Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Instituto de Ontario de Investigación del Cáncer (# 08NOV230), la Fundación Canadiense para la Innovación (# 13199), el cáncer de próstata Canadá, Janssen Oncología, el Programa Regional del Cáncer de Londres, y el apoyo de los donantes de John y Donna Bristol a través el London Health Sciences Foundation (ALA). LEL es apoyado por un Banting y Charles Best Frederick Canada Graduate Beca Premio de Doctorado. ALA es apoyado por un Premio al Investigador Nueva CIHR y un Premio Investigador Temprana del Ministerio de Investigación e Innovación de Ontario.

Todos los estudios humanos descritas en este manuscrito se llevaron a cabo bajo los protocolos aprobados por la Junta de Ética de Investigación Humana de la Universidad de Western. Se realizaron todos los estudios en animales de acuerdo con las recomendaciones del Consejo Canadiense de los Animales, en virtud de los protocolos aprobados por el Uso de Animales Subcomité Universidad Occidental. 1. Estándar CTC Enumeración de muestras de sangre de pacientes utilizando los CSS 1. Sangre humana Recolección y Preparación para el procesamiento en el Instrumento de preparación <ol><li> Utilizando técnicas estándar de flebotomía asépticas, dibujar un mínimo de 8,0 ml de sangre humana en un tubo CellSave 10 ml (en lo sucesivo referido como el tubo conservante CTC), que contiene ácido etileno diaminotetraacético (EDTA) y un conservante celular patentada. Invierta las 5x tubo para evitar que la sangre se coagule. Las muestras pueden ser procesadas inmediatamente o almacenarse a temperatura ambiente durante un máximo de 96 horas. </li><li> DESMONTAJEreactivos e CSS de la nevera y permita que alcancen la temperatura ambiente antes de usar. </li><li> Usando una pipeta desechable 10 ml y pipeta automatizada, recolectar 7,5 ml de sangre del tubo conservante CTC y dispensar lentamente la sangre en un tubo de procesamiento instrumento de preparación marcada de manera apropiada. </li><li> Añadir 6,5 ml de tampón de dilución a cada muestra. Mezclar por inversión de muestra 5x. Centrifugar la muestra a 800 xg durante 10 minutos con el freno en la posición &quot;off&quot;. Siga las instrucciones que aparecen en pantalla en el instrumento de preparación para cargar todas las muestras de los pacientes en el sistema para su procesamiento. Las muestras deben ser procesadas dentro de 1 hora de preparación. </li></ol> 2. Preparación de control para el procesamiento en el Instrumento de Preparación <ol><li> Agite suavemente el frasco de control e invertir 5x para mezclar. </li><li> Retire con cuidado la tapa del frasco de control y colocar un tubo de procesamiento de instrumentos de preparación invertida en la parte superior del vial destapado. En un movimiento rápido, invierta lacontrolar vial, y verter el contenido en el tubo de procesamiento. Si bien invertida, chasquear suavemente los lados del vial de control para liberar el contenido restante. </li><li> Retire con cuidado el vial de control invertidos desde el tubo de procesamiento, garantizando que ningún líquido se pierde y coloque a un lado. Usando una pipeta de 1000 l, recoger el contenido restante del vial y de la tapa y la pipeta suavemente en el tubo de procesamiento. </li><li> Siga las instrucciones que aparecen en pantalla en el instrumento de preparación para cargar el control en el sistema para su procesamiento. </li></ol> 3. Escaneo de muestra en el instrumento de análisis <ol><li> Siga las instrucciones que aparecen en pantalla en el instrumento de preparación para descargar todas las muestras del sistema. Sin apretar coronar cada cartucho dispositivo magnético y toque en el dispositivo magnético utilizando las manos o mesa de laboratorio para liberar las burbujas que están pegados a los bordes del cartucho. Una vez que se han eliminado todas las burbujas, cierre bien el cartucho, coloque el dispositivo magnético plano, y incubate en la oscuridad durante al menos 20 min a temperatura ambiente. Las muestras deben ser escaneados dentro de las 24 horas de preparación. </li><li> Encienda el instrumento de análisis e inicializar la lámpara. Una vez calentado (~ 15 min), cargue el cartucho de verificación del sistema en el instrumento de análisis y seleccione la pestaña de prueba del control de calidad. Siga las instrucciones en pantalla para llevar a cabo las medidas de control de calidad necesarios. </li><li> Cargue una muestra en el instrumento de análisis y seleccione la ficha Prueba de paciente. Se mostrará toda la información guardada en el instrumento de preparación. Haga clic en Inicio para iniciar la exploración de la muestra. El sistema lleva a cabo un enfoque grueso y detección de bordes en el cartucho de dispositivo magnético. </li><li> Ajuste todos los bordes como sea necesario utilizando las teclas de dirección. Seleccione Aceptar. El sistema realizará una multa enfoque y empezar a escanear muestra. </li><li> Tras el control de la exploración de los resultados debe ser validado utilizando los criterios definidos para las células enriquecidas en alto (CK + DAPI + CD45 - APC +) y baja (CK + DAPI + CD45 - FITC +) las concentraciones. A raíz de la muestra del paciente la exploración de los resultados debe ser revisado para CTCs capturadas utilizando los criterios definidos CTC (CK + DAPI + CD45 -). </li></ol> 2. CTC Caracterización de marcadores definidos por el usuario utilizando el CSS 1. Preparación de marcadores definidos por el usuario y de instrumentos de inicialización <ol><li> Diluir el anticuerpo de interés utilizando primarios de bonos diluyente de anticuerpos a la concentración deseada en una taza de reactivo marcador usando la siguiente fórmula, en donde la concentración de trabajo es la concentración del anticuerpo después de la adición a la muestra y la concentración de valores es la concentración de anticuerpo en el taza de reactivo. Para múltiples muestras, ajustar los volúmenes de anticuerpos como se describe en la Tabla 1. Coloque la taza de reactivo marcador en la posición 1 en el cartucho de reactivo y LOAD cartucho sobre CSS. Stock Concentración = (concentración de trabajo x 850 mu l) / 150 l </li><li> Recoger la sangre, preparar muestras, y cargar el instrumento de preparación como se describe en el estándar por encima de CTC Enumeración de muestras de sangre de pacientes utilizando el protocolo de CSS. Para activar Además marcador personalizado, seleccione Definido por el usuario ensayo cuando se le solicite por el instrumento de preparación. Introduzca el nombre del marcador y seleccione Guardar. Como muestras se cargan en el instrumento, el operador se le solicitará que indique que debe recibir marcador personalizado seleccionando Sí o No, según sea necesario. </li></ol> 2. Escaneo Muestra de marcadores definidos por el usuario en el instrumento de análisis <ol><li> Encienda el instrumento de análisis, inicializar la lámpara, y llevar a cabo el control de calidad y verificación del sistema como se describe en la Sección 3.2 de la CTC Enumeración estándar de muestras de sangre de los pacientes con el CSS </strong&gt; protocolo. </li><li> Cargue una muestra en el instrumento de análisis y seleccione la ficha Configuración. Para inicializar el canal FITC, seleccione CellSearch CTC como ID Kit en la sección Protocolos de pruebas. Desde este menú, seleccione CTC Investigación, haga clic en el botón Editar y establezca el tiempo de exposición si lo deseas. Se recomienda que un tiempo de exposición de 1,0 segundos no ser excedido cuando utilizando el kit de CSS CTC como esto puede aumentar sangrado a través en otros canales fluorescentes utilizados para la identificación de CTC. </li></ol> 3. Adaptación del CSSProtocol estándar para su uso en modelos preclínicos del ratón ** Adaptado de Veridex ratón / rata CellCapture Kit (ya no está disponible en el comercio) 1. Ratón extracción de sangre y almacenamiento <ol><li> Antes de la recogida de sangre, se ejecutan ~ 30 l de EDTA 0,5 M de ida y vuelta a través de una aguja de 22 G, dejando una pequeña cantidad de EDTA en el cubo. </li><li>Reunir un mínimo de 50 l de la sangre del ratón de los ratones previamente inyectados con células tumorales humanas a través de rutas ortotópico, vena de la cola, o intracardiaca. Recoger sangre de la vena safena (para el análisis de CTC en serie) o por punción cardiaca (para el análisis de terminal de CTC). Retire la aguja y dispensar la sangre en un Microtainer con EDTA tubo de recogida de sangre de 1 ml. Mezclar por inversión o tubo suavemente flick evitar que la sangre se coagule. La sangre puede ser procesada inmediatamente o se almacenó a temperatura ambiente durante hasta 48 horas después de la adición de un volumen igual de CytoChex conservante celular. </li></ol> 2. CTC Enriquecimiento <ol><li> Retire reactivos CSS de la nevera y deje que alcancen la temperatura ambiente antes de usar. </li><li> Transferir el equivalente de 50 l de sangre completa a un 12 mm x 75 mm flujo citometría de tubo. Añadir 500 l de tampón de dilución a cada muestra, lavando cualquier sangre que queda en los lados del tubo. Si es necesario, un breve centrifugado centrífugase puede utilizar para recoger cualquier sangre restante. </li><li> Vórtice suavemente el ferrofluido anti-EpCAM y añadir 25 l de cada muestra mediante la colocación de la punta de la pipeta directamente en la muestra. Añadir 25 l de reactivo Mejora captura y agitar suavemente para mezclar. Incubar las muestras a temperatura ambiente durante 15 min. </li><li> Coloque los tubos de muestra en el imán y se incuba durante 10 min. Mientras que los tubos de muestra son todavía en el imán, utilizar una pipeta de vidrio para aspirar cuidadosamente el líquido residual sin tocar la pared del tubo al lado del imán y desechar. </li></ol> 3. CTC tinción <ol><li> Quitar los tubos de muestra del imán y resuspender en 50 l de ácido nucleico Dye, 50 l de reactivo de tinción, 1,5 l de anti-ratón CD45-APC, 5,0 l de anti-humano HLA-Alexa Fluor 488, y 100 l de permeabilización Reactivo. Para múltiples muestras, estos reactivos se pueden mezclar previamente y 206,5 l de mezcla se pueden añadir a cada tubo. Vortex suavemente para mezclare incubar durante 20 min a temperatura ambiente en la oscuridad. </li><li> Añadir 500 l de tampón de dilución, vórtice suavemente, tubos de muestra en lugar del imán, y se incuba durante 10 min. Mientras que los tubos de muestra son todavía en el imán, utilizar una pipeta de vidrio para aspirar cuidadosamente el líquido residual sin tocar la pared del tubo al lado del imán y desechar. Quitar los tubos de muestra del imán y resuspender en 350 l de tampón de dilución. Vortex suavemente para mezclar. </li></ol> 4. Magnética dispositivo de carga <ol><li> Con una punta de carga de gel, transferir cuidadosamente la totalidad del volumen del tubo de muestra en un cartucho en el dispositivo magnético. Comience en la parte inferior del cartucho y retirar lentamente la punta como se dispensa la muestra. </li><li> Una vez que la muestra ha sido transferida, sin apretar tapar el cartucho de dispositivo magnético y toque en el dispositivo magnético utilizando las manos o mesa de laboratorio para liberar las burbujas que están pegados a los bordes del cartucho como se describe en la Sección 3.1 de la CTC Enumeración estándar de muestras de sangre de los pacientes utilizando el CSS. </li><li> Pop las burbujas utilizando una aguja estéril 22 G atrapándolos entre el bisel y el borde del cartucho. Una vez que se han eliminado todas las burbujas, la tapa con firmeza el cartucho, coloque el dispositivo magnético plana, y se incuban en la oscuridad durante al menos 10 min. Las muestras deben ser escaneados dentro de las 24 horas de preparación. </li></ol> 5. Escaneo de muestras separadas de forma manual en el instrumento de análisis <ol><li> Encienda el instrumento de análisis, inicializar la lámpara, y llevar a cabo el control de calidad y verificación del sistema como se describe en la Sección 3.2 de la CTC Enumeración estándar de muestras de sangre de los pacientes que utilizan el protocolo CSS. </li><li> Cargue la muestra en el instrumento de análisis y seleccione la ficha Configuración. Borre los datos existentes en el botón datos dispositivo magnético haciendo clic en el botón de formato de muestra. Habilitar el canal FITC unnd establecer el tiempo de exposición a 1,0 seg como se describe en la sección 2.2 de la CTC Caracterización de marcadores definidos por el usuario utilizando el CSS. </li><li> Haga clic en la ficha Prueba de paciente y seleccione Editar para introducir la información de la muestra. Seleccione CellSearch CTC como ID Kit y CTC de Investigación como el Protocolo de prueba. Introduzca el resto de la información necesaria, como se indica como el asterisco. Guardar la información de la muestra y haga clic en Iniciar. </li></ol>

