Este trabajo es apoyado por una beca de Desarrollo Nacional Científico de la Asociación Americana del Corazón: 10SDG3500034 y UTMB-BCN en marcha los fondos de SSM. Los autores reconocen las instalaciones Cryo-EM y Computación Científica en el Centro de Sealy de Biología Estructural en UTMB ( <a href="http://www.scsb.utmb.edu">www.scsb.utmb.edu</a> ), así como los Dres. Steve Ludtke y Ed Egelman ayuda con los algoritmos de reconstrucción helicoidales en 2D y 3D.

1. Preparación de la muestra <ol><li> El cambio de tampón de FVIII humano de BDD-14 y porcino de FVIII BDD-15 contra el tampón HBS-Ca (HEPES 20 mM, NaCl 150 mM, CaCl2 5 mM, pH = 7,4) y se concentran a 1,2 mg / ml. Mantenga la solución de proteína a -80 ° C. </li><li> Preparar nanotubos de lípidos (LNT) mezclando galactosilceramida (GC) y fosfatidilserina (PS) en 01:04 w / w proporción en cloroformo. Evaporar el cloroformo en atmósfera de argón y solubilizar los lípidos en tampón HBS a 1 mg / ml. Mantenga la solución LNT a 4 ° C. </li></ol> 2. Cryo-Microscopía Electrónica de FVIII-LNT <ol><li> Cryo-EM Preparación de la muestra <ol><li> Resplandor de descarga de la malla 300 Quantifoil R2 / 2 rejillas de cobre (laterales de carbono a) en una mezcla de O 2 y H 2 gas durante 10 segundos a 50 W. </li><li> Mezclar las soluciones de FVIII y LNT en tampón HBS-Ca al 01:01 w / w proporción y se incuba durante 15 min a temperatura ambiente. </li><li> Aplique una gota de 2,5 lde la muestra de FVIII-LNT a la red de microscopía electrónica hidrófilo en la cámara humidificada Vitrobot Mark IV (100% de humedad). </li><li> Blot y flash congelar la red (una mancha de 3,5 seg, fuerza borraré 1) en el líquido C 2 H 6, enfriados por N2 líquido para obtener hielo amorfo. </li><li> Rejillas tienda en cajas de almacenamiento bajo N2 líquido (LN2). </li></ol></li><li> Cryo-EM Data Collection NOTA: El JEM2100-LaB6 (año 2010) está equipada con un sistema operativo Temcon que consiste en un ordenador conectado a la microscopio electrónico, una pantalla con ventanas de lectura del sistema de vacío, sistema de iluminación, HT, corrientes de lentes y de modo-en, y dos paneles: izquierda y derecha, colocada en ambos lados de la columna. El cambio de barras en cruz, perillas Y (SHIFT Y, SIFT Y) y la multifunción (DEF / STIG) perillas están en ambos paneles. En el panel izquierdo es el botón de iluminación (brigthness). En el panel de la derecha se encuentran: la ampliación (MAG / CAM LONGITUD) y enfoque (FOCUS) perillas y los tres imaging (MAG1, MAG2, LOWMAG) y una difracción modos botones (DIF). Adquirimos nuestros datos en MAG1 en alfa 2. Las condiciones mínimas dosis de iluminación (MDS) necesarios para la adquisición de datos Cryo-EM se establecen con botones F1 a F6, fila superior del panel DERECHA. En este protocolo se utiliza la configuración genéricos: F1 - levantar / pantalla inferior, F2 - modo de búsqueda, F3 - modo de enfoque, F4 - Modo PHOTO, F5 - MDS OFF / ON y F6 - RAYO BLANCO, que sirve para proteger la muestra de la radiación dañar al desviar el haz. <ol><li> Coloque la crio-soporte en la crio-estación y llenar el Dewar del titular y la crio-estación con LN2. Cuando la temperatura llega a -192 ° C, obturador abierto en la punta titular, el lugar previamente congelado rejilla Cryo-EM en el lugar designado y seguro con una abrazadera de anillo. </li><li> Inserte la crio-soporte en el microscopio electrónico. Vuelva a llenar el Dewar de la crio-soporte y la cámara contra el contaminador con LN2. Espere a que el titular se estabilice durante 30 a 60 min. Presione F6 yconvertir el filamento en. Cuando el filamento está saturado, pulse F6 obturador y abra el soporte para ver la cuadrícula. </li><li> Pulse Bajo Mag / alfa 1 (puesta a 200X mag) y localizar zonas con hielo delgado en la parrilla. </li><li> Cambiar al MAG 1/alfa 2 para establecer dosis mínima modo (MDS) y adquirir datos de Cryo-EM a dosis bajas de electrones, sin dañar la muestra. <ol><li> Presione F2 para configurar el modo de búsqueda. Set de ampliación a 40.000 x. Agrandar viga con perilla brigtness a dosis mínima de electrones ~ 0.04 e - / Å 2 · s. Presione DIF para cambiar al modo de difracción. Ajuste la longitud de la cámara de 120 cm con mando MAG / CAM LONGITUD. Localiza las zonas de la cuadrícula dentro de las zonas de pre-seleccionados en LOWMAG que tienen nanotubos de lípidos en los agujeros de la película de carbono. </li><li> Presione F4 para establecer el modo de fotos a 40.000 X de aumento y set de iluminación con botón BRILLO en dosis de 16 a 25 e - / A 2 · s. Pulse el botón Estándar Focus para establecer las condiciones de enfoque ajustando la altura Zde la muestra con los botones ARRIBA / ABAJO (Z del panel de control a la derecha). Establecer desenfoque entre -1,5 y -2,5 m. </li><li> Alinear búsqueda y el modo FOTO dibujando un cuadrado en la ventana de Vista en vivo en la pantalla de la cámara digital en modo de búsqueda correspondiente al área a explorar en el modo Foto. </li><li> Presione F3 para configurar el modo de enfoque a 100.000 aumentos. Enfoque de iluminación para cubrir el chip CCD (~ 4 - 5 cm de radio) y fuera del eje para no irradiar el área a explorar en el modo de FOTO. Ajuste de desenfoque a ~ -1,5 y -2,5 m con el botón de enfoque y correcta para el astigmatismo de la imagen con perillas DEF / STIG. </li></ol></li><li> Seleccione el FVIII-LNT en ser fotografiado en modo BUSCAR mediante la adquisición de imágenes en directo en la ventana de Vista en vivo en la pantalla de la cámara digital. Centre el FVIII-LNT en el cuadrado dibujado en la ventana de vista en directo. </li><li> Grabar una imagen digital de la cámara del CCD en 52.000 magnificación X eficaz y 0,5 segundos de exposición al cambiar a modo Foto y hacer clic en el AcquirBotón E en la micrografía pantalla de la cámara digital. Las condiciones de adquisición de imágenes se establecen como el blanco del haz (PERSIANAS) abierto sólo cuando la imagen se adquiere en el modo Foto. </li><li> Compruebe la calidad y el desenfoque de la imagen adquirida pulsando CTRL-C para obtener una transformada rápida de Fourier (FFT). </li></ol></li></ol> 3. Reconstrucción 3D NOTA: El software de análisis de imagen que se utiliza para el análisis 2D y 3D: EMAN2 y IHRSR son de libre acceso. EMAN2 se puede descargar desde http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Install. El software IHRSR se puede obtener de Profesor Egelman: egelman@virginia.edu. Los refinamientos IHRSR finales se ejecutan en el de Texas Advanced Computing cluster central: http://www.tacc.utexas.edu/ en la Universidad de Texas, Austin. El algoritmo de reconstrucción 3D se muestra en la figura 1 consta de dos pasos principales: En primer lugar la selección de un conjunto homogéneo de segmentos helicoidales (partículas) con la referencia gratuita alignme 2DNT (RFA) algoritmos implementados en EMAN 2, segunda lograr una reconstrucción en 3D basado en los parámetros helicoidales y algoritmos de retroproyección incorporados en IHRSR. El primer paso utiliza los programas desarrollados para la selección de conjuntos de partículas homogéneas para la reconstrucción 3D con sola partícula SPA (algoritmos) para los que EMAN2 ha sido desarrollado y distribuido en concreto: http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2. Este paso se ha adaptado a los datos de Cryo-EM. El segundo paso se consigue con el algoritmo IHRSR, que está diseñado específicamente para el tipo de los conjuntos helicoidales obtenidos con las formas de factor VIII recombinantes. Este algoritmo se ha documentado ampliamente a través de la literatura científica 12. <ol><li> Realizar el análisis de imágenes en 2D con la científica suite de procesamiento de imágenes EMAN2: http://blake.bcm.edu/eman2/doxygen_html 16 para seleccionar partículas homogénea (segmento helicoidal) juegos para la reconstrucción helicoidal. <ol><li> Seleccione micrografías Cryo-EM con straight y bien organizada tubos helicoidales con el software de la cámara digital y herramientas de visualización. </li><li> Invertir, Normalizar y filtrar para los píxeles de rayos X en la GUI e2workflow.py, la reconstrucción de una sola partícula opción (spr): http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2projectmanager </li><li> Importe las imágenes invertidas, normalizados y pixel de rayos X filtrada en la GUI e2helixboxer.py. Seleccione tubos helicoidales FVIII-LNT y segmento de 256 x 256 píxeles (2,9 Å / pix) con 90% de superposición usando: http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2helixboxer </li><li> Evaluar el desenfoque de las micrografías originales y aplicar la función de transferencia de contraste (CTF) corrección (sólo corrección de fase) a los segmentos helicoidales de los mismos micrografías con la opción e2ctf.py incorporado en el e2workflow.py: http://blake.bcm. edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2ctf. </li><li> Generar partículas iniciales (segmentos helicoidales) establece en el GUI e2workflow.py opción - SPR: http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2workflow. </li><li> Calcular los promedios de clase en 2D con el algoritmo e2refine2d.py aplicar referencia libre de clasificación k-mean para seleccionar conjuntos de datos homogéneos con el mismo LNT diámetro y grado de orden helicoidal (Figura 2), siguiendo el guión: &#39;e2refine2d.py - iter = 8 - naliref = 5 - nbasisfp = 8 - path = r2d_001 - entrada = INPUT.hdf - NCLS = 51 - simcmp = dot - simalign = rotate_translate_flip - classaligncmp = dot - classraligncmp = fase - classiter = 2 - classkeep = 0,8 - classnormproc = normalize.edgemean - classaverager = media - normproj-classkeepsig &#39;, cambiando el valor de este trastorno en consecuencia. <ol><li> Clasificar los datos iniciales establecidos en &#39;NCLS = 151&#39; 150 clases de más de 8 repeticiones con &#39;classkeep = 0.8&#39;, lo que significa que las partículas con menos de 80% de similitud con el promedio de la clase están excluidas de la clase dada. http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2refine2d </li><li> Combinar las partículas de los promedios de la clasecon difracción helicoidal pronunciado en e2display.py para crear conjunto de datos intermedio. </li><li> Clasificar las establecidas en 50 clases de &#39;NCLS = 51&#39; para diferenciar las clases con el mismo diámetro y el grado de orden de los datos intermedios. </li><li> Combinar las partículas de las clases con el mismo diámetro y grado de orden en e2display.py para crear el conjunto de datos finales para la reconstrucción en tres dimensiones: http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/emselector. </li></ol></li></ol></li><li> Realizar la reconstrucción helicoidal con el algoritmo iterativo helicoidal real espacio Reconstrucción (IHRSR), como se describe en Egelman 17, 18. <ol><li> Estimar la subida, Delta Z (A) de la hélice FVIII-LNT Del Fourier transformar combinado de las partículas en el conjunto de datos final. </li><li> Definir el ángulo azimutal ΔΦ (º) mediante la ejecución de mejoras IHRSR paralelas con un Delta Z constante, aumentando ΔΦ de 576; a 60 ° en incrementos de 5 °. </li><li> Correr 100 ciclos IHRSR consecutivos para el grupo con un cilindro sin rasgos como un volumen inicial y los parámetros helicoidales iniciales Delta Z y ΔΦ definidos en 3.2.1 cada dato de finales. y 3.2.2. </li><li> Inspeccione los volúmenes finales de la convergencia de los parámetros helicoidales y la correspondencia entre los promedios de la clase de la clasificación 2D del conjunto final de datos y las proyecciones de la reconstrucción IHRSR final. </li><li> Imponer la simetría de las reconstrucciones en 3D finales, correspondiente a la distribución unidad asimétrica observado en los últimos volúmenes 3D asimétricos: 4 veces para el FVIII humano-LNT y 5 veces para el FVIII porcino-LNT. Ejecute otros 100 ciclos de perfeccionamiento para generar una reconstrucción 3D symmetrized final. </li><li> Calcula la curva de correlación Fourier Shell para ambos volúmenes separando primero los datos correspondientes establecidos en pares e impares: &#39;e2proc2d.py &lt;infile&gt; &lt;Outfile&gt; - split = 2 &#39;. A continuación, ejecute 100 IHRSR refinamientos consecutivos como se describe en 3.2.3. Calcular la FSC de los volúmenes 3D creados a partir de los conjuntos de datos de pares e impares: &#39;e2proc3d.py evenvolume.mrc fsc.txt - calcfsc = oddmap.mrc&#39;. </li></ol></li><li> Visualizar y Segmento los volúmenes FVIII-LNT en UCSF quimera. </li><li><ol><li> Abra los volúmenes finales de la etapa 3.2.5. en UCSF Chimera y establecer el nivel de contorno a 0.005 en el Herramientas&gt; DATOS VOLUMEN&gt; opción Volume Viewer. </li><li> En Herramientas&gt; DATOS VOLUMEN&gt; mapa de segmentos, seleccione el volumen en la pestaña de mapa de segmentos y hacer clic en un segmento a otro volumen. </li><li> Segmentos del Grupo correspondiente a una celda unidad mediante la selección con CTRL + SHIFT y el grupo de clic. </li><li> Colorea los segmentos por celda unidad y la hélice con ACCIONES&gt; opción COLOR destacar las características estructurales. </li></ol></li></ol> 4. Tomografía electrónica <ol><li> Tinción negativa FVIII-LNT Preparación de la muestra <ol> &lt;li&gt; Prepare muestras FVIII-LNT como para los experimentos de Cryo-EM. </li><li> Las descargas luminiscentes rejilla de cobre recubierta de carbono de malla 300 (lado de carbono hacia arriba) en una mezcla de O 2 y H 2 de gas de 10 segundos a 50 W como para los experimentos de Cryo-EM. </li><li> Aplicar una gota de 2,5 l de suspensión de FVIII-LNT con 6-nm nanopartículas de oro coloidal a la red, secar el exceso de líquido y manchar negativamente por la aplicación de 5 l solución de 1% de acetato de uranilo durante 2 min. Seque el exceso de líquido y secar la rejilla. </li></ol></li><li> Tomografía electrónica de recopilación de datos <ol><li> Transfiera la red en el soporte de inclinación individual. </li><li> Transferir el titular en el microscopio electrónico. </li><li> Recoger serie de inclinación automáticamente con el software SerialEM 19 a los 2 ° incrementos sobre un rango angular de -60 ° a 60 ° y grabar las imágenes con una cámara CCD a 52.000 X magnificación efectiva, -6--10 desenfoque micras y la dosis de electrones de 150 - 170 elementosctrons / A 2 · s por tomografía. </li></ol></li><li> Tomografía electrónica Reconstrucción de FVIII-LNT Nota: Reconstruir la serie inclinada pFVIII-LNT y hFVIII-LNT adquirida en 4.2. con la opción Etomo del software IMOD siguiendo el tutorial: http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/etomoTutorial.html <ol><li> El uso de una ventana de terminal, abra la tomografía en 3dmod. http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/3dmodguide.html. </li><li> Papelera de la tomografía por 4 con el IMOD BINVOL comando para disminuir el tamaño de la tomografía. </li><li> Seleccionar el ángulo correcto para girar el nanotubo de lípidos a lo largo del eje Y en la tomografía binned usando el comando IMOD ROTATEVOL. </li><li> Gire la tomografía completa con el comando IMOD ROTATEVOL. </li><li> Recortar el nanotubo de lípidos seleccionada orientada a lo largo del eje Y con el comando RESIZE CLIP IMOD. </li><li> Abra la sub-tomografía recortada con 3dmod. </li><li> Haga clic en la tomografía de visualizar la disposición de las moléculas del factor VIII a lo largo delos cortes en el eje Z ya lo largo del eje Y en el volumen sub-tomografía. </li></ol></li></ol>

