Este trabalho foi financiado por doações do Instituto Ontário de Pesquisa do Câncer (# 08NOV230), a Fundação Canadense para Inovação (# 13199), o cancro da próstata Canadá, Janssen Oncologia, o Programa Regional Cancer Londres, e apoio de doadores de John e Donna Bristol através Fundação Londres Ciências da Saúde (para ALA). LEL é apoiado por uma Frederick Banting e Charles Best Canadá Scholarship Award de Pós-Graduação de Doutorado. ALA é apoiado por uma CIHR New Investigator Award e um Prêmio Pesquisador Precoce do Ministério da Investigação e Inovação Ontário.

Todos os estudos em humanos descritos neste manuscrito foram realizados sob protocolos aprovados pelo Comitê de Ética de Pesquisa Humana da Universidade Ocidental. Todos os estudos em animais foram realizados de acordo com as recomendações do Conselho Canadense de Cuidados Animal, no âmbito de protocolos aprovados pela Western University Uso de Animais Subcomissão. 1. Padrão CTC enumeração de amostras de sangue de pacientes, utilizando o CSS 1. Coleta de sangue humano e Preparação para processamento no Instrumento Preparação <ol><li> Usando técnicas de flebotomia assépticas padrão, desenhe um mínimo de 8,0 ml de sangue humano em um tubo de 10 ml CellSave (doravante referido como o tubo de conservante CTC), que contém ácido etileno diamino (EDTA) e um conservante celular proprietária. Inverta os 5x tubo para prevenir a coagulação do sangue. As amostras podem ser processados ​​imediatamente ou armazenado à temperatura ambiente durante até 96 horas. </li><li> REMOÇÃOreagentes e CSS da geladeira e deixe aquecer até à temperatura ambiente antes de usar. </li><li> Usando uma pipeta descartável de 10 ml e pipetador automático, recolher 7,5 ml de sangue a partir do tubo de conservante CTC e dispensar lentamente sangue em tubo de um instrumento de processamento de preparação adequadamente rotulado. </li><li> Adicionar 6,5 ml de tampão de diluição de cada amostra. Misture invertendo amostra de 5x. Amostra Centrifugar a 800 xg por 10 minutos com o freio na posição &quot;off&quot;. Siga as instruções na tela do instrumento de preparação para carregar todas as amostras do paciente no sistema para processamento. As amostras devem ser processadas no prazo de 1 hora de preparação. </li></ol> 2. Preparação de Controle de Processamento no Instrumento Preparação <ol><li> Suavemente vortex o frasco controle e inverter 5x para misturar. </li><li> Com cuidado, retire a tampa do frasco de controlo e coloque um instrumento tubo processamento preparação invertido em cima do frasco destampado. Em um movimento rápido, inverter acontrolar frasco e despeje o conteúdo para dentro do tubo de processamento. Enquanto invertida, agite delicadamente as laterais do frasco de controlo para liberar qualquer conteúdo remanescente. </li><li> Retire cuidadosamente o frasco de controlo invertido a partir do tubo de processamento, garantindo que nenhum líquido é perdido e colocar de lado. Usando uma pipeta de 1000 mL, recolher qualquer conteúdo restantes do frasco e tampa e pipeta suavemente para dentro do tubo de processamento. </li><li> Siga as instruções na tela do instrumento de preparação para carregar o controle no sistema para processamento. </li></ol> 3. Digitalização de amostra sobre o Instrumento de Análise <ol><li> Siga as instruções na tela do instrumento de preparação para descarregar todas as amostras do sistema. Vagamente cap cada cartucho dispositivo magnético e toque no dispositivo magnético usando as mãos ou bancada do laboratório para libertar quaisquer bolhas que estão presos às extremidades do cartucho. Uma vez que todas as bolhas tenham sido removidos, firmemente cobre o cartucho, coloque o dispositivo magnético plana, e euncubate no escuro durante pelo menos 20 min à temperatura ambiente. As amostras devem ser digitalizados dentro de 24 horas de preparação. </li><li> Ligue o instrumento de análise e inicializar a lâmpada. Depois de aquecida (~ 15 min), coloque o cartucho de verificação do sistema para o instrumento de análise e selecione a guia teste QC. Siga as instruções na tela para executar as medidas de controle de qualidade necessários. </li><li> Coloque uma amostra para o instrumento de análise e selecione a guia Teste do Paciente. Todas as informações salvas do instrumento de preparação será exibido. Clique em Iniciar para iniciar a digitalização da amostra. O sistema irá realizar um foco grosso e detecção de borda do cartucho dispositivo magnético. </li><li> Ajuste todas as bordas, se necessário, utilizando as teclas direcionais. Selecione Aceitar. O sistema irá realizar um bom foco e iniciar a digitalização da amostra. </li><li> Após a digitalização de controle os resultados devem ser validados utilizando os critérios definidos para as células contaminadas em alta (CK + DAPI + CD45 - APC +) e baixo (CK + DAPI + CD45 - FITC +) concentrações. Após a digitalização de amostra do paciente, os resultados devem ser revistos para CTCs capturados utilizando os critérios definidos CTC (CK + DAPI + CD45 -). </li></ol> 2. CTC Caracterização de marcadores definidos pelo usuário usando o CSS 1. Preparação de marcadores definidos pelo usuário e Instrumento de Inicialização <ol><li> Diluir o anticorpo de interesse, utilizando ligação primária diluente de anticorpo para a concentração desejada em um copo de reagente marcador através da seguinte fórmula, em que a concentração de trabalho é a concentração do anticorpo após a adição à amostra e a concentração de estoque é a concentração de anticorpo na copo reagente. Para várias amostras, ajustar os volumes de anticorpos, tal como descrito na Tabela 1. Coloque o copo reagente marcador para a posição 1 no cartucho de reagente e lOAD o cartucho para CSS. Banco de Concentração = (concentração de trabalho x 850 ul) / 150 mL </li><li> Recolha de sangue, amostras de preparar, e carregar o instrumento de preparação, tal como descrito acima no padrão CTC Enumeração das amostras de sangue do paciente, utilizando o protocolo de CSS. Para habilitar disso marcador personalizado, selecione Definido pelo usuário Ensaio quando solicitado pelo instrumento de preparação. Digite o nome do marcador e selecione Salvar. Como as amostras são carregados no instrumento, o operador será solicitado a indicar qual deve receber marcador personalizado selecionando Sim ou Não, se necessário. </li></ol> 2. Amostra de digitalização de marcadores definidos pelo usuário sobre o Instrumento de Análise <ol><li> Ligue o instrumento de análise, inicializar a lâmpada, e realizar o controle de qualidade e sistemas de verificação, conforme descrito na Seção 3.2 da Norma CTC enumeração de amostras de sangue de pacientes usando o CSS </strong&gt; protocolo. </li><li> Coloque uma amostra para o instrumento de análise e selecione a guia Configuração. Para inicializar o canal FITC, selecione CellSearch CTC como o ID de Kit na seção Teste de Protocolos. A partir deste menu, selecione CTC Research, clique no botão Editar e defina o tempo de exposição se o desejar. Recomenda-se que um tempo de exposição de 1,0 seg não ser excedido quando se utiliza o kit de CSS CTC como este pode aumentar de passagem de purga para outros canais fluorescentes utilizados para a identificação do CTC. </li></ol> 3. Adaptação do CSSProtocol padrão para uso em pré-clínica do rato Modelos ** Adaptado de Veridex Mouse / Rato CellCapture Kit (não mais disponível no mercado) 1. Rato coleta de sangue e armazenamento <ol><li> Antes da recolha de sangue, funcionamento ~ 30 ul de EDTA 0,5 M, para trás e para a frente através de uma agulha G 22, deixando uma pequena quantidade de EDTA no cubo. </li><li>Coletar um mínimo de 50 mL de sangue do rato dos ratos previamente injetados com células tumorais humanas através de rotas ortotópico, veia da cauda, ​​ou intracardíacas. Recolha de sangue a partir da veia safena (para análise CTC série) ou por meio de punção cardíaca (por análise CTC terminal). Remova a agulha e distribuir sangue para a 1 ml EDTA microtainer tubo de coleta de sangue. Misture por inversão ou tubo suavemente movimento para evitar a coagulação do sangue. O sangue pode ser processado imediatamente ou armazenado à temperatura ambiente durante até 48 horas após a adição de um volume igual de CytoChex conservante celular. </li></ol> 2. CTC Enriquecimento <ol><li> Remover reagentes CSS da geladeira e deixe aquecer até à temperatura ambiente antes de usar. </li><li> Transferir o equivalente de 50 ul de sangue inteiro a um fluxo de 12 milímetros x 75 milímetros de citometria tubo. Adicionar 500 ul de tampão de diluição de cada amostra, lava-se todo o sangue que permanece sobre os lados do tubo. Se necessário, a uma curta rotação centrífugapode ser usado para coletar todo o sangue restante. </li><li> Suavemente vortex o ferrofluido anti-EpCAM e adicionar 25 ul de cada amostra, colocando a ponta da pipeta directamente para a amostra. Adicionar 25 mL de reagente de captura Enhancement e vortex suavemente para misturar. Incubar as amostras à temperatura ambiente durante 15 min. </li><li> Coloque os tubos de amostras para o ímã e incubar por 10 min. Embora os tubos de amostra estão ainda no íman, utilizar uma pipeta de vidro para aspirar cuidadosamente o líquido residual, sem tocar na parede do tubo ao lado do íman e descartar. </li></ol> 3. CTC Coloração <ol><li> Retire os tubos de amostra do íman e ressuspender em 50 mL de ácido nucléico da tintura, 50 ul de reagente de coloração, 1,5 ul de anti-rato de CD45-APC, 5,0 ul de anti-HLA-Alexa Fluor 488, e 100 ul de permeabilização Reagente. Para várias amostras, estes reagentes podem ser previamente misturados e 206,5 uL de mistura pode ser adicionada a cada tubo. Vortex suavemente para misturare incubar durante 20 min à temperatura ambiente no escuro. </li><li> Adicionar 500 mL de tampão de diluição, vortex suavemente, tubos lugar de amostra para o ímã, e incubar por 10 min. Embora os tubos de amostra estão ainda no íman, utilizar uma pipeta de vidro para aspirar cuidadosamente o líquido residual, sem tocar na parede do tubo ao lado do íman e descartar. Retire os tubos de amostra do íman e ressuspender em 350 ul de tampão de diluição. Vortex suavemente para misturar. </li></ol> 4. Magnetic dispositivo de carregamento <ol><li> Utilizando uma ponta de carregamento de gel, transferir cuidadosamente a totalidade do volume do tubo de ensaio para um cartucho no dispositivo magnético. Comece na parte inferior do cartucho e retirar lentamente a ponta medida que a amostra é distribuída. </li><li> Uma vez que toda a amostra foi transferida, vagamente cobre o cartucho dispositivo magnético e toque no dispositivo magnético usando as mãos ou bancada do laboratório para libertar quaisquer bolhas que estão presos às extremidades do cartucho, conforme descrito no Section 3.1 da Norma CTC enumeração de amostras de sangue de pacientes usando o CSS. </li><li> Pop quaisquer bolhas utilizando uma agulha esterilizada 22 G, aprisionando-entre o bisel e o bordo do cartucho. Uma vez que todas as bolhas de ter sido removido, firmemente cobre o cartucho, colocar o dispositivo magnético plana, e incubar no escuro durante pelo menos 10 min. As amostras devem ser digitalizados dentro de 24 horas de preparação. </li></ol> 5. Digitalização de amostras separadas manualmente sobre o Instrumento de Análise <ol><li> Ligue o instrumento de análise, inicializar a lâmpada, e realizar o controle de qualidade e sistemas de verificação, conforme descrito na Seção 3.2 da Norma CTC enumeração de amostras de sangue de pacientes que utilizam o protocolo CSS. </li><li> Coloque a amostra no instrumento de análise e selecione a guia Configuração. Limpe todos os dados existentes sobre o botão de dados do dispositivo magnético, clicando no botão Formatar da Amostra. Ativar o canal a FITCª definir o tempo de exposição a 1,0 seg, como descrito na Seção 2.2 do CTC Caracterização de marcadores definidos pelo usuário usando o CSS. </li><li> Clique na aba teste do paciente e selecione Editar para inserir a informação da amostra. Selecione CellSearch CTC como o ID de Kit e CTC Research como o Protocolo de Teste. Insira as informações necessárias permanecendo como indicado como o asterisco. Salve as informações da amostra e clique em Iniciar. </li></ol>

