Reconocemos la financiación de los NIH (NHLBI Contrato No. HHSN268201000044C a RW, SH y SYS).

1. Preparación de GST y nanopartículas (NP) Conjugados <ol><li> Preparación GST-TCO: <ol><li> Añadir 8 l de solución de TCO-NHS (50 mM en DMSO) a 100 l de GST (1 mg / ml en PBS) y agitar la mezcla a TA durante 1 h. </li><li> Retire el exceso de reactivo utilizando una columna de desalado giro Zeba. El filtrado recuperado que contiene el conjugado de GST-TCO se almacena a 4 ° C antes de su uso. </li></ol></li><li> Preparación GST-Tz: <ol><li> Añadir 6 l de solución de Tz-NHS (25 mM en DMF) a 75 l de GST (1 mg / ml en PBS) y agitar la mezcla a TA durante 1 h. </li><li> Se diluye la mezcla de reacción con 25 l de PBS y se purifica usando una columna de desalación de centrifugado. El filtrado que contiene el conjugado de GST-Tz se almacena a 4 ° C antes de su uso. </li></ol> Nota: Los análisis de masas (MALDI-TOF) mostraron que, en promedio ~ 10 Tz o TCO moléculas se conjugaron con GST. </li><li> Preparación NP-TCO: <ol><li> Añadir 100 l de solución de TCO-NHS (50 mM en DMSO) a150 l de nanopartículas aminado (NP-NH 2, 8,7 mg Fe / ml en PBS, núcleo de hierro 3 nm ~ 8000 Fe / NP) y agitar la mezcla a temperatura ambiente durante 1 hora. </li><li> Eliminar el exceso de reactivo por filtración de gel utilizando una columna NAP-10 se eluyó con tampón PBS. Recoger la banda de color que contiene el producto NP-TCO. </li><li> Se concentra el filtrado a un volumen final de ~ 150 l utilizando un dispositivo de filtro centrífugo (100 k MWCO). </li><li> Añadir 50 l de anhídrido succínico, (0,1 M en DMSO) a la solución de NP-TCO y agitar a TA durante 1 h (anhídrido reacciona con cualquier amina restantes para formar ácidos carboxílicos terminales. Esto evita las interacciones no específicas con la superficie de dextrano). </li><li> Se purifica el producto NP-TCO utilizando una columna NAP-10 eluyendo con PBS. Almacenar la solución de NP-TCO a 4 ° C antes de su uso. </li></ol></li></ol> 2. Preparación de la superficie Todos los ensayos de resonancia de plasmón superficial se realizaron en un instrumento Biacore T100 (GE Healthcare) en25 ° C utilizando un chip sensor CM5 y PBS-P como el tampón de desplazamiento a menos que se indique lo contrario. Control de Biacore y la evaluación de software suministrado con el instrumento se emplean para la creación de experimentos y análisis de datos. Dos modos de funcionamiento, asistentes para aplicaciones y ejecución manual se utilizarán para la preparación y el seguimiento de superficie en el chip de captura-cicloadición. El modo de método de constructor se utiliza para la creación de experimentos de unión orientación inversa y para la medición de las velocidades de reacción de cicloadición. Los datos son doble referencia resta y los análisis cinéticos se realizó con un modelo de unión de Langmuir 1:1. <ol><li> Utilice la plantilla de asistente inmovilización amina y seleccione la inmovilización de células de flujo 1 (referencia) y 2 (de detección). Modificar método de amina para activar los grupos carboxílicos de la superficie por inyección de una solución 1:1 de 0,4 M de EDC: NHS 0,1 M de 480 segundos a una velocidad de flujo de 10 l / min. Establezca la inyección de etanolamina para extinguir restantes ésteres activados a 420 seg tiempo de contacto enuna velocidad de flujo de 10 l / min. </li><li> Nombre de entrada de ligando, anti-GST (18 g / ml en tampón de acetato, pH 5,0) y se puso a inyectar para un tiempo de contacto de 420 segundos a una velocidad de flujo de 10 l / min. </li><li> Coloque los viales solución necesarias en el reactivo de rack 2 asegurándose de hacer coincidir las posiciones con la lista de contenidos. Guardar e iniciar la inmovilización. Nota: Al ejecutar el Asistente para la inmovilización de esta manera da como resultado niveles de inmovilización anti-GST en el rango de 14.000 a 17.000 ~ RU. </li><li> Edite el asistente de inmovilización sólo para inyectar ligando GST solución (20 mg / ml) durante 420 segundos a 5 l / min a través de células de flujo de referencia 1. </li></ol> 3. Monitoreo on-chip de captura-cicloadición de moléculas funcionalizadas <ol><li> Monitoreo en el chip de captura-cicloadición en tiempo real (Figura 2). <ol><li> Coloque GST-TCO (20 g / ml), Tz-BnNH 2 (10 mM) y la regeneración (glicina 10 mM, pH = 2,0) en viales de solución de reactivo bastidor 2. Seleccionar el hombremétodo de ejecución manual, ajuste el caudal de 5 l / min y la ruta de flujo de flujo de células 2. </li><li> Inyectar la solución de GST-TCO para 420 sec. </li><li> Inyectar la solución de Tz-BnNH 2 de 600 seg. </li><li> Regenera la superficie con dos inyecciones de 30 seg de solución de regeneración. </li></ol></li><li> Supervisión de montaje en el chip de estructuras de componentes múltiples, en tiempo real (Figura 3): <ol><li> Coloque GST-Tz (20 g / ml), NP-TCO (100 mg Fe / ml), Tz-BnNH 2 (10 mM) y la regeneración (glicina 10 mM, pH = 2,0) en viales de solución de reactivo bastidor 2. Seleccione el instrumento método run manual, ajuste la velocidad de flujo de 5 l / min y la trayectoria del flujo de Celda de flujo 2. </li><li> Inyectar una solución de GST-Tz durante 60 segundos. </li><li> Inyectar una solución de NP-TCO durante 60 segundos. </li><li> Inyectar una solución de Tz-BnNH 2 durante 60 segundos. </li><li> Regenera la superficie con dos inyecciones de 30 seg de solución de regeneración. </li></ol></li></ol> 4. MONITOREO Densidad Inmovilización y Determinación de cicloadición Precios <ol><li> Caracterización de pequeñas velocidades de reacción de cicloadición de moléculas (Figura 4). <ol><li> Seleccione los nuevos parámetros generales de método y de entrada. En el panel de las etapas del ensayo crear un nuevo paso y el nombre de la muestra. Establecer el propósito y Conecte ajustes de la base a la Muestra. </li><li> En el panel Tipos de ciclo Crea un nuevo paso del ciclo e introducir los siguientes comandos; Capture, Muestra, Regeneración 1 y Regeneración 2. </li><li> Seleccione