Agradecemos al Dr. Yves L. Janin por sus fructíferos comentarios y sugerencias. Nos gustaría dar las gracias a HH Gad para CHIK / Ren y C. Combredet por su apoyo técnico. Este trabajo fue apoyado por el Instituto Pasteur, el Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS), el Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM), el Instituto Carnot - Pasteur Maladies infectieuses (STING Programa de POV y HM- L), la Agence Nationale pour la Recherche (ANR-RPIB, Programa de STING 2.0 de POV), y el &quot;Conseil Régional d&#39;Ile-de-France&quot; (Biblioteca Química de proyectos, subvenciones n ° 06-222 I / R y yo 09-1739 / R para HM-L.). El trabajo sobre CHIKV / Ren fue apoyada por los ArbOAS proyecto (donación de ANR 2010-INTB-1601-02).

1. Preparación de placas de 96 pocillos hija con compuestos <ol><li> Mueva placas madre de 96 pocillos que contienen 10 mM de soluciones madre de los compuestos químicos en DMSO de -20 ° C a temperatura ambiente. Diluir compuestos 5x en DMSO para obtener placas de dilución de 96 pocillos intermedios a 2 mM. La dilución se logra con la pipeta 5 l en 20 l de DMSO y la mezcla. </li><li> Pipetear 1 l de placas de dilución en pocillos secos de blanco, de cultivo de tejidos con código de barras placas de 96 pocillos. Este primer conjunto de placas hijas (D1) se puede utilizar para evaluar la toxicidad de los compuestos a una concentración final de 20 mM. Tienda placas hijas a -20 ° C hasta su uso. </li><li> Diluir 1:10 compuestos de nuevo pipeteando 4 l de placas de dilución en 36 l de DMSO y la mezcla. Pipetear 1 l en los pozos secos de color blanco, de fondo plano, cultivo de tejidos con código de barras placas de 96 pocillos. Este segundo conjunto de placas hijas (D2) se utiliza para evaluar la inhibición de la MV replication por los compuestos a una concentración final de 2 mM. Tienda placas hijas a -20 ° C hasta su uso. </li></ol> 2. Preparación de cultivos celulares para determinar la toxicidad Compuesto <ol><li> Se cultivan las células HEK-293T a 37 ° C y 5% de CO2 en medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) con estabilizado L-glutamina y complementado con 10% de suero de ternera fetal (FCS), estreptomicina (100 mg / ml) y penicilina (100 UI / ml). Las células se pasan por tripsinización cada 4-5 días, y se diluyeron 1:10 en un frasco de dulce. Las células deben estar en fase de registro para los experimentos. </li><li> En el día del experimento, recuperar las células por tripsinización y realizar el recuento de células. Precipitar las células por centrifugación y resuspender en 3 x 10 5 células / ml en medio de cultivo. Considere que se requieren 12,5 ml de suspensión de células para cada placa de cribado. </li><li> Células de transferencia a un canal, y prescindir de 100 l de suspensión celular en placas D1 contienen componentes químicos de pinchosunds. Suspensión celular dentro de la cubeta se agita con regularidad para evitar la sedimentación. </li><li> Adicionar de control de los pocillos A1, C1, E1, G1, A12, C12, E12 y G12 con 1 l de DMSO. Pocillos correspondientes se utilizarán como referencia para las células vivas (sin toxicidad). Pico de control de pozos B1, D1, F1, H1, B12, D12, F12 y H12 con 1 l de DMSO y 2,5 l de una solución IGEPAL 0,5% para eliminar las células. Pocillos correspondientes se utilizarán como referencia para las células muertas (de mayor toxicidad). </li><li> Se incuban las células durante 24 horas a 37 ° C y 5% de CO 2. </li></ol> 3. Preparación de cultivos celulares infectados por rMV2/Luc <ol><li> Crecer y recuperar las células como se describe en 2.1 y 2.2. Una vez más, volver a suspender las células en 3 x 10 5 células / ml en medio de cultivo. Considere que se requieren 12,5 ml de suspensión de células para cada placa de cribado. </li><li> Opcional: medio de cultivo con suplemento de uridina en 20 g / ml. Nota: Cuando la selección de bibliotecas químicas para replicatio viraln inhibidores, parece que compuestos dirigidos primeros pasos de la ruta de biosíntesis de pirimidina se aíslan con frecuencia 13,16,27,28. La adición de uridina al medio de cultivo se utiliza para filtrar tales moléculas antivirales. De hecho, esto restaura eficazmente la replicación viral cuando las enzimas de aguas arriba de ruta de biosíntesis de pirimidina están bloqueadas. </li><li> Ahorra 1:10 de la suspensión celular de los pocillos de control con células no infectadas, y proceder a la infección con el volumen restante. </li><li> Descongele el volumen apropiado de la solución madre rMV2/Luc. Soluciones madre de MT son por lo general a 10 -10 6 8 partículas infecciosas por ml. Cultura debe estar infectada con 0,1 partículas infecciosas de rMV2/Luc por las células diana, lo que corresponde a 0,1 multiplicidad de infección (MOI). Nota: rMV2/Luc