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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+epithelial-mesenchymal+transition-inducing+transcription+factors+in+primary+breast+cancer:+The+effect+of+neoadjuvant+therapy.">Expression of epithelial-mesenchymal transition-inducing transcription factors in primary breast cancer: The effect of neoadjuvant therapy.</a> Int. J. Cancer. 130 (4), 808-816 (2012).</li><li>Yu, M., Bardia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+breast+tumor+cells+exhibit+dynamic+changes+in+epithelial+and+mesenchymal+composition.">Circulating breast tumor cells exhibit dynamic changes in epithelial and mesenchymal composition.</a> Science. 339 (6119), 580-584 (2013).</li><li>Armstrong, A. J., Marengo, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumor+cells+from+patients+with+advanced+prostate+and+breast+cancer+display+both+epithelial+and+mesenchymal+markers.">Circulating tumor cells from patients with advanced prostate and breast cancer display both epithelial and mesenchymal markers.</a> Mol. Cancer Res. 9 (8), 997-1007 (2011).</li></ol>

O autor (ALA) recebeu financiamento que foi fornecida pelo Janssen Oncologia, cuja empresa-mãe Johnson &amp; Johnson também possui Janssen Diagnostics LLC, que produz reagentes e instrumentos utilizados neste artigo.

Apesar do desenvolvimento de muitas novas tecnologias CTC desde a introdução da CSS em 2004, esta técnica ainda é a única tecnologia clinicamente aprovado hoje no mercado e, portanto, é considerada o padrão ouro atual para a detecção e enumeração CTC. Este manuscrito demonstrou que embora o CSS tem padrões de controle de qualidade rigoroso que pode estar sujeito a viés de interpretação e que a identificação CTC em amostras de pacientes é muito diferente de identificação em amostras enriquecidas. Fora...

