Este estudio fue financiado por subvenciones concedidas a RLM de la Salud y medicina Consejo de Investigación Nacional de Australia (subvención # 606658).

1. Cultivos Celulares (3-7 días antes de la acreditación de la Asamblea) 1.1. Primaria células cerebrales humanas endoteliales microvasculares (BEC) BEC se obtuvieron comercialmente. Las células fueron producidas por disociación dispasa de tejido normal corteza cerebral humana y presenten en estado congelado en el paso 3 (&lt;12 duplicaciones de la población). <ol><li> Sustrato: vasos Escudo de cultivo de tejidos con &quot;factor de unión&quot; de acuerdo con las instrucciones del fabricante. </li><li> Mantenimiento celular: Mantener BEC en medio completo que contiene suero. Para la experimentación, la cultura BEC en un medio libre de suero completo. Mantener las células en un humidificado 5% de CO 2, 21% de O 2 incubadora a 37 ° C Nota: Como alternativa a los reactivos especializados, 0,1% (w / v) de solución de gelatina puede servir como un reactivo de recubrimiento, mientras que DMEM/F-12 complementado con 15 mM de HEPES, 10% (v / v) de suero de ternera fetal (FCS), 2 mM de L-glutamina, 50 g/ Ml de gentamicina, 20 mg / ml de heparina y 20 mg de suplemento de crecimiento de células endoteliales / ml se pueden utilizar para el mantenimiento de BEC. </li><li> Sub-cultivo para la experimentación: BEC confluentes Split en una proporción de 01:03-01:06, dependiendo de la hora prevista para el próximo uso (3-7 días). Cambie el medio de mantenimiento cada 3 días. Utilice BEC hasta 15 pasajes. </li></ol> 1.2. SVG humano fetal astrogliales Cell-line Células astrogliales SVG humanos fetales 22 se derivaron originalmente de cultivos primarios de cerebro fetal humano transformado con replicación deficiente virus de simio 40. <ol><li> Mantenimiento: células de cultivo de SVG en medio esencial mínimo con solución salina equilibrada de Earle suplementado con 20% (v / v) de FCS (mismo porcentaje de suero utilizada para mantener sus células primarias de los padres 22), 2 mM de L-glutamina, 50 U / ml de penicilina y 50 mg / ml de estreptomicina. Mantener las células en un humidificado 5% de CO 2, 21% de O2 </sub&gt; incubadora a 37 ° C. </li><li> Sub-cultivo para la experimentación: IVS confluentes Split en una proporción de 1:5 a 1:10, dependiendo de la hora prevista para el próximo uso (3-7 días). La eliminación de la tripsina no es necesario debido al alto contenido de suero en el medio. Cambie el medio cada 3 días. Utilice SVGs hasta 20 pasajes. </li></ol> 2. Asamblea y cocultivo del humano in vitro BBB Modelo (día 0) Comentario: El humana in vitro modelo de contacto acreditación se preparó de acuerdo con los protocolos publicados 13,23, con modificaciones. 2.1. Recubrimiento de las inserciones <ol><li> Coloque los insertos de cultivo de tejidos (6,5 mm de diámetro con poliéster membrana porosa, 3 micras de tamaño de poro) en los pocillos de la placa de 24 pocillos se suministra. Cubra la superficie luminal de los insertos <s> </s> durante la noche en un incubador humidificado 37 ° C con colágeno I de rata (20 g / cm 2; 50 l de 132 g/ Ml de colágeno I en ácido acético 0,02% en agua Milli-Q (MQH 2 O)). Lavar los insertos de una vez (tanto desde el lado abluminal y luminal) con MQH 2 O para eliminar el ácido residual. Nota: La membrana basal de los capilares del cerebro no contiene colágeno I, pero principalmente lamininas, isoformas de colágeno tipo IV, nidogens y proteoglicanos heparán sulfato 9. Por esta razón, algunos investigadores utilizan agentes de revestimiento tales como colágeno IV, fibronectina 13, o Matrigel (BD Biosciences) 16 para una más auténtico modelado de la acreditación. </li></ol> 2.2. SVGs Siembra en la parte inferior (Abluminal) superficie de la membrana <ol><li> Invierta la inserción y ajuste suavemente por el borde de la membrana porosa de un pequeño trozo de tubo de silicona elástica (&quot;tubing externa&quot;; ~ 10 