el comando de captura, el nombre ligando entrada (GST-TCO, 20 mg / ml), el tiempo de contacto 120 seg a 5 l / min y la trayectoria del flujo se establece en: Segundo. Seleccione el comando de muestra; entrada 180 tiempo de contacto seg, 60 seg tiempo de disociación, el caudal de 30 l / min y la trayectoria del flujo se establece en: Ambos. Seleccione el comando de regeneración 1, el nombre de la solución de regeneración de entrada (10 mM glicina-HCl pH 2,0), tiempo de contacto de 30 segundos a 30 l / min y la trayectoria del flujo se establece en: Segundo. Repita lo mismo para la regeneración de comandos 2. &lt;/ Li&gt; <li> Seleccione Configuración Ejecutar y trayectoria del flujo se establece en: 2-1. Seleccionar la siguiente lista y llenar la muestra con una solución de analito (Tz-BnNH 2) y serie de concentraciones (0,3-10 M, dilución 1:2). Seleccione junto al panel de rack de posición. Lugar de soluciones en viales de reactivo bastidor 2 y la serie de dilución en placa de 96 pocillos asegurándose de hacer coincidir las posiciones con la lista de contenidos. Guardar plantilla método y comenzar ensayo de unión. Los datos de unión y análisis cinético se muestran en la Figura 4. </li></ol></li><li> Caracterización de las velocidades de reacción de cicloadición NP (Figura 4). <ol><li> Abra la plantilla de método salvado de arriba y cambiar los siguientes parámetros. Seleccione el panel Captura, cambio de nombre ligando a GST-Tz, 20 mg / ml. Seleccione el panel de la muestra, el cambio de tiempo de contacto de 120 segundos de tiempo de contacto y el tiempo de disociación a 120 seg. </li><li> Seleccione la lista de muestra; cambiar analito serie de concentraciones (7-224 nM, dilución 1:2) NP-TCO y. Viales Place de soluciones en el rack de reactivos2 y la serie de dilución en placa de 96 pocillos asegurándose de hacer coincidir las posiciones con la lista de contenidos. Guardar plantilla método y comenzar ensayo de unión. Los datos de unión y análisis cinético se muestran en la Figura 4. </li></ol></li></ol> 5. La medición de la unión de FKBP12 a AP1497 inmovilizado Los estudios de unión-orientación inversa emplean FKBP12 como el analito y AP1497 compuesto como ligando inmovilizado (Figura 5). El método general para este ensayo se configura de la siguiente manera con la función método constructor: <ol><li> Seleccione los nuevos parámetros generales de método y de entrada. En el panel de las etapas del ensayo crear y pasos nombre de Captura, muestra y la regeneración. Seleccione Propósito correspondiente y Conecte ajustes de la base. </li><li> Seleccione el panel Tipos de ciclo y de crear 3 etapas del ciclo: Captura, muestra y la regeneración. </li><li> Introduzca el comando de captura en dos ocasiones en la etapa del ciclo de captura. Seleccione la captura de 1 panel y seleccione la solución de captura como variablE, establecer el tiempo de contacto a 300 segundos a una velocidad de flujo de 5 l / min y trayectoria de flujo se establece en: Segundo. Seleccione el panel de captura 2 y seleccione la solución de captura como variables, establecer el tiempo de contacto de 250 segundos a un caudal de 5 l / min y la trayectoria del flujo se establece en: Segundo. </li><li> Introduzca el comando de muestra bajo el paso del ciclo de la muestra. Seleccione el panel de muestra, conjunto de tiempo de contacto de 60 segundos, tiempo de disociación de 200 segundos a un caudal de 30 l / min y la trayectoria del flujo se establece en: Ambos. </li><li> Introduzca el comando Regeneración dos veces bajo el paso del ciclo de regeneración. Seleccione el panel de regeneración 1, el nombre de la solución de regeneración de entrada (10 mM glicina-HCl pH 2,0), tiempo de contacto de 30 segundos a 30 l / min y la trayectoria del flujo se establece en: Segundo. Repita lo mismo para el panel de la regeneración 2. </li><li> Seleccione Configuración Ejecutar y trayectoria del flujo se establece en: 2-1. Seleccione próximos y para entrar los nombres de soluciones de captura, nombre de la muestra (FKBP12), serie de concentraciones (0,020 a 5 mg / ml, dilución 1:2) (GST-TCO y AP1497-Tz) y MW (13.000). Viales Place de soluciones en reAgent bastidor 2 y la serie de dilución en placa de 96 pocillos asegurándose de hacer coincidir las posiciones con la lista de contenidos. Guardar plantilla método y comenzar ensayo de unión. Los datos del análisis cinético se muestran en la Figura 5. </li></ol> 6. La medición de la unión de FKBP12 a AP1497 Adjunto a Inmovilizados NPs El método general para la inmovilización de nanopartículas, pequeña derivación molécula y ensayo de unión de FKBP12 es puesta en marcha de la siguiente manera con la función método constructor: <ol><li> Abra la plantilla de método salvado de arriba y modificar. Inserte un comando adicional Capture en el paso del ciclo de captura. Seleccione la captura el 1 panel; desmarque solución de captura como variable y nombre de la solución de captura de 1 (GST-Tz). Conjunto de tiempo de contacto a 60 segundos a una velocidad de flujo de 5 l / min y trayectoria de flujo ajustado en la segunda. Seleccione el panel Captura 2; desmarque solución de captura como solución de captura y nombre de variable 2 (NP-TCO). Tiempo de contacto establecido en 90 segundos a un caudal de 5 l / min ytrayectoria de flujo se establece en segundos. Seleccione la captura de 3 paneles, anule la selección de la solución de captura como solución de captura y nombre de variable 3 (AP1497-Tz). Tiempo de contacto Set de 180 segundos a un caudal de 5 l / min y la vía de flujo ajustado en segundo lugar. </li><li> Seleccione Configuración Ejecutar y trayectoria del flujo se establece en: 2-1. Seleccionar el siguiente dos veces. Lugar de soluciones en viales de reactivo bastidor 2 y la serie de dilución en placa de 96 pocillos asegurándose de hacer coincidir las posiciones con la lista de contenidos. Guardar plantilla método y comenzar ensayo de unión. Los datos del análisis cinético se muestran en la Figura 5. </li></ol>