se deriva de la vacuna MV (cepa Schwarz) y se manipula en un ambiente BSL2. </li><li> Añadir el virus a la suspensión de células y mezclar suavemente. Transferir las células infectadas a un abrevadero, y dispensar 100l de suspensión de células infectadas en las columnas 2 y 11 de las placas D2 contienen compuestos químicos con pinchos. Suspensión celular dentro de la cubeta se mezcla suavemente con regularidad. </li><li> En las columnas 1 y 12, dispense 100 l de células no infectadas una así en dos. Las células infectadas se dispensan en los otros pozos. </li><li> Se incuban las células durante 24 horas a 37 ° C y 5% de CO 2. </li></ol> 4. Medidas luciferasa Actividad y análisis de datos <ol><li> Retire las placas D1 de la incubadora, y determinar la viabilidad celular mediante la adición de 50 l de reactivo de viabilidad basado en luciferasa directamente a los pocillos de cultivo. Mezclar e incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente. Leer las placas con un luminómetro. Tiempo de integración se establece en 100 mseg por pocillo. </li><li> Retire las placas D2 de la incubadora, y determinar la actividad luciferasa mediante la adición de 50 l de sustrato de luciferasa directamente a los pocillos de cultivo. Incubar durante 6 minutos a temperatura ambiente, y la lectura de las placas con un luminómetro como descrilecho por encima. </li><li> Calcular una Z &#39;-factor para cada placa de D1 del ensayo de toxicidad para garantizar la calidad de la pantalla 29. Z &#39;= 1-3 * (σ + + σ-) / (μ + - μ-), donde μ + y + σ corresponden a los medios de luminiscencia y desviaciones estándar para las células HEK-293T con DMSO solo (sin toxicidad), y μ y σ-son medios de luminiscencia y las desviaciones estándar para los pocillos de cultivo tratados con IGEPAL para matar las células. Se espera que Z &#39;para estar por encima de 0,5, o la placa correspondiente se descarta. </li><li> Establecer umbral de toxicidad en μ + / 2. Desechar los compuestos con valores de luminiscencia por debajo de este límite (Figura 3A). </li><li> Calcular una Z &#39;-factor para cada placa de D2 de la ensayo antiviral. Aquí, μ + y + σ corresponden a los medios de luminiscencia y desviaciones estándar para las células infectadas cultivadas con DMSO solo, y μ-y σ-son medios de luminiscencia y desviaciones estándar para las células no infectadas. Una vez más, placas con Z &amp; #39; valores por debajo de 0,5 se descartan. </li><li> Calcular la inhibición de la replicación vírica de la siguiente manera: porcentaje de inhibición = (μ + - actividad de la luciferasa para el compuesto X) / (μ + - μ-) * 100. Ajuste del umbral de inhibición a 75%, y seleccionar los compuestos que reduzcan los valores de luminiscencia por debajo de este límite (Figura 3B) y no son tóxicas según los criterios descritos en el punto 4.4. </li></ol> 5. Pantalla secundaria de la toxicidad y de amplio espectro antiviral Actividad <ol><li> Asegúrese de 1:02 diluciones seriadas de cada golpe compuesto en DMSO, a partir de 500 M a 4 M (8 diluciones). Rellene blanco, placas de cultivo de tejidos con códigos de barras con 50 l de medio de cultivo. Añadir 1 l de cada dilución del compuesto en pocillos de cultivo. Repetir dos veces para tener 3 placas de cultivo con diluciones seriadas por duplicado para cada compuesto hit. </li><li> Preparar 37,5 ml de una suspensión de células HEK-293T en 6 x 10 5 células / ml en medio de cultivo como se describió anteriormente (en 2,1 y 20,2). Dispense 2x 12,5 ml en tubos Falcon e infectar las células, ya sea con rMV2/Luc a MOI = 0,1 o CHIKV recombinante que expresa Renilla luciferasa (CHIKV / Ren) a MOI = 0,2. Mezclar por inversión. Nota: CHIKV / Ren se deriva de una cepa de tipo salvaje de CHIKV y por lo tanto debe ser manipulado en un entorno BSL3. Las placas se pueden mover de NBS3 a BSL1 una vez sustrato de Renilla se ha añadido a los pocillos de cultivo (véase a continuación). </li><li> Dispensar 50 / l de las células infectadas por Ren no infectadas, rMV2/Luc-infected, o CHIKV en placas de cultivo que contienen diluciones en serie de compuestos de ataque. Incubar 24 horas a 37 ° C. </li><li> Añadir 50 l de sustrato de luciferasa de luciérnaga para determinar la actividad luciferasa de luciérnaga en pozos rMV2/Luc-infected. Añadir 50 l de sustrato de luciferasa Renilla para determinar la actividad de la luciferasa de Renilla en CHIKV / pozos infectados por Ren. Finalmente, añadir 50 l de reactivo de ensayo de viabilidad basado en la luciferasa a células no infectadas para determinar la viabilidad celular. </li><li> Datos de gráficos (Figura 4) y determinar las concentraciones de compuestos que inhiben afectadas MV y replicación CHIKV en un 50%. No tenga en cuenta compuesto que muestra cierta toxicidad en este ensayo. </li></ol>