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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+epithelial-mesenchymal+transition-inducing+transcription+factors+in+primary+breast+cancer:+The+effect+of+neoadjuvant+therapy.">Expression of epithelial-mesenchymal transition-inducing transcription factors in primary breast cancer: The effect of neoadjuvant therapy.</a> Int. J. Cancer. 130 (4), 808-816 (2012).</li><li>Yu, M., Bardia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+breast+tumor+cells+exhibit+dynamic+changes+in+epithelial+and+mesenchymal+composition.">Circulating breast tumor cells exhibit dynamic changes in epithelial and mesenchymal composition.</a> Science. 339 (6119), 580-584 (2013).</li><li>Armstrong, A. J., Marengo, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumor+cells+from+patients+with+advanced+prostate+and+breast+cancer+display+both+epithelial+and+mesenchymal+markers.">Circulating tumor cells from patients with advanced prostate and breast cancer display both epithelial and mesenchymal markers.</a> Mol. Cancer Res. 9 (8), 997-1007 (2011).</li></ol>

El autor (ALA) recibió fondos que fue proporcionado por Janssen Oncología, cuya compañía matriz Johnson &amp; Johnson también es propietaria de Janssen Diagnósticos LLC, que produce reactivos e instrumentos utilizados en este artículo.

A pesar del desarrollo de muchas nuevas tecnologías de CTC desde la introducción de la CSS en el año 2004, esta técnica sigue siendo la única tecnología clínicamente aprobada hoy en el mercado, por lo que se considera el estándar de oro actual para la detección y enumeración CTC. Este manuscrito ha demostrado que a pesar de la CSS tiene rigurosos estándares de control de calidad que puede estar sujeto a sesgos de interpretación y que la identificación de CTC en muestras de pacientes es muy diferente de la i...