<ol>
	<li>Devaraj, N. K., Upadhyay, R., Haun, J. B., Hilderbrand, S. A., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+and+sensitive+pretargeted+labeling+of+cancer+cells+through+a+tetrazine/trans-cyclooctene+cycloaddition.">Fast and sensitive pretargeted labeling of cancer cells through a tetrazine/trans-cyclooctene cycloaddition.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 48, 7013-7016 (2009).</li><li>Seitchik, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+tetrazine+amino+acid+directs+rapid+site-specific+in+vivo+bioorthogonal+ligation+with+trans-cyclooctenes.">Genetically encoded tetrazine amino acid directs rapid site-specific in vivo bioorthogonal ligation with trans-cyclooctenes.</a> J Am Chem Soc. 134, 2898-2901 (2012).</li><li>Haun, J. B., Devaraj, N. K., Marinelli, B. S., Lee, H., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+intracellular+biomarkers+and+mediators+of+cell+activation+using+nanosensors+and+bioorthogonal+chemistry.">Probing intracellular biomarkers and mediators of cell activation using nanosensors and bioorthogonal chemistry.</a> ACS Nano. 5, 3204-3213 (2011).</li><li>Budin, G., Yang, K. S., Reiner, T., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioorthogonal+probes+for+polo-like+kinase+1+imaging+and+quantification.">Bioorthogonal probes for polo-like kinase 1 imaging and quantification.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 50, 9378-9381 (2011).</li><li>Liu, D. S., Tangpeerachaikul, A., Selvaraj, R., Taylor, M. T., Fox, J. M., Ting, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diels-Alder+cycloaddition+for+fluorophore+targeting+to+specific+proteins+inside+living+cells.">Diels-Alder cycloaddition for fluorophore targeting to specific proteins inside living cells.</a> J Am Chem Soc. 134, 792-795 (2012).</li><li>Haun, J. B., Devaraj, N. K., Hilderbrand, S. A., Lee, H., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioorthogonal+chemistry+amplifies+nanoparticle+binding+and+enhances+the+sensitivity+of+cell+detection.">Bioorthogonal chemistry amplifies nanoparticle binding and enhances the sensitivity of cell detection.</a> Nat Nanotechnol. 5, 660-665 (2010).</li><li>Liong, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+pathogen+detection+using+bioorthogonal+chemistry+and+diagnostic+magnetic+resonance.">Specific pathogen detection using bioorthogonal chemistry and diagnostic magnetic resonance.</a> Bioconjug Chem. 22, 2390-2394 (2011).</li><li>Tassa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On-chip+bioorthogonal+chemistry+enables+immobilization+of+in+situ+modified+nanoparticles+and+small+molecules+for+label-free+monitoring+of+protein+binding+and+reaction+kinetics.">On-chip bioorthogonal chemistry enables immobilization of in situ modified nanoparticles and small molecules for label-free monitoring of protein binding and reaction kinetics.</a> Lab Chip. 12, 3103-3110 (2012).</li><li>Pol, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+correct+protein+concentration+for+kinetics+and+affinity+determination+in+structure-function+analysis.">The importance of correct protein concentration for kinetics and affinity determination in structure-function analysis.</a> J Vis Exp. (37), e1746 (2010).</li><li>MacBeath, G., Schreiber, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Printing+proteins+as+microarrays+for+high-throughput+function+determination.">Printing proteins as microarrays for high-throughput function determination.</a> Science. 289, 1760-1763 (2000).</li><li>Ong, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+the+proteins+to+which+small-molecule+probes+and+drugs+bind+in+cells.">Identifying the proteins to which small-molecule probes and drugs bind in cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 4617-4622 (2009).</li><li>Tassa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+affinity+and+kinetic+analysis+of+targeted+small+molecule-modified+nanoparticles.">Binding affinity and kinetic analysis of targeted small molecule-modified nanoparticles.</a> Bioconjug Chem. 21, 14-19 (2010).</li><li>Weissleder, R., Kelly, K., Sun, E. Y., Shtatland, T., Josephson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-specific+targeting+of+nanoparticles+by+multivalent+attachment+of+small+molecules.">Cell-specific targeting of nanoparticles by multivalent attachment of small molecules.</a> Nat Biotechnol. 23, 1418-1423 (2005).</li><li>Yuan, J., Oliver, R., Aguilar, M. I., Wu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+plasmon+resonance+assay+for+chloramphenicol.">Surface plasmon resonance assay for chloramphenicol.</a> Anal Chem. 80, 8329-8333 (2008).</li><li>Myung, J. H., Gajjar, K. A., Saric, J., Eddington, D. T., Hong, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendrimer-mediated+multivalent+binding+for+the+enhanced+capture+of+tumor+cells.">Dendrimer-mediated multivalent binding for the enhanced capture of tumor cells.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 50, 11769-11772 (2011).</li><li>Keelan, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanotoxicology:+nanoparticles+versus+the+placenta.">Nanotoxicology: nanoparticles versus the placenta.</a> Nat Nanotechnol. 6, 263-264 (2011).</li><li>Lundqvist, M., Stigler, J., Elia, G., Lynch, I., Cedervall, T., Dawson, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticle+size+and+surface+properties+determine+the+protein+corona+with+possible+implications+for+biological+impacts.">Nanoparticle size and surface properties determine the protein corona with possible implications for biological impacts.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 14265-14270 (2008).</li><li>Lundqvist, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolution+of+the+protein+corona+around+nanoparticles:+a+test+study.">The evolution of the protein corona around nanoparticles: a test study.</a> ACS Nano. 5, 7503-7509 (2011).</li><li>Mammen, M., Choi, S. -. K., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyvalent+interactions+in+biological+systems:+implications+for+design+and+use+of+multivalent+ligands+and+inhibitors.">Polyvalent interactions in biological systems: implications for design and use of multivalent ligands and inhibitors.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 37, 2754-2899 (1998).</li><li>Kausaite-Minkstimiene, A., Ramanaviciene, A., Kirlyte, J., Ramanavicius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+of+random+and+oriented+antibody+immobilization+techniques+on+the+binding+capacity+of+immunosensor.">Comparative study of random and oriented antibody immobilization techniques on the binding capacity of immunosensor.</a> Anal Chem. 82, 6401-6408 (2010).</li><li>Arkin, M. R., Wells, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule+inhibitors+of+protein-protein+interactions:+progressing+towards+the+dream.">Small-molecule inhibitors of protein-protein interactions: progressing towards the dream.</a> Nat Rev Drug Discov. 3, 301-317 (2004).</li><li>Giannetti, A. M., Koch, B. D., Browner, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+plasmon+resonance+based+assay+for+the+detection+and+characterization+of+promiscuous+inhibitors.">Surface plasmon resonance based assay for the detection and characterization of promiscuous inhibitors.</a> J Med Chem. 51, 574-580 (2008).</li><li>Kimple, A. J., Willard, F. S., Giguere, P. M., Johnston, C. A., Mocanu, V., Siderovski, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RGS+protein+inhibitor+CCG-4986+is+a+covalent+modifier+of+the+RGS4+Galpha-interaction+face.">The RGS protein inhibitor CCG-4986 is a covalent modifier of the RGS4 Galpha-interaction face.</a> Biochim Biophys Acta. 1774, 1213-1220 (2007).</li><li>GE Healthcare. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biacore Sensor Surface Handbook BR-1005-71. , (2005).</li></ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

