El protocolo descrito aquí permite identificar las condiciones que pueden afectar significativamente la persistencia bacteriana de una manera de alto rendimiento. Este método es fácilmente adaptable a la detección de varias áreas, tales como paneles de medicamentos, bibliotecas de genes y más. Como el método incluye varios pasos secundarios, que deben llevarse a cabo simultáneamente, la demostración visual puede ayudar a los investigadores a administrar su tiempo para obtener resultados precisos.
Comience por preparar cultivos celulares de microarrays. Transfiera 250 microlitros de células de fase exponencial a 25 mililitros de medio LB fresco modificado en un tubo centrífuga de 50 mililitros. Luego mezcle suavemente la suspensión celular para que sea homogénea.
Transfiera la suspensión de celda diluida a un depósito estéril de 50 mililitros. Usando una pipeta multicanal, transfiera 150 microlitros de la suspensión celular a cada pozo de una placa de microarray que contenga varios productos químicos. Los microarrays también se pueden generar manualmente siguiendo el método descrito en el manuscrito del texto.
Cubra la placa de microarrays con una membrana de techo permeable al gas e incubarla en una coctelera orbital a 37 grados Celsius y 250 RPM durante 24 horas. Para hacer placas de ensayo persistentes, prepare 25 mililitros de medio LB modificado que contenga cinco microgramos por mililitro de Ofloxacina en un tubo centrífugo de 50 mililitros y transfiera este medio a un depósito estéril. Transfiera 190 microlitros del medio LB modificado a cada pozo de una placa genérica de fondo plano de 96 pozos.
Después de la incubación de 24 horas, retire el microarray de la coctelera y transfiera 10 microlitros de cultivos celulares del microarray a los pozos de la placa de ensayo persistente que contiene el medio LB modificado con Ofloxacina. Tome 10 microlitros de suspensiones celulares de la placa de ensayo persistente y diluya en serie tres veces en 290 microlitros de solución PBS usando una placa redonda inferior de 96 pozos y una pipeta multicanal. A continuación, detecte 10 microlitros de todas las suspensiones celulares diluidas en serie en placas de agar fresco libres de antibióticos.
Cubra la placa de ensayo persistente con una membrana de techo permeable al gas e incubarla en una coctelera orbital a 37 grados Celsius y 250 RPM durante seis horas. Después de la incubación de seis horas, repita la dilución en serie y la manchado en placas de agar. Incubar las placas de agar durante 16 horas a 37 grados centígrados.
A continuación, cuente las unidades formantes de colonias o UFC. Utilice los niveles de UFC antes y seis horas después del tratamiento antibiótico para calcular la fracción persistente en cada pozo. Los recuentos de UFC antes del tratamiento con OFX también ayudan a evaluar los efectos de los osmolitos sobre la viabilidad de e coli.
Transfiera 250 microlitros de células de fase exponencial a 25 mililitros de medio LB fresco modificado que contiene la osmolita identificada a partir del cribado de microarrays. Incubar el matraz en una coctelera orbital a 250 RPM y 37 grados Centígrados durante 24 horas. Después de 24 horas, retire el matraz de la coctelera y transfiera 250 microlitros del cultivo celular a 25 mililitros de medio LB fresco modificado en un matraz desconcertado de 250 mililitros.
Añadir 25 microlitros de solución madre de Ofloxacina a la suspensión celular y agitar el matraz suavemente para que el cultivo ensayado sea homogéneo. Incubar el matraz en una coctelera a 37 grados centígrados y 250 RPM. A cada hora durante el tratamiento, incluido un punto de tiempo antes de la adición de Ofloxacina, transfiera un mililitro del cultivo de ensayo del matraz a un tubo de micro centrífuga de 1,5 mililitros y centrífugalo a 17,000 veces G durante tres minutos.
Retire 950 microlitros de sobrenadante y lave las células tres veces con 950 microlitros de PBS. Después del lavado final, vuelva a suspender el pellet celular en 100 microlitros de solución de PBS. Tome 10 microlitros de la suspensión celular y diluya en serie seis veces con 90 microlitros de PBS dentro de una placa inferior redonda de 96 pozos.
Detecte 10 microlitros de las suspensiones de células diluidas en una placa de agar libre de antibióticos. Para aumentar el límite de detección, platee los 90 microlitros restantes de suspensión celular en una placa de agar fresco. Incubar las placas a 37 grados Centígrados durante 16 horas, luego contar las UFC.
Una imagen representativa de las placas de agar usadas para determinar niveles de CFU de cultivos celulares antes y después del tratamiento de OFX se muestra aquí. La primera columna es el grupo de control. La segunda columna tiene células que se cultivaron en nitrato de sodio de 100 milimolares y la tercera columna contiene células que se cultivaron en nitrato de sodio de 60 milimolares.
Para simplificar, sólo dos osmolitos se centran en aquí. Aquí se muestra una representación gráfica de los datos de la UFC de las placas y fracciones persistentes de los cultivos celulares probados en 96 placas de pozos. Para calcular las fracciones, las cuentas persistentes fueron normalizadas a las cuentas de célula obtenidas antes del tratamiento antibiótico.
Para generar curvas de muerte porfásicas, las células se cultivaron en 25 mililitros de medio LB modificado con los osmolitos indicados y frascos desconcertados durante 24 horas, luego se transfirieron a frascos de ensayo persistentes para la enumeración persistente. Al intentar este protocolo, tenga en cuenta que la detección de las células en la placa de agar es intensiva en mano de obra y requiere enfoque. Un error durante el paso puede conducir a la contaminación cruzada entre las condiciones que se están probando.
Por lo tanto, es importante practicar la detección de múltiples muestras simultáneamente antes del experimento. Siguiendo este protocolo, los paneles de fármacos y las bibliotecas de células mutantes pueden ser examinados para estudiar los impactos en la persistencia. Con esta investigación, hemos identificado un número de osmolitos y de condiciones del PS que tengan un impacto significativo en persistencia bacteriana.