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	<li>Henderson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Realizing+the+potential+of+electron+cryo-microscopy.">Realizing the potential of electron cryo-microscopy.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 37, 3-13 (2004).</li><li>Fujiyoshi, Y., Unwin, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+crystallography+of+proteins+in+membranes.">Electron crystallography of proteins in membranes.</a> Current opinion in structural biology. 18, 587-592 (2008).</li><li>Toole, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+cloning+of+a+cDNA+encoding+human+antihaemophilic+factor.">Molecular cloning of a cDNA encoding human antihaemophilic factor.</a> Nature. 312, 342-347 (1984).</li><li>Fay, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factor+VIII+structure+and+function.">Factor VIII structure and function.</a> International journal of hematology. 83, 103-108 (2006).</li><li>Stoilova-McPhie, S., Lynch, G. C., Ludtke, S. J., Pettitt, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Domain+organization+of+membrane-bound+factor+VIII.">Domain organization of membrane-bound factor VIII.</a> Biopolymers. , (2013).</li><li>Pipe, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemophilia:+new+protein+therapeutics.">Hemophilia: new protein therapeutics.</a> Hematology / the Education Program of the American Society of Hematology. American Society of Hematology. Education Program. 2010, 203-209 (2010).</li><li>Gatti, L., Mannucci, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+porcine+factor+VIII+in+the+management+of+seventeen+patients+with+factor+VIII+antibodies.">Use of porcine factor VIII in the management of seventeen patients with factor VIII antibodies.</a> Thrombosis and haemostasis. 51, 379-384 (1984).</li><li>Parmenter, C. D., Cane, M. C., Zhang, R., Stoilova-McPhie, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+microscopy+of+coagulation+Factor+VIII+bound+to+lipid+nanotubes.">Cryo-electron microscopy of coagulation Factor VIII bound to lipid nanotubes.</a> Biochemical and biophysical research communications. 366, 288-293 (2008).</li><li>Parmenter, C. D., Stoilova-McPhie, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+recombinant+human+coagulation+factor+VIII+to+lipid+nanotubes.">Binding of recombinant human coagulation factor VIII to lipid nanotubes.</a> FEBS letters. 582, 1657-1660 (2008).</li><li>Wassermann, G. E., Olivera-Severo, D., Uberti, A. F., Carlini, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helicobacter+pylori+urease+activates+blood+platelets+through+a+lipoxygenase-mediated+pathway.">Helicobacter pylori urease activates blood platelets through a lipoxygenase-mediated pathway.</a> Journal of cellular and molecular medicine. 14, 2025-2034 (2010).</li><li>Wilson-Kubalek, E. M., Chappie, J. S., Arthur, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helical+crystallization+of+soluble+and+membrane+binding+proteins.">Helical crystallization of soluble and membrane binding proteins.</a> Methods in enzymology. 481, 45-62 (2010).</li><li>Egelman, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+helical+filaments+and+tubes.">Reconstruction of helical filaments and tubes.</a> Methods in enzymology. 482, 167-183 (2010).</li><li>Lusher, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+introduction+of+recombinant+factor+VIII--a+clinician's+experience.">Development and introduction of recombinant factor VIII--a clinician's experience.</a> Haemophilia : the official journal of the World Federation of Hemophilia. 18, 483-486 (2012).</li><li>Thim, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+a+new+recombinant+factor+VIII+(N8).">Purification and characterization of a new recombinant factor VIII (N8).</a> Haemophilia : the official journal of the World Federation of Hemophilia. 16, 349-359 (2010).</li><li>Doering, C. B., Healey, J. F., Parker, E. T., Barrow, R. T., Lollar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+level+expression+of+recombinant+porcine+coagulation+factor+VIII.">High level expression of recombinant porcine coagulation factor VIII.</a> The Journal of biological chemistry. 277, 38345-38349 (2002).</li><li>Tang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EMAN2:+an+extensible+image+processing+suite+for+electron+microscopy.">EMAN2: an extensible image processing suite for electron microscopy.</a> Journal of structural biology. 157, 38-46 (2007).</li><li>Egelman, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+algorithm+for+the+reconstruction+of+helical+filaments+using+single-particle+methods.">A robust algorithm for the reconstruction of helical filaments using single-particle methods.</a> Ultramicroscopy. 85, 225-234 (2000).</li><li>Egelman, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+iterative+helical+real+space+reconstruction+method:+surmounting+the+problems+posed+by+real+polymers.">The iterative helical real space reconstruction method: surmounting the problems posed by real polymers.</a> Journal of structural biology. 157, 83-94 (2007).</li><li>Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+electron+microscope+tomography+using+robust+prediction+of+specimen+movements.">Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements.</a> Journal of structural biology. 152, 36-51 (2005).</li><li>Stoilova-McPhie, S., Villoutreix, B. O., Mertens, K., Kemball-Cook, G., Holzenburg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3-Dimensional+structure+of+membrane-bound+coagulation+factor+VIII:+modeling+of+the+factor+VIII+heterodimer+within+a+3-dimensional+density+map+derived+by+electron+crystallography.">3-Dimensional structure of membrane-bound coagulation factor VIII: modeling of the factor VIII heterodimer within a 3-dimensional density map derived by electron crystallography.</a> Blood. 99, 1215-1223 (2002).</li><li>Goddard, T. D., Huang, C. C., Ferrin, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+density+maps+with+UCSF+Chimera.">Visualizing density maps with UCSF Chimera.</a> Journal of structural biology. 157, 281-287 (2007).</li></ol>