En 2013 se estima que 580,350 personas morirán de cáncer y que los 1.660.290 nuevos casos de esta enfermedad se diagnostica sólo en 1 de los Estados Unidos. La mayoría de estas muertes se producen con posterioridad a la presentación de enfermedad metastásica 2. La actual falta de terapias efectivas en el tratamiento de metástasis y una comprensión limitada de la cascada metastásica hace que esta etapa de la enfermedad altamente letal. La presencia de células tumorales circulantes (CTC) en el torrente sanguíneo se ha demostrado que se correlaciona con la enfermedad metastásica 3. Estas células son muy poco frecuentes y su detección es indicativa de la supervivencia general en cáncer de mama metastásico 4, 5 de próstata y colorrectal 6 cáncer. En estos pacientes, la presencia de ≥ ≥ 3 (colorrectal) CTCs en 7,5 ml de sangre 5 (mama y próstata) o es un indicador de mal pronóstico en comparación con aquellos pacientes con menos o ningún CTCs detectables en el samvolumen e sangre. Además, el cambio en el número de CTC durante o después de la intervención terapéutica ha demostrado ser útil como un factor de predicción de la respuesta al tratamiento, a menudo antes de lo que las técnicas actualmente utilizadas 7-10. Se ha estimado que, en pacientes con cáncer metastásico, CTC se produce a una frecuencia de aproximadamente 1 por CTC 10 5 -10 7 células mononucleares de la sangre y en los pacientes con enfermedad localizada, esta frecuencia puede ser aún más baja (~ 1 en 10 8). La naturaleza poco común de estas células puede hacer que sea difícil de detectar y analizar con precisión y fiabilidad CTC 11. Existen varios métodos (revisado previamente 12-14) se han utilizado para enriquecer y detectar estas células mediante la explotación de las propiedades que los diferencian de los alrededores componentes sanguíneos. En general, la enumeración CTC es un proceso de dos partes que requiere tanto una etapa de enriquecimiento y una etapa de detección. Tradicionalmente, las etapas de enriquecimiento se basan en las diferencias en educación físicapropiedades de iCal de CTC (tamaño de la celda, densidad, capacidad de deformación) o en la expresión del marcador de proteína (es decir, molécula de adhesión celular epitelial [EpCAM], citoqueratina [CK]). Después de enriquecimiento, la detección de CTC puede llevarse a cabo en un número de maneras diferentes, la más común de las cuales son ensayos basados ​​en ácidos nucleicos y / o enfoques de citometría. Cada una de estas estrategias son únicos, tienen ventajas y desventajas, sin embargo todos ellos carecen de normalización; una necesidad para entrar en el entorno clínico. Por tanto, el sistema de CellSearch (CSS) se desarrolló para brindar un método estándar para la detección y enumeración de los CTC raras en la sangre humana utilizando microscopía de fluorescencia y técnicas basadas en anticuerpos 4-6. Esta plataforma es actualmente considerado el estándar de oro en la enumeración CTC y es la única técnica aprobado por los EE.UU. Food and Drug Administration (FDA) para su uso en la clínica 15. El CSS es una consistin plataforma de dos componentesg de, (1) el sistema de CellTracks AutoPrep (de aquí en adelante referido como el instrumento de preparación), que automatiza la preparación de muestras de sangre humana, y (2) la CellTracks Analyzer II (en lo sucesivo referido como el instrumento de análisis), que analiza estos muestras siguientes preparación. Para distinguir CTC de leucocitos contaminantes del instrumento de preparación emplea un anticuerpo mediada, enfoque separación magnética a base de ferrofluido y tinción de fluorescencia diferencial. Inicialmente, el sistema de etiquetas CTC usando anticuerpos anti-EpCAM conjugados con nanopartículas de hierro. La muestra se incuba a continuación en un campo magnético, y todas las células no marcadas son aspirados. Las células tumorales seleccionadas se resuspendieron, y se incubaron en una mancha de fluorescencia diferencial, que consiste en anticuerpos marcados de forma fluorescente y un reactivo de tinción nuclear. Finalmente, la muestra se transfiere a un cartucho magnético, llamado un magnest (en lo sucesivo, el dispositivo magnético), y SCanned usando el instrumento de análisis. El instrumento de análisis se utiliza para explorar muestras preparadas usando diferentes filtros de fluorescencia, cada uno optimizado para la partícula fluorescente apropiada, usando una lente objetivo de 10X. CTC se identifican como células que están obligados por anti-EpCAM, anti-pan-CK-ficoeritrina (PE) (CK8, 18, y 19), y la mancha nuclear 4 &#39;,6-diamino-2-fenilindol (DAPI). Por el contrario, los leucocitos contaminantes se identifican como células que están obligados por anti-CD45-aloficocianina (APC) y DAPI. Después de la exploración, potenciales células tumorales informáticos definidos se presentan al usuario. A partir de estas imágenes, el usuario debe emplear métodos cualitativos a través de los parámetros definidos y tinción diferencial discutidos anteriormente para determinar qué eventos son los CTC. Además de proporcionar un método estandarizado para la enumeración de CTC, el CSS permite para la caracterización molecular de CTC basado en marcadores de proteínas de interés. Este interrogatorio cun ser realizadas a nivel de una sola célula, utilizando un isotiocianato de fluoresceína (FITC) canal de fluorescencia no se requiere para la identificación CTC 16. Aunque esta plataforma proporciona la capacidad para la caracterización molecular, no está bien definido el proceso detallado de elaboración de protocolos y optimización. Tres marcadores disponibles comercialmente han sido desarrollados por el fabricante para su uso con el CSS, incluyendo receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), receptor del factor de crecimiento epidérmico humano 2 (HER2), y factor de crecimiento similar a la insulina 1 receptor (IGF-1R). Análisis de HER2, en combinación con el CSS, ha sido utilizado por varios grupos para ilustrar el potencial para la caracterización de CTC para informar la toma de decisiones clínicas y de cambiar las pautas de tratamiento potencialmente existentes. Por ejemplo, Fehm et al. 17 demostraron que aproximadamente un tercio de los pacientes con cáncer de mama con tumores HER2-primaria tenía HER2 + CTC. Además, Liu et al.18 informó recientemente que hasta el 50% de los pacientes con cáncer de mama HER + metastásico no tenía HER2 + CTC. Herceptin, un receptor HER2 interferir anticuerpo monoclonal demostrado beneficiarse en gran medida los pacientes cuyos tumores expresan suficientes niveles de HER2, es un tratamiento comúnmente utilizado para los pacientes con tumores HER2 + primarias 19-21. Sin embargo, estos estudios sugieren que Herceptin puede estar siendo sub-óptima utilizada y que la caracterización de CTC puede ayudar en la predicción de la respuesta al tratamiento. En última instancia, la caracterización CTC puede tener el potencial de mejorar la atención personalizada. Investigación CTC es único en que ha utilizado en gran medida un enfoque de la cabecera-a de sobremesa. Este método, a diferencia de-sobremesa-al lado de la cama de investigación, que a menudo puede tomar años para impactar el cuidado del paciente, ha permitido a CTC rápida entrada en el ámbito clínico. Sin embargo, los médicos no se atreven a utilizar los resultados de los análisis de CTC en el tratamiento del paciente la decisión de tomaing debido a una falta de entendimiento de su biología subyacente. Por lo tanto adecuados modelos preclínicos de ratón de las técnicas de metástasis y análisis complementarios CTC se deben utilizar con el fin de