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Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

La tubería de cribado descrito aquí tiene como objetivo seleccionar compuestos con un perfil adecuado como inhibidores de amplio espectro de virus de ARN. Cuando una biblioteca de 10.000 compuestos se rastreó con este protocolo y se aplicaron los criterios de filtrado antes mencionados, es decir, la inhibición de la replicación del MV superior al 75%, 40 compuestos (0,4%) calificó como positivo. Además, aproximadamente la mitad de ellos mostró cierta toxicidad en el ensayo de viabilidad basado en la luc...

Los virus de ARN son responsables de una gran variedad de infecciones humanas, y tienen un gran impacto en las poblaciones de todo el mundo, tanto en términos de salud pública y el coste económico. Vacunas eficaces se han desarrollado contra varios virus de ARN humano, y son ampliamente utilizados como tratamientos profilácticos. Sin embargo, todavía hay una falta crítica de fármacos terapéuticos contra las infecciones de virus de ARN. De hecho, las vacunas eficaces no están disponibles frente a las principales patógenos humanos, tales como el virus del dengue, virus de la hepatitis C o el virus sincitial respiratorio humano (VRSh). Además, los virus de ARN son responsables de la mayoría de las enfermedades emergentes, que han aumentado en frecuencia a causa de los intercambios mundiales y el impacto humano sobre los sistemas ecológicos. Contra esta amenaza que representan los virus ARN, nuestro arsenal terapéutico es muy limitado y relativamente ineficiente 1-3. Las terapias actuales se basan esencialmente en el tipo recombinante I interferones (IFN-α / β) para estimular la inmunidad innata,o la administración de ribavirina. Aunque el modo de acción de este análogo de ribonucleósido es controvertido y probablemente se basa en diversos mecanismos, la inhibición de la IMPDH celular (inosina monofosfato deshidrogenasa), que agota piscinas GTP intracelulares, es claramente esencial 4. La ribavirina, en combinación con pegilado IFN-α, es el principal tratamiento contra el virus de la hepatitis C. Sin embargo, los tratamientos de IFN-α / β y ribavirina son de relativamente poca eficacia in vivo contra la mayoría de los virus de ARN, ya que de manera eficiente contundente IFN-α / β señalización a través de la expresión de factores de virulencia 5 y, a menudo escapar ribavirina 3. Esto sumado al hecho de que el tratamiento con ribavirina está planteando problemas de toxicidad importantes, a pesar de que recientemente se aprobó contra la enfermedad VRSh grave con beneficios controversiales 6. Más recientemente, algunos tratamientos específicos para el virus se han comercializado, en particular, contra el virus de la gripe con el o desarrolloinhibidores de la neuraminidasa f 3. Sin embargo, la gran diversidad y la aparición permanente de los virus de ARN se opone al desarrollo de tratamientos específicos contra cada uno de ellos en un futuro relativamente cercano. En conjunto, esto subraya la necesidad de estrategias eficaces para identificar y desarrollar moléculas antivirales potentes en un futuro próximo. Es trivial decir que un inhibidor de amplio espectro activo frente a un gran panel de virus de ARN podría resolver este problema. Aunque tal molécula sigue siendo el sueño de un virólogo, nuestro conocimiento de los mecanismos de defensa celular y el sistema inmune innato sugieren que existen algunas posibilidades 7,8. Varios laboratorios académicos e industriales están buscando moléculas que estimulan facetas específicas de los mecanismos de defensa celular o rutas metabólicas para embotar la replicación viral. Aunque tales compuestos probablemente mostrar efectos secundarios significativos, tratamientos contra las infecciones virales agudas serán administrarcado desde hace relativamente poco tiempo, lograr que sean aceptables a pesar de cierta toxicidad potencial en el largo plazo. Varias estrategias se han desarrollado para identificar tales moléculas antivirales de amplio espectro. Algunos programas de investigación tienen por objeto la búsqueda de moléculas que se dirigen a las vías de defensa o metabólicas específicas. Esto incluye, por ejemplo, receptores de reconocimiento de patógeno para provocar la expresión de genes antivirales 9 y activar factores antivirales tales como RNaseL 10, maquinaria autofagia para promover la degradación de virus de 11, la síntesis de nucleósido vías 12,13, o cascadas apoptóticas para precipitar la muerte de las células infectadas por virus 14. Otros grupos han desarrollado pantallas fenotípicas que no son objetivo basadas en 13,15-17. En ese caso, las moléculas antivirales son simplemente identifican por su capacidad para bloquear la replicación viral en un sistema celular dado. La suposición general es que un compuesto inhibidor 2-3 virus ARN sin relación tendría un perfil adecuado para una amplia-spectrum molécula antiviral. El modo de acción de los compuestos seleccionados de golpe con un enfoque empírico sólo se determina en un segundo tiempo y, finalmente, puede conducir a la identificación de dianas celulares nuevos de antivirales. Curiosamente, un análisis retrospectivo de los nuevos medicamentos aprobados por la Food and Drug Administration de EE.UU. entre 1999 y 2008 ha puesto de manifiesto que, en general, dichas proyecciones fenotípicas tienden a obtener mejores resultados que los enfoques basados ​​en metas de descubrir drogas 18 de molécula pequeña primero en su clase . La replicación viral en ensayos basados ​​en células de alto rendimiento se determinará a partir de los efectos citopáticos del virus. Las células se infectan y se cultivaron en 96 - o placas de 384 pocillos en presencia de compuestos ensayados. Después de pocos días, las capas celulares se fijaron y se tiñeron con colorantes tales como violeta cristal. Por último, se determina la absorbancia con un lector de placas y los compuestos que inhiben la replicación viral se identifican por su capacidad para conservar capas celulares lado a otrom de virus inducida por efecto citopático. Por otra parte, los efectos citopáticos mediadas por virus