Em 2013 estima-se que 580.350 pessoas morrerão de câncer e que 1.660.290 novos casos da doença serão diagnosticados nos Estados Unidos sozinho 1. A maioria das mortes ocorrem subsequente ao desenvolvimento da doença metastática 2. A atual falta de terapias eficazes no tratamento de metástases e uma compreensão limitada da cascata metastática faz nesta fase da doença altamente letal. A presença de células tumorais circulantes (CTCs) na corrente sanguínea tem sido demonstrada estar correlacionada com doença metastática 3. Estas células são extremamente raros e a sua detecção é indicativo de sobrevida de mama metastático 4, 5 da próstata, colo-rectal e cancro da 6. Nestes pacientes, a presença de ≥ 5 (mama e próstata) ou ≥ 3 (colorectal) CTC em 7,5 ml de sangue é indicativo de um pior prognóstico quando comparado com os pacientes com menos ou nenhuma CTC detectáveis ​​na samvolume de e sangue. Além disso, a alteração no número CTC durante ou após intervenção terapêutica tem sido demonstrado ser úteis como um indicador da resposta ao tratamento, muitas vezes, mais cedo do que as técnicas actualmente utilizadas 7-10. Estimou-se que, em pacientes com cancro metastático, CTC ocorrem com uma frequência de cerca de 1 por CTC 10 5 -10 7 células mononucleares de sangue e em pacientes com doença localizada, essa frequência pode ser ainda mais baixa (~ 1: 10 8). A natureza raras dessas células pode tornar difícil a precisão e fiabilidade detectar e analisar CTC 11. Vários métodos (avaliação previamente 12-14) têm sido utilizados para o enriquecimento e detectar estas células através da exploração de propriedades que os diferenciam dos componentes do sangue circundante. Em geral, CTC enumeração é um processo de duas etapas que exige uma etapa de enriquecimento e um passo de detecção. Tradicionalmente, as etapas de enriquecimento de contar com as diferenças de Physpropriedades iCal de CTCs (tamanho da célula, densidade, deformabilidade) ou na expressão de marcador de proteína (ou seja, a molécula de adesão de células epiteliais [EpCAM], citoqueratina [CK]). Seguindo o enriquecimento, a detecção CTC pode ser realizada em um número de maneiras diferentes, sendo o mais comum dos quais são os ensaios baseados em ácidos nucleicos e / ou citometria de abordagens. Cada uma dessas estratégias são únicos, com vantagens e desvantagens, no entanto todos eles não têm padronização; uma necessidade para a entrada no ambiente clínico. O sistema CellSearch (CSS), foi desenvolvido para proporcionar um método normalizado para a detecção e enumeração de CTC raras no sangue humano, através de microscopia de fluorescência e técnicas à base de anticorpos 4-6. Esta plataforma é actualmente considerado o padrão ouro no CTC enumeração e é a única técnica aprovado pelo os EUA Food and Drug Administration (FDA) para uso na clínica 15. O CSS é um dois consistin plataforma componenteg, (1) o sistema CellTracks Autoprep (doravante referido como o instrumento de preparação), que automatiza a preparação de amostras de sangue humano, e (2) o CellTracks Analyzer II (doravante referido como o instrumento de análise), que analisa estes amostras seguintes preparação. Para distinguir CTC contaminem leucócitos o instrumento de preparação utiliza um anticorpo mediado, separação magnética abordagem baseada em ferrofluido e fluorescência de coloração diferencial. Inicialmente, o sistema de etiquetas CTC, utilizando anticorpos anti-EpCAM conjugados com nanopartículas de ferro. A amostra é então incubada num campo magnético, e todas as células não marcadas são aspirados. Células tumorais seleccionadas são ressuspensos e incubados em um de fluorescência da mancha diferencial, que consiste de anticorpos fluorescentemente marcadas e um reagente de coloração nuclear. Finalmente, a amostra é transferida para um cartucho magnético, chamado um magnest (daqui em diante referido como o dispositivo magnético), e scanned usando o instrumento de análise. O instrumento de análise é usado para digitalizar amostras preparadas com diferentes filtros de fluorescência, cada um otimizado para a partícula fluorescente apropriado, usando uma lente objetiva de 10X. CTCs são identificadas como células que estão vinculados por anti-EpCAM, anti-pan-CK-ficoeritrina (PE) (CK8, 18, e 19), ea mancha nuclear 4 &#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). Por outro lado, os leucócitos contaminantes são identificadas como células que estão vinculados por anti-CD45-aloficocianina (APC) e DAPI. Após a análise, as células de tumor possíveis definidos por computador são apresentados ao utilizador. A partir dessas imagens, o usuário deve empregar análise qualitativa utilizando os parâmetros definidos e coloração diferencial discutidos acima para determinar quais eventos são CTCs. Além de fornecer um método padronizado para CTC enumeração, o CSS permite a caracterização molecular de CTCs com base em marcadores de proteínas de interesse. Este interrogatório cum ser efectuada ao nível de uma única célula, utilizando um isotiocianato de fluoresceína (FITC), canal de fluorescência não é necessária para a identificação CTC 16. Embora esta plataforma proporciona a capacidade para a caracterização molecular, o processo detalhado de desenvolvimento do protocolo e optimização não é bem definida. Três marcadores comercialmente disponíveis foram desenvolvidas pelo fabricante para utilização com o EAP, incluindo o receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR), o crescimento epidérmico humano do receptor do factor 2 (HER2), e factor de crescimento semelhante à insulina-1 receptor (IGF-1R). Análise HER2, em combinação com o CSS, tem sido utilizado por vários grupos para ilustrar o potencial de caracterização CTC para informar a tomada de decisão clínica e mudar potencialmente diretrizes de tratamento existentes. Por exemplo, Fehm et al. 17 demonstraram que aproximadamente um terço dos pacientes com cancro da mama com tumores HER2-primário tinha HER2 + CTC. Além disso, Liu et al.18 informou recentemente que até 50% dos pacientes com HER + câncer de mama metastático HER2 não tinha + CTCs. Herceptin, um receptor HER2 interferindo anticorpo monoclonal demonstraram beneficiar muito a pacientes cujos tumores expressam níveis suficientes de HER2, é um tratamento vulgarmente utilizado para pacientes com tumores HER2 + primárias 19-21. No entanto, esses estudos sugerem que Herceptin pode estar sendo sub-utilizada de forma otimizada e que a caracterização CTC pode ajudar na previsão de resposta ao tratamento. Em última análise, a caracterização CTC pode ter o potencial para melhorar o atendimento personalizado. Pesquisa CTC é o único que tem em grande parte utilizou uma abordagem de cabeceira-to-de bancada. Este método, ao contrário de bancada-a-cabeceira investigação, que muitas vezes pode levar anos para afetar o atendimento ao paciente, permitiu CTCs entrada rápida no ambiente clínico. No entanto, os médicos hesitam em utilizar os resultados da análise CTC no tratamento do paciente-mak decisãoção, devido a uma falta de compreensão da sua biologia subjacente. Portanto mouse modelos pré-clínicos adequados de técnicas de metástase e análise CTC complementar deve ser utilizado, a fim de investigar essas questões pendentes. Em geral, existem dois tipos de modelos pré-clínicos usados ​​para