investigar estas cuestiones pendientes. En general, hay dos tipos de modelos preclínicos utilizados para estudiar la cascada metastásica, (1) modelos de metástasis espontánea, que permiten el estudio de todos los pasos de la cascada metastásica, y (2) modelos de metástasis experimentales, que sólo permiten el estudio de las etapas posteriores en el proceso metastásico, tales como la extravasación y la formación de tumor secundario 22. Modelos de metástasis espontáneas, implican inyecciones de células tumorales en lugares ortotópico apropiadas (por ejemplo, inyección de células de cáncer de próstata en la glándula prostática para el estudio del cáncer de próstata). Después las células se les da tiempo para formar tumores primarios y metástasis espontáneamente a los sitios secundarios, tales como el hueso, pulmón, y los ganglios linfáticos. EnPor el contrario, los modelos experimentales de metástasis implican la inyección directa de células tumorales en el torrente sanguíneo (por ejemplo a través de la vena de la cola o la inyección intracardiaca para dirigirse a las células a lugares específicos) y, por tanto, se saltan los pasos iniciales de intravasation y difusión a los órganos secundarios 22. Hasta ahora la mayoría de los análisis de CTC en vivo en sistemas modelo se ha realizado usando ya sea 23 o adaptados técnicas CTC basado en citometría de origen humano (por ejemplo AdnaTest) 24. Aunque útil, ninguna de estas técnicas refleja adecuadamente enumeración CTC usando el CSS estándar de oro. Sobre la base de la aprobación clínica, la naturaleza estandarizada, y el uso generalizado de la CSS, el desarrollo de una técnica de captura y detección de CTC para el modelado in vivo que utiliza preparación de la muestra equivalente, procesamiento, y los criterios de identificación sería ventajoso como resultados serían comparables a los obtenido a partir de muestras de pacientes. Sin embargo, debido a la REQ volumenuirements del instrumento de preparación no es posible procesar pequeños volúmenes de sangre utilizando esta plataforma automatizada. . Además, el trabajo previo de Eliane et al 25 han demostrado que la contaminación de las muestras con células epiteliales del ratón (que también cumplen con la definición estándar CTC [EpCAM + CK + DAPI + CD45 -]) puede dar lugar a errores de clasificación de ratón las células epiteliales escamosas como CTC. Para abordar estas cuestiones una técnica adaptada que permite la utilización de los reactivos del kit CSS CTC combinados con un procedimiento de aislamiento manual fue desarrollado. La adición de un antígeno leucocitario humano marcado con FITC (HLA) de anticuerpos para el ensayo permite que las células tumorales humanas para distinguirse de ratón células epiteliales escamosas. Este manuscrito describe la norma, desarrollada comercialmente y protocolo CSS optimizado para el procesamiento de las muestras de pacientes de sangre y las trampas más comunes que se pueden encontrar, entre ellos discrepanciasartículos camisetas que pueden conducir a errores de clasificación errónea de CTC. Además, la personalización del ensayo CSS para examinar las características de la proteína de CTC capturados y una técnica de CSS adaptado comparable que permite el enriquecimiento y detección de CTC de pequeños volúmenes de sangre en modelos preclínicos de ratón de metástasis definidas por el usuario se describen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="790">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">REAGENTS</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">0.5M EDTA</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Anti-human CD44-FITC</td>
			<td style="width:175px;">BD Pharmigen&#160;</td>
			<td style="width:161px;">555478</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Anti-human CD44-PE</td>
			<td style="width:175px;">BD Pharmigen&#160;</td>
			<td style="width:161px;">555479</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Anti-human HLA-AlexaFluor488</td>
			<td style="width:175px;">BioLegend</td>
			<td style="width:161px;">311415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Anti-mouse CD45-APC</td>
			<td style="width:175px;">eBioscience</td>
			<td style="width:161px;">17-0451-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Bond Primary Antibody Diluent</td>
			<td style="width:175px;">Leica</td>
			<td style="width:161px;">AR9352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:267px;">CellSave Preservative Tubes</td>
			<td style="width:175px;">Veridex</td>
			<td style="width:161px;">952820 (20 pack)&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 79100005 (100 pack)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">CellSearch CTC Control Kit</td>
			<td style="width:175px;">Veridex</td>
			<td style="width:161px;">7900003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">CellSearch CTC Kit</td>
			<td style="width:175px;">Veridex</td>
			<td style="width:161px;">7900001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">CellSearch CXC Control Kit</td>
			<td style="width:175px;">Veridex</td>
			<td style="width:161px;">7900018RUO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">CellSearch CXC Kit</td>
			<td style="width:175px;">Veridex</td>
			<td style="width:161px;">7900017RUO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Instrument Buffer</td>
			<td style="width:175px;">Veridex</td>
			<td style="width:161px;">7901003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:267px;">Streck Cell Preservative (aka CytoChex)</td>
			<td style="width:175px;">Streck</td>
			<td>213350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">EQUIPMENT</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">1 ml syringe</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">10 ml serological pipette</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">1000&#181;l pipette</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">1000&#181;l pipette tips</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">12 x 75mm flow tubes</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">200&#181;l gel loading tips</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">200&#181;l pipette</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">22 gauge needle</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">5 3/4&#34; disposible pasteur pipet</td>
			<td style="width:175px;">VWR</td>
			<td style="width:161px;">14672-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:267px;">5 ml serological pipette</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:267px;">Automated pipettor</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:267px;">Capillary Blood Collection Tube (EDTA)</td>
			<td style="width:175px;">BD Microtainer</td>
			<td style="width:161px;">365974</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">CellSearch Analyzer II</td>
			<td style="width:175px;">Veridex</td>
			<td style="width:161px;">9555</td>
			<td rowspan="2" style="width:188px;">Includes magnests and verification cartirdges</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">CellSearch AutoPrep System</td>
			<td style="width:175px;">Veridex</td>
			<td style="width:161px;">9541</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">MagCellect Magnet&#160;</td>
			<td style="width:175px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:161px;">MAG997</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Small Latex Bulb</td>
			<td style="width:175px;">VWR</td>
			<td>82024-550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Vortex</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