que se determina utilizando ensayos estándar de viabilidad como la reducción de MTS. Tales ensayos son altamente manejable y rentable, pero sufren de tres importantes limitaciones. En primer lugar, requieren una combinación virus-célula, donde la replicación viral es citopático en sólo unos pocos días, pero esto no siempre es posible, por lo que exigen enfoques alternativos 19. En segundo lugar, son poco cuantitativa, ya que se basan en una medida indirecta de la replicación viral. Finalmente, los compuestos tóxicos pueden ser calificados como positivos hits, y por lo tanto deben ser eliminados con una pantalla de contador que mide la viabilidad celular. Para superar algunos de estos obstáculos, virus o replicones recombinantes han sido diseñados por la genética inversa para expresar proteínas informadoras, tales como EGFP o luciferasa, desde una unidad de transcripción adicional o en el marco con genes de proteínas virales (algunos ejemplos son 20-23). Cuando estos virus se replican, pr reporterooteins se producen junto con las propias proteínas virales. Esto proporciona un ensayo muy cuantitativo para medir la replicación viral y evaluar la actividad inhibidora de las moléculas candidatas. Esto es particularmente cierto para los virus recombinantes que expresan luciferasa (u otras enzimas capaces de bioluminiscencia) ya que este sistema reportero exhibe un amplio rango dinámico con una alta sensibilidad y prácticamente sin fondo. Además, no hay una fuente de luz de excitación, evitando así la interferencia con fluorescencia compuesto 24. Aquí, nos detalle un protocolo de alto rendimiento para examinar bibliotecas químicas para los inhibidores de amplio espectro de virus de ARN. Los compuestos se ensayan primero en células humanas infectadas con un virus recombinante sarampión (MV) que expresa luciferasa de luciérnaga 25 (rMV2/Luc, la Figura 1, la pantalla principal). MV pertenece a MONONEGAVIRALES orden, y es a menudo considerado como un miembro prototípico de virus de ARN de cadena negativaes. Como tal, MV genoma se utiliza como una plantilla por la polimerasa viral para sintetizar moléculas de ARNm que codifican para las proteínas virales. En la cepa recombinante MV llamado rMV2/Luc, la expresión de luciferasa se ​​expresa a partir de una unidad de transcripción adicional insertado entre los genes P y M (Figura 2A). En paralelo, los compuestos se ensayaron para determinar su toxicidad en células humanas utilizando un reactivo basado en luciferasa comercial que evalúa, mediante la cuantificación de ATP, el número de células metabólicamente activas en el cultivo (Figura 1, la pantalla principal). Bibliotecas químicas enteras pueden ser fácilmente evaluados con estos dos ensayos con el fin de seleccionar compuestos que no son tóxicos y bloquean eficazmente la replicación del MV. Luego, los golpes se volvieron a ensayar para la inhibición dosis-respuesta de la replicación del MV, la falta de toxicidad, así como por su capacidad de alterar el virus Chikungunya (CHIKV) replicación (Figura 1, la pantalla secundaria). CHIKV es un miembro de la familia Togaviridae y su genoma es apositive molécula de una sola cadena de ARN. Como tal, es completamente no relacionado con el sarampión y compuestos que inhiben tanto MV y CHIKV destacan una gran oportunidad para inhibir un gran panel de los virus ARN. Proteínas no estructurales CHIKV se traducen directamente desde el genoma viral, mientras que las proteínas estructurales son codificadas por la transcripción y traducción de una molécula de ARNm subgenómico. Nuestro ensayo de replicación in vitro para CHIKV se basa en una cepa recombinante llamado CHIKV / Ren, que expresa enzima luciferasa de Renilla como una parte escindida de la poliproteína no estructural a través de una inserción del gen reportero entre nsP3 y nsP4 secuencias 26 (Figura 2B). La medida de la actividad de luciferasa de Renilla permite la monitorización de la replicación viral en la primera etapa del ciclo de vida CHIKV. Este protocolo de alto rendimiento se utiliza para identificar de forma rápida los compuestos con un perfil adecuado de antivirales de amplio espectro en una biblioteca comercial de 10.000 molecdulos enriquecida por la diversidad química. Los compuestos fueron esencialmente siguiendo la regla del cinco de Lipinski, con pesos moleculares que van desde 250 hasta 600 daltons, y registrar valores de D por debajo de 5. La mayoría de estas moléculas eran nuevas entidades químicas que no están disponibles en otras bibliotecas comerciales.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="756">
	<colgroup>
		<col />
		<col /> 
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Freedom EVO platform</td>
			<td style="width:105px;">TECAN</td>
			<td style="width:119px;"> </td>
			<td style="width:316px;">Robotic platform</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">96-Well Polystyrene Cell Culture Microplates, White</td>
			<td style="width:105px;">Greiner Bio One</td>
			<td style="width:119px;">655083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay</td>
			<td style="width:105px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">G7570</td>
			<td>Luciferase-based viability assay</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Bright-Glo Luciferase Assay System</td>
			<td style="width:105px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">E2610</td>
			<td>Reagent containing firefly luciferase substrate</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Renilla-Glo Luciferase Assay System</td>
			<td style="width:105px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">E2710</td>
			<td>Reagent containing Renilla luciferase substrate</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Britelite plus Reporter Gene Assay System</td>
			<td style="width:105px;">Perkin-Elmer</td>
			<td style="width:119px;">6016761</td>
			<td style="width:316px;">Reagent containing firefly luciferase substrate. Can be used as an alternative to Brigh-Glo reagent to determine luciferase activity</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput screening for broad-spectrum chemical inhibitors of rna viruses