estudar a cascata metastática, (1) os modelos de metástase espontânea, o que permite o estudo de todos os passos da cascata metastática, e (2) os modelos de metástases experimentais, os quais só permitem o estudo de passos posteriores no processo metastático como extravasamento e a formação do tumor secundário 22. Modelos de metástase espontâneas, envolvem injeções de células tumorais em locais ortotópico apropriadas (por exemplo, injeção de células de câncer de próstata na próstata para o estudo do câncer de próstata). As células são então dado tempo para formar os tumores primários e metástase espontânea para locais secundários, tais como o osso, pulmão, e nódulos linfáticos. Emcontraste, os modelos de metástase experimentais envolvem injeção direta de células tumorais na corrente sanguínea (por exemplo, via veia da cauda ou injeção intracardíaca às células-alvo para locais específicos) e, portanto, ignorar as etapas iniciais de intravasation e disseminação para os órgãos secundários 22. Até agora, a maioria das análises CTC em sistemas modelo in vivo tem sido realizada utilizando qualquer 23 ou adaptados CTC técnicas à base de citometria de base humana (por exemplo, AdnaTest) 24. Embora útil, nenhuma dessas técnicas reflete adequadamente CTC enumeração usando o padrão ouro CSS. Com base na aprovação clínica, natureza padronizada, e o uso generalizado do CSS, o desenvolvimento de uma técnica de captura e detecção do CTC para modelar in vivo que utiliza a preparação da amostra equivalente, processamento, e critérios de identificação seria vantajoso que os resultados sejam comparáveis ​​àqueles obtido a partir de amostras de doentes. No entanto, devido ao volume de requirements do instrumento de preparação não é possível processar pequenas quantidades de sangue, utilizando esta plataforma automatizada. . Além disso, o trabalho anterior por Eliane et al 25 demonstraram que a contaminação das amostras com células epiteliais do mouse (que também se enquadram na definição CTC padrão [EpCAM + CK + DAPI + CD45 -]) pode levar a erros de classificação de rato células epiteliais escamosas como CTCs. Para tratar dessas questões de uma técnica adaptada que permite a utilização dos reagentes CSS CTC combinados com um procedimento de isolamento manual foi desenvolvido. A adição de um antigénio de leucócitos humanos marcados com FITC (HLA) de anticorpos para o doseamento permite que as células de tumor humano a ser distinguido de rato células epiteliais escamosas. Este manuscrito descreve o padrão, desenvolvido comercialmente e protocolo CSS otimizado para o processamento de amostras de pacientes de sangue e armadilhas comuns que podem ser encontrados, incluindo discrepânciast itens que podem levar a erros de classificação do CTC. Além disso, a personalização do ensaio CSS para examinar as características de proteína definida pelo utilizador de CTC capturados e uma técnica CSS comparável adaptado que permite o enriquecimento e a detecção dos CTC de pequenos volumes de sangue de rato, em modelos pré-clínicos de metástases são descritos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="790">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">REAGENTS</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">0.5M EDTA</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Anti-human CD44-FITC</td>
			<td style="width:175px;">BD Pharmigen&#160;</td>
			<td style="width:161px;">555478</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Anti-human CD44-PE</td>
			<td style="width:175px;">BD Pharmigen&#160;</td>
			<td style="width:161px;">555479</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Anti-human HLA-AlexaFluor488</td>
			<td style="width:175px;">BioLegend</td>
			<td style="width:161px;">311415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Anti-mouse CD45-APC</td>
			<td style="width:175px;">eBioscience</td>
			<td style="width:161px;">17-0451-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Bond Primary Antibody Diluent</td>
			<td style="width:175px;">Leica</td>
			<td style="width:161px;">AR9352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:267px;">CellSave Preservative Tubes</td>
			<td style="width:175px;">Veridex</td>
			<td style="width:161px;">952820 (20 pack)&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 79100005 (100 pack)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">CellSearch CTC Control Kit</td>
			<td style="width:175px;">Veridex</td>
			<td style="width:161px;">7900003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">CellSearch CTC Kit</td>
			<td style="width:175px;">Veridex</td>
			<td style="width:161px;">7900001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">CellSearch CXC Control Kit</td>
			<td style="width:175px;">Veridex</td>
			<td style="width:161px;">7900018RUO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">CellSearch CXC Kit</td>
			<td style="width:175px;">Veridex</td>
			<td style="width:161px;">7900017RUO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Instrument Buffer</td>
			<td style="width:175px;">Veridex</td>
			<td style="width:161px;">7901003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:267px;">Streck Cell Preservative (aka CytoChex)</td>
			<td style="width:175px;">Streck</td>
			<td>213350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">EQUIPMENT</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">1 ml syringe</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">10 ml serological pipette</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">1000&#181;l pipette</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">1000&#181;l pipette tips</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">12 x 75mm flow tubes</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">200&#181;l gel loading tips</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">200&#181;l pipette</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">22 gauge needle</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">5 3/4&#34; disposible pasteur pipet</td>
			<td style="width:175px;">VWR</td>
			<td style="width:161px;">14672-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:267px;">5 ml serological pipette</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:267px;">Automated pipettor</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:267px;">Capillary Blood Collection Tube (EDTA)</td>
			<td style="width:175px;">BD Microtainer</td>
			<td style="width:161px;">365974</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">CellSearch Analyzer II</td>
			<td style="width:175px;">Veridex</td>
			<td style="width:161px;">9555</td>
			<td rowspan="2" style="width:188px;">Includes magnests and verification cartirdges</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">CellSearch AutoPrep System</td>
			<td style="width:175px;">Veridex</td>
			<td style="width:161px;">9541</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">MagCellect Magnet&#160;</td>
			<td style="width:175px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:161px;">MAG997</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Small Latex Bulb</td>
			<td style="width:175px;">VWR</td>
			<td>82024-550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Vortex</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

