Este protocolo describe un método para la enumeración de glóbulos rojos y el aislamiento clínico de CTC. Para comenzar, se cultivan las células tumorales MCF-7, MDA-MB-231 y HeLa en un matraz de cultivo celular a una vez de 10 a la quinta en un milímetro de DMEM, suplementado con 10% de suero fetal bovino y 1% de penicilina-estreptomicina. Incubar las células a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono.
Cuando las líneas celulares crezcan como monocapas adherentes al 95% de confluencia, sepárelas de la placa de cultivo con una solución de tripsina al 0,25% durante dos minutos. Tiña las células tumorales agregando tres microlitros de Calceína AM y coloca la placa en la incubadora durante 30 minutos. Al final de la incubación, digiere todas las células con tripsina.
Contar las células tumorales cultivadas en PBS con una cámara de recuento de células y diluir hasta obtener 100 células tumorales por mililitro de PBS. A continuación, introduzca la suspensión celular diluida en el chip microfluídico utilizando una jeringa con una bomba de jeringa a caudales variados. Obtenga la eficiencia de captura para los distintos caudales y determine el caudal óptimo.
Cuente el número de células tumorales capturadas en el chip y que salen de la salida. Calcule la eficiencia de captura utilizando la fórmula dada. Repita el procedimiento para obtener la eficiencia de captura para diferentes números de células tumorales, de 10 a 100.
Pruebe y valide el chip microfluídico para detectar un número raro de células tumorales. Inyecte estas 10 suspensiones de muestra en los chips microfluídicos utilizando una aguja hueca hecha con un extractor de micropipetas para aspirar las células tumorales diluidas. Detecte y enumere el número de células tumorales para cada muestra después de su captura en el chip.
A continuación, tiñe las células tumorales con Calcein AM y enumera 100 células tumorales en cinco microlitros de PBS. Coloque estas células en un mililitro de muestra de sangre normal entera. Introduzca estas células en el chip y enumere el número de células tumorales capturadas en el chip con inmunofluorescencia verde.
Realice la enumeración in vivo como se describe y calcule la eficiencia de captura después de la captura. Enumere de una a 10 células tumorales sin tinción. Convierte estas células en un mililitro de sangre entera normal.
Introducir estas muestras en el chip microfluídico y capturar las células tumorales. Agregue de tres a cinco microlitros de tinte fluorescente en 20 a 30 microlitros de PBS e introduzca esta solución en el chip con una jeringa. Enumere el número de células tumorales capturadas en el chip con inmunofluorescencia azul y verde para determinar la eficiencia de captura.
A continuación, modifique la superficie del chip con 100 microlitros de trimetoxisilano de mercaptopropilo al 4%3 y etanol a temperatura ambiente durante 45 minutos para la captura basada en la afinidad de la molécula de adhesión celular antiepitelial. Al final de la incubación, lave el chip tres veces con etanol. Luego agregue 100 microlitros del agente de acoplamiento GMBS y déjelo interactuar durante 30 minutos.
Al final de la incubación, use una jeringa para lavar el chip tres veces con un mililitro de PBS. Trate el chip con 30 a 40 microlitros de neutravidina de 10 microgramos por mililitro a temperatura ambiente durante 30 minutos, lo que lleva a la inmovilización de las células en el GMBS, y luego enjuague con PBS para eliminar el exceso de avidina. Modifique el chip con tres microlitros de anticuerpo antimolécula de adhesión de células epiteliales biotiniladas e incube durante la noche.
Todas las células tumorales se capturaron alrededor de la matriz del chip de onda sin que faltara ninguna célula, lo que indica la alta eficiencia de captura del chip microfluídico. Aquí se muestran las células tumorales teñidas con Hoechst y Calcein AM. Aquí se muestran las CTC de un paciente con cáncer gástrico capturadas con microfiltros de elipse pequeños.
Además, se muestran CTC de un paciente con cáncer colorrectal capturadas con microfiltros trapezoidales y que emiten fluorescencia azul y verde. Se observó una alta eficiencia de captura y viabilidad para las células tumorales capturadas con microfiltros de elipse grandes. El análisis clínico de inmunofluorescencia de las CTC colorrectales capturadas en el chip microfluídico reconoció las CTC como DAPI positivas, CK-positivas, CD45-negativas, y los leucocitos como DAPI-positivos, CK-negativos, CD45-positivos.
Aquí se muestran las células tumorales colorrectales cultivadas en el chip de elipse grande después de la captura, y las células tumorales colorrectales capturadas en los microfiltros de elipse grande. Este método de modificación con aptámero proporciona un nuevo enfoque para enriquecer el aislamiento de CTC.