Los virus de ARN son los responsables de las principales enfermedades humanas como la gripe, la bronquitis, el dengue, la hepatitis C o el sarampión. También representan una amenaza emergente debido al aumento de los intercambios en todo el mundo y las poblaciones humanas que penetran en los ecosistemas cada vez más naturales. Un buen ejemplo de una situación tan emergente es epidemias de virus chikungunya de 2005-2006 en el Océano Índico. Avances recientes en nuestra comprensión de las vías celulares que controlan la replicación viral sugieren que los compuestos destinados a funciones de la célula huésped, más que el propio virus, podrían inhibir un gran panel de virus de ARN. Algunos compuestos antivirales de amplio espectro han sido identificados con ensayos orientados a objetivos de acogida. Sin embargo, la medición de la inhibición de la replicación viral en cultivos celulares utilizando la reducción de los efectos citopáticos como una lectura todavía representa una estrategia de cribado de suma importancia. Tales pantallas funcionales se han mejorado en gran medida por el desarrollo de los virus recombinantes que expresan reportero enzimas CAPable de bioluminiscencia tal como luciferasa. En el presente informe, detallamos una tubería cribado de alto rendimiento, que combina el sarampión recombinantes y virus chikungunya con ensayos de viabilidad celular, para identificar compuestos con un perfil antiviral de amplio espectro.

Esta tubería de detección se basa en primer lugar en la selección de compuestos que inhiben la replicación de MV y no muestran ninguna toxicidad celular significativa (figura 1, la pantalla principal). Se aprovecha de ensayos basados ​​en la luciferasa para determinar la toxicidad celular y la inhibición de la replicación viral. Todos los pasos de pipeteado y la adquisición de datos se puede realizar en un entorno de alto rendimiento con una plataforma robótica. ...

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High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

En ensayos in vitro para medir la replicación del virus se han mejorado en gran medida por el desarrollo de virus de ARN recombinantes que expresan luciferasa u otras enzimas capaces de bioluminiscencia. A continuación te detallamos una tubería de cribado de alto rendimiento que combina dichas cepas recombinantes de virus del sarampión y chikungunya para aislar a los antivirales de amplio espectro de bibliotecas químicas.

Screening de alto rendimiento para los de amplio espectro químico Inhibidores de Virus ARN

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

high-throughput-screening-for-broad-spectrum-chemical-inhibitors-rna

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.6K vistas.  Institut Pasteur, CNRS UMR3569.  En ensayos in vitro para medir la replicación del virus se han mejorado en gran medida por el desarrollo de virus de ARN recombinantes que expresan luciferasa u otras enzimas capaces de bioluminiscencia. A continuación te detallamos una tubería de cribado de alto rendimiento que combina dichas cepas recombinantes de virus del sarampión y chikungunya para aislar a los antivirales de amplio espectro de bibliotecas químicas. 