adaptation of semiautomated circulating tumor cell (ctc) assays for clinical and preclinical research applications

La mayoría de las muertes relacionadas con el cáncer se produce con posterioridad a la presentación de enfermedad metastásica. Este estadio de la enfermedad altamente letal se asocia con la presencia de células tumorales circulantes (CTC). Estas células raras se han demostrado para ser de importancia clínica en cáncer de mama metastásico, de próstata, y cánceres colorrectales. El actual estándar de oro en la detección clínica CTC y enumeración es el sistema CellSearch aprobado por la FDA (CSS). Este manuscrito describe el protocolo estándar utilizado por esta plataforma, así como dos protocolos adaptados adicionales que describen el proceso detallado de la optimización de marcador definido por el usuario para la caracterización de proteínas de CTC paciente y un protocolo comparable para la captura de CTC en muy bajos volúmenes de sangre, utilizando el estándar reactivos CSS, para estudiar in vivo los modelos preclínicos de ratón de la metástasis. Además, las diferencias en la calidad de CTC entre la sangre de donantes sanos se dispararon con células de cultivo de tejidos en comparación con la sangre del paciente samples se destacan. Por último, varios artículos que se discrepantes que pueden conducir a errores de clasificación errónea de CTC se describen. Tomados en conjunto, estos protocolos proporcionarán un recurso útil para los usuarios de esta plataforma de interesados ​​en la investigación preclínica y clínica relacionada con la metástasis y la CTC.

Enumeración Ensayo CTC estándar La sensibilidad y especificidad de la CSS ha sido bien documentado en la literatura. Sin embargo, para validar la recuperación de CTC equivalente, se dispararon (1000 LNCaP células de cáncer de próstata humano) y muestras de sangre humana no enriquecidos de donantes voluntarios sanos fueron procesadas en el CSS mediante el protocolo CSSCTC estándar. Como era de esperar, las muestras no enriquecidos estaban libres de CTCs, 0,00 ± 0,00%, y la recuperación ...

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Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell CTC Assays for Clinical and Preclinical Research Applications

Las células tumorales circulantes (CTC) son pronóstico en varios tipos de cáncer metastásico. Este manuscrito describe el sistema de patrón oro CellSearch (CSS) plataforma enumeración CTC y destaca los errores de clasificación errónea comunes. Además, dos protocolos adaptados se describen, por definido por el usuario caracterización marcador de CTCs y CTC enumeración en modelos de ratones preclínicos de metástasis que utilizan esta tecnología.