El método de captura-cicloadición aquí descrito permite una rápida inmovilización reversible de las nanopartículas modificadas y pequeñas moléculas para la interacción basada en el chip sin etiquetas y los estudios cinéticos. El protocolo de inmovilización se puede realizar en minutos que requieren &lt;10 M concentraciones de ligandos de molécula pequeña. Mediante la modulación de la concentración de ligando y densidades de inmovilización de tiempo de contacto puede estar estrechamente controlado. Nuestr...

Reacciones de conjugación eficientes son herramientas valiosas para la fijación de moléculas bioactivas a las superficies para una variedad de aplicaciones de la biotecnología. Recientemente, el bioorthogonal muy rápido [4 2] de reacción de cicloadición entre trans-cicloocteno (TCO) y 1,2,4,5-tetrazina (Tz) se ha utilizado para etiquetar superficies de las células, estructuras subcelulares, anticuerpos y nanopartículas 1. - 7 Aquí, utilizamos el [4 +2] reacción de cicloadición en combinación con la captura de antígeno / anticuerpo (GST / anti-GST) para reversible la síntesis en el chip de estructuras de componentes múltiples para resonancia de plasmones superficiales (SPR) análisis de la interacción y monitoreamos la proceso en tiempo real (Figura 1). 8,9 En particular, la estrategia de captura-cicloadición permite la regeneración de la superficie utilizando un protocolo establecido. 8 Como consecuencia de ello, el conjunto de superficies de sensor estables con control sobre la orientación y densidad de ligando para la variedad de nuevo ensayo formatos es ahora posible. Usoesta estrategia demostramos la inmovilización de pequeñas moléculas derivatizadas-Tz TCO / y caracterizar los tipos de cicloadición en una variedad de condiciones de tampón. Elegimos la conocida interacción entre FKBP12 y un AP1497 molécula que se une a FKBP12 10-12 como un ejemplo para verificar que la estrategia de captura-cicloadición conserva la capacidad de la molécula pequeña para interactuar con su objetivo cuando ya sea directamente unido a los antígenos inmovilizados de GST o nanopartículas inmovilizadas (NPS). Este método ofrece varias ventajas. En primer lugar, la inmovilización reversible de moléculas pequeñas en chips sensores es ahora posible. En segundo lugar, TCO / Tz inmovilización de moléculas pequeñas también permite estudios de interacción de marca libre que revierten la orientación de los estudios SPR canónicas, y puede proporcionar una visión complementaria de una interacción de unión. En tercer lugar, este método permite la síntesis de microfluidos de nanopartículas dirigidas, y la evaluación inmediata de su bindinpropiedades g. Esto promete mejorar la eficiencia de la evaluación o prueba de nanopartículas específicas, y también disminuir las cantidades de nanopartículas requeridos. 13-15 En cuarto lugar, este enfoque puede medir la cinética de reacción de reacciones de cicloadición bioorthogonal en tiempo real en un flujo continuo. Finalmente, la inmovilización química TCO / Tz es robusto en presencia de suero. Tomados en conjunto, podemos anticipar que este enfoque versátil ampliamente facilitar la construcción de superficies de sensor estables para una amplia variedad de estudios de microfluidos con relevancia para in vitro y en aplicaciones celulares in vivo.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sensor Chip CM5</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>BR-1005-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amine coupling kit</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>BR-1000-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GST capture kit</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>BR-1002-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAP-10 Columns</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0854-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GST, lyophilized in 1X PBS</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>Z02039</td>
			<td>1 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rhFKBP12</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>3777-FK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surfactant P-20</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>BR-1000-54</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine 2.0</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>BR-1003-55</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeba spin desalting column</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>89882</td>
			<td>7 K MWCO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra 4</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>UFC810096</td>
			<td>100 K centrifugal filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCO-OH</td>
			<td>Ref. 8</td>
			<td></td>
			<td>Synthesized in-house</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCO-NHS</td>
			<td>Ref. 8</td>
			<td></td>
			<td>Synthesized in-house, *Commercially available from Click Chemistry Tools # 1016-25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tz-BnNH2</td>
			<td>Ref. 8</td>
			<td></td>
			<td>Synthesized in-house</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tz-NHS</td>
			<td>Ref. 8</td>
			<td>764701</td>
			<td>Synthesized in-house, *Commercially available from Sigma Aldrich # 764701</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-NH2 = CLIO-NH2</td>
			<td>Ref. 8</td>
			<td></td>
			<td>Synthesized in-house</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AP1497, AP1497-Tz</td>
			<td>Ref. 8</td>
			<td></td>
			<td>Synthesized in-house</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPR Biosensor</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>Biacore T100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microfluidic on-chip capture-cycloaddition reaction to reversibly immobilize small molecules or multi-component structures for biosensor applications