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Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Cancer immunotherapy can harness the specificity of immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT) based on the adoptive transfer of T cells genetically modified to express a chimeric antigen receptor (CAR) has shown considerable promise in clinical trials1-4. There are several advantages to using CAR+ T cells for the treatment of cancers including the ability to target non-MHC restricted antigens and to functionalize the T cells for optimal survival, homing and persistence within the host; and finally to induce apoptosis of CAR+ T cells in the event of host toxicity5.
Delineating the optimal functions of CAR+ T cells associated with clinical benefit is essential for designing the next generation of clinical trials. Recent advances in live animal imaging like multiphoton microscopy have revolutionized the study of immune cell function in vivo6,7. While these studies have advanced our understanding of T-cell functions in vivo, T-cell based ACT in clinical trials requires the need to link molecular and functional features of T-cell preparations pre-infusion with clinical efficacy post-infusion, by utilizing in vitro assays monitoring T-cell functions like, cytotoxicity and cytokine secretion. Standard flow-cytometry based assays have been developed that determine the overall functioning of populations of T cells at the single-cell level but these are not suitable for monitoring conjugate formation and lifetimes or the ability of the same cell to kill multiple targets8.
Microfabricated arrays designed in biocompatible polymers like polydimethylsiloxane (PDMS) are a particularly attractive method to spatially confine effectors and targets in small volumes9. In combination with automated time-lapse fluorescence microscopy, thousands of effector-target interactions can be monitored simultaneously by imaging individual wells of a nanowell array. We present here a high-throughput methodology for monitoring T-cell mediated cytotoxicity at the single-cell level that can be broadly applied to studying the cytolytic functionality of T cells.

We describe a single-cell high-throughput assay to measure cytotoxicity of T cells when incubated with tumor target cells. This method employs a dense, elastomeric array of sub-nanoliter wells (~100,000 wells/array) to spatially confine the T cells and target cells at defined ratios and is coupled to fluorescence microscopy to monitor effector-target conjugation and subsequent apoptosis.

Cuantitativo de alto rendimiento de una sola célula de ensayo de citotoxicidad de las células T

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

Investigación

Inmunología e Infección

A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since several decades, the sudden burst of multi- and extensively-drug resistant strains is a serious threat for the control of tuberculosis. Therefore, it is essential to identify new targets and pathways critical for the causative agent of the tuberculosis, Mycobacterium tuberculosis (Mtb) and to search for novel chemicals that could become TB drugs. One approach is to set&#160;up methods suitable for the genetic and chemical screens of large scale libraries enabling the search of a needle in a haystack. To this end, we developed a phenotypic assay relying on the detection of fluorescently labeled Mtb within fluorescently labeled host&#160;cells using automated confocal microscopy. This in vitro assay allows an image based quantification of the colonization process of Mtb&#160;into the host and was optimized for the 384-well microplate format, which is proper for screens of siRNA-, chemical compound- or Mtb mutant-libraries. The images are then processed for multiparametric analysis, which provides read&#160;out inferring on the pathogenesis of Mtb&#160;within host cells.

Here, we describe a phenotypic assay applicable to the High-throughput/High-content screens of small-interfering synthetic RNA (siRNA), chemical compound, and Mycobacterium tuberculosis mutant libraries. This method relies on the detection of fluorescently labeled Mycobacterium tuberculosis within fluorescently labeled host&#160;cell using automated confocal microscopy.

Un Ensayo Fenotípico Microscópico Para La Cuantificación De Micobacterias Intracelulares Adaptadas Para La Detección De Alto Rendimiento / Alto Contenido

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since ...

Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify new compounds that can inhibit infection by the common drug resistant HIV-1 strains with minimal toxicity. Here we describe an efficient assay that can be used to rapidly determine the cellular cytotoxicity and efficacy of a compound against WT and mutant viral strains.
The desired target cell line is seeded in a 96-well plate and, after a 24 hr incubation, serially dilutions of the compounds to be tested are added. No further manipulations are necessary for cellular cytotoxicity assays; for anti HIV assays a predetermined amount of either a WT or drug resistant HIV-1 vector that expresses luciferase is added to the cells. Cytotoxicity is measured by using an ATP dependent luminescence assay and the impact of the compounds on infectivity is measured by determining the amount of luciferase in the presence or the absence of the putative inhibitors.
This screening assay takes 4 days to complete and multiple compounds can be screened in parallel. Compounds are screened in triplicate and the data are normalized to the infectivity/ATP levels in absence of target compounds. This technique provides a quick and accurate measurement of the efficacy and toxicity of potential anti HIV compounds.

Here we describe cellular cytotoxicity and single round infectivity assays that allow for the rapid and accurate screening of compounds to determine their cellular cytotoxicity (CC50) and IC50 values against WT and drug resistant HIV-1.

Detección rápida de la transcriptasa inversa del VIH y inhibidores de la integrasa

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify ...