Adaptación de semiautomatizado de células tumorales circulantes (CTC) Ensayos para aplicaciones clínicas y de investigación preclínica

The majority of cancer-related deaths occur subsequent to the development of metastatic disease. This highly lethal disease stage is associated with the ...

adaptation-semiautomated-circulating-tumor-cell-ctc-assays-for

Research

JoVE Journal

Medicine

Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell (CTC) Assays for Clinical and Preclinical Research Applications

15.8K vistas.  London Health Sciences Centre.  Las células tumorales circulantes (CTC) son pronóstico en varios tipos de cáncer metastásico. Este manuscrito describe el sistema de patrón oro CellSearch (CSS) plataforma enumeración CTC y destaca los errores de clasificación errónea comunes. Además, dos protocolos adaptados se describen, por definido por el usuario caracterización marcador de CTCs y CTC enumeración en modelos de ratones preclínicos de metástasis que utilizan esta tecnología. 

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Processing of Primary Brain Tumor Tissue for Stem Cell Assays and Flow Sorting

Brain tumors are typically comprised of morphologically diverse cells that express a variety of neural lineage markers. Only a relatively small fraction of cells in the tumor with stem cell properties, termed brain tumor initiating cells (BTICs), possess an ability to differentiate along multiple lineages, self-renew, and initiate tumors in vivo. We applied culture conditions originally used for normal neural stem cells (NSCs) to a variety of human brain tumors and found that this culture method specifically selects for stem-like populations. Serum-free medium (NSC) allows for the maintenance of an undifferentiated stem cell state, and the addition of bFGF and EGF allows for the proliferation of multi-potent, self-renewing, and expandable tumorspheres.
To further characterize each tumor's BTIC population, we evaluate cell surface markers by flow cytometry. We may also sort populations of interest for more specific characterization. Self-renewal assays are performed on single BTICs sorted into 96 well plates; the formation of tumorspheres following incubation at 37 &deg;C indicates the presence of a stem or progenitor cell. Multiple cell numbers of a particular population can also be sorted in different wells for limiting dilution analysis, to analyze self-renewal capacity. We can also study differential gene expression within a particular cell population by using single cell RT-PCR.
The following protocols describe our procedures for the dissociation and culturing of primary human samples to enrich for BTIC populations, as well as the dissociation of tumorspheres. Also included are protocols for staining for flow cytometry analysis or sorting, self-renewal assays, and single cell RT-PCR.

The identification of brain tumor initiating cells (BTICs), the rare cells within a heterogeneous tumor possessing stem cell properties, provides new insights into human brain tumor pathogenesis. We have refined specific culture conditions to enrich for BTICs, and we routinely use flow cytometry to further enrich these populations. Self-renewal assays and transcript analysis by single cell RT-PCR can subsequently be performed on these isolated cells.

Procesamiento de tejido primario Tumor cerebral para ensayos con células madre y flujo de Ordenación

Brain tumors are typically comprised of morphologically diverse cells that express a variety of neural lineage markers. Only a relatively small fraction ...

Investigación

Medicina

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. Here, we describe a general protocol for cell labeling, imaging, and image processing. The technique is applicable to various cell types and animal models, although here we focus on a typical mouse model for tracking murine immune cells. The most important issues for cell labeling are described, as these are relevant to all models. Similarly, key imaging parameters are listed, although the details will vary depending on the MRI system and the individual setup. Finally, we include an image processing protocol for quantification. Variations for this, and other parts of the protocol, are assessed in the Discussion section. Based on the detailed procedure described here, the user will need to adapt the protocol for each specific cell type, cell label, animal model, and imaging setup. Note that the protocol can also be adapted for human use, as long as clinical restrictions are met.

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

We describe a general protocol for in vivo cell tracking using MRI in a mouse model with ex vivo labeled cells. A typical protocol for cell labeling, image acquisition processing and quantification is included.

In vivo MRI de 19F para el seguimiento de la célula

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. ...

A Novel in vivo Gene Transfer Technique and in vitro Cell Based Assays for the Study of Bone Loss in Musculoskeletal Disorders

Differentiation and activation of osteoclasts play a key role in the development of musculoskeletal diseases as these cells are primarily involved in bone resorption. Osteoclasts can be generated in vitro from monocyte/macrophage precursor cells in the presence of certain cytokines, which promote survival and differentiation. Here, both in vivo and in vitro techniques are demonstrated, which allow scientists to study different cytokine contributions towards osteoclast differentiation, signaling, and activation. The minicircle DNA delivery gene transfer system provides an alternative method to establish an osteoporosis-related model is particularly useful to study the efficacy of various pharmacological inhibitors in vivo. Similarly, in vitro culturing protocols for producing osteoclasts from human precursor cells in the presence of specific cytokines enables scientists to study osteoclastogenesis in human cells for translational applications. Combined, these techniques have the potential to accelerate drug discovery efforts for osteoclast-specific targeted therapeutics, which may benefit millions of osteoporosis and arthritis patients worldwide.

A Novel in vivo Gene Transfer Technique and in vitro Cell Based Assays for the Study of Bone Loss in Musculoskeletal Disorders

Differentiation of precursor cells into osteoclasts is regulated by cytokines and growth factors. Here, a novel gene transfer technique for differentiation of osteoclasts in vivo and cell culture protocols for differentiating precursor cells into osteoclasts in vitro as a method to study the effects of cytokines on osteoclastogenesis are described.

A Novel<em&gt; In vivo</em&gt; Técnica de transferencia de genes y<em&gt; In vitro</em&gt; ensayos basados ​​en células para el estudio de la pérdida ósea en los trastornos musculoesqueléticos

Differentiation and activation of osteoclasts play a key role in the development of musculoskeletal diseases as these cells are primarily involved in bone ...

Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a potential source of cells for regenerative medicine. The reason for this interest is evidence that these cells have highly multipotent differentiation ability, low immunogenicity, and anti-inflammatory functions. These properties have prompted researchers to investigate the potential of hAECs to be used to treat a variety of diseases and disorders in pre-clinical animal studies with much success.
hAECs have found widespread application for the treatment of a range of diseases and disorders. Potential clinical applications of hAECs include the treatment of stroke, multiple sclerosis, liver disease, diabetes and chronic and acute lung diseases. Progressing from pre-clinical animal studies into clinical trials requires a higher standard of quality control and safety for cell therapy products. For safety and quality control considerations, it is preferred that cell isolation protocols use animal product-free reagents. 
We have developed protocols to allow researchers to isolate, cryopreserve and culture hAECs using animal product-free reagents. The advantage of this method is that these cells can be isolated, characterized, cryopreserved and cultured without the risk of delivering potentially harmful animal pathogens to humans, while maintaining suitable cell yields, viabilities and growth potential. For researchers moving from pre-clinical animal studies to clinical trials, these methodologies will greatly accelerate regulatory approval, decrease risks and improve the quality of their therapeutic cell population.

We describe a protocol to isolate and culture human amnion epithelial cells (hAECs) using animal product-free reagents in accordance with current good manufacturing practices (cGMP) guidelines.

El aislamiento, la criopreservación y cultivo de células epiteliales Amnion Humanos para Aplicaciones clínicas

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a ...

Ex Vivo Treatment Response of Primary Tumors and/or Associated Metastases for Preclinical and Clinical Development of Therapeutics

The molecular analysis of established cancer cell lines has been the mainstay of cancer research for the past several decades. Cell culture provides both direct and rapid analysis of therapeutic sensitivity and resistance. However, recent evidence suggests that therapeutic response is not exclusive to the inherent molecular composition of cancer cells but rather is greatly influenced by the tumor cell microenvironment, a feature that cannot be recapitulated by traditional culturing methods. Even implementation of tumor xenografts, though providing a wealth of information on drug delivery/efficacy, cannot capture the tumor cell/microenvironment crosstalk (i.e., soluble factors) that occurs within human tumors and greatly impacts tumor response. To this extent, we have developed an ex vivo (fresh tissue sectioning) technique which allows for the direct assessment of treatment response for preclinical and clinical therapeutics development. This technique maintains tissue integrity and cellular architecture within the tumor cell/microenvironment context throughout treatment response providing a more precise means to assess drug efficacy.

Ex Vivo Treatment Response of Primary Tumors and/or Associated Metastases for Preclinical and Clinical Development of Therapeutics

Established cancer cell lines and xenografts have been the mainstay of cancer research for the past several decades. However, recent evidence suggests that therapeutic response is greatly influenced by the tumor cell microenvironment. Therefore, we have developed an ex vivo analysis of primary tumor specimens for drug development purposes.

Ex Vivo respuesta al tratamiento de los tumores primarios y / o Asociados Metástasis de Preclínica y Desarrollo Clínico de Terapéutica

The molecular analysis of established cancer cell lines has been the mainstay of cancer research for the past several decades. Cell culture provides both ...

Isolation and Propagation of Circulating Tumor Cells from a Mouse Cancer Model

Cancer metastasis is the foremost cause of cancer-associated deaths. Recent studies have shown that circulating tumor cells (CTCs) are important in cancer metastasis. Indeed, the number of CTCs correlates with tumor size. Here, a detailed description is provided of a methodology for isolation and propagation of CTCs from a syngeneic mouse model of hepatocellular carcinoma (HCC) which allows for downstream analysis of potentially important molecular mechanisms of solid organ tumor metastasis. This method is efficient and reproducible. It is a non-invasive technique and, therefore, has potential to replace the invasive biopsy of tissues from humans which may be associated with complications. Therefore, the method discussed here allows for the isolation and propagation of CTCs from whole blood samples such that they can be examined and characterized. This has potential for future adaptation for clinical applications such as diagnosis, and personalized targeted therapy.

Circulating tumor cells (CTCs) have been shown to play an important role in tumor metastasis. Here, a method for the isolation and propagation of CTCs from the whole blood of a syngeneic mouse tumor model of hepatocellular carcinoma (HCC) metastasis is described.

El aislamiento y la propagación de células tumorales circulantes de un Cáncer de ratón

Cancer metastasis is the foremost cause of cancer-associated deaths. Recent studies have shown that circulating tumor cells (CTCs) are important in cancer ...

Generation of Prostate Cancer Patient Derived Xenograft Models from Circulating Tumor Cells

Patient derived xenograft (PDX) models are gaining popularity in cancer research and are used for preclinical drug evaluation, biomarker identification, biologic studies, and personalized medicine strategies. Circulating tumor cells (CTC) play a critical role in tumor metastasis and have been isolated from patients with several tumor types. Recently, CTCs have been used to generate PDX experimental models of breast and prostate cancer. This manuscript details the method for the generation of prostate cancer PDX models from CTCs developed by our group. Advantages of this method over conventional PDX models include independence from surgical sample collection and generating experimental models at various disease stages. Density gradient centrifugation followed by red blood cell lysis and flow cytometry depletion of CD45 positive mononuclear cells is used to enrich CTCs from peripheral blood samples collected from patients with metastatic disease. The CTCs are then injected into immunocompromised mice; subsequently generated xenografts can be used for functional studies or harvested for molecular characterization. The primary limitation of this method is the negative selection method used for CTC enrichment. Despite this limitation, the generation of PDX models from CTCs provides a novel experimental model to be applied to prostate cancer research.

This manuscript details a method used to generate prostate cancer patient derived xenografts (PDXs) from circulating tumor cells (CTCs). The generation of PDX models from CTCs provides an alternative experimental model to study prostate cancer; the most commonly diagnosed tumor and a frequent cause of death from cancer in men.

Generación del paciente con cáncer de próstata Derivado modelos de xenoinjertos de células tumorales circulantes

Patient derived xenograft (PDX) models are gaining popularity in cancer research and are used for preclinical drug evaluation, biomarker identification, ...