Los autores declaran que no tienen ningún interés financiero en competencia y se les puede contactar directamente con respecto a cualquiera de los procedimientos publicados en este manuscrito.

En este trabajo se presenta una metodología para diferenciar entre dos organizaciones unidas a la membrana de proteínas altamente homólogas: FVIII humano y porcino auto-ensamblado en nanotubos de lípidos en las condiciones encontradas en el cuerpo humano. En el procedimiento descrito, humana y FVIII porcino se organizan con éxito helicoidalmente en nanotubos de lípidos, que es el paso más crítico. El siguiente paso fundamental es preservar la muestra en hi...

Factor de coagulación sanguínea VIII (FVIII) es una glicoproteína grande de 2332 aminoácidos organizados en seis dominios: A1-A2-B-A3-C1-C2 3. Tras la activación de trombina de FVIII actúa como cofactor para el factor IXa en el complejo activador unido a la membrana. La unión de FVIII activado (FVIIIa) de FIXa de una manera membrana dependiendo mejora FIXa eficiencia proteolítica más de 10 5 veces, que es crítico para la coagulación de la sangre eficiente 4. A pesar de la importante función de FVIII juega en la coagulación y la formación del complejo tenasa, la estructura de FVIII unido a la membrana funcional todavía no se ha resuelto. Para hacer frente a esto, los nanotubos única bicapa lipídica (LNT) ricos en fosfatidilserina (PS), capaces de unirse con alta afinidad de FVIII 8, 9 y se asemeja a la superficie de las plaquetas activadas se han desarrollado 10. Organización helicoidal consecutiva de FVIII unido a LNT ha demostrado ser efective para la determinación estructural de estado unida a la membrana FVIII por Cryo-EM 5. Funcionalizado LNT son un sistema ideal para estudiar la proteína-proteína y las interacciones proteína-membrana de proteínas asociadas a la membrana helicoidal organizados por Cryo-EM 11, 12. Cryo-EM tiene la ventaja sobre los métodos estructurales tradicionales tales como la cristalografía de rayos X y RMN, como la muestra se conserva en más cercana a la ambiente fisiológico (tampón, membrana, pH), sin aditivos e isótopos. En el caso del FVIII, el estudio de la estructura unida a la membrana con esta técnica es aún más fisiológicamente relevantes, como la LNT se asemejan estrechamente por tamaño, forma y composición de los pseudópodos de las plaquetas activadas en donde los complejos de tenasa ensamblan in vivo. Defectos y deficiencia de FVIII causa de la hemofilia A, un trastorno hemorrágico grave que afecta a 1 de cada 5.000 varones de la población humana 4, 6. La mayoría de los eterapia ffective para la Hemofilia A es la administración de toda la vida de FVIII recombinante humano (hFVIII). Una complicación importante de la terapia de FVIII recombinante La hemofilia A es el desarrollo de anticuerpos inhibidores para la forma humana que afecta aproximadamente al 30% de los pacientes de la hemofilia A 13. En este caso, se utiliza FVIII porcino (pFVIII) concentrado, como pantallas de FVIII porcino baja reactividad cruzada con anticuerpos inhibidores contra FVIII y forma complejos funcionales con FIXa humano 7 humana. El establecimiento de la organización unida a la membrana de ambos porcina y formas de FVIII humanos es importante entender las bases estructurales de la función y las repercusiones para la hemostasia sanguínea cofactor FVIII. En este estudio, se describe una combinación de nanotecnología de lípidos, Cryo-EM, y análisis de la estructura diseñada para resolver la organización unido a la membrana de dos formas de FVIII altamente homólogas. Los datos de Cryo-EM presentados y estructuras 3D para porci helicoidal organizadoFVIII NE y humano cargado negativamente en LNT muestran el potencial de la nanotecnología propuesto como base para la determinación de la estructura de FVIII y factores y complejos en un entorno fisiológico de la coagulación de la membrana unidos a la membrana.