adaptation of semiautomated circulating tumor cell (ctc) assays for clinical and preclinical research applications

A maioria das mortes relacionadas ao câncer ocorrem subseqüente para o desenvolvimento da doença metastática. Este estádio da doença altamente letal está associada com a presença de células tumorais (CTCs) circulante. Estas células raras foram demonstrou ser de relevância clínica em mama metastático, próstata e colorretal. O atual padrão ouro na detecção clínica CTC e enumeração é o sistema CellSearch aprovado pela FDA (CSS). Este manuscrito descreve o protocolo padrão utilizado por esta plataforma, bem como dois protocolos adicionais adaptados que descrevem o processo detalhado de optimização marcador definido pelo utilizador para a caracterização da proteína de CTC paciente e um protocolo similar para o CTC captura em volumes muito baixos de sangue, usando o padrão reagentes de estilo CSS, para estudar em modelos de ratos pré-clínicos in vivo de metástase. Além disso, as diferenças de qualidade entre CTC sangue doador saudável enriquecida com células de cultura de tecidos contra samp sangue do pacienteles são realçados. Finalmente, vários itens comumente discrepantes que podem levar a erros de classificação do CTC são delineadas. Tomados em conjunto, estes protocolos irá fornecer um recurso útil para os utilizadores desta plataforma interessados ​​em pesquisa pré-clínica e clínica pertencente a metástase e CTCs.

Padrão CTC enumeração Assay A sensibilidade e especificidade do CSS tem sido bem documentada na literatura. No entanto, para validar a recuperação CTC equivalente, cravado (1.000 LNCaP células cancerosas da próstata humana) e amostras de sangue humano não enriquecido de doadores voluntários saudáveis ​​foram processados ​​no CSS usando o protocolo CSSCTC padrão. Como esperado, as amostras não enriquecido estavam livres dos CTC, 0,00 ± 0,00%, e a recuperação do CTC mostrou...

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Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell CTC Assays for Clinical and Preclinical Research Applications

As células tumorais circulantes (CTCs) são prognóstico em vários tipos de câncer metastático. Este manuscrito descreve o sistema padrão ouro CellSearch (CSS) CTC plataforma enumeração e destaca os erros comuns erros de classificação. Além disso, dois protocolos adaptados são descritos para o marcador caracterização definida pelo usuário de CTCs e CTC enumeração em modelos de ratos pré-clínicos de metástase que utilizam esta tecnologia.

