 60 &#176;C or in the presence of urea) is slower than that formed in the pristine protein (without drugs). Moreover, the fluorescent intensity of the as-formed NCs is found to be inversely correlated to the binding affinities of these drugs to the albumin proteins. Particularly, the higher the drug-protein binding affinity, the slower the rate of Au NCs formation, and thus a lower fluorescence intensity of the resultant Au NCs is observed. The fluorescence intensity of the resultant Au NCs therefore provides a simple measure of the relative binding strength of different drugs tested. This method is also extendable to measure the specific drug-protein binding constant (KD) by simply varying the drug content preloaded in the protein at a fixed protein concentration. The measured results match well with the values obtained using other prestige but more complicated methods.

A protocol for small molecular drug screening based on in-situ synthesis of ultrasmall fluorescent gold nanoclusters (Au NCs) using drug-loaded protein as template is presented. This method is simple to determine the binding affinity of drugs to a target protein by a visible fluorescent signal emitted from the protein-templated Au NCs.

Una rápida y cuantitativa método fluorimétrico para la proteína-Targeting Pequeña Molécula De Drogas

We demonstrate a new drug screening method for determining the binding affinity of small drug molecules to a target protein by forming fluorescent gold ...

Fabrication of Mechanically Tunable and Bioactive Metal Scaffolds for Biomedical Applications

Biometal systems have been widely used for biomedical applications, in particular, as load-bearing materials. However, major challenges are high stiffness and low bioactivity of metals. In this study, we have developed a new method towards fabricating a new type of bioactive and mechanically reliable porous metal scaffolds-densified porous Ti scaffolds. The method consists of two fabrication processes, 1) the fabrication of porous Ti scaffolds by dynamic freeze casting, and 2) coating and densification of the porous scaffolds. The dynamic freeze casting method to fabricate porous Ti scaffolds allowed the densification of porous scaffolds by minimizing the chemical contamination and structural defects. The densification process is distinctive for three reasons. First, the densification process is simple, because it requires a control of only one parameter (degree of densification). Second, it is effective, as it achieves mechanical enhancement and sustainable release of biomolecules from porous scaffolds. Third, it has broad applications, as it is also applicable to the fabrication of functionally graded porous scaffolds by spatially varied strain during densification.

Bioactive and mechanically reliable metal scaffolds have been fabricated through a method which consists of two processes, dynamic freeze casting for the fabrication of porous Ti, and coating and densification of the Ti scaffolds. The densification process is simple, effective and applicable to the fabrication of functionally graded scaffolds.

Fabricación de Mecánicamente sintonizable y Bioactivos metal andamios para Aplicaciones Biomédicas

Biometal systems have been widely used for biomedical applications, in particular, as load-bearing materials. However, major challenges are high stiffness ...

Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In particular, light-mediated click reactions, such as photoinitiated thiol&#8722;ene and thiol&#8722;yne reactions, afford spatiotemporal control over material properties and allow the design of systems with a high degree of user-directed property control. Fabrication and modification of hydrogel-based biomaterials using the precision afforded by light and the versatility offered by these thiol&#8722;X photoclick chemistries are of growing interest, particularly for the culture of cells within well-defined, biomimetic microenvironments. Here, we describe methods for the photoencapsulation of cells and subsequent photopatterning of biochemical cues within hydrogel matrices using versatile and modular building blocks polymerized by a thiol&#8722;ene photoclick reaction. Specifically, an approach is presented for constructing hydrogels from allyloxycarbonyl (Alloc)-functionalized peptide crosslinks and pendant peptide moieties and thiol-functionalized poly(ethylene glycol) (PEG) that rapidly polymerize in the presence of lithium acylphosphinate photoinitiator and cytocompatible doses of long wavelength ultraviolet (UV) light. Facile techniques to visualize photopatterning and quantify the concentration of peptides added are described. Additionally, methods are established for encapsulating cells, specifically human mesenchymal stem cells, and determining their viability and activity. While the formation and initial patterning of thiol-alloc hydrogels are shown here, these techniques broadly may be applied to a number of other light and radical-initiated material systems (e.g., thiol-norbornene, thiol-acrylate) to generate patterned substrates.

We describe a sequential process for light-mediated formation and subsequent biochemical patterning of synthetic hydrogel matrices for three-dimensional cell culture applications. The construction and modification of hydrogels with cytocompatible photoclick chemistry is demonstrated. Additionally, facile techniques to quantify and observe patterns and determine cell viability within these hydrogels are presented.

Formación luz mediada y el patrón de hidrogeles para aplicaciones de cultivo celular

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In ...

Extraction of Plant-based Capsules for Microencapsulation Applications

Microcapsules derived from plant-based spores or pollen provide a robust platform for a diverse range of microencapsulation applications. Sporopollenin exine capsules (SECs) are obtained when spores or pollen are processed so as to remove the internal sporoplasmic contents. The resulting hollow microcapsules exhibit a high degree of micromeritic uniformity and retain intricate microstructural features related to the particular plant species. Herein, we demonstrate a streamlined process for the production of SECs from Lycopodium clavatum spores and for the loading of hydrophilic compounds into these SECs. The current SEC isolation procedure has been recently optimized to significantly reduce the processing requirements which are conventionally used in SEC isolation, and to ensure the production of intact microcapsules. Natural L. clavatum spores are defatted with acetone, treated with phosphoric acid, and extensively washed to remove sporoplasmic contents. After acetone defatting, a single processing step using 85% phosphoric acid has been shown to remove all sporoplasmic contents. By limiting the acid processing time to 30 hr, it is possible to isolate clean SECs and avoid SEC fracturing, which has been shown to occur with prolonged processing time. Extensive washing with water, dilute acids, dilute bases, and solvents ensures that all sporoplasmic material and chemical residues are adequately removed. The vacuum loading technique is utilized to load a model protein (Bovine Serum Albumin) as a representative hydrophilic compound. Vacuum loading provides a simple technique to load various compounds without the need for harsh solvents or undesirable chemicals which are often required in other microencapsulation protocols. Based on these isolation and loading protocols, SECs provide a promising material for use in a diverse range of microencapsulation applications, such as, therapeutics, foods, cosmetics, and personal care products.