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	<tbody>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:239px;">JEM2100 with LaB6&#160;</td>
			<td style="width:205px;">JEOL Ltd.</td>
			<td style="width:119px;">JEM-2100</td>
			<td style="width:447px;">operated at 200 kV</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:239px;">with TEMCON software</td>
			<td style="width:205px;">JEOL Ltd.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:447px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Gatan626 Cryo-holder</td>
			<td style="width:205px;">Gatan, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">626.DH</td>
			<td style="width:447px;">cooled to -175 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">with temperature controler unit</td>
			<td style="width:205px;">Gatan, Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:447px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Gatan 4K x 4K CCD camera</td>
			<td style="width:205px;">Gatan, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">US4000</td>
			<td style="width:447px;">4096 x 4096 pixel at 15 microns/pixel physical resolution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Solarus Model 950 plasma cleaner</td>
			<td style="width:205px;">Gatan, Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:447px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Vitrobot Mark IV</td>
			<td style="width:205px;">FEI</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:447px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;"></td>
			<td style="width:205px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:447px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Materials</td>
			<td style="width:205px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:447px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Carbon coated 300 mesh 3mm copper grid</td>
			<td style="width:205px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:119px;">01821</td>
			<td style="width:447px;">plasma cleaned for 10 s on high power</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:239px;">Quantifoil R2/2 300 mesh</td>
			<td style="width:205px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;">Q225-CR2</td>
			<td style="width:447px;">Carbon coated 300 mesh Cu grids with 2 mm in diameters holes&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Uranyl acetate dihydrate</td>
			<td style="width:205px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:119px;">19481</td>
			<td style="width:447px;">1% solution, filtered</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:239px;">Galactosyl ceramide</td>
			<td style="width:205px;">Avanti Polar Lipids Inc.&#160;</td>
			<td style="width:119px;">860546</td>
			<td style="width:447px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Dioleoyl-sn-glycero-phospho-L-serine</td>
			<td style="width:205px;">Avanti Polar Lipids Inc.&#160;</td>
			<td style="width:119px;">840035</td>
			<td style="width:447px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;"></td>
			<td style="width:205px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:447px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Software</td>
			<td style="width:205px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:447px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:239px;">EM software Digital Micrograph</td>
			<td style="width:205px;">Gatan, Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:447px;"><a href="http://www.gatan.com/DM/">http://www.gatan.com/DM/</a></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;">EM software EMAN</td>
			<td style="width:205px;">free download</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:447px;"><a href="http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN/">http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN/&#160;</a></td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;">EM software Spider</td>
			<td style="width:205px;">free download</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:447px;"><a href="http://spider.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html">http://spider.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html</a></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">EM software IHRSR</td>
			<td style="width:205px;">free download</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:447px;">Programs available from Edward H. Egelman http://people.virginia.edu/~ehe2n/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">EM software (IMOD)</td>
			<td style="width:205px;">free download</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:447px;"><a href="http://bio3d.colorado.edu/imod/">http://bio3d.colorado.edu/imod/&#160;</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">EM software (SerialEM)</td>
			<td style="width:205px;">free download</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:447px;"><a href="ftp://bio3d.colorado.edu/pub/SerialEM/">ftp://bio3d.colorado.edu/pub/SerialEM/</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">UCSF-Chimera</td>
			<td style="width:205px;">free download</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:447px;"><a href="http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/download.html">http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/download.html</a></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

helical organization of blood coagulation factor viii on lipid nanotubes

<html> Crio-microscopía electrónica (Cryo-EM) 1 es un enfoque poderoso para investigar la estructura funcional de las proteínas y complejos en un entorno de estado y de la membrana hidratada 2. Factor de coagulación VIII (FVIII) 3 es un multi-dominio de la glicoproteína del plasma sanguíneo. Defecto o deficiencia de FVIII es la causa para el tipo de hemofilia A - un trastorno hemorrágico grave. Tras la activación proteolítica, de FVIII se une a la serina proteasa Factor IXa en la membrana plaquetaria cargados negativamente, lo cual es crítico para la coagulación normal de la sangre 4. A pesar del papel fundamental FVIII juega en la coagulación, la información estructural de su estado unida a la membrana es incompleta 5. Concentrado de FVIII recombinante es el medicamento más eficaz contra la hemofilia tipo A y disponible comercialmente FVIII se puede expresar como ambos forman complejos funcionales con Factor humano IXa 6,7 humana o porcina,. &quot;&gt; En este estudio se presenta una combinación de crio-microscopía electrónica (crio-ME), el análisis de lípidos y la nanotecnología estructura aplicarse para resolver la estructura unida a la membrana de dos formas de FVIII altamente homólogas:. Humano y porcino La metodología desarrollada en nuestro laboratorio para organizar helicoidalmente las dos formas de FVIII recombinantes funcionales en nanotubos de lípidos cargados negativamente (LNT) se describe. Los resultados representativos demuestran que nuestro método es suficientemente sensible para definir las diferencias en la organización helicoidal entre los dos altamente homóloga en secuencia (86% de identidad de secuencia ) proteínas. protocolos detallados para la organización helicoidal, Cryo-EM y tomografía electrónica ET adquisición de datos () se dan. Los dos dimensiones (2D) y tridimensional (3D) análisis de la estructura aplican para obtener las reconstrucciones en 3D de humano y porcino Se discute FVIII-LNT. Las estructuras humanas y porcinas presentados FVIII-LNT muestran el potencial de la metodología propuesta para Calculate la organización funcional, unido a la membrana del Factor VIII de coagulación sanguínea en alta resolución.