Adaptação do Semi-Automática de circulação Tumor de Células (CTC) Ensaios para aplicações clínicas e pré-clínica de Pesquisa

The majority of cancer-related deaths occur subsequent to the development of metastatic disease. This highly lethal disease stage is associated with the ...

adaptation-semiautomated-circulating-tumor-cell-ctc-assays-for

Research

JoVE Journal

Medicine

Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell (CTC) Assays for Clinical and Preclinical Research Applications

15.8K visualizações.  London Health Sciences Centre.  As células tumorais circulantes (CTCs) são prognóstico em vários tipos de câncer metastático. Este manuscrito descreve o sistema padrão ouro CellSearch (CSS) CTC plataforma enumeração e destaca os erros comuns erros de classificação. Além disso, dois protocolos adaptados são descritos para o marcador caracterização definida pelo usuário de CTCs e CTC enumeração em modelos de ratos pré-clínicos de metástase que utilizam esta tecnologia. 

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Processing of Primary Brain Tumor Tissue for Stem Cell Assays and Flow Sorting

Brain tumors are typically comprised of morphologically diverse cells that express a variety of neural lineage markers. Only a relatively small fraction of cells in the tumor with stem cell properties, termed brain tumor initiating cells (BTICs), possess an ability to differentiate along multiple lineages, self-renew, and initiate tumors in vivo. We applied culture conditions originally used for normal neural stem cells (NSCs) to a variety of human brain tumors and found that this culture method specifically selects for stem-like populations. Serum-free medium (NSC) allows for the maintenance of an undifferentiated stem cell state, and the addition of bFGF and EGF allows for the proliferation of multi-potent, self-renewing, and expandable tumorspheres.
To further characterize each tumor's BTIC population, we evaluate cell surface markers by flow cytometry. We may also sort populations of interest for more specific characterization. Self-renewal assays are performed on single BTICs sorted into 96 well plates; the formation of tumorspheres following incubation at 37 &deg;C indicates the presence of a stem or progenitor cell. Multiple cell numbers of a particular population can also be sorted in different wells for limiting dilution analysis, to analyze self-renewal capacity. We can also study differential gene expression within a particular cell population by using single cell RT-PCR.
The following protocols describe our procedures for the dissociation and culturing of primary human samples to enrich for BTIC populations, as well as the dissociation of tumorspheres. Also included are protocols for staining for flow cytometry analysis or sorting, self-renewal assays, and single cell RT-PCR.

The identification of brain tumor initiating cells (BTICs), the rare cells within a heterogeneous tumor possessing stem cell properties, provides new insights into human brain tumor pathogenesis. We have refined specific culture conditions to enrich for BTICs, and we routinely use flow cytometry to further enrich these populations. Self-renewal assays and transcript analysis by single cell RT-PCR can subsequently be performed on these isolated cells.

Processamento de tecido primário do tumor cerebral para Ensaios de Células Tronco e Fluxo de Classificando

Brain tumors are typically comprised of morphologically diverse cells that express a variety of neural lineage markers. Only a relatively small fraction ...

Medicina

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for progression-free and overall survival. Therefore, translational research needs to provide further molecular evidence to improve targeted therapies for malignant melanomas. In the past, oncogenic mechanisms related to melanoma were extensively studied in established cell lines. On the way to more personalized treatment regimens based on individual genetic profiles, we propose to use patient-derived cell lines instead of generic cell lines. Together with high quality clinical data, especially on patient follow-up, these cells will be instrumental to better understand the molecular mechanisms behind melanoma progression.
Here, we report the establishment of primary melanoma cultures from dissected fresh tumor tissue. This procedure includes mincing and dissociation of the tissue into single cells, removal of contaminations with erythrocytes and fibroblasts as well as primary culture and reliable verification of the cells' melanoma origin.
Recent reports revealed that melanomas, like the majority of tumors, harbor a small subpopulation of cancer stem cells (CSCs), which seem to exclusively fuel tumor initiation and progression towards the metastatic state. One of the key markers for CSC identification and isolation in melanoma is CD133. To isolate CD133+ CSCs from primary melanoma cultures, we have modified and optimized the Magnetic-Activated Cell Sorting (MACS) procedure from Miltenyi resulting in high sorting purity and viability of CD133+ CSCs and CD133- bulk, which can be cultivated and functionally analyzed thereafter.

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

This article describes the preparation of freshly obtained melanoma tissue into primary cell cultures, and how to remove contaminations of erythrocytes and fibroblasts from the tumor cells. Finally, we describe how CD133+ putative melanoma stem cells are sorted from the CD133- bulk using Magnetic Activated Cell Sorting (MACS).

Cultura de Células e Isolamento paciente Derivado de CD133<sup&gt; +</sup&gt; Células-tronco de câncer putativos Melanoma

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for ...

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. Here, we describe a general protocol for cell labeling, imaging, and image processing. The technique is applicable to various cell types and animal models, although here we focus on a typical mouse model for tracking murine immune cells. The most important issues for cell labeling are described, as these are relevant to all models. Similarly, key imaging parameters are listed, although the details will vary depending on the MRI system and the individual setup. Finally, we include an image processing protocol for quantification. Variations for this, and other parts of the protocol, are assessed in the Discussion section. Based on the detailed procedure described here, the user will need to adapt the protocol for each specific cell type, cell label, animal model, and imaging setup. Note that the protocol can also be adapted for human use, as long as clinical restrictions are met.

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

We describe a general protocol for in vivo cell tracking using MRI in a mouse model with ex vivo labeled cells. A typical protocol for cell labeling, image acquisition processing and quantification is included.

In vivo 19 F MRI para Rastreamento celular

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. ...