This protocol/manuscript describes a streamlined process for the production of sporopollenin exine capsules (SECs) from Lycopodium clavatum spores and for the loading of hydrophilic compounds into these SECs.

Las cápsulas de origen vegetal extracción de microencapsulación para Aplicaciones

Microcapsules derived from plant-based spores or pollen provide a robust platform for a diverse range of microencapsulation applications. Sporopollenin ...

Applications for Open Source Microplate-Compatible Illumination Panels

Microplates are commonly used in the modern laboratory environment for a wide variety of tasks both in small-scale laboratory benchtop operations as well as large-scale high-throughput screening (HTS) campaigns. Though laboratory automation has greatly increased the utility of microplates there remain instances where automation-based instrumentation is not feasible, cost-effective or compatible with microplate formatting needs. In these cases, microplates must be manually prepared. Problematic to manual microplate manipulations is that a number of difficulties can arise pertaining to the accurate tracking of sample operations, data record keeping and quality control (QC) inspection for well artifacts or formatting errors. As microplate well densities increase (i.e., 96-well, 384-well, 1536-well) the potential for introducing errors also drastically increases.&#160; Moreover, for small bench-top laboratory operations there exists a need to improve the ease and accuracy of sample handling in a cost-effective fashion. Herein, we describe a system that acts as a semi-automated pipetting guide referred to as the Microplate Assistive Pipetting Light Emitter (M.A.P.L.E.). &#160;M.A.P.L.E. has multiple uses for supporting compound hit-picking and microplate preparation for assay development in high-throughput screening or laboratory benchtop operations, as well as QC/quality assurance (QA) diagnostic evaluation of microplate quality or visualizing well formatting errors.

Microplate Assistive Pipetting Light Emitter (M.A.P.L.E.) is a computer-driven device that systematically illuminates microtiter wells to provide guidance for the manual preparation of microplates.&#160; M.A.P.L.E. improves the accuracy of microplate preparation while automating data recordkeeping. &#160;In addition, it can assist with examining microplate quality or aid in the detection of errors.&#160; &#160;

Aplicaciones para paneles de iluminación compatibles con microplacas de código abierto

Microplates are commonly used in the modern laboratory environment for a wide variety of tasks both in small-scale laboratory benchtop operations as well ...

Screening and Identification of Small Peptides Targeting Fibroblast Growth Factor Receptor2 using a Phage Display Peptide Library

The human Fibroblast Growth Factor Receptor (FGFR) family comprises four members, namely, FGFR1, FGFR2, FGFR3, and FGFR4, that are involved in various biological activities including cell proliferation, survival, migration and differentiation. Several aberrations in the FGFR signaling pathway, owing to mutations or gene amplification events, have been identified in various types of cancers. Hence, recent research has focused on developing strategies involving therapeutic targeting of FGFRs. Current FGFR inhibitors at various stages of pre-clinical and clinical development include either small molecule inhibitors of tyrosine kinases or monoclonal antibodies, with only a few peptide- based inhibitors in the pipeline. Here, we provide a protocol using phage display technology to screen small peptides as antagonists of FGFR2. Briefly, a library of phage-displayed peptides was incubated in a plate coated with FGFR2. Subsequently, unbound phage was washed off by TBST (TBS + 0.1% [v/v] Tween-20), and bound phage was eluted with 0.2 M glycine-HCl buffer (pH 2.2). The eluted phage was further amplified and used as input for the next round of biopanning. Following three rounds of biopanning, the peptide sequences of individual phage clones were identified by DNA sequencing. Finally, the screened peptides were synthesized and analyzed for affinity and biological activity.

Herein, we present a detailed protocol for screening small peptides that bind to FGFR2 using a phage display peptide library. We further analyze the affinity of the selected peptides toward FGFR2 in vitro and its ability to suppress cell proliferation.

Detección e identificación de pequeños péptidos dirigidos al receptor de factor de crecimiento de fibroblastos2 utilizando una biblioteca de péptidos de pantalla de fago

The human Fibroblast Growth Factor Receptor (FGFR) family comprises four members, namely, FGFR1, FGFR2, FGFR3, and FGFR4, that are involved in various ...

Rapid Fabrication of Custom Microfluidic Devices for Research and Educational Applications

Microfluidic devices allow for the manipulation of fluids, particles, cells, micro-sized organs or organisms in channels ranging from the nano to submillimeter scales. A rapid increase in the use of this technology in the biological sciences has prompted a need for methods that are accessible to a wide range of research groups. Current fabrication standards, such as PDMS bonding, require expensive and time consuming lithographic and bonding techniques. A viable alternative is the use of equipment and materials that are easily affordable, require minimal expertise and allow for the rapid iteration of designs. In this work we describe a protocol for designing and producing PET-laminates (PETLs), microfluidic devices that are inexpensive, easy to fabricate, and consume significantly less time to generate than other approaches to microfluidics technology. They consist of thermally bonded film sheets, in which channels and other features are defined using a craft cutter. PETLs solve field-specific technical challenges while dramatically reducing obstacles to adoption. This approach facilitates the accessibility of microfluidics devices in both research and educational settings, providing a reliable platform for new methods of inquiry.

Here we present a protocol to design and fabricate custom microfluidic devices with minimal financial and time investment. The aim is to facilitate the adoption of microfluidic technologies in biomedical research laboratories and educational settings.