Los métodos para la inmovilización de superficie rápida de pequeñas moléculas bioactivas con el control sobre la orientación y densidad de inmovilización son altamente deseables para aplicaciones de biosensores y de microarrays. En este estudio, utilizamos una bioorthogonal altamente eficiente covalente [4 +2] reacción de cicloadición entre trans-cicloocteno (TCO) y 1,2,4,5-tetrazina (Tz) para permitir la inmovilización de microfluidos de moléculas derivatizadas-Tz TCO / . Supervisamos el proceso en tiempo real bajo condiciones de flujo continuo utilizando resonancia de plasmones superficiales (SPR). Para permitir la inmovilización reversible y ampliar la gama experimental de la superficie del sensor, se combinan un componente de captura de antígeno-anticuerpo no covalente con la reacción de cicloadición. Al presentar alternativamente restos TCO o Tz a la superficie del sensor, múltiples procesos de captura-cicloadición son ahora posibles en una superficie del sensor de montaje y de interacción on-chip de estudios de una variedad de estructuras de componentes múltiples. Nos illustrate este método con dos experimentos diferentes de inmovilización en un chip biosensor; una molécula pequeña, AP1497 que se une la proteína de unión a FK506-12 (FKBP12), y la misma molécula pequeña como parte de una nanopartícula in situ-funcionalizado inmovilizado y en.

Los datos y las cifras han sido adaptados de referencia 8. Inmovilización reversible eficiente de pequeñas moléculas bioactivas con el control sobre la orientación y la densidad juega un papel clave en el desarrollo de nuevas aplicaciones de biosensores. El uso de la reacción bioorthogonal rápida entre el TCO y Tz, se describe un método para el montaje paso a paso y la regeneración de las superficies de ligando con retención de la actividad biológica. Figura 2 mues...

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Microfluidic On-chip Capture-cycloaddition Reaction to Reversibly Immobilize Small Molecules or Multi-component Structures for Biosensor Applications

Se presenta un método para la rápida inmovilización reversible de moléculas pequeñas y las asambleas de nanopartículas funcionalizadas de resonancia de plasmones superficiales (SPR) los estudios, utilizando secuencial en el chip de captura química cicloadición bioorthogonal y anticuerpo-antígeno.

Microfluidic Reacción en el chip de captura-cicloadición para inmovilizar reversiblemente pequeñas moléculas o estructuras de múltiples componentes para aplicaciones de biosensores

Methods  for rapid surface immobilization of bioactive small molecules with control over  orientation and immobilization density are highly desirable for ...

microfluidic-on-chip-capture-cycloaddition-reaction-to-reversibly

Research

JoVE Journal

Chemistry

10.7K vistas.  Massachusetts General Hospital.  Se presenta un método para la rápida inmovilización reversible de moléculas pequeñas y las asambleas de nanopartículas funcionalizadas de resonancia de plasmones superficiales (SPR) los estudios, utilizando secuencial en el chip de captura química cicloadición bioorthogonal y anticuerpo-antígeno. 

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Formation of Ordered Biomolecular Structures by the Self-assembly of Short Peptides

In nature, complex functional structures are formed by the self-assembly of biomolecules under mild conditions. Understanding the forces that control self-assembly and mimicking this process in vitro will bring about major advances in the areas of materials science and nanotechnology. Among the available biological building blocks, peptides have several advantages as they present substantial diversity, their synthesis in large scale is straightforward, and they can easily be modified with biological and chemical entities1,2. Several classes of designed peptides such as cyclic peptides, amphiphile peptides and peptide-conjugates self-assemble into ordered structures in solution. Homoaromatic dipeptides, are a class of short self-assembled peptides that contain all the molecular information needed to form ordered structures such as nanotubes, spheres and fibrils3-8. A large variety of these peptides is commercially available.
This paper presents a procedure that leads to the formation of ordered structures by the self-assembly of homoaromatic peptides. The protocol requires only commercial reagents and basic laboratory equipment. In addition, the paper describes some of the methods available for the characterization of peptide-based assemblies. These methods include electron and atomic force microscopy and Fourier-Transform Infrared Spectroscopy (FT-IR). Moreover, the manuscript demonstrates the blending of peptides (coassembly) and the formation of a &#34;beads on a string&#34;-like structure by this process.9 The protocols presented here can be adapted to other classes of peptides or biological building blocks and can potentially lead to the discovery of new peptide-based structures and to better control of their assembly.