mm de largo, 8 mm de diámetro interior y 1,6 mm de pared), básicamente la creación de un nuevo muy por encima de la superficie abluminal (Figura 2A). </li><li> La parte inferior de la Nee insertods a sellar para evitar la fuga de los medios de comunicación. En primer lugar, preparar un enchufe (Figura 2A y 2B) hecha de un tubo de silicona (denominado &quot;tubo interno&quot;; ~ 8 mm de largo, 3,2 mm de diámetro interno, 1,6 mm de pared; Figura 2B), sellado en un extremo con un cono de sellado de plástico (~ 3 mm de largo; preparado por el corte de la parte inferior de una reacción en cadena de 0,2 ml de la polimerasa (PCR) del tubo; Figura 2B). Este cono no sólo sella el lumen de los tubos internos, pero también amplía su borde más apretado para encajar en el inserto. A continuación, utilizando unas pinzas esterilizadas, inserte el tapón de silicona en la cavidad luminal y avanzar hasta que llegue hasta a ~ 1-2 mm de la membrana (Figura 2A). </li><li> A continuación, las semillas 4 x 10 4 células SVG en 200 medio de mantenimiento SVG l (SEcción 1.2.2 anterior) directamente en la silicona muy por encima de la superficie de la membrana abluminal (Figura 2A). Permitir SVGs se adhieran durante al menos 4 horas en la incubadora. Nota: Para mantener la esterilidad transportar los insertos montados entre dos placas de 6 pocillos (una placa invertida sobre la otra; Figura 2C) para reducir al mínimo la exposición al aire sin filtrar durante el procedimiento. Tubos de silicona y tapones se lavan en etanol y en autoclave para su uso posterior. Nota: Utilice tapones (apartado 2.2.2) sólo para plaquitas con poro de la membrana de tamaño mayor que 1 m. Las membranas con poros de diámetro ≤ 1 m rara vez se escapan y sólo requieren la instalación de la tubería de silicona externo (sección 2.2.1). Además, algunos agentes de recubrimiento que no sean de colágeno I (véase la nota a la sección 2.1) pueden impedir leakiness incluso a través de 3 micras poros. Determinar esto empíricamente. </li><li> Con el fin de supervisar el estado de cumplimiento de los astrocitos, sembrar en paralelo enun estándar de 96 pocillos un volumen idéntico de la célula astrocito-suspensión. Este pozo tiene la misma superficie que el inserto de 6,5 mm (0,33 cm 2) y permite la fácil visualización de las células por microscopía de contraste de fase de la membrana de inserción. Cuando se observa la adherencia suficiente de la astrocitos en el control de 96 pocillos, los astrocitos han adecuadamente adherido también a la membrana de inserción. </li><li> Cuando los astrocitos se han adherido suficientemente en el control de 96 pocillos, transferir los conjuntos de inserto a la campana de cultivo de tejido (ver nota anterior) y retire suavemente el tubo de silicona externa y tapones. Inserciones Volver a la orientación normal (es decir, en posición vertical) en los pocillos suministrados contienen 800 l / pocillo de medio de mantenimiento BEC (sección 1.1.2). </li></ol> 2.3. Siembra de BEC en la Cámara por encima de los astrocitos Luminal Seed 2x10 4 BEC en 200 l sobre la superficie luminal de colágeno recubierto y devolver la inseguridadRTS en la incubadora. 2.4. Cocultivo Cocultivo los insertos SVG / BEC sembrados durante 3 días en medio BEC sin cambio de medio antes de la experimentación. 3. La experimentación con el modelo de acreditación Humano (Día 3) <ol><li> Para estimular las células in vitro primera colada de BBB en los medios de comunicación mediante la sustitución abluminal y luminal con 600 l y 100 l de medio libre de suero BEC, respectivamente. </li><li> Aspirar el medio luminal de nuevo y reemplazar con 100 l de medio libre de suero con agentes estimulantes. Nota: Si es necesaria la estimulación de la cámara abluminal (para activar la acreditación vitro desde el compartimiento astrocítica), aspirar el medio abluminal y reemplazar con 600 ul de medio libre de suero con agentes estimulantes. </li><li> Pon a prueba cada