Estos asuntos pueden ayudar a responder preguntas clave en la investigación sobre el VIH/SIDA, como el mecanismo molecular y el pronóstico de la infección por el VIH, y cómo y dónde se establece el reservorio de latencia. La ventaja de esta técnica es que no es invasiva, y estableció un hu-NSG ratones que deben tratar un desarrollo multilínea sobre células madre humanas trasplantadas que son susceptibles a la infección por VIH y son receptivas al CART. Comience filtrando una muestra digerida, humana, fetal, de lodo, a través de una muestra estéril de 70 micrómetros, nylon, malla para obtener una suspensión de una sola célula, y enriquecer para CD34+ HSCs mediante la clasificación de células activadas magnéticas de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Después de contar, vuelva a suspender el HSC en una concentración de dos veces-diez-a-seventh células viables por mililitro en DPBS fresco en hielo. A continuación, coloque toda una camada de ratón noD/SCID/gamma o NSG humana neonatal en una jaula de irradiación estéril, en forma de pastel, y trate a los animales con 200 a 250 centígrados de rayos gamma de una fuente de radiación de cesio-137. A continuación, cargue las células en una jeringa de 50 microlitro de 50 microlitros de Hamilton 80508 equipada con una aguja de calibre 30 e inyecte a cada animal neonatal directamente en el hígado con cinco veces diez a la quinta CD34+HSC humano viable y 25 microlitros de DPBS.
De diez a doce semanas después de la infección, girar retro-orbital, periférico, muestras de sangre de cada ratón por centrifugación, y transferir los supernatos de plasma a tubos de microcentrífuga para un almacenamiento negativo de 80 grados Celsius según sea experimentalmente apropiado. Para la validación de injertos de HSC, vuelva a suspender los gránulos con 200 microlitros de tampón de lysis de glóbulos rojos, y tire de las suspensiones celulares en un tubo de microcentrífuga de 1,5 milímetros para una incubación de diez minutos a temperatura ambiente. Luego recoja los glóbulos blancos restantes por centrifugación para dos lavados en 0.5 mililitros de albúmina sérica fresca, 0.01 por ciento bovino, o BSA, en DPBS por lavado.
Después del segundo lavado, bloquee las células con 100 microlitros de cóctel de bloqueo durante veinte minutos a 4 grados Centígrados seguidos de etiquetado con el cóctel anticuo adecuado de interés a 2 microlitros de anticuos por concentración de una a la sexta célula. Después de 30 minutos a 4 grados celsius, lave las células dos veces en DPBS fresco más BSA, y evalúe las muestras de sangre periférica por citometría de flujo de acuerdo con los protocolos estándar para cuantificar el porcentaje de células CD45+CD3+CD14+ o CD19+ humanas por muestra. A continuación, calcule la relación de las células CD4+a CD8+T y evalúe la carga viral en las muestras de plasma de acuerdo con los protocolos estándar, cuantitativos, transcriptasa inversa, PCR.
Para evaluar los efectos de la infección por el VIH, entregue el virus de las pacas del VIH a ratones sin garantía fúngica, humanos y anestesiados con una población de CD45+células humanas superiores al 20 por ciento en su sangre periférica, a una proporción de 200 nanogramos de P24 por concentración de ratón a través de la administración intraperitoneal, recogiendo muestras de sangre a través de sangrado retro-orbital cada dos semanas, y analizar tanto la relación CD4-CD8 como la carga plasmática , como se ha demostrado. Para la validación de la supresión viral, suministra a los animales NSG humanos infectados un tratamiento fresco, combinatorio, antirretroviral o cART, en agua edulcorada cada semana durante 4 semanas, recogiendo muestras de sangre a través de sangrado retro-orbital cada dos semanas y analizar tanto la relación CD4-CD8 como la carga viral plasmática como se ha demostrado. Para evaluar el rebote viral cuando las cargas virales plasmáticas están por debajo del límite de detección y la relación CD4-CD8 se restaura entre 1,5 y 2,5 recoger muestras de sangre periférica a través de sangrado retro-orbital cada 2 semanas después de la extracción de cART y evaluar las muestras como se ha demostrado.
Durante la validación inicial del injerto, el recuento humano de células CD45+deben oscilar entre el 20 y el 80 por ciento, y los subconjuntos de leucocitos humanos deben aparecer como poblaciones discretas mediante el análisis citométrico de flujo. La proporción de células CD4+a CD8+ se mantiene entre 1,5 y 2,5 en individuos sanos, mientras que el agotamiento significativo de las células CD4+T se observa típicamente tras la infección viral. En particular, la proporción saludable se restaura en respuesta al tratamiento con cART.
La detección de cargas virales plasmáticas por PCR RT cuantitativa a lo largo de la infección y el régimen de cART se puede trazar y utilizar para evaluar la eficiencia de la administración viral y el tratamiento antiviral, respectivamente. Aunque este método puede proporcionar información sobre los estudios de vitología del VIH/SIDA y el desarrollo terapéutico, también se puede aplicar a otros estudios relacionados con enfermedades humanas, como el cáncer, la diabetes y las enfermedades autoinmunes. El desarrollo del modelo de ratón hu-NSG allanó el camino para que los investigadores de inmunología y oncología exploraran una nueva disfunción y patología en humanos, particularmente estudios mecánicos y terapéuticos dirigidos a la infección crónica por VIH y el reservorio de latencia.