This paper describes the formation of highly ordered peptide-based structures by the spontaneous process of self-assembly. The method utilizes commercially available peptides and common lab equipment. This technique can be applied to a large variety of peptides and may lead to the discovery of new peptide-based assemblies.

Formación de estructuras biomoleculares ordenada por el auto-ensamblaje de péptidos cortos

In nature, complex functional structures are formed by the self-assembly of biomolecules under mild conditions. Understanding the forces that control ...

Investigación

Química

Preparation of Hydrophobic Metal-Organic Frameworks via Plasma Enhanced Chemical Vapor Deposition of Perfluoroalkanes for the Removal of Ammonia

Plasma enhanced chemical vapor deposition (PECVD) of perfluoroalkanes has long been studied for tuning the wetting properties of surfaces. For high surface area microporous materials, such as metal-organic frameworks (MOFs), unique challenges present themselves for PECVD treatments. Herein the protocol for development of a MOF that was previously unstable to humid conditions is presented. The protocol describes the synthesis of Cu-BTC (also known as HKUST-1), the treatment of Cu-BTC with PECVD of perfluoroalkanes, the aging of materials under humid conditions, and the subsequent ammonia microbreakthrough experiments on milligram quantities of microporous materials. Cu-BTC has an extremely high surface area (~1,800 m2/g) when compared to most materials or surfaces that have been previously treated by PECVD methods. Parameters such as chamber pressure and treatment time are extremely important to ensure the perfluoroalkane plasma penetrates to and reacts with the inner MOF surfaces. Furthermore, the protocol for ammonia microbreakthrough experiments set forth here can be utilized for a variety of test gases and microporous materials.

Herein the procedures for plasma enhanced chemical vapor deposition of perfluoroalkanes on microporous materials such as metal-organic frameworks to enhance their stability and hydrophobicity are described. Furthermore, breakthrough testing of milligram quantities of samples is described in detail.

Preparación de hidrófobos orgánicos marcos de metal a través de Plasma Enhanced Chemical Vapor Deposition de perfluoroalcanos para la eliminación de amoniaco

Plasma enhanced chemical vapor deposition (PECVD) of perfluoroalkanes has long been studied for tuning the wetting properties of surfaces. For high ...

Activating Molecules, Ions, and Solid Particles with Acoustic Cavitation

The chemical and physical effects of ultrasound arise not from a direct interaction of molecules with sound waves, but rather from the acoustic cavitation: the nucleation, growth, and implosive collapse of microbubbles in liquids submitted to power ultrasound. The violent implosion of bubbles leads to the formation of chemically reactive species and to the emission of light, named sonoluminescence. In this manuscript, we describe the techniques allowing study of extreme intrabubble conditions and chemical reactivity of acoustic cavitation in solutions. The analysis of sonoluminescence spectra of water sparged with noble gases provides evidence for nonequilibrium plasma formation. The photons and the "hot" particles generated by cavitation bubbles enable to excite the non-volatile species in solutions increasing their chemical reactivity. For example the mechanism of ultrabright sonoluminescence of uranyl ions in acidic solutions varies with uranium concentration: sonophotoluminescence dominates in diluted solutions, and collisional excitation contributes at higher uranium concentration. Secondary sonochemical products may arise from chemically active species that are formed inside the bubble, but then diffuse into the liquid phase and react with solution precursors to form a variety of products. For instance, the sonochemical reduction of Pt(IV) in pure water provides an innovative synthetic route for monodispersed nanoparticles of metallic platinum without any templates or capping agents. Many studies reveal the advantages of ultrasound to activate the divided solids. In general, the mechanical effects of ultrasound strongly contribute in heterogeneous systems in addition to chemical effects. In particular, the sonolysis of PuO2 powder in pure water yields stable colloids of plutonium due to both effects.

Acoustic cavitation in liquids submitted to power ultrasound creates transient extreme conditions inside the collapsing bubbles, which are the origin of unusual chemical reactivity and light emission, known as sonoluminescence. In the presence of noble gases, nonequilibrium plasma is formed. The "hot" particles and the photons generated by collapsing bubbles are able to excite species in solution.

Activación de moléculas, iones y partículas sólidas con cavitación acústica

The chemical and physical effects of ultrasound arise not from a direct interaction of molecules with sound waves, but rather from the acoustic ...

Synthesis of Cd-free InP/ZnS Quantum Dots Suitable for Biomedical Applications

Fluorescent nanocrystals, specifically quantum dots, have been a useful tool for many biomedical applications. For successful use in biological systems, quantum dots should be highly fluorescent and small/monodisperse in size. While commonly used cadmium-based quantum dots possess these qualities, they are potentially toxic due to the possible release of Cd2+ ions through nanoparticle degradation. Indium-based quantum dots, specifically InP/ZnS, have recently been explored as a viable alternative to cadmium-based quantum dots due to their relatively similar fluorescence characteristics and size. The synthesis presented here uses standard hot-injection techniques for effective nanoparticle growth; however, nanoparticle properties such as size, emission wavelength, and emission intensity can drastically change due to small changes in the reaction conditions. Therefore, reaction conditions such temperature, reaction duration, and precursor concentration should be maintained precisely to yield reproducible products. Because quantum dots are not inherently soluble in aqueous solutions, they must also undergo surface modification to impart solubility in water. In this protocol, an amphiphilic polymer is used to interact with both hydrophobic ligands on the quantum dot surface and bulk solvent water molecules. Here, a detailed protocol is provided for the synthesis of highly fluorescent InP/ZnS quantum dots that are suitable for use in biomedical applications.