A Novel in vivo Gene Transfer Technique and in vitro Cell Based Assays for the Study of Bone Loss in Musculoskeletal Disorders

Differentiation and activation of osteoclasts play a key role in the development of musculoskeletal diseases as these cells are primarily involved in bone resorption. Osteoclasts can be generated in vitro from monocyte/macrophage precursor cells in the presence of certain cytokines, which promote survival and differentiation. Here, both in vivo and in vitro techniques are demonstrated, which allow scientists to study different cytokine contributions towards osteoclast differentiation, signaling, and activation. The minicircle DNA delivery gene transfer system provides an alternative method to establish an osteoporosis-related model is particularly useful to study the efficacy of various pharmacological inhibitors in vivo. Similarly, in vitro culturing protocols for producing osteoclasts from human precursor cells in the presence of specific cytokines enables scientists to study osteoclastogenesis in human cells for translational applications. Combined, these techniques have the potential to accelerate drug discovery efforts for osteoclast-specific targeted therapeutics, which may benefit millions of osteoporosis and arthritis patients worldwide.

A Novel in vivo Gene Transfer Technique and in vitro Cell Based Assays for the Study of Bone Loss in Musculoskeletal Disorders

Differentiation of precursor cells into osteoclasts is regulated by cytokines and growth factors. Here, a novel gene transfer technique for differentiation of osteoclasts in vivo and cell culture protocols for differentiating precursor cells into osteoclasts in vitro as a method to study the effects of cytokines on osteoclastogenesis are described.

A Novel<em&gt; In vivo</em&gt; Técnica Gene Transferência e<em&gt; In vitro</em&gt; Ensaios baseados em células para o Estudo da perda óssea em Distúrbios Osteomusculares

Differentiation and activation of osteoclasts play a key role in the development of musculoskeletal diseases as these cells are primarily involved in bone ...

Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a potential source of cells for regenerative medicine. The reason for this interest is evidence that these cells have highly multipotent differentiation ability, low immunogenicity, and anti-inflammatory functions. These properties have prompted researchers to investigate the potential of hAECs to be used to treat a variety of diseases and disorders in pre-clinical animal studies with much success.
hAECs have found widespread application for the treatment of a range of diseases and disorders. Potential clinical applications of hAECs include the treatment of stroke, multiple sclerosis, liver disease, diabetes and chronic and acute lung diseases. Progressing from pre-clinical animal studies into clinical trials requires a higher standard of quality control and safety for cell therapy products. For safety and quality control considerations, it is preferred that cell isolation protocols use animal product-free reagents. 
We have developed protocols to allow researchers to isolate, cryopreserve and culture hAECs using animal product-free reagents. The advantage of this method is that these cells can be isolated, characterized, cryopreserved and cultured without the risk of delivering potentially harmful animal pathogens to humans, while maintaining suitable cell yields, viabilities and growth potential. For researchers moving from pre-clinical animal studies to clinical trials, these methodologies will greatly accelerate regulatory approval, decrease risks and improve the quality of their therapeutic cell population.

We describe a protocol to isolate and culture human amnion epithelial cells (hAECs) using animal product-free reagents in accordance with current good manufacturing practices (cGMP) guidelines.

Isolamento, criopreservação e cultivo de células epiteliais humanas Amnion para aplicações clínicas

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a ...

Ex Vivo Treatment Response of Primary Tumors and/or Associated Metastases for Preclinical and Clinical Development of Therapeutics

The molecular analysis of established cancer cell lines has been the mainstay of cancer research for the past several decades. Cell culture provides both direct and rapid analysis of therapeutic sensitivity and resistance. However, recent evidence suggests that therapeutic response is not exclusive to the inherent molecular composition of cancer cells but rather is greatly influenced by the tumor cell microenvironment, a feature that cannot be recapitulated by traditional culturing methods. Even implementation of tumor xenografts, though providing a wealth of information on drug delivery/efficacy, cannot capture the tumor cell/microenvironment crosstalk (i.e., soluble factors) that occurs within human tumors and greatly impacts tumor response. To this extent, we have developed an ex vivo (fresh tissue sectioning) technique which allows for the direct assessment of treatment response for preclinical and clinical therapeutics development. This technique maintains tissue integrity and cellular architecture within the tumor cell/microenvironment context throughout treatment response providing a more precise means to assess drug efficacy.

Ex Vivo Treatment Response of Primary Tumors and/or Associated Metastases for Preclinical and Clinical Development of Therapeutics

Established cancer cell lines and xenografts have been the mainstay of cancer research for the past several decades. However, recent evidence suggests that therapeutic response is greatly influenced by the tumor cell microenvironment. Therefore, we have developed an ex vivo analysis of primary tumor specimens for drug development purposes.

Ex Vivo resposta ao tratamento de tumores primários e / ou Associated Metástases para pré-clínica e clínica de Desenvolvimento Therapeutics

The molecular analysis of established cancer cell lines has been the mainstay of cancer research for the past several decades. Cell culture provides both ...

Isolation and Propagation of Circulating Tumor Cells from a Mouse Cancer Model

Cancer metastasis is the foremost cause of cancer-associated deaths. Recent studies have shown that circulating tumor cells (CTCs) are important in cancer metastasis. Indeed, the number of CTCs correlates with tumor size. Here, a detailed description is provided of a methodology for isolation and propagation of CTCs from a syngeneic mouse model of hepatocellular carcinoma (HCC) which allows for downstream analysis of potentially important molecular mechanisms of solid organ tumor metastasis. This method is efficient and reproducible. It is a non-invasive technique and, therefore, has potential to replace the invasive biopsy of tissues from humans which may be associated with complications. Therefore, the method discussed here allows for the isolation and propagation of CTCs from whole blood samples such that they can be examined and characterized. This has potential for future adaptation for clinical applications such as diagnosis, and personalized targeted therapy.

Circulating tumor cells (CTCs) have been shown to play an important role in tumor metastasis. Here, a method for the isolation and propagation of CTCs from the whole blood of a syngeneic mouse tumor model of hepatocellular carcinoma (HCC) metastasis is described.

Isolamento e propagação de células tumorais circulantes de um cancro do modelo do rato

Cancer metastasis is the foremost cause of cancer-associated deaths. Recent studies have shown that circulating tumor cells (CTCs) are important in cancer ...

