Este método proporciona una plataforma de alto rendimiento para el cribado de Salmonella y Shigella. La principal ventaja de esta técnica es repetir, específica, sensible y de alto rendimiento. Esta técnica combina el método rápido NAAT y el cultivo en el que primero se aplicó el cribado de PCR en tiempo real, y luego se enviaron positivos para el cultivo y la identificación de bacterias.
Aunque este método se centra en el cribado de Salmonella y Shigella, también se puede aplicar a otros patógenos como Vibrios, Staphylococcus, E.coli y et cetera. La demostración visual de este método es crítica ya que la selección de la colonia correcta es difícil debido a la flora de fondo en las muestras. Para comenzar, agregue tres mililitros de caldo de nutrientes a cada muestra.
Luego, incuba las muestras a 36 grados centígrados durante seis horas. Después de esto, centrifugar el cultivo de pre-enriquecimiento a 800 gs durante dos minutos. Luego, transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo, y centrifugarlo de nuevo durante cinco minutos a 12.000 gs.
Después de desechar el sobrenadante, añadir 100 microlitros de solución de extracción de ADN al pellet. Luego, vórtice el tubo durante un minuto. A continuación, calienta la muestra a 1.000 grados Centígrados en el baño seco.
Después de repetir la centrifugación, recoger el sobrenadante en un tubo nuevo. En primer lugar, cree la mezcla de reacción y establezca el programa de ciclismo de acuerdo con el protocolo de texto. A continuación, realice PCR en tiempo real en una máquina de PCR fluorescente en tiempo real.
En primer lugar, añadir 100 microlitros del cultivo de pre-enriquecimiento a cinco mililitros de medio cristal de selenita. Luego, incubar el cultivo a 36 grados centígrados durante 18 a 24 horas. A continuación, recoja un bucle de la cultura y extiéndalo en un plato.
Luego, incuba la placa a 36 grados Celsius durante 18 a 24 horas. Después de la incubación, seleccione colonias sospechosas y transfieralas a un plato. Incubar la placa a 36 grados centígrados durante 18 a 24 horas.
A continuación, identifique la colonia sospechosa utilizando un sistema automatizado de identificación microbiana. Para comenzar la caracterización del antígeno O, agregue una gota de los sueros polivalentes del antígeno O a una diapositiva limpia. Transfiera un bucle de la colonia al tobogán y muele en el suero.
Si las bacterias parecen arena que fluye, repita el tratamiento previo con sueros monovalentes de antígeno O hasta que se caracterice el antígeno. Para comenzar la caracterización del antígeno H, agregue una gota de sueros polivalentes de antígeno H a una diapositiva limpia. Luego, recoge un bucle lleno de la colonia y la encuadría en el suero.
Utilice sueros monovalentes de antígeno H para repetir el tratamiento hasta que se caracterice el antígeno H específico. Para separar la cultura, recoja un bucle de la cultura de pre-enriquecimiento y extiéndalo en un plato. Luego, incuba el lugar a 36 grados centígrados durante 18 a 24 horas.
Después de la incubación, recoger una colonia de aspecto sospechoso en un plato. Incubar la placa a 36 grados centígrados durante 17 a 24 horas. A continuación, someta la colonia a una identificación bioquímica mediante un sistema automatizado de identificación microbiana.
A continuación, aplica una gota de sueros polivalentes de la especie Shigella a un portaobjetos limpio. Luego, usa un micro-loop para recoger algunas de las bacterias y moler en el suero. Finalmente, si los sueros se asemejan a la arena que fluye, utilice sueros monovalentes de especies de Shigella para caracterizar aún más las bacterias.
Utilizando este protocolo, se examinaron muestras de heces de pacientes para detectar especies de Salmonella y Shigella. Utilizando PCR en tiempo real, hubo una amplificación exitosa en el canal HEX, lo que indica que la muestra fue positiva para las especies de Salmonella. La PCR adicional en tiempo real indicó que la muestra dos era positiva para Salmonella y fue elegida para el cultivo guiado de especies de Salmonella.
En el cultivo guiado de las especies de Salmonella, las colonias rosadas y púrpuras fueron chapadas por separado y sometidas a identificación bioquímica. Los resultados indicaron que las colonias de la muestra dos eran Salmonella paratyphi B.Utilizando PCR en tiempo real, hubo amplificación exitosa en el canal FAM, lo que indica que la muestra era positiva para las especies de Shigella. La PCR adicional en tiempo real indicó que la muestra 10 era positiva para Shigella y fue elegida para la cultura guiada.
En el cultivo guiado de las especies Shigella, las colonias de color rojo rosa-rojo e incoloro fueron chapadas por separado y sometidas a identificación bioquímica. Los resultados indicaron que la muestra 10 contenía la bacteria Shigella sonnei fase II. Al intentar este procedimiento, es importante recordar la limitación del método debido a la variación de la secuencia.
Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la referencia cultural directa, para evitar falsos resultados negativos de PCR en tiempo real. Esta técnica allana el camino para los investigadores en el campo de la detección de Salmonella y Shigella, ya que el nuevo protocolo podría aumentar la tasa positiva en dos y disminuir la carga de trabajo y TAT significativamente. No olvide que trabajar con Salmonella y Shigella puede ser extremadamente peligroso, y el equipo de protección personal, EPP, siempre debe tomarse mientras se realiza este procedimiento.