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

RNA or DNA folded in stable tridimensional folding are interesting targets in the development of antitumor or antiviral drugs. In the case of HIV-1, viral proteins involved in the regulation of the virus activity recognize several nucleic acids. The nucleocapsid protein NCp7 (NC) is a key protein regulating several processes during virus replication. NC is in fact a chaperone destabilizing the secondary structures of RNA and DNA and facilitating their annealing. The inactivation of NC is a new approach and an interesting target for anti-HIV therapy. The Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) assay was developed to identify molecules able to inhibit the melting and annealing of RNA and DNA folded in thermodynamically stable tridimensional conformations, such as hairpin structures of TAR and cTAR elements of HIV, by the nucleocapsid protein of HIV-1. The new assay employs either the recombinant or the synthetic protein, and oligonucleotides without the need of their previous labeling. The analysis of the results is achieved by standard polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) followed by conventional nucleic acid staining. The protocol reported in this work describes how to perform the NAME assay with the full-length protein or its truncated version lacking the basic N-terminal domain, both competent as nucleic acids chaperones, and how to assess the inhibition of NC chaperone activity by a threading intercalator. Moreover, NAME can be performed in two different modes, useful to obtain indications on the putative mechanism of action of the identified NC inhibitors.

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis NAME Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

This protocol describes NAME, an assay that allows the rapid identification of molecules able to inhibit in vitro the chaperone activities of HIV-1 nucleocapsid protein.

El recocido mediada nucleocápside electroforesis (NOMBRE) ensayo permite la identificación rápida del VIH-1 inhibidores de la nucleocápside

RNA or DNA folded in stable tridimensional folding are interesting targets in the development of antitumor or antiviral drugs. In the case of HIV-1, viral ...

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Brucella species are facultative intracellular pathogens that infect animals as their natural hosts. Transmission to humans is most commonly caused by direct contact with infected animals or by ingestion of contaminated food and can lead to severe chronic infections.
Brucella can invade professional and non-professional phagocytic cells and replicates within endoplasmic reticulum (ER)-derived vacuoles. The host factors required for Brucella entry into host cells, avoidance of lysosomal degradation, and replication in the ER-like compartment remain largely unknown. Here we describe two assays to identify host factors involved in Brucella entry and replication in HeLa cells. The protocols describe the use of RNA interference, while alternative screening methods could be applied. The assays are based on the detection of fluorescently labeled bacteria in fluorescently labeled host cells using automated wide-field microscopy. The fluorescent images are analyzed using a standardized image analysis pipeline in CellProfiler which allows single cell-based infection scoring.
In the endpoint assay, intracellular replication is measured two days after infection. This allows bacteria to traffic to their replicative niche where proliferation is initiated around 12 hr after bacterial entry. Brucella which have successfully established an intracellular niche will thus have strongly proliferated inside host cells. Since intracellular bacteria will greatly outnumber individual extracellular or intracellular non-replicative bacteria, a strain constitutively expressing GFP can be used. The strong GFP signal is then used to identify infected cells.
In contrast, for the entry assay it is essential to differentiate between intracellular and extracellular bacteria. Here, a strain encoding for a tetracycline-inducible GFP is used. Induction of GFP with simultaneous inactivation of extracellular bacteria by gentamicin enables the differentiation between intracellular and extracellular bacteria based on the GFP signal, with only intracellular bacteria being able to express GFP. This allows the robust detection of single intracellular bacteria before intracellular proliferation is initiated.

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Two assays for microscopy-based high-throughput screening of host factors involved in Brucella infection are described. The entry assay detects host factors required for Brucella entry and the endpoint assay those required for intracellular replication. While applicable for alternative approaches, siRNA screening in HeLa cells is used to illustrate the protocols.

Los ensayos basados ​​en la microscopía para la selección de alto rendimiento de los factores del huésped que participan en<em&gt; Brucella</em&gt; Infección de células Hela

Brucella species are facultative intracellular pathogens that infect animals as their natural hosts. Transmission to humans is most commonly caused by ...

A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or cellular processes. With the advancement of biotechnologies and the high translational potential of small molecules, a number of innovative approaches in drug discovery have evolved, which explains the resurgent interest in the use of HTS. The oncology field is currently the most active research area for drug screening, with no major breakthrough made for the identification of new immunomodulatory compounds targeting transplantation-related complications or autoimmune ailments. Here, we present a novel in vitro murine fluorescent-based lymphocyte assay easily adapted for the identification of new immunomodulatory compounds. This assay uses T or B cells derived from a transgenic mouse, in which the Nur77 promoter drives GFP expression upon T- or B-cell receptor stimulation. As the GFP intensity reflects the activation/transcriptional activity of the target cell, our assay defines a novel tool to study the effect of given compound(s) on cellular/biological responses. For instance, a primary screening was performed using 4,398 compounds in the absence of a &#34;target hypothesis&#34;, which led to the identification of 160 potential hits displaying immunomodulatory activities. Thus, the use of this assay is suitable for drug discovery programs exploring large chemical libraries prior to further in vitro/in vivo validation studies.

We present in the current study a novel fluorescence-based assay using lymphocytes derived from a transgenic mouse. This assay is suitable for high-throughput screening (HTS) of small molecules endowed with the capacity of either inhibiting or promoting lymphocyte activation.

Una de linfocitos ensayo basado en la fluorescencia adecuado para el cribado de alto rendimiento de pequeñas moléculas

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or ...