Generation of Prostate Cancer Patient Derived Xenograft Models from Circulating Tumor Cells

Patient derived xenograft (PDX) models are gaining popularity in cancer research and are used for preclinical drug evaluation, biomarker identification, biologic studies, and personalized medicine strategies. Circulating tumor cells (CTC) play a critical role in tumor metastasis and have been isolated from patients with several tumor types. Recently, CTCs have been used to generate PDX experimental models of breast and prostate cancer. This manuscript details the method for the generation of prostate cancer PDX models from CTCs developed by our group. Advantages of this method over conventional PDX models include independence from surgical sample collection and generating experimental models at various disease stages. Density gradient centrifugation followed by red blood cell lysis and flow cytometry depletion of CD45 positive mononuclear cells is used to enrich CTCs from peripheral blood samples collected from patients with metastatic disease. The CTCs are then injected into immunocompromised mice; subsequently generated xenografts can be used for functional studies or harvested for molecular characterization. The primary limitation of this method is the negative selection method used for CTC enrichment. Despite this limitation, the generation of PDX models from CTCs provides a novel experimental model to be applied to prostate cancer research.

This manuscript details a method used to generate prostate cancer patient derived xenografts (PDXs) from circulating tumor cells (CTCs). The generation of PDX models from CTCs provides an alternative experimental model to study prostate cancer; the most commonly diagnosed tumor and a frequent cause of death from cancer in men.

Geração de paciente com câncer de próstata Derivado modelos de xenotransplante de células tumorais circulantes

Patient derived xenograft (PDX) models are gaining popularity in cancer research and are used for preclinical drug evaluation, biomarker identification, ...

An In Vivo Method for Evaluating the Gut-Blood Barrier and Liver Metabolism of Microbiota Products

The gut-blood barrier (GBB) controls the passage of nutrients, bacterial metabolites and drugs from intestinal lumen to the bloodstream. The GBB integrity is disturbed in gastrointestinal, cardiovascular and metabolic diseases, which may result in easier access of biologically active compounds, such as gut bacterial metabolites, to the bloodstream. Thus, the permeability of the GBB may be a marker of both intestinal and extraintestinal diseases. Furthermore, the increased penetration of bacterial metabolites may affect the functioning of the entire organism.
Commonly used methods for studying the GBB permeability are performed ex vivo. The accuracy of those methods is limited, because the functioning of the GBB depends on intestinal blood flow. On the other hand, commonly used in vivo methods may be biased by liver and kidney performance, as those methods are based on evaluation of urine or/and peripheral blood concentrations of exogenous markers. Here, we present a direct measurement of GBB permeability in rats using an in vivo method based on portal blood sampling, which preserves intestinal blood flow and is virtually not affected by the liver and kidney function. 
Polyurethane catheters are inserted into the portal vein and inferior vena cava just above the hepatic veins confluence. Blood is sampled at baseline and after administration of a selected marker into a desired part of the gastrointestinal tract. Here, we present several applications of the method including (1) evaluation of the colon permeability to TMA, a gut bacterial metabolite, (2) evaluation of liver clearance of TMA, and (3) evaluation of a gut-portal blood-liver-peripheral blood pathway of gut bacteria-derived short-chain fatty acids. Furthermore, the protocol may also be used for tracking intestinal absorption and liver metabolism of drugs or for measurements of portal blood pressure.

An In Vivo Method for Evaluating the Gut-Blood Barrier and Liver Metabolism of Microbiota Products

The access of nutrients, microbiota metabolites and medicines to the circulation is controlled by the gut-blood barrier (GBB). We describe a direct method for measuring the GBB permeability in vivo, which, in contrast to commonly used indirect methods, is virtually not affected by liver and kidney functions.

Um método In Vivo para avaliar a barreira de sangue do intestino e metabolismo hepático da Microbiota produtos

The gut-blood barrier (GBB) controls the passage of nutrients, bacterial metabolites and drugs from intestinal lumen to the bloodstream. The GBB integrity ...

An Ex Vivo Tissue Culture Model for Fibrovascular Complications in Proliferative Diabetic Retinopathy

Diabetic retinopathy (DR) is the most common microvascular complication of diabetes and one of the leading causes of blindness in working-age adults. No current animal models of diabetes and oxygen-induced retinopathy develop the full-range progressive changes manifested in human proliferative diabetic retinopathy (PDR). Therefore, understanding of the disease pathogenesis and pathophysiology has relied largely on the use of histological sections and vitreous samples in approaches that only provide steady-state information on the involved pathogenic factors. Increasing evidence indicates that dynamic cell-cell and cell-extracellular matrix (ECM) interactions in the context of three-dimensional (3D) microenvironments are essential for the mechanistic and functional studies towards the development of new treatment strategies. Therefore, we hypothesized that the pathological fibrovascular tissue surgically excised from eyes with PDR could be utilized to reliably unravel the cellular and molecular mechanisms of this devastating disease and to test the potential for novel clinical interventions. Towards this end, we developed a novel method for 3D ex vivo culture of surgically-excised patient-derived fibrovascular tissue (FT), which will serve as a relevant model of human PDR pathophysiology. The FTs are dissected into explants and embedded in fibrin matrix for ex vivo culture and 3D characterization. Whole-mount immunofluorescence of the native FTs and end-point cultures allows thorough investigation of tissue composition and multicellular processes, highlighting the importance of 3D tissue-level characterization for uncovering relevant features of PDR pathophysiology. This model will allow the simultaneous assessment of molecular mechanisms, cellular/tissue processes and treatment responses in the complex context of dynamic biochemical and physical interactions within the PDR tissue architecture and microenvironment. Since this model recapitulates PDR pathophysiology, it will also be amenable for testing or developing new treatments.

Here, we present a protocol to study the pathophysiology of proliferative diabetic retinopathy by using patient-derived, surgically-excised, fibrovascular tissues for three-dimensional native tissue characterization and ex vivo culture. This ex vivo culture model is also amenable for testing or developing new treatments.

Um modelo de cultura de tecidos de Ex Vivo para fibrovasculares complicações retinopatia diabética proliferativa

Diabetic retinopathy (DR) is the most common microvascular complication of diabetes and one of the leading causes of blindness in working-age adults. No ...