In this protocol, the synthesis of Cd-free InP/ZnS quantum dots (QDs) is detailed. InP-based QDs are gaining popularity due to the toxicity of Cd2+ ions that may be released through nanoparticle degradation. After synthesis, QDs are solubilized in water using an amphiphilic polymer for use in biomedical applications.

Síntesis de Cd-libre EAD / ZnS puntos cuánticos Adecuado para aplicaciones biomédicas

Fluorescent nanocrystals, specifically quantum dots, have been a useful tool for many biomedical applications. For successful use in biological systems, ...

Highly Stable, Functional Hairy Nanoparticles and Biopolymers from Wood Fibers: Towards Sustainable Nanotechnology

Nanoparticles, as one of the key materials in nanotechnology and nanomedicine, have gained significant importance during the past decade. While metal-based nanoparticles are associated with synthetic and environmental hassles, cellulose introduces a green, sustainable alternative for nanoparticle synthesis. Here, we present the chemical synthesis and separation procedures to produce new classes of hairy nanoparticles (bearing both amorphous and crystalline regions) and biopolymers based on wood fibers. Through periodate oxidation of soft wood pulp, the glucose ring of cellulose is opened at the C2-C3 bond to form 2,3-dialdehyde groups. Further heating of the partially oxidized fibers (e.g., T = 80 &#176;C) results in three products, namely fibrous oxidized cellulose, sterically stabilized nanocrystalline cellulose (SNCC), and dissolved dialdehyde modified cellulose (DAMC), which are well separated by intermittent centrifugation and co-solvent addition. The partially oxidized fibers (without heating) were used as a highly reactive intermediate to react with chlorite for converting almost all aldehyde to carboxyl groups. Co-solvent precipitation and centrifugation resulted in electrosterically stabilized nanocrystalline cellulose (ENCC) and dicarboxylated cellulose (DCC). The aldehyde content of SNCC and consequently surface charge of ENCC (carboxyl content) were precisely controlled by controlling the periodate oxidation reaction time, resulting in highly stable nanoparticles bearing more than 7 mmol functional groups per gram of nanoparticles (e.g., as compared to conventional NCC bearing &#60;&#60; 1 mmol functional group/g). Atomic force microscopy (AFM), transmission electron microscopy (TEM), and scanning electron microscopy (SEM) attested to the rod-like morphology. Conductometric titration, Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR), nuclear magnetic resonance (NMR), dynamic light scattering (DLS), electrokinetic-sonic-amplitude (ESA) and acoustic attenuation spectroscopy shed light on the superior properties of these nanomaterials.

Synthesis schemes to prepare highly stable wood fiber-based hairy nanoparticles and functional cellulose-based biopolymers have been detailed.

Altamente estable, funcional Hairy nanopartículas y biopolímeros con fibras de madera: Hacia Nanotecnología Sostenible

Nanoparticles, as one of the key materials in nanotechnology and nanomedicine, have gained significant importance during the past decade. While ...

Low-energy Cathodoluminescence for (Oxy)Nitride Phosphors

Nitride and oxynitride (Sialon) phosphors are good candidates for the ultraviolet and visible emission applications. High performance, good stability and flexibility of their emission properties can be achieved by controlling their composition and dopants. However, a lot of work is still required to improve their properties and to reduce the production cost. A possible approach is to correlate the luminescence properties of the Sialon particles with their local structural and chemical environment in order to optimize their growth parameters and find novel phosphors. For such a purpose, the low-voltage cathodoluminescence (CL) microscopy is a powerful technique. The use of electron as an excitation source allows detecting most of the luminescence centers, revealing their luminescence distribution spatially and in depth, directly comparing CL results with the other electron-based techniques, and investigating the stability of their luminescence properties under stress. Such advantages for phosphors characterization will be highlighted through examples of investigation on several Sialon phosphors by low-energy CL.

Low-energy Cathodoluminescence for OxyNitride Phosphors

An excellent chemical and luminescence stabilities of (oxy)nitride phosphors present it as an promising alternative to currently used sulfide and oxide phosphors. In this paper, we present the way to investigate its local luminescence properties using low-energy cathodoluminescence (CL).

Catodoluminiscencia de baja energía para (Oxy) Los fósforos de nitruro

Nitride and oxynitride (Sialon) phosphors are good candidates for the ultraviolet and visible emission applications. High performance, good stability and ...

The Preparation and Properties of Thermo-reversibly Cross-linked Rubber Via Diels-Alder Chemistry

A method for using Diels Alder thermo-reversible chemistry as cross-linking tool for rubber products is demonstrated. In this work, a commercial ethylene-propylene rubber, grafted with maleic anhydride, is thermo-reversibly cross-linked in two steps. The pending anhydride moieties are first modified with furfurylamine to graft furan groups to the rubber backbone. These pendant furan groups are then cross-linked with a bis-maleimide via a Diels-Alder coupling reaction. Both reactions can be performed under a broad range of experimental conditions and can easily be applied on a large scale. The material properties of the resulting Diels-Alder cross-linked rubbers are similar to a peroxide-cured ethylene/propylene/diene rubber (EPDM) reference. The cross-links break at elevated temperatures (&#62; 150 &#176;C) via the retro-Diels-Alder reaction and can be reformed by thermal annealing at lower temperatures (50-70 &#176;C). Reversibility of the system was proven with infrared spectroscopy, solubility tests and mechanical properties. Recyclability of the material was also shown in a practical way, i.e., by cutting a cross-linked sample into small parts and compression molding them into new samples displaying comparable mechanical properties, which is not possible for conventionally cross-linked rubbers.

A simple two-step approach involving rubber modification and cross-linking yields fully reworkable, elastic rubber products.

La preparación y propiedades de termo-reversible reticulado Química Caucho Vía de Diels-Alder

A method for using Diels Alder thermo-reversible chemistry as cross-linking tool for rubber products is demonstrated. In this work, a commercial ...

From Molecules to Materials: Engineering New Ionic Liquid Crystals Through Halogen Bonding

Herein, we demonstrate that a bottom-up approach, based on halogen bonding (XB), can be successfully applied for the design of a new type of ionic liquid crystals (ILCs). Taking advantages of the high specificity of XB for haloperfluorocarbons and the ability of anions to act as XB-acceptors, we obtained supramolecular complexes based on 1-alkyl-3-methylimidazolium iodides and iodoperfluorocarbons, overcoming the well-known immiscibility between hydrocarbons (HCs) and perfluorocarbons (PFCs). The high directionality of the XB combined with the fluorophobic effect, allowed us to obtain enantiotropic liquid crystals where a rigid, non-aromatic, XB supramolecular anion acts as mesogenic core.
X-ray structure analysis of the complex between 1-ethyl-3-methylimidazolium iodide and iodoperfluorooctane showed the presence of a layered structure, which is a manifestation of the well-known tendency to segregation of perfluoroalkyl chains. This is consistent with the observation of smectic mesophases. Moreover, all the reported complexes melt below 100 &#176;C, and most are mesomorphic even at room temperature, despite that the starting materials were non-mesomorphic in nature.
The supramolecular strategy reported here provides new design principles for mesogen design allowing a totally new class of functional materials.

A protocol for the synthesis of a new type of mesogens, based on the halogen-bonded supramolecular anion [CnF2n+1-I&#183;&#183;&#183;I&#183;&#183;&#183;I-CnF2n+1]&#8722;, is reported.

De las moléculas a los materiales: Ingeniería nuevos cristales líquidos iónicos a través de la vinculación de halógeno

Herein, we demonstrate that a bottom-up approach, based on halogen bonding (XB), can be successfully applied for the design of a new type of ionic liquid ...

Application and Methodology of the Non-destructive 19F Time-domain NMR Technique to Measure the Content in Fluorine-containing Drug Products

Here, we describe a protocol developed by our group that uses low-field fluorine-19 (19F) time-domain (TD) nuclear magnetic resonance (NMR) to measure the average content of fluorinated drugs in their formulated drug product forms: tablets or capsules. This method is specific to fluorinated drugs because it detects only the content of fluorine, avoiding interference from the excipients that lack fluorine. The advantages of measuring the active content of fluorinated drugs using low-field 19F TD-NMR versus high-field 19F solid-state (SS) NMR are the simplicity of the method; the low cost; and the non-destructive nature of the technique, with all samples recoverable in intact forms (e.g., powders, tablets, and capsules), making this technique affordable for any laboratory.
We have tested the method with three fluorinated drug products available on the market - cinacalcet, lansoprazole, and ciprofloxacin - with doses ranging from 15 to 500 mg. The results of the analyses, measured by low-field 19F TD-NMR, supported the reported label claims for the average drug content.
Based on the simplicity and reproducibility of the analysis, we envision this methodology being implemented in any laboratory, including manufacturing plants, as a process analytical technology (PAT) tool in the pharmaceutical industry.

Application and Methodology of the Non-destructive 19F Time-domain NMR Technique to Measure the Content in Fluorine-containing Drug Products

A simple and non-destructive technique that measures the average content of drug substances in formulated drug products containing fluorine using low-field fluorine-19 (19F) time-domain (TD) nuclear magnetic resonance (NMR) is presented here. The technique can be applied to the development and manufacturing of drugs in the pharmaceutical industry.

Aplicación y metodología de la técnica de RMN no destructivos 19F dominio del tiempo para medir el contenido en medicamentos que contienen flúor

Here, we describe a protocol developed by our group that uses low-field fluorine-19 (19F) time-domain (TD) nuclear magnetic resonance (NMR) to measure the ...

Stable DNA Motifs, 1D and 2D Nanostructures Constructed from Small Circular DNA Molecules

This article presents a detailed protocol for synthesis of small circular DNA molecules, annealing of circular DNA motifs, and construction of 1D and 2D DNA nanostructures. Over decades, the rapid development of DNA nanotechnology is attributed to the use of linear DNAs as the source materials. For example, the DAO (double crossover, antiparallel, odd half-turns) tile is well-known as a building block for construction of 2D DNA lattices; the core structure of DAO is made from two linear single-stranded (ss) oligonucleotides, like two ropes making a right hand granny&#160;knot. Herein, a new type of DNA tiles called cDAO (coupled DAO) are built using a small circular ss-DNA of c64nt or c84nt (circular 64 or 84 nucleotides) as the scaffold strand and several linear ss-DNAs as the staple strands. Perfect 1D and 2D nanostructures are assembled from cDAO tiles: infinite nanowires, nanospirals, nanotubes, nanoribbons; and finite nano-rectangles. Detailed protocols are described: 1) preparation by T4 ligase and purification by denaturing PAGE (polyacrylamide gel electrophoresis) of small circular oligonucleotides, 2) annealing of stable circular tiles, followed by native PAGE analysis, 3) assembling of infinite 1D nanowires, nanorings, nanospirals, infinite 2D lattices of nanotubes and nanoribbons, and finite 2D nano-rectangles, followed by AFM (Atomic Force Microscopy) imaging. The method is simple, robust, and affordable for most labs.

This article presents a detailed protocol for T4 ligation and denaturing PAGE purification of small circular DNA molecules, annealing and native PAGE analysis of circular tiles, assembling and AFM imaging of 1D and 2D DNA nanostructures, as well as agarose gel electrophoresis and centrifugation purification of finite DNA nanostructures.

Motivos de ADN estable, 1D y 2D nanoestructuras construyen a partir de moléculas de ADN Circular pequeño

This article presents a detailed protocol for synthesis of small circular DNA molecules, annealing of circular DNA motifs, and construction of 1D and 2D ...