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread of multi drug-resistant TB (MDR-TB), there is a real urgency to develop new therapeutic strategies against M. tuberculosis infections. Traditionally, compounds are evaluated based on their antibacterial activity under in vitro growth conditions in broth; however, results are often misleading for intracellular pathogens like M. tuberculosis since in-broth phenotypic screening conditions are significantly different from the actual disease conditions within the human body. Screening for inhibitors that work inside macrophages has been traditionally difficult due to the complexity, variability in infection, and slow replication rate of M. tuberculosis. In this study, we report a new approach to rapidly assess the effectiveness of compounds on the viability of M. tuberculosis in a macrophage infection model. Using a combination of a cytotoxicity assay and an in-broth M. tuberculosis viability assay, we were able to create a screening system that generates a comprehensive analysis of compounds of interest. This system is capable of producing quantitative data at a low cost that is within reach of most labs and yet is highly scalable to fit large industrial settings.

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

We have developed a modular high-throughput screening system for discovering novel compounds against Mycobacterium tuberculosis, targeting intracellular and in-broth growing bacteria as well as cytotoxicity against the mammalian host cell.

Sistema para la eficacia y la citotoxicidad de detección de inhibidores de focalización intracelular<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread ...

A High-throughput Cre-Lox Activated Viral Membrane Fusion Assay to Identify Inhibitors of HIV-1 Viral Membrane Fusion

This assay is designed to specifically report on HIV-1 fusion via the expression of green fluorescent protein (GFP) detectable by flow cytometry or fluorescence microscopy. An HIV-1 reporter virus (HIV-1 Gag-iCre) is generated by inserting Cre recombinase into the HIV-1 genome between the matrix and the capsid proteins of the Gag polyprotein. This results in a packaging of Cre recombinase into virus particles, which is then released into a target cell line stably expressing a Cre recombinase-activated red fluorescent protein (RFP) to GFP switch cassette. In the basal state, this cassette expresses RFP only. Following the delivery of Cre recombinase into the target cell, the RFP, flanked by loxP sites, excises, resulting in GFP expression. This assay can be used to test any inhibitors of viral entry (specifically at the fusion step) in cell-free and cell-to-cell infection systems and has been used to identify a class of purinergic receptor antagonists as novel inhibitors of HIV-1 viral membrane fusion.

We describe a cell-based assay to report on HIV-1 fusion via the expression of green fluorescent protein detectable by flow cytometry or fluorescence microscopy. It can be used to test inhibitors of viral entry (specifically at the fusion step) in cell-free and cell-to-cell infection systems.

Un alto rendimiento Cre-Lox activado análisis de fusión de la membrana Viral para identificar inhibidores de la fusión de la membrana Viral VIH-1

This assay is designed to specifically report on HIV-1 fusion via the expression of green fluorescent protein (GFP) detectable by flow cytometry or ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella spp./Shigella spp. The gold standard method for the detection of Salmonella spp./Shigella spp. is direct culture but this is labor-intensive and time-consuming. Here, we describe a high-throughput platform for Salmonella spp./Shigella spp. screening, using real-time polymerase chain reaction (PCR) combined with guided culture. There are two major stages: real-time PCR and the guided culture. For the first stage (real-time PCR), we explain each step of the method: sample collection, pre-enrichment, DNA extraction and real-time PCR. If the real-time PCR result is positive, then the second stage (guided culture) is performed: selective culture, biochemical identification and serological characterization. We also illustrate representative results generated from it. The protocol described here would be a valuable platform for the rapid, specific, sensitive and high-throughput screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Salmonella spp./Shigella spp. are common pathogens attributed to diarrhea. Here, we describe a high-throughput platform for the screening of Salmonella spp./Shigella spp. using real-time PCR combined with guided culture.

Una plataforma de alto rendimiento para la detección de Salmonella spp. /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

High-throughput Screening of Chemical Compounds to Elucidate Their Effects on Bacterial Persistence

Bacterial persisters are defined as a small subpopulation of phenotypic variants with the capability of tolerating high concentrations of antibiotics. They are an important health concern as they have been associated with recurrent chronic infections. Although stochastic and deterministic dynamics of stress-related mechanisms are known to play a significant role in persistence, mechanisms underlying the phenotypic switch to/from the persistence state are not completely understood. While persistence factors triggered by environmental signals (e.g., depletion of carbon, nitrogen and oxygen sources) have been extensively studied, the impacts of osmolytes on persistence are yet to be determined. Using microarrays (i.e., 96 well plates containing various chemicals), we have designed an approach to elucidate the effects of various osmolytes on Escherichia coli persistence in a high throughput manner. This approach is transformative as it can be readily adapted for other screening arrays, such as drug panels and gene knockout libraries.

In this method paper, we present a high-throughput screening strategy to identify chemical compounds, such as osmolytes, that have a significant impact on bacterial persistence.

Detección de alto rendimiento de compuestos químicos para dilucidar sus efectos sobre la persistencia bacteriana

Bacterial persisters are defined as a small subpopulation of phenotypic variants with the capability of tolerating high concentrations of antibiotics. ...