FVIII porcino recombinante humana y se organizaron con éxito helicoidalmente en carga negativa única LNT bicapa, parecida a la superficie de las plaquetas activadas. La organización helicoidal de la humano y porcino de FVIII-LNT fue consistente a través de las micrografías digitales recogidas (Figura 2). Fueron seleccionados La LNT control y lo humano y tubos helicoidales FVIII-LNT porcinos y segmentados con la GUI e2helixboxer.py y conjuntos de datos iniciales creados con la inter...

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Helical Organization of Blood Coagulation Factor VIII on Lipid Nanotubes

Se presenta una combinación de crio-microscopía electrónica, la nanotecnología de lípidos, y análisis de la estructura aplicada para resolver la estructura unida a la membrana de dos formas de FVIII altamente homólogas: humanos y porcinos. La metodología desarrollada en nuestro laboratorio para organizar helicoidalmente las dos formas de FVIII recombinantes funcionales en nanotubos de lípidos cargados negativamente (LNT) se describe.

Organización helicoidal de sangre Coagulación Factor VIII en lípidos nanotubos

Cryo-electron microscopy (Cryo-EM)1 is a powerful approach to investigate the functional structure of proteins and complexes in a hydrated state and ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

12.2K vistas.  University of Texas Medical Branch.  Se presenta una combinación de crio-microscopía electrónica, la nanotecnología de lípidos, y análisis de la estructura aplicada para resolver la estructura unida a la membrana de dos formas de FVIII altamente homólogas: humanos y porcinos. La metodología desarrollada en nuestro laboratorio para organizar helicoidalmente las dos formas de FVIII recombinantes funcionales en nanotubos de lípidos cargados negativamente (LNT) se describe. 

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Simultaneous Synthesis of Single-walled Carbon Nanotubes and Graphene in a Magnetically-enhanced Arc Plasma

Carbon nanostructures such as single-walled carbon nanotubes (SWCNT) and graphene attract a deluge of interest of scholars nowadays due to their very promising application for molecular sensors, field effect transistor and super thin and flexible electronic devices1-4. Anodic arc discharge supported by the erosion of the anode material is one of the most practical and efficient methods, which can provide specific non-equilibrium processes and a high influx of carbon material to the developing structures at relatively higher temperature, and consequently the as-synthesized products have few structural defects and better crystallinity.
 To further improve the controllability and flexibility of the synthesis of carbon nanostructures in arc discharge, magnetic fields can be applied during the synthesis process according to the strong magnetic responses of arc plasmas. It was demonstrated that the magnetically-enhanced arc discharge can increase the average length of SWCNT 5, narrow the diameter distribution of metallic catalyst particles and carbon nanotubes 6, and change the ratio of metallic and semiconducting carbon nanotubes 7, as well as lead to graphene synthesis 8. 
 Furthermore, it is worthwhile to remark that when we introduce a non-uniform magnetic field with the component normal to the current in arc, the Lorentz force along the J&times;B direction can generate the plasmas jet and make effective delivery of carbon ion particles and heat flux to samples. As a result, large-scale graphene flakes and high-purity single-walled carbon nanotubes were simultaneously generated by such new magnetically-enhanced anodic arc method. Arc imaging, scanning electron microscope (SEM), transmission electron microscope (TEM) and Raman spectroscopy were employed to analyze the characterization of carbon nanostructures. These findings indicate a wide spectrum of opportunities to manipulate with the properties of nanostructures produced in plasmas by means of controlling the arc conditions.

Anodic arc discharge is one of the most practical and efficient methods to synthesize various carbon nanostructures. To increase the arc controllability and flexibility, a non-uniform magnetic field was introduced to process the one-step synthesis of large-scale graphene flakes and high-purity single-walled carbon nanotubes.

Síntesis simultánea de los nanotubos de carbono de pared simple y grafeno en un arco de plasma magnético mejorada

Carbon nanostructures such as single-walled carbon nanotubes (SWCNT) and graphene attract a deluge of interest of scholars nowadays due to their very ...

Investigación

Bioingeniería

Localization and Relative Quantification of Carbon Nanotubes in Cells with Multispectral Imaging Flow Cytometry

Carbon-based nanomaterials, like carbon nanotubes (CNTs), belong to this type of nanoparticles which are very difficult to discriminate from carbon-rich cell structures and de facto there is still no quantitative method to assess their distribution at cell and tissue levels. What we propose here is an innovative method allowing the detection and quantification of CNTs in cells using a multispectral imaging flow cytometer (ImageStream, Amnis). This newly developed device integrates both a high-throughput of cells and high resolution imaging, providing thus images for each cell directly in flow and therefore statistically relevant image analysis. Each cell image is acquired on bright-field (BF), dark-field (DF), and fluorescent channels, giving access respectively to the level and the distribution of light absorption, light scattered and fluorescence for each cell. The analysis consists then in a pixel-by-pixel comparison of each image, of the 7,000-10,000 cells acquired for each condition of the experiment. Localization and quantification of CNTs is made possible thanks to some particular intrinsic properties of CNTs: strong light absorbance and scattering; indeed CNTs appear as strongly absorbed dark spots on BF and bright spots on DF with a precise colocalization.
This methodology could have a considerable impact on studies about interactions between nanomaterials and cells given that this protocol is applicable for a large range of nanomaterials, insofar as they are capable of absorbing (and/or scattering) strongly enough the light.

In this study, the main purpose was to monitor the cellular uptake and eventual exocytosis of carbon nanotubes (CNTs). From this perspective, we proposed here a unique method using multispectral imaging flow cytometry allowing a quantification and localization of CNTs in a statistically relevant number of cells.

Localización y cuantificación relativa de nanotubos de carbono en las células con multiespectral de imágenes de Citometría de Flujo

Carbon-based nanomaterials, like carbon nanotubes (CNTs), belong to this type of nanoparticles which are very difficult to discriminate from carbon-rich ...

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has been implied in the etiology of many brain pathologies, creating a need for development of human in vitro BBB models to assist in clinically-relevant research. Among the numerous BBB models thus far described, a static (without flow), contact BBB model, where astrocytes and brain endothelial cells (BECs) are cocultured on the opposite sides of a porous membrane, emerged as a simplified yet authentic system to simulate the BBB with high throughput screening capacity. Nevertheless the generation of such model presents few technical challenges. Here, we describe a protocol for preparation of a contact human BBB model utilizing a novel combination of primary human BECs and immortalized human astrocytes. Specifically, we detail an innovative method for cell-seeding on inverted inserts as well as specify insert staining techniques and exemplify how we use our model for BBB-related research.