Proton Therapy Delivery and Its Clinical Application in Select Solid Tumor Malignancies

Radiation therapy is a frequently used modality for the treatment of solid cancers. Although the mechanisms of cell kill are similar for all forms of radiation, the in vivo properties of photon and proton beams differ greatly and maybe exploited to optimize clinical outcomes. In particular, proton particles lose energy in a predictable manner as they pass through the body. This property is used clinically to control the depth at which the proton beam is terminated, and to limit radiation dose beyond the target region. This strategy can allow for substantial reductions in radiation dose to normal tissues located just beyond a tumor target. However, the degradation of proton energy in the body remains highly sensitive to tissue density. As a consequence, any changes in tissue density during the course of treatment may significantly alter proton dosimetry. Such changes may occur through alterations in body weight, respiration, or bowel filling/gas, and may result in unfavorable dose deposition. In this manuscript, we provide a detailed method for the delivery of proton therapy using both passive scatter and pencil beam scanning techniques for prostate cancer. Although the described procedure directly pertains to prostate cancer patients, the method may be adapted and applied for the treatment of virtually all solid tumors. Our aim is to equip readers with a better understanding of proton therapy delivery and outcomes in order to facilitate the appropriate integration of this modality during cancer therapy.

The fundamentals of radiation planning and delivery for proton therapy using prostate cancer as a model are presented. The application of these principles to other selected disease sites highlights how proton radiotherapy may enhance clinical outcomes for cancer patients.

Entrega de terapia de protones y su aplicación clínica en tumores malignos Tumor sólido seleccione

Radiation therapy is a frequently used modality for the treatment of solid cancers. Although the mechanisms of cell kill are similar for all forms of ...

An In Vivo Method for Evaluating the Gut-Blood Barrier and Liver Metabolism of Microbiota Products

The gut-blood barrier (GBB) controls the passage of nutrients, bacterial metabolites and drugs from intestinal lumen to the bloodstream. The GBB integrity is disturbed in gastrointestinal, cardiovascular and metabolic diseases, which may result in easier access of biologically active compounds, such as gut bacterial metabolites, to the bloodstream. Thus, the permeability of the GBB may be a marker of both intestinal and extraintestinal diseases. Furthermore, the increased penetration of bacterial metabolites may affect the functioning of the entire organism.
Commonly used methods for studying the GBB permeability are performed ex vivo. The accuracy of those methods is limited, because the functioning of the GBB depends on intestinal blood flow. On the other hand, commonly used in vivo methods may be biased by liver and kidney performance, as those methods are based on evaluation of urine or/and peripheral blood concentrations of exogenous markers. Here, we present a direct measurement of GBB permeability in rats using an in vivo method based on portal blood sampling, which preserves intestinal blood flow and is virtually not affected by the liver and kidney function. 
Polyurethane catheters are inserted into the portal vein and inferior vena cava just above the hepatic veins confluence. Blood is sampled at baseline and after administration of a selected marker into a desired part of the gastrointestinal tract. Here, we present several applications of the method including (1) evaluation of the colon permeability to TMA, a gut bacterial metabolite, (2) evaluation of liver clearance of TMA, and (3) evaluation of a gut-portal blood-liver-peripheral blood pathway of gut bacteria-derived short-chain fatty acids. Furthermore, the protocol may also be used for tracking intestinal absorption and liver metabolism of drugs or for measurements of portal blood pressure.

An In Vivo Method for Evaluating the Gut-Blood Barrier and Liver Metabolism of Microbiota Products

The access of nutrients, microbiota metabolites and medicines to the circulation is controlled by the gut-blood barrier (GBB). We describe a direct method for measuring the GBB permeability in vivo, which, in contrast to commonly used indirect methods, is virtually not affected by liver and kidney functions.

Un método In Vivo para evaluar la barrera intestinal-sangre y hígado metabolismo de la Microbiota de productos

The gut-blood barrier (GBB) controls the passage of nutrients, bacterial metabolites and drugs from intestinal lumen to the bloodstream. The GBB integrity ...

An Ex Vivo Tissue Culture Model for Fibrovascular Complications in Proliferative Diabetic Retinopathy

Diabetic retinopathy (DR) is the most common microvascular complication of diabetes and one of the leading causes of blindness in working-age adults. No current animal models of diabetes and oxygen-induced retinopathy develop the full-range progressive changes manifested in human proliferative diabetic retinopathy (PDR). Therefore, understanding of the disease pathogenesis and pathophysiology has relied largely on the use of histological sections and vitreous samples in approaches that only provide steady-state information on the involved pathogenic factors. Increasing evidence indicates that dynamic cell-cell and cell-extracellular matrix (ECM) interactions in the context of three-dimensional (3D) microenvironments are essential for the mechanistic and functional studies towards the development of new treatment strategies. Therefore, we hypothesized that the pathological fibrovascular tissue surgically excised from eyes with PDR could be utilized to reliably unravel the cellular and molecular mechanisms of this devastating disease and to test the potential for novel clinical interventions. Towards this end, we developed a novel method for 3D ex vivo culture of surgically-excised patient-derived fibrovascular tissue (FT), which will serve as a relevant model of human PDR pathophysiology. The FTs are dissected into explants and embedded in fibrin matrix for ex vivo culture and 3D characterization. Whole-mount immunofluorescence of the native FTs and end-point cultures allows thorough investigation of tissue composition and multicellular processes, highlighting the importance of 3D tissue-level characterization for uncovering relevant features of PDR pathophysiology. This model will allow the simultaneous assessment of molecular mechanisms, cellular/tissue processes and treatment responses in the complex context of dynamic biochemical and physical interactions within the PDR tissue architecture and microenvironment. Since this model recapitulates PDR pathophysiology, it will also be amenable for testing or developing new treatments.

Here, we present a protocol to study the pathophysiology of proliferative diabetic retinopathy by using patient-derived, surgically-excised, fibrovascular tissues for three-dimensional native tissue characterization and ex vivo culture. This ex vivo culture model is also amenable for testing or developing new treatments.

Un modelo de cultivo de tejidos Ex Vivo para las complicaciones Fibrovascular en la retinopatía diabética proliferativa

Diabetic retinopathy (DR) is the most common microvascular complication of diabetes and one of the leading causes of blindness in working-age adults. No ...