grupo experimental en tres ejemplares (por lo tanto, si no se realiza la estimulación luminal, que requiere 3 x 100 l, se recomienda diluir la re<html> agentes a sus concentraciones finales en 350 l de medio libre de suero por grupo para reducir al mínimo los errores de pipeteo entre pozos). </li><li> Realizar paracelular estándar y / o ensayos de permeabilidad transcelular de trazadores marcados 16,24 (para el último usamos isotiocianato de fluoresceína (FITC) y conjugado con albúmina) y / o la medición de la TEER 13,16,25 como se describe anteriormente. </li></ol> Para tener en cuenta las fluctuaciones en la permeabilidad de la línea de base entre los experimentos, analizar los cambios en la permeabilidad relativa a un inserto revestido sin células (que sirve como una referencia para la permeabilidad máxima) y al grupo tratado con vehículo usando la fórmula: Permeabilidad (% de max) = ( valor de permeabilidad de inserción experimental - valor promedio de la permeabilidad del grupo del vehículo) / (valor de permeabilidad de la inserción en blanco - el valor promedio de la permeabilidad del grupo del vehículo) X 100. 4. La visualización de las células en membranas porosas nt &quot;&gt; Comentario: las células no teñidas en las membranas de inserción son difíciles de observar por contraste de fase o el contraste de interferencia diferencial (DIC) de microscopía ya que la membrana es bastante opaca e interfiere con la transmisión de la luz Para hacer frente a este problema, hemos desarrollado diversos procedimientos de tinción de células en. inserciones, que mejoran en gran medida la apariencia de células en la membrana. Generalmente, las manchas de las membranas de inserción mientras que todavía unido a la pieza de inserción, en los pozos. Las membranas deben ser retirados sólo al final del procedimiento de tinción para los propósitos de montaje. 4.1. Hematoxilina tinción <ol><li> Fijar insertos con helado 4% (w / v) paraformaldehído (PFA) en solución salina tamponada con fosfato (PBS; NaCl 130 mM, 10 mM Na 2 HPO 4, 10 mM NaH 2 PO 4, pH 7,2) durante 20 min. Lavar una vez con PBS. </li><li> Sumerja el inserto en solución de hematoxilina de Mayer 0,1% durante 2 min. </li><li> Lave suavemente la boquilla con agua del grifo (sumergiendo las insert en un vaso que contiene el agua del grifo y pipetear suavemente el exceso de agua). Transferir el inserto a la solución de Scott agua del grifo (2 g / l de NaHCO3, 20 g / L MgSO4) durante ~ 20 s hasta que el color azul deseado desarrolla. Lave el inserto de nuevo con agua del grifo (punto 4.1.3). Una tinción de eosina opcional se puede introducir aquí por inmersión de la pieza de inserción en la solución de eosina 1% durante 10 s seguido por un lavado con agua del grifo. </li><li> Aire secar la membrana de inserción. Usando un bisturí (corte alrededor del borde de la membrana) quitar la membrana y montarlo en un portaobjetos de vidrio para la imagen de campo claro Nota: Si se utiliza di-N-butylphthalateinxylene (DPX) medio de montaje lavar el inserto con etanol al 100%, seguido de xileno antes de retirar y montar la membrana. </li></ol> 4.2. Microscopio Electrónico de Barrido (SEM) <ol><li> Fijar insertos con enfriado con hielo 4% (w / v) de PFA en PBS durante 20 min. Lavar tres veces en PBS. </li><li> Post-fijar las membranas durante 30 min en 1% (w / v) Tetróxido de osmio en MQH 2 O. </li><li> Lavar insertos en agua (sección 4.1.3) y se deshidratan en un gradiente creciente de etanol (50%, 70%, 90% durante 5 min cada uno, y luego 3 veces con etanol al 100% durante 10 minutos por intervalo). </li><li> Tratar insertos deshidratados con una mezcla de hexametildisilazano (HMDS): etanol (1:2 y luego 2:1 para 5 min). </li><li> Tratar insertos con 100% HMDS de 5 min, aire seco y almacenar en condiciones desecadas. </li><li> Retire la membrana utilizando un bisturí (corte alrededor del borde de la membrana). Examine las membranas por microscopía electrