1. Preparación y la siembra de células en micropatrones <ol><li> Coloque 2 CYTOOchips en dos pozos independientes de una placa de 6 y asegurarse de que usted lea &quot;CYTOO&quot; en la esquina inferior derecha de la CYTOOchip. Micropatrones puede ser marcado con fluorescencia con Cy3 o Cy5 tintes. CYTOOChips utilizados para este experimento se han marcado con fluorescencia Cy3 micropatrones. CUIDADO: Evite que los chips en la oscuridad. </li><li> Muestras de células HeLa (confluente ~ 80%) por tripsinización. Compruebe con un microscopio que las células están bien dispersos por el tratamiento con tripsina. Recoger y centrifugar las células a 300 g durante 4 minutos, luego suavemente resuspender el botón celular. Recuento de células y se diluye a una concentración de 15.000 células / ml en los medios de cultivo DMEM/F12 completa. </li><li> Prescindir de 4 ml (60.000 células) en cada pocillo que contiene una CYTOOchip. PRECAUCIÓN: La placa se debe mover lo menos posible para evitar la inducción de los movimientos de rotación en el medio, ya que esto tiende a concentrar las células en el centro. </li><li> Deje que el sedimento células durante 10 minutos bajo el capó luego pasar a la celda incubadora. Después de 10-20 minutos, las células comienzan a adherirse a la micropatrones. Después de 10 minutos, comprobar con regularidad bajo el microscopio. </li><li> Tan pronto como las células se ha fijado, cambiar el medio celular y lave cuidadosamente la superficie del cubreobjetos mediante el siguiente procedimiento: </li><li> Mantener la placa plana, Aspire con cuidado el medio con una pipeta del lado del bien. PRECAUCIÓN: Nunca deje que el chip de secarse, esto significa que no fuera aspirado todo el líquido, pero dejan suficiente para cubrir el CYTOOchip en todo momento. </li><li> Agregar 4 ml de PBS y aspirar de nuevo se empieza en el centro del chip luego pasar al lado del pozo. Aspirado de la PBS como se describe, sin exponer el chip a la atmósfera. Repita 3-4 veces. </li><li> Compruebe con el microscopio de las células flotantes: <ul><li> Si un gran número de células flotantes permanecen, repita el procedimiento de lavado. </li><li> Si usted ve muy pocas células, aspirar a una parte de la PBS y reemplazarlo con 2 ml de medio fresco. Aspirar y añadir 4 ml de medio fresco dos veces. </li></ul></li><li> Colocar la placa en un cultivo de tejidos incubadora a 37 ° C con 5% de CO2 durante un mínimo de tres horas para permitir que las células para lograr la plena difusión. NOTA: El uso de este método entre un 10-30% (2.000 a 6500) micropatrones será ocupado por una o varias células. PRECAUCIÓN: El tiempo necesario para que las células se adhieran antes de la etapa de lavado y el tiempo necesario para la plena difusión de las células en micropatrones será específico para cada línea celular. </li></ol> 2. Blebbistatin tratamiento <ol><li> Disolver el blebbistatin en el 100% DMSO para obtener una solución stock de 17 mM. Diluir la solución madre de más de 5 mm con 100% de DMSO. Hacer una dilución final en medio de cultivo para obtener una concentración final de blebbistatin M 5 en el 0,1% de DMSO. </li><li> Para las condiciones de control, preparar 4 ml de medio que contiene 0,1% de DMSO sólo. </li><li> Aspirar los medios de comunicación en las células y reemplazarlo con el medio de 4 ml preparada para las condiciones de tratamiento y de control. </li><li> Las células se incuban durante 1 hora a 37 ° C. </li></ol> 3. Fijación y la tinción de células de la actina <ol><li> Preparación de la solución para la fijación de la célula Por favor, consulte la sección de reactivos para la preparación del citoesqueleto de amortiguación (CB) y el 5% de PFA. CB se recomienda especialmente para el etiquetado de fluorescencia de los filamentos de actina y los microtúbulos. <ul><li> Prepare 1xCB-sacarosa: añadir 1 g de sacarosa a 2 ml de CB. La inclusión de sacarosa ayuda a preservar las estructuras internas de la célula. </li><li> Prepare un 4% PFA-CB-sacarosa: Añadir 1 ml de sacarosa-1xCB a 4 ml de agua tibia PFA 5%. ATENCIÓN: Esta solución puede conservarse a 4 ° C durante unos pocos días. </li></ul></li><li> PFA fijación <ul><li> El uso de fórceps para recoger el CYTOOchip en el logotipo de CYTOO y colocarla (sin lavar) en un pocillo de una placa de 6 pocillos con 2 ml de PFA-CB-sacarosa solución al 4% </li><li> Incubar 10 min a temperatura ambiente </li><li> Quitar PFA-CB-sacarosa y lavar una vez con PBS </li><li> Hacer un segundo lavado con 2 ml de 100 mM NH 4 Cl durante 10 minutos con el fin de saciar la actividad residual de entrecruzamiento PFA NOTA: diapositivas PFA fijo puede ser almacenada en PBS durante varios días a 4 ° C antes de la tinción orgánulo de imágenes fluorescentes. </li></ul></li><li> Permeabilización de la membrana celular con Triton X-100 Permeabilización de las células con detergente permite anticuerpos o sondas para penetrar la membrana celular y elimina parte de la piscina citosólico de las proteínas del citoesqueleto que de otra manera se puede reducir el contraste de los polímeros del citoesqueleto por lo que es difícil de analizar su localización. <ul><li> Quitar NH 4 Cl y agregar 2 ml / pocillo de 0,1% Triton X-100-CB de 3 min a temperatura ambiente </li><li> Lavar dos veces con 2 ml de PBS </li></ul></li><li> Actina tinción Fluorescentes phalloidin queh une a la actina nativos sólo se utiliza para teñir los filamentos de actina. <ul><li> Añadir 2 ml de FITC-conjugado phalloidin diluido 1:2000 en PBS con 1,5% de BSA </li><li> Incubar 1 hora a temperatura ambiente </li><li> Lavar una vez con 2 ml de PBS </li></ul></li><li> Los núcleos de tinción <ul><li> Añadir 2 ml de Hoechst (mancha con 1 g / ml en PBS) </li><li> Incubar tres minutos a temperatura ambiente </li><li> Lavar dos veces con 2 ml de PBS </li></ul></li><li> Montaje de diapositivas <ul><li> Levante el CYTOOchips en el logotipo y CYTOO CYTOOchip montar en un portaobjetos de microscopio estándar con 25-30 l de Mowiol o cualquier otra solución de montaje. </li></ul></li></ol> 4. Microscopio de instalación y adquisición automática de imagen Numerosos paquetes de software de imágenes existentes que controlan el microscopio en busca de una rápida adquisición de imágenes automatizado y la pantalla. En este ejemplo se utiliza Metamorph software de imágenes y adquisiciones automáticas se realizan en un microscopio Nikon Eclipse Ti equipado con una cámara CCD Hamamatsu y un iluminador Intensilight mercurio contenido en fibra. Las imágenes se adquieren a 20 aumentos en tres longitudes de onda correspondientes a DAPI (núcleos), Cy-3 (micropatrones) y FITC-faloidina (actina). El número de micropatrones visualizado por campo variará dependiendo de las configuraciones de la cámara y el objetivo. Micropatrones CYTOO se colocan a intervalos definidos el uno del otro (100 o 130 m) a través del chip facilitando enormemente la adquisición. <ol><li> Seleccione 20 aumentos </li><li> Adquisición abierta multidimensionales (en la barra de menú: Aplicaciones / Multidimensional de adquisición) y configurar los distintos parámetros del experimento: <ul><li> Número de longitudes de onda: 3 </li><li> Tipos de longitud de onda: DAPI, FITC, Cy3 </li><li> Establecer el tiempo de exposición para cada longitud de onda, en primer lugar se centra en un campo de las células </li><li> El enfoque automático se puede realizar en cada longitud de onda </li><li> Seleccionar dónde guardar los datos </li></ul></li><li> Seleccione Cy3 longitud de onda y la posición de la cámara de modo que el 12 micropatrones se visualizan y se centra en el campo de la cámara (4 columnas y 3 filas de los patrones). </li><li> Crear un diario de carreras de adquisición multidimensional. El procedimiento para la creación de una revista se describe en la figura 1. </li><li> Función de exploración abierta la etapa (en la barra de menús: Dispositivos / Fases / Scan). Para adquirir 24 imágenes cada uno con 12 micropatrones a 20 aumentos, entre 6 columnas y 4 filas con -400 micras de tamaño X paso y 300 micras de tamaño Y paso. En el Diario SET para ejecutar, cargar el MDA.JNL revista. A continuación, pulse Escanear para iniciar la adquisición automática de todo el bloque en las tres longitudes de onda. NOTA: La X e Y tamaño de los pasos aquí indicados pueden variar en función del número de micropatrones presente en un campo de la cámara. Dependiendo de la etapa de creación, dirección en la X y / o Y pueden requerir valores negativos para el movimiento en la dirección correcta. </li></ol> 5. Procesamiento de imágenes y análisis automatizado Muchos paquetes de software de imagen de procesamiento y análisis de existir. Los procedimientos descritos a continuación procesamiento de contorno de la imagen y los pasos de análisis realizada por 2 a medida macros escritas para el programa de código abierto ImageJ. La primera CellRef macro crea una celda de referencia, la hipotenusa segunda rigidez medidas / colapso de la membrana celular. Ambos están disponibles a través del <a href="www.cytoo.com">www.cytoo.com</a> . <ol><li> Crear pilas de imágenes de los tres canales se centró en micropatrones (macro CellRef). El uso de células micropatrones evita la agrupación y agrupación, simplificando en gran medida el primer paso en el procesamiento automatizado de imágenes, que es la localización y la segmentación de las células individuales. El marcado con fluorescencia imágenes micropattern se utilizan para definir y delimitar las regiones se centró en la micropatrones. Estas regiones son luego incorporadas a las imágenes adquiridas en otros canales y recortada. Correspondientes imágenes recortadas se ensamblan en pilas para cada longitud de onda. Una pila de RGB, también se crea a partir de la fusión de los tres canales (Figura 2). </li><li> Aplicar una sola celda de la selección de filtros (macro CellRef) Como se indicó anteriormente, el 10-30% (2,000 a 6,500) de la micropatrones están ocupados por una sola celda o varias celdas, mientras que el resto de micropatrones están vacíos. Para seleccionar las imágenes que muestran micropatrones ocupado por una sola célula, la macro detecta el número de núcleos por la imagen y elimina de todas las pilas (RGB y diferentes longitudes de onda) que contienen más de un núcleo o núcleos no (Figura 3). </li><li> Eliminar la no normalizada y las células que no son completamente estirada a través de la micropattern con corte de células del área del filtro (macro CellRef) Para eliminar la división de células que han escapado del filtro de núcleos, otro filtro a través del canal FITC para actina se aplica. Área de la celda se calcula y por debajo de un punto de corte determinado (áreas de células alrededor de 2 veces menos que el área de la célula en interfase) se retiran de todas las pilas. El área cubierta celular está determinado por el tamaño del patrón. </li><li&gt; Alinear imágenes de células (macro CellRef) De los pasos anteriores, las imágenes que contiene solo las células micropatterned fueron seleccionados. A pesar de que estas imágenes se centran en micropatrones, nunca están perfectamente alineados entre sí. Para concluir el procesamiento de imágenes, un plugin de ImageJ (MultiStackReg) se aplica a todas las imágenes recogidas realinear y todos los canales basados ​​en la posición micropattern. Este paso genera pilas alineado de imágenes individuales que se pueden utilizar ahora para el análisis de células individuales o la creación de una celda de referencia (Figura 4) </li><li> La construcción de una celda de referencia (macro CellRef) Células que crecen en micropatrones significa que todas las células tienen formas similares. Esta normalización permite una orientación precisa y la superposición de imágenes de células muchos. Resumiendo la señal en cada imagen a través de toda la pila permite visualizar y medir un &quot;efecto de la droga promedio&quot;. La imagen final general o celda de referencia es una herramienta única y útil para la representación y análisis de imágenes y sólo se puede obtener con células micropatterned (Figura 4). En ImageJ, la celda de referencia se construye haciendo una proyección de las imágenes filtradas y alineado de una pila (Imagen&gt; Pilas&gt; Z-proyecto). Existen varios métodos de proyección se puede aplicar como la intensidad media o máxima, pero por lo general una proyección mediana que se elija lo que elimina los valores extremos principales de la pila de la imagen. Para facilitar el examen de los resultados, una LUT (Look Up Tables) convertir la imagen monocolor en un mapa de frecuencias de colores se aplica. </li><li> Medición y cuantificación de los parámetros de interés (Hipotenusa macro) En este artículo de vídeo, L-micropatrones se utilizan debido a la forma de organizar el citoesqueleto de actina en una fibra de gran estrés individual. Al poner de relieve la actina de esta manera, el impacto blebbistatin en el citoesqueleto se puede determinar de varias maneras: midiendo los cambios en la curvatura de la fibra de actina estrés, intensidad de la tinción, longitud o el grosor de la fibra de estrés, cambios en las características morfométricas de los filamentos de actina o etc célula forma Estos parámetros se puede medir en las imágenes de células individuales o en la celda de referencia final mismo. En este caso, el impacto de la M blebbistatin 5 se caracteriza por contar el número de células se derrumbó en una segunda macro llamado ImageJ Hipotenusa (Figura 7). En pocas palabras, las imágenes un umbral de la L-micropattern se utilizan para definir una hipotenusa teórico de la forma de triángulo de la célula. A continuación, umbral de las imágenes de actina teñido se realiza con el fin de forma aproximada la célula actual. El área entre la hipotenusa del triángulo teórico celular y la membrana celular real cóncava se mide. Cuando la célula se ha derrumbado, un área por debajo de la hipotenusa teórico aparece. El porcentaje de células se derrumbó se utiliza para comparar el control y tratamiento condiciones. </li></ol> 6. Resultados representante Ejemplos de lo que las células se vería en micropatrones inmediatamente y varias horas después de las etapas de lavado críticos descritos en 1.6-1.8, se muestran en la Figura 5. Después de 15 min en CYTOOchips, ronda las células HeLa se observan a la misma distancia que indica que se han adherido a la micropatrones fibronectina (Figura 5). La adhesión es completa cuando las células permanecen inmovilizados a pesar de agitación suave del recipiente de cultivo. Para reducir al mínimo el número de micropatrones ocupado por varias celdas, los chips luego se lava con PBS para eliminar las células flotando sobre las áreas cytophobic. Después de varias horas, las células que son completamente estirada sobre la micropatrones se verá como los que se muestran en la figura 5b. Típicas imágenes de células individuales obtenidos después de la incubación de células con blebbistatin, la fijación y la tinción de actina y los núcleos se presentan en la Figura 6. Después de la adquisición automática de imágenes múltiples y procesamiento de imágenes mediante el ImageJ CellRef macro, un mapa de frecuencias de colores se genera que representa la intensidad de la actina media de todas las imágenes de células (Figura 6c y 6f). La comparación de la celda de referencia para las condiciones no tratados y tratados demuestra el potencial de este enfoque facilita la observación del fenotipo en estudio y es especialmente útil para explorar los efectos celulares de drogas. Un ejemplo de un posible análisis del efecto de blebbistatin en las células se presenta en la Figura 7. El número de células se derrumbó (es decir, las células con un área en blanco existentes en el marco teórico de la hipotenusa) detectado en 50 células control y células tratadas con 50 mM blebbistatin 5 detectada por el macro Hipotenusa ImageJ se muestra. El aumento del número de células se derrumbó en la población blebbistatin tratados refleja la relajación de las fibras de estrés y por lo tanto la tensión en la membrana debido a la inhibición de las fuerzas blebbistatin actinomyosin contráctil de la célula. <img src="/files/ftp_upload/2514/2514fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Procedimiento para crear una nueva revista con Metamorph. </p&gt; <img src="/files/ftp_upload/2514/2514fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Diagrama de flujo del procedimiento de procesamiento de imágenes automático. <img src="/files/ftp_upload/2514/2514fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Filtrado de células individuales. <img src="/files/ftp_upload/2514/2514fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. La construcción de una celda de referencia. <img src="/files/ftp_upload/2514/2514fig5.jpg" alt="Figura 5" /> Figura 5. Siembra de células. A) las células Hela conforme con micropatrones tras la etapa de lavado (4x) B) Las células HeLa después de la plena difusión de micropatrones L (10 aumentos). <img src="/files/ftp_upload/2514/2514fig6.jpg" alt="Figura 6" /> Figura 6. Comparación de las células y nonpatterned micropatterned en el control de drogas y las condiciones de tratamiento. Las células HeLa fueron sembradas durante 3 horas y se tratan con blebbistatin 5 M durante 1 hora (panel inferior) o se deja sin tratamiento (panel superior). En el control de las células nonpatterned (a), la actina se ensambla en múltiples fibras que desmontar imperceptiblemente durante el tratamiento con blebbistatin M 5 (d). El L-micropatrones, control de las células adoptan una forma triangular (b) y desarrollar una fibra de actina mayor (fibras de estrés) entre los dos vértices de la L. En comparación con las células nonpatterned (d), blebbistatin induce un gran cambio fenotípico de la L-micropatterned las células (e). Visualización directa de los efectos de drogas y la comparación de control y condiciones que se tratan se pueden visualizar rápidamente con la presentación de la célula de referencia construido a partir de 20 células. Similares a las células individuales, una fibra de estrés intenso y claro está presente en la celda de referencia de control (C), mientras que las células blebbistatin tratados colapso y desaparece la fibra de mayor estrés (f). <img src="/files/ftp_upload/2514/2514fig7.jpg" alt="Figura 7" /> Figura 7. Ejemplo de un análisis de los efectos de blebbistatin en las células con la hipotenusa macro. Mientras que el 25% del control de las células se derrumbó, este aumento de 3 veces al 75% en los cinco células blebbistatin M tratado que refleja el debilitamiento actinomyosin contráctil de la red (n = 50 células).

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	<li>Thery, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+matrix+guides+the+orientation+of+the+cell+division+axis.">The extracellular matrix guides the orientation of the cell division axis.</a> Nat Cell Biol. 7, 947-953 (2005).</li><li>Thery, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anisotropy+of+cell+adhesive+microenvironment+governs+cell+internal+organization+and+orientation+of+polarity.">Anisotropy of cell adhesive microenvironment governs cell internal organization and orientation of polarity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 19771-19776 (2006).</li><li>Schauer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probabilistic+density+maps+to+study+global+endomembrane+organization.">Probabilistic density maps to study global endomembrane organization.</a> Nat Methods. , (2010).</li><li>Bischofs, I. B., Klein, F., Lehnert, D., Bastmeyer, M., Schwarz, U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filamentous+network+mechanics+and+active+contractility+determine+cell+and+tissue+shape.">Filamentous network mechanics and active contractility determine cell and tissue shape.</a> Biophys J. 95, 3488-3496 (2008).</li><li>Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometric+control+of+cell+life+and+death.">Geometric control of cell life and death.</a> Science. 276, 1425-1428 (1997).</li><li>Dupin, I., Camand, E., Etienne-Manneville, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Classical+cadherins+control+nucleus+and+centrosome+position+and+cell+polarity.">Classical cadherins control nucleus and centrosome position and cell polarity.</a> J Cell Biol. 185, 779-786 (2009).</li><li>Gomez, E. W., Chen, Q. K., Gjorevski, N., Nelson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+geometry+patterns+epithelial-mesenchymal+transition+via+intercellular+mechanotransduction.">Tissue geometry patterns epithelial-mesenchymal transition via intercellular mechanotransduction.</a> J Cell Biochem. 110, 44-51 (2010).</li><li>Kilian, K. A., Bugarija, B., Lahn, B. 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Todos los autores, excepto Anne Béghin son empleados de CYTOO SA, que produce los reactivos y los instrumentos que aparecen en este artículo.

Elección de micropattern Si bien los efectos de blebbistatin M 5 son apenas detectables en soportes estándar de la cultura, la cuantificación eficiente disponible en el micropatrones que concentran la actina en una fibra de gran estrés individual. Esto mejora la visualización del citoesqueleto de actina ayudar a la cuantificación exacta de los efectos blebbistatin en la célula. La elección de la forma micropattern es fundamental en el diseño de la prueba y se ha diseñado de acuerdo con el cambio fenotípico a destacar en el estudio. Conclusiones Micropatrones facilitar la visualización y cuantificación de los efectos de drogas, especialmente a bajas concentraciones. La sustitución de sustratos homogéneos plana con micropatrones adhesivo para ensayos basados ​​en células mejora la precisión, sensibilidad y calidad de los datos. En consecuencia, menor cantidad de células necesarias para el análisis a fin de lograr los resultados estadísticos robustos 3. Micropatrones adhesivos ofrecen una oportunidad real para mejorar los estudios funcionales y el estudio de los cambios fenotípicos en las concentraciones de fármacos más bajos con el fin de evitar la inducción de efectos de drogas tóxicas o indirecta. Si las plataformas de detección adecuados se utilizan, micropatrones puede satisfacer las demandas de las empresas farmacéuticas para mejorar el gen / aplicaciones de cribado de drogas. Algunos ejemplos adicionales de las publicaciones recientes que se han aprovechado de micropatrones para analizar y cuantificar fenómeno celular se citan a continuación 3-13.

<table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td colspan="5" align="center"> De cultivo celular </td></tr><tr><td colspan="2"> CYTOOchips 20x20 LM-FN </td><td> CYTOO </td><td> 10-114 </td><td> CYTOOchips están disponibles para la absorción de la proteína de su elección </td></tr><tr><td colspan="2"> PBS 1x </td><td> Gibco </td><td> 14040-091 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Cámara de recuento (diapositiva Kova) </td><td> Prolabo </td><td> 71.287,01 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> DMEM/F-12 + Glutamax-I </td><td> Gibco-Invitrogen </td><td> 25300-054 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> FBS (f tal suero bovino) </td><td> PAA </td><td> 31331-028 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> La penicilina y estreptomicina </td><td> PAA </td><td> A15-101 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> 6 pozos de la placa </td><td> Dutscher </td><td> 353046 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> centrífugo </td><td> Fisher Scientific </td><td> M65838 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Microscopio </td><td> Nikon </td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="5" align="center"> Las drogas, la fijación y tinción </td></tr><tr><td colspan="2" > Citoesqueleto Buffer 1X (CB) </td><td > Sigma </td><td > MES: M8250 KCl: I2636 De MgCl: M2393 EGTA: E3889 </td><td > 10 mM MES pH 6,1, KCl 138 mm, De MgCl 3 mm, 2 mM EGTA </td></tr><tr><td colspan="2" > Sacarosa </td><td > Sigma </td><td > S2395 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> PFA 32% </td><td> Microscopía electrónica de Ciencias </td><td> 15714 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> PFA 5% </td><td></td><td></td><td> Mezclar 10 ml de PFA 32% con 54 ml de CB 1.185X </td></tr><tr><td colspan="2"> Triton-X100 </td><td> Sigma </td><td> T9284 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> PBS tabletas </td><td> Gibco-Invitrogen </td><td> 18912-014 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Bovin albúmina sérica (BSA) </td><td> Sigma </td><td> A7806 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Phallodin-FITC </td><td> Sigma </td><td> P5282 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Hoescht </td><td> Invitrogen </td><td> H3570 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Blebbistatin </td><td> Euromedex </td><td> BN0640 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> DMSO </td><td> Sigma </td><td> D8418 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> NH 4 Cl 0,1 M </td><td> Sigma </td><td> M11209 </td><td></td></tr><tr><td colspan="5" align="center"> Adquisición de imágenes </td></tr><tr><td colspan="2"> Microscopio de epifluorescencia </td><td> Nikon</td><td> Eclipse Ti </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Cámara CCD </td><td> TBC </td><td> TBC </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> ImageJ Software </td><td> <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

improved visualization and quantitative analysis of drug effects using micropatterned cells

Hasta la fecha, la mayoría de HCA (análisis de contenido de alta) los estudios se llevan a cabo con líneas de células adherentes cultivadas en un sustrato homogéneo en el cultivo de tejidos tratados con micro-placas. En estas condiciones, las células se dividen y difusión en todas las direcciones dando lugar a una variabilidad inherente en la forma celular, la morfología y el comportamiento. El alta de célula a célula varianza de la población en general impide el éxito de la HCA, especialmente para el desarrollo de fármacos. La capacidad de micropatrones para normalizar la forma y la polaridad interna de cada célula individual ofrece una tremenda oportunidad para resolver este cuello de botella crítico 1-2. Para facilitar el acceso y uso de la tecnología micropatterning, CYTOO ha desarrollado una gama de productos listos para usar micropatrones, disponible en formatos cubreobjetos y pocillos. En este artículo de vídeo, que proporciona protocolos detallados de todos los procedimientos de siembra de células en micropatrones CYTOOchip, tratamiento contra las drogas, la fijación y tinción para la adquisición automatizada, el procesamiento automatizado de imágenes y análisis de datos final. Con este ejemplo, se ilustra cómo se puede facilitar micropatrones ensayos basados ​​en células. Alteraciones del citoesqueleto de la célula son difíciles de cuantificar en las células cultivadas en los sustratos homogéneos, pero el cultivo de células en los resultados micropatrones en una organización reproducible de la malla de actina debido a la colocación sistemática de los contactos de adhesión celular en cada célula. Dicha normalización de la arquitectura intracelular permite la cuantificación de incluso pequeños efectos sobre el citoesqueleto de actina como se demuestra en este conjunto de protocolos que utilizan blebbistatin, un inhibidor de la interacción actina-miosina.

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Improved Visualization and Quantitative Analysis of Drug Effects Using Micropatterned Cells

Micropatrones adhesivo que normalizar la arquitectura celular se puede utilizar para aumentar la sensibilidad en la detección de los efectos de drogas, mejorar la reproducibilidad y simplificar la adquisición automática de imágenes y análisis. Dicha tecnología se beneficiarán de drogas / siRNA ensayos de selección, efectuado en soportes convencionales de cultivo de células y por lo tanto sufren de exceso de célula a célula variabilidad.

Una mejor visualización y análisis cuantitativo de los efectos de drogas Uso de células micropatterned

To date, most HCA (High Content Analysis) studies are carried out with adherent cell lines grown on a homogenous substrate in tissue-culture treated ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

17.2K vistas.  Grenoble, France. Micropatrones adhesivo que normalizar la arquitectura celular se puede utilizar para aumentar la sensibilidad en la detección de los efectos de drogas, mejorar la reproducibilidad y simplificar la adquisición automática de imágenes y análisis. Dicha tecnología se beneficiarán de drogas / siRNA ensayos de selección, efectuado en soportes convencionales de cultivo de células y por lo tanto sufren de exceso de célula a célula variabilidad.

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Micropatterned Surfaces to Study Hyaluronic Acid Interactions with Cancer Cells

Cancer invasion and progression involves a motile cell phenotype, which is under complex regulation by growth factors/cytokines and extracellular matrix (ECM) components within the tumor microenvironment. Hyaluronic acid (HA) is one stromal ECM component that is known to facilitate tumor progression by enhancing invasion, growth, and angiogenesis1. Interaction of HA with its cell surface receptor CD44 induces signaling events that promote tumor cell growth, survival, and migration, thereby increasing metastatic spread2-3. HA is an anionic, nonsulfated glycosaminoglycan composed of repeating units of D-glucuronic acid and D-N-acetylglucosamine. Due to the presence of carboxyl and hydroxyl groups on repeating disaccharide units, native HA is largely hydrophilic and amenable to chemical modifications that introduce sulfate groups for photoreative immobilization 4-5. Previous studies involving the immobilizations of HA onto surfaces utilize the bioresistant behavior of HA and its sulfated derivative to control cell adhesion onto surfaces6-7. In these studies cell adhesion preferentially occurs on non-HA patterned regions.
To analyze cellular interactions with exogenous HA, we have developed patterned functionalized surfaces that enable a controllable study and high-resolution visualization of cancer cell interactions with HA. We utilized microcontact printing (uCP) to define discrete patterned regions of HA on glass surfaces. A "tethering" approach that applies carbodiimide linking chemistry to immobilize HA was used 8. Glass surfaces were microcontact printed with an aminosilane and reacted with a HA solution of optimized ratios of EDC and NHS to enable HA immobilization in patterned arrays. Incorporating carbodiimide chemistry with mCP enabled the immobilization of HA to defined regions, creating surfaces suitable for in vitro applications. Both colon cancer cells and breast cancer cells implicitly interacted with the HA micropatterned surfaces. Cancer cell adhesion occurred within 24 hours with proliferation by 48 hours. Using HA micropatterned surfaces, we demonstrated that cancer cell adhesion occurs through the HA receptor CD44. Furthermore, HA patterned surfaces were compatible with scanning electron microscopy (SEM) and allowed high resolution imaging of cancer cell adhesive protrusions and spreading on HA patterns to analyze cancer cell motility on exogenous HA.

A novel approach that allows the high-resolution analysis of cancer cell interactions with exogenous hyaluronic acid (HA) is described. Patterned surfaces are fabricated by combining carbodiimide chemistry and microcontact printing.

Superficies micropatterned para estudiar las interacciones de ácido hialurónico con células de cáncer

Cancer invasion and progression involves a motile cell phenotype, which is under complex regulation by growth factors/cytokines and extracellular matrix ...

Investigación

Bioingeniería

Fabrication of Micropatterned Hydrogels for Neural Culture Systems using Dynamic Mask Projection Photolithography

Increasingly, patterned cell culture environments are becoming a relevant technique to study cellular characteristics, and many researchers believe in the need for 3D environments to represent in vitro experiments which better mimic in vivo qualities 1-3. Studies in fields such as cancer research 4, neural engineering 5, cardiac physiology 6, and cell-matrix interaction7,8have shown cell behavior differs substantially between traditional monolayer cultures and 3D constructs.
Hydrogels are used as 3D environments because of their variety, versatility and ability to tailor molecular composition through functionalization 9-12. Numerous techniques exist for creation of constructs as cell-supportive matrices, including electrospinning13, elastomer stamps14, inkjet printing15, additive photopatterning16, static photomask projection-lithography17, and dynamic mask microstereolithography18. Unfortunately, these methods involve multiple production steps and/or equipment not readily adaptable to conventional cell and tissue culture methods. The technique employed in this protocol adapts the latter two methods, using a digital micromirror device (DMD) to create dynamic photomasks for crosslinking geometrically specific poly-(ethylene glycol) (PEG) hydrogels, induced through UV initiated free radical polymerization. The resulting "2.5D" structures provide a constrained 3D environment for neural growth. We employ a dual-hydrogel approach, where PEG serves as a cell-restrictive region supplying structure to an otherwise shapeless but cell-permissive self-assembling gel made from either Puramatrix or agarose. The process is a quick simple one step fabrication which is highly reproducible and easily adapted for use with conventional cell culture methods and substrates.
Whole tissue explants, such as embryonic dorsal root ganglia (DRG), can be incorporated into the dual hydrogel constructs for experimental assays such as neurite outgrowth. Additionally, dissociated cells can be encapsulated in the photocrosslinkable or self polymerizing hydrogel, or selectively adhered to the permeable support membrane using cell-restrictive photopatterning. Using the DMD, we created hydrogel constructs up to ~1mm thick, but thin film (&lt;200 &mu;m) PEG structures were limited by oxygen quenching of the free radical polymerization reaction. We subsequently developed a technique utilizing a layer of oil above the polymerization liquid which allowed thin PEG structure polymerization.
In this protocol, we describe the expeditious creation of 3D hydrogel systems for production of microfabricated neural cell and tissue cultures. The dual hydrogel constructs demonstrated herein represent versatile in vitro models that may prove useful for studies in neuroscience involving cell survival, migration, and/or neurite growth and guidance. Moreover, as the protocol can work for many types of hydrogels and cells, the potential applications are both varied and vast.

Simple techniques are described for the rapid production of microfabricated neural culture systems using a digital micromirror device for dynamic mask projection lithography on regular cell culture substrates. These culture systems may be more representative of natural biological architecture, and the techniques described could be adapted for numerous applications.

Fabricación de hidrogeles micropatterned para sistemas de cultivo neuronal usando fotolitografía dinámica de proyección Máscara

Increasingly, patterned cell culture environments are becoming a relevant technique to study cellular characteristics, and many researchers believe in the ...

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting 3D cellular construct can often be more relevant to studying the molecular events and cell-cell interactions than similar experiments studied in 2D. To create effective 3D cultures with high cell viability throughout the scaffold the culture conditions such as oxygen and pH need to be carefully controlled as gradients in analyte concentration can exist throughout the 3D construct. Here we describe the methods of preparing biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors and their incorporation into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds along with their subsequent preparation for the culture of mammalian cells. The pH responsive scaffolds can be used as tools to determine microenvironmental pH within a 3D cellular construct. Furthermore, we detail the delivery of pH responsive nanosensors to the intracellular environment of mammalian cells whose growth was supported by electrospun PLGA scaffolds. The cytoplasmic location of the pH responsive nanosensors can be utilized to monitor intracellular pH (pHi) during ongoing experimentation.

Biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors can be incorporated into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds. The produced self-reporting scaffolds can be used for in&#160;situ monitoring of microenvironmental conditions whilst culturing cells upon the scaffold. This is beneficial as the 3D cellular construct can be monitored in real-time without disturbing the experiment.

Los andamios de autoinforme para el 3-Dimensional Cultivo Celular

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Stretching Micropatterned Cells on a PDMS Membrane

Mechanical forces exerted on cells and/or tissues play a major role in numerous processes. We have developed a device to stretch cells plated on a PolyDiMethylSiloxane (PDMS) membrane, compatible with imaging. This technique is reproducible and versatile. The PDMS membrane can be micropatterned in order to confine cells or tissues to a specific geometry. The first step is to print micropatterns onto the PDMS membrane with a deep UV technique. The PDMS membrane is then mounted on a mechanical stretcher. A chamber is bound on top of the membrane with biocompatible grease to allow gliding during the stretch. The cells are seeded and allowed to spread for several hours on the micropatterns. The sample can be stretched and unstretched multiple times with the use of a micrometric screw. It takes less than a minute to apply the stretch to its full extent (around 30%). The technique presented here does not include a motorized device, which is necessary for applying repeated stretch cycles quickly and/or computer controlled stretching, but this can be implemented. Stretching of cells or tissue can be of interest for questions related to cell forces, cell response to mechanical stress or tissue morphogenesis. This video presentation will show how to avoid typical problems that might arise when doing this type of seemingly simple experiment.

This manuscript presents a technique to apply or release forces on adherent cells or tissues using unidirectional stretching.

El estiramiento células micropatterned en una membrana de PDMS

Mechanical forces exerted on cells and/or tissues  play a major role in numerous processes. We have developed a device to stretch  cells plated on a ...

Drug-induced Sensitization of Adenylyl Cyclase: Assay Streamlining and Miniaturization for Small Molecule and siRNA Screening Applications

Sensitization of adenylyl cyclase (AC) signaling has been implicated in a variety of neuropsychiatric and neurologic disorders including substance abuse and Parkinson&#39;s disease. Acute activation of G&#945;i/o-linked receptors inhibits AC activity, whereas persistent activation of these receptors results in heterologous sensitization of AC and increased levels of intracellular cAMP. Previous studies have demonstrated that this enhancement of AC responsiveness is observed both in vitro and in vivo following the chronic activation of several types of G&#945;i/o-linked receptors including D2 dopamine and &#956; opioid receptors. Although heterologous sensitization of AC was first reported four decades ago, the mechanism(s) that underlie this phenomenon remain largely unknown. The lack of mechanistic data presumably reflects the complexity involved with this adaptive response, suggesting that nonbiased approaches could aid in identifying the molecular pathways involved in heterologous sensitization of AC. Previous studies have implicated kinase and Gb&#947; signaling as overlapping components that regulate the heterologous sensitization of AC. To identify unique and additional overlapping targets associated with sensitization of AC, the development and validation of a scalable cAMP sensitization assay is required for greater throughput. Previous approaches to study sensitization are generally cumbersome involving continuous cell culture maintenance as well as a complex methodology for measuring cAMP accumulation that involves multiple wash steps. Thus, the development of a robust cell-based assay that can be used for high throughput screening (HTS) in a 384&#160;well format would facilitate future studies. Using two D2 dopamine receptor cellular models (i.e.&#160;CHO-D2L and HEK-AC6/D2L), we have converted our 48-well sensitization assay (&#62;20 steps 4-5 days) to a five-step, single day assay in 384-well format. This new format is amenable to small molecule screening, and we demonstrate that this assay design can also be readily used for reverse transfection of siRNA in anticipation of targeted siRNA library screening.

Persistent activation of inhibitory G protein-coupled receptors results in sensitization of adenylyl cyclase signaling. To identify the essential molecular pathways, nonbiased approaches are necessary; however, this strategy requires the development of a scalable cell-based cAMP sensitization assay. Herein, we describe a sensitization assay for small molecule and siRNA screening.

Inducido por fármacos Sensibilización de adenilciclasa: Racionalización Ensayo y miniaturización de moléculas pequeñas y siRNA aplicaciones de cribado

Sensitization of adenylyl cyclase (AC) signaling has been implicated in a variety of neuropsychiatric and neurologic disorders including substance abuse ...

Gene Transfection toward Spheroid Cells on Micropatterned Culture Plates for Genetically-modified Cell Transplantation

To improve the therapeutic effectiveness of cell transplantation, a transplantation system of genetically modified, injectable spheroids was developed. The cell spheroids are prepared in a culture system on micropatterned plates coated with a thermosensitive polymer. A number of spheroids are formed on the plates, corresponding to the cell adhesion areas of 100 &#181;m diameter that are regularly arrayed in a two-dimensional manner, surrounded by non-adhesive areas that are coated by a polyethylene glycol (PEG) matrix. The spheroids can be easily recovered as a liquid suspension by lowering the temperature of the plates, and their structure is well maintained by passing them through injection needles with a sufficiently large caliber (over 27 G). Genetic modification is achieved by gene transfection using the original non-viral gene carrier, polyplex nanomicelle, which is capable of introducing genes into cells without disrupting the spheroid structure. For primary hepatocyte spheroids transfected with a luciferase-expressing gene, the luciferase is sustainably obtained in transplanted animals, along with preserved hepatocyte function, as indicated by albumin expression. This system can be applied to a variety of cell types including mesenchymal stem cells.

This protocol describes a cell transplantation system using genetically modified, injectable spheroids. Cell spheroids are cultured on micropatterned culture plates and recovered after gene introduction using polyplex nanomicelles. This system facilitates prolonged transgene expression from the transplanted cells in host animals while maintaining the innate function of the cells.

La transfección de genes hacia células Esferoide sobre placas micropatterned Cultura para el trasplante de células genéticamente modificadas

To improve the therapeutic effectiveness of cell transplantation, a transplantation system of genetically modified, injectable spheroids was developed. ...

A Rapid and Quantitative Fluorimetric Method for Protein-Targeting Small Molecule Drug Screening

We demonstrate a new drug screening method for determining the binding affinity of small drug molecules to a target protein by forming fluorescent gold nanoclusters (Au NCs) within the drug-loaded protein, based on the differential fluorescence signal emitted by the Au NCs. Albumin proteins such as human serum albumin (HSA) and bovine serum albumin (BSA) are selected as the model proteins. Four small molecular drugs (e.g., ibuprofen, warfarin, phenytoin, and sulfanilamide) of different binding affinities to the albumin proteins are tested. It was found that the formation rate of fluorescent Au NCs inside the drug loaded albumin protein under denaturing conditions (i.e., 60 &#176;C or in the presence of urea) is slower than that formed in the pristine protein (without drugs). Moreover, the fluorescent intensity of the as-formed NCs is found to be inversely correlated to the binding affinities of these drugs to the albumin proteins. Particularly, the higher the drug-protein binding affinity, the slower the rate of Au NCs formation, and thus a lower fluorescence intensity of the resultant Au NCs is observed. The fluorescence intensity of the resultant Au NCs therefore provides a simple measure of the relative binding strength of different drugs tested. This method is also extendable to measure the specific drug-protein binding constant (KD) by simply varying the drug content preloaded in the protein at a fixed protein concentration. The measured results match well with the values obtained using other prestige but more complicated methods.

A protocol for small molecular drug screening based on in-situ synthesis of ultrasmall fluorescent gold nanoclusters (Au NCs) using drug-loaded protein as template is presented. This method is simple to determine the binding affinity of drugs to a target protein by a visible fluorescent signal emitted from the protein-templated Au NCs.

Una rápida y cuantitativa método fluorimétrico para la proteína-Targeting Pequeña Molécula De Drogas

We demonstrate a new drug screening method for determining the binding affinity of small drug molecules to a target protein by forming fluorescent gold ...

Use of High-Throughput Automated Microbioreactor System for Production of Model IgG1 in CHO Cells

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of experimental conditions while minimizing potential process variability. Applications of this approach include: clone screening, temperature and pH shifts,&#160;media and supplement optimization. Furthermore, the small reactor volumes are conducive to large Design of Experiments that investigate a wide range of conditions. This allows upstream processes to be significantly optimized before scale-up where experimentation is more limited in scope due to time and economic constraints. Automated microscale bioreactor systems offer various advantages over traditional small scale cell culture units, such as shake flasks or spinner flasks. However, during pilot scale process development&#160;significant care must be taken to ensure that these advantages are realized. When run with care, the system can enable high level automation, can be programmed to run DOE&#39;s with a higher number of variables&#160;and can reduce sampling time when integrated with a nutrient analyzer or cell counter. Integration of the expert-derived heuristics presented here, with current automated microscale bioreactor experiments can minimize common pitfalls that hinder meaningful results. In the extreme, failure to adhere to the principles laid out here can lead to equipment damage that requires expensive repairs. Furthermore, the microbioreactor systems have small culture volumes&#160;making characterization of cell culture conditions difficult. The number and amount of samples taken in-process in batch mode culture is limited as operating volumes cannot fall below 10 mL. This method will discuss the benefits and drawbacks of microscale bioreactor systems.

A detailed protocol for the concurrent operation of 48 parallel cell cultures under varied conditions in a microbioreactor system is presented. Cell culture process, harvest and subsequent antibody titer analysis are described.

Microbioreactor uso de alto rendimiento automático para la producción de IgG1 modelo en células CHO

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of ...

Purification and Analytics of a Monoclonal Antibody from Chinese Hamster Ovary Cells Using an Automated Microbioreactor System

Monoclonal antibodies (mAbs) are one of the most popular and well-characterized biological products manufactured today. Most commonly produced using Chinese hamster ovary (CHO) cells, culture and process conditions must be optimized to maximize antibody titers and achieve target quality profiles. Typically, this optimization uses automated microscale bioreactors (15 mL) to screen multiple process conditions in parallel. Optimization criteria include culture performance and the critical quality attributes (CQAs) of the monoclonal antibody (mAb) product, which may impact its efficacy and safety. Culture performance metrics include cell growth and nutrient consumption, while the CQAs include the mAb's N-glycosylation and aggregation profiles, charge variants, and molecular weight. This detailed protocol describes how to purify and subsequently analyze HCCF samples produced by an automated microbioreactor system to gain valuable performance metrics and outputs. First, an automated protein A fast protein liquid chromatography (FPLC) method is used to purify the mAb from harvested cell culture samples. Once concentrated, the glycan profiles are analyzed by mass spectrometry using a specific platform (refer to the Table of Materials). Antibody molecular weights and aggregation profiles are determined using size exclusion chromatography-multiple angle light scattering (SEC-MALS), while charge variants are analyzed using microchip capillary zone electrophoresis (mCZE). In addition to the culture performance metrics captured during the bioreactor process (i.e., culture viability, cell counts, and common metabolites including glutamine, glucose, lactate, and ammonia), spent media is analyzed to identify limiting nutrients to improve the feeding strategies and overall process design. Therefore, a detailed protocol for the absolute quantification of amino acids by liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) of spent media is also described. The methods used in this protocol take advantage of high-throughput platforms that are compatible for large numbers of small-volume samples.

A detailed protocol for the purification and subsequent analysis of a monoclonal antibody from harvested cell culture fluid (HCCF) of automated microbioreactors has been described. Use of analytics to determine critical quality attributes (CQAs) and maximizing limited sample volume to extract vital information is also presented.

Purificación y análisis de un anticuerpo monoclonal de células de ovario de hámster chino utilizando un sistema automatizado de microbiorreactores

Monoclonal antibodies (mAbs) are one of the most popular and well-characterized biological products manufactured today. Most commonly produced using ...

Primary Clarification of CHO Harvested Cell Culture Fluid using an Acoustic Separator

Primary clarification is an essential step in a biomanufacturing process for the initial removal of cells from therapeutic products within the harvested cell culture fluid. While traditional methods like centrifugation or filtration are widely implemented for cell removal, the equipment for these processes have large footprints and operation can involve contamination risks and filter fouling. Additionally, traditional methods may not be ideal for continuous bioprocessing schemes for primary clarification. Thus, an alternate application using acoustic (sound) waves was investigated to continuously separate cells from the cell culture fluid. Presented in this study is a detailed protocol for using a bench-scale acoustic wave separator (AWS) for the primary separation of culture fluid containing a monoclonal IgG1 antibody from a CHO cell bioreactor harvest. Representative data are presented from the AWS and demonstrate how to achieve effective cell clarification and product recovery. Finally, potential applications for AWS in continuous bioprocessing are discussed. Overall, this study provides a practical and general protocol for the implementation of AWS in primary clarification for CHO cell cultures and further describes its application potential in continuous bioprocessing.

Presented here is a protocol for the primary clarification of CHO cell culture using an acoustic separator. This protocol can be used for the primary clarification of shake flask cultures or bioreactor harvests and has the potential application for continuous clarification of the cell bleed material during perfusion bioreactor operations.

Clarificación primaria del fluido de cultivo celular cosechado con CHO utilizando un separador acústico

Primary clarification is an essential step in a biomanufacturing process for the initial removal of cells from therapeutic products within the harvested ...