Establishment of human models of the blood-brain barrier (BBB) can benefit research into brain conditions associated with BBB failure. We describe here an improved technique for preparation of a contact BBB model, which permits coculturing of human astrocytes and brain endothelial cells on the opposite sides of a porous membrane.

Método mejorado para la preparación de una base de células, Contacto Modelo Humano de la barrera hematoencefálica

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

Electrospun Nanofiber Scaffolds with Gradations in Fiber Organization

The goal of this protocol is to report a simple method for generating nanofiber scaffolds with gradations in fiber organization and test their possible applications in controlling cell morphology/orientation. Nanofiber organization is controlled with a new fabrication apparatus that enables the gradual decrease of fiber organization in a scaffold. Changing the alignment of fibers is achieved through decreasing deposition time of random electrospun fibers on a uniaxially aligned fiber mat. By covering the collector with a moving barrier/mask, along the same axis as fiber deposition, the organizational structure is easily controlled. For tissue engineering purposes, adipose-derived stem cells can be seeded to these scaffolds. Stem cells undergo morphological changes as a result of their position on the varied organizational structure, and can potentially differentiate into different cell types depending on their locations. Additionally, the graded organization of fibers enhances the biomimicry of nanofiber scaffolds so they more closely resemble the natural orientations of collagen nanofibers at tendon-to-bone insertion site compared to traditional scaffolds. Through nanoencapsulation, the gradated fibers also afford the possibility to construct chemical gradients in fiber scaffolds, and thereby further strengthen their potential applications in fast screening of cell-materials interaction and interfacial tissue regeneration. This technique enables the production of continuous gradient scaffolds, but it also can potentially produce fibers in discrete steps by controlling the movement of the moving barrier/mask in a discrete fashion.

Here, we present a protocol to fabricate electrospun nanofiber scaffolds with gradated organization of fibers and explore their applications in regulating cell morphology/orientation. Gradients with regard to physical and chemical properties of the nanofiber scaffolds offer a wide variety of applications in the biomedical field.

Electrospun nanofibras andamios con gradaciones en Organización de fibra

The goal of this protocol is to report a simple method for generating nanofiber scaffolds with gradations in fiber organization and test their possible ...

Describing a Transcription Factor Dependent Regulation of the MicroRNA Transcriptome

While the transcription regulation of protein coding genes was extensively studied, little is known on how transcription factors are involved in transcription of non-coding RNAs, specifically of microRNAs. Here, we propose a strategy to study the potential role of transcription factor in regulating transcription of microRNAs using publically available data, computational resources and high throughput data. We use the H3K4me3 epigenetic signature to identify microRNA promoters and chromatin immunoprecipitation (ChIP)-sequencing data from the ENCODE project to identify microRNA promoters that are enriched with transcription factor binding sites. By transfecting cells of interest with shRNA targeting a transcription factor of interest and subjecting the cells to microRNA array, we study the effect of this transcription factor on the microRNA transcriptome. As an illustrative example we use our study on the effect of STAT3 on the microRNA transcriptome of chronic lymphocytic leukemia (CLL) cells.

Herein we propose a strategy to study the effect of a transcription factor of interest on the microRNA transcriptome using publically available data, computational resources and high throughput data from microRNA arrays after transfecting cells with small hairpin (sh)RNA targeting a transcription factor of interest.

Descripción de una regulación dependiente de factor de transcripción del transcriptoma MicroARN

While the transcription regulation of protein coding genes was extensively studied, little is known on how transcription factors are involved in ...

Polyelectrolyte Complex for Heparin Binding Domain Osteogenic Growth Factor Delivery

During reconstructive bone surgeries, supraphysiological amounts of growth factors are empirically loaded onto scaffolds to promote successful bone fusion. Large doses of highly potent biological agents are required due to growth factor instability as a result of rapid enzymatic degradation as well as carrier inefficiencies in localizing sufficient amounts of growth factor at implant sites. Hence, strategies that prolong the stability of growth factors such as BMP-2/NELL-1, and control their release could actually lower their efficacious dose and thus reduce the need for larger doses during future bone regeneration surgeries. This in turn will reduce side effects and growth factor costs. Self-assembled PECs have been fabricated to provide better control of BMP-2/NELL-1 delivery via heparin binding and further potentiate growth factor bioactivity by enhancing in vivo stability. Here we illustrate the simplicity of PEC fabrication which aids in the delivery of a variety of growth factors during reconstructive bone surgeries.

Self-assembled polyelectrolyte complexes (PEC) fabricated from heparin and protamine were deposited on alginate beads to entrap and regulate the release of osteogenic growth factors. This delivery strategy enables a 20-fold reduction of BMP-2 dose in spinal fusion applications. This article illustrates the benefits and fabrication of PECs.

Complejo de polielectrolito para la unión a heparina de entrega osteogénico Factor de Crecimiento de dominio

During reconstructive bone surgeries, supraphysiological amounts of growth factors are empirically loaded onto scaffolds to promote successful bone ...

Engineering Molecular Recognition with Bio-mimetic Polymers on Single Walled Carbon Nanotubes

Semiconducting single-wall carbon nanotubes (SWNTs) are a class of optically active nanomaterial that fluoresce in the near infrared, coinciding with the optical window where biological samples are most transparent. Here, we outline techniques to adsorb amphiphilic polymers and polynucleic acids onto the surface of SWNTs to engineer their corona phases and create novel molecular sensors for small molecules and proteins. These functionalized SWNT sensors are both biocompatible and stable. Polymers are adsorbed onto the nanotube surface either by direct sonication of SWNTs and polymer or by suspending SWNTs using a surfactant followed by dialysis with polymer. The fluorescence emission, stability, and response of these sensors to target analytes are confirmed using absorbance and near-infrared fluorescence spectroscopy. Furthermore, we demonstrate surface immobilization of the sensors onto glass slides to enable single-molecule fluorescence microscopy to characterize polymer adsorption and analyte binding kinetics.

We present a protocol for engineering the corona phase of near infrared fluorescent single walled carbon nanotubes (SWNTs) using amphiphilic polymers and DNA to develop sensors for molecular targets without known recognition elements.

Ingeniería Molecular Recognition con polímeros biomiméticos en una sola pared nanotubos de carbono

Semiconducting single-wall carbon nanotubes (SWNTs) are a class of optically active nanomaterial that fluoresce in the near infrared, coinciding with the ...

DNA Nanotubes as a Versatile Tool to Study Semiflexible Polymers

Mechanical properties of complex, polymer-based soft matter, such as cells or biopolymer networks, can be understood in neither the classical frame of flexible polymers nor of rigid rods. Underlying filaments remain outstretched due to their non-vanishing backbone stiffness, which is quantified via the persistence length (lp), but they are also subject to strong thermal fluctuations. Their finite bending stiffness leads to unique, non-trivial collective mechanics of bulk networks, enabling the formation of stable scaffolds at low volume fractions while providing large mesh sizes. This underlying principle is prevalent in nature (e.g., in cells or tissues), minimizing the high molecular content and thereby facilitating diffusive or active transport. Due to their biological implications and potential technological applications in biocompatible hydrogels, semiflexible polymers have been subject to considerable study. However, comprehensible investigations remained challenging since they relied on natural polymers, such as actin filaments, which are not freely tunable. Despite these limitations and due to the lack of synthetic, mechanically tunable, and semiflexible polymers, actin filaments were established as the common model system. A major limitation is that the central quantity lp cannot be freely tuned to study its impact on macroscopic bulk structures. This limitation was resolved by employing structurally programmable DNA nanotubes, enabling controlled alteration of the filament stiffness. They are formed through tile-based designs, where a discrete set of partially complementary strands hybridize in a ring structure with a discrete circumference. These rings feature sticky ends, enabling the effective polymerization into filaments several microns in length, and display similar polymerization kinetics as natural biopolymers. Due to their programmable mechanics, these tubes are versatile, novel tools to study the impact of lp on the single-molecule as well as the bulk scale. In contrast to actin filaments, they remain stable over weeks, without notable degeneration, and their handling is comparably straightforward.

Semiflexible polymers display unique mechanical properties that are extensively applied by living systems. However, systematic studies on biopolymers are limited since properties such as polymer rigidity are inaccessible. This manuscript describes how this limitation is circumvented by programmable DNA nanotubes, enabling experimental studies on the impact of filament rigidity.

Nanotubos de ADN como una herramienta versátil para el estudio de polímeros Semiflexible

Mechanical properties of complex, polymer-based soft matter, such as cells or biopolymer networks, can be understood in neither the classical frame of ...

Synthesis of Multi-walled Carbon Nanotubes Modified with Silver Nanoparticles and Evaluation of Their Antibacterial Activities and Cytotoxic Properties

In this study, multi-walled carbon nanotubes (MWCNTs) were treated with an aqueous sulfuric acid solution to form an oxygen-based functional group. Silver MWCNTs were prepared by the reductive deposition of silver from an aqueous solution of AgNO3 on the oxidized MWCNTs. Given the unique color of the CNTs, it was not possible to apply them to the minimum inhibitory concentration or mitochondrial toxicity assays to evaluate the toxicity and antibacterial properties, since they would interfere with the assays. The inhibition zone and minimum bactericidal concentration for the Ag-MWCNTs were measured and Live/Dead and Trypan Blue assays were used to measure the toxicity and antibacterial properties without interfering with the color of the CNTs.

In this study, antimicrobial nanomaterials were synthesized by acidic oxidation of multiwalled carbon nanotubes and subsequent reductive deposition of silver nanoparticles. Antimicrobial activity and cytotoxicity tests were performed with the as-prepared nanomaterials.

Síntesis de nanotubos de carbono multipared modificados con nanopartículas de plata y la evaluación de sus actividades antibacterianas y propiedades citotóxicas

In this study, multi-walled carbon nanotubes (MWCNTs) were treated with an aqueous sulfuric acid solution to form an oxygen-based functional group. Silver ...

High Throughput Traction Force Microscopy Using PDMS Reveals Dose-Dependent Effects of Transforming Growth Factor-&#946; on the Epithelial-to-Mesenchymal Transition

Cellular contractility is essential in diverse aspects of biology, driving processes that range from motility and division, to tissue contraction and mechanical stability, and represents a core element of multi-cellular animal life. In adherent cells, acto-myosin contraction is seen in traction forces that cells exert on their substrate. Dysregulation of cellular contractility appears in a myriad of pathologies, making contractility a promising target in diverse diagnostic approaches using biophysics as a metric. Moreover, novel therapeutic strategies can be based on correcting the apparent malfunction of cell contractility. These applications,&#160;however, require direct quantification of these forces.
We have developed silicone elastomer-based traction force microscopy (TFM) in a parallelized multi-well format. Our use of a silicone rubber, specifically polydimethylsiloxane (PDMS), rather than the commonly employed hydrogel polyacrylamide (PAA) enables us to make robust and inert substrates with indefinite shelf-lives requiring no specialized storage conditions. Unlike pillar-PDMS based approaches that have a modulus in the GPa range, the PDMS used here is very compliant, ranging from approximately 0.4 kPa to 100 kPa. We create a high-throughput platform for TFM by partitioning these large monolithic substrates spatially into biochemically independent wells, creating a multi-well platform for traction force screening that is compatible with existing multi-well systems.
In this manuscript, we use this multi-well traction force system to examine the Epithelial to Mesenchymal Transition (EMT); we induce EMT in NMuMG cells by exposing them to TGF-&#946;, and to quantify the biophysical changes during EMT. We measure the contractility as a function of concentration and duration of TGF-&#946; exposure. Our findings here demonstrate the utility of parallelized TFM in the context of disease biophysics.

High Throughput Traction Force Microscopy Using PDMS Reveals Dose-Dependent Effects of Transforming Growth Factor-&amp;#946; on the Epithelial-to-Mesenchymal Transition

We present a high throughput traction force assay fabricated with silicone rubber (PDMS). This novel assay is suitable for studying physical changes in cell contractility during various biological and biomedical processes and diseases. We demonstrate this method's utility by measuring a TGF-&#946; dependent increase in contractility during the epithelial-to-mesenchymal transition.

Microscopía de fuerza de tracción de alto rendimiento Mediante PDMS revela efectos dependientes de la dosis de transformar el factor de crecimiento en la transición epitelial a mesenquimal

Cellular contractility is essential in diverse aspects of biology, driving processes that range from motility and division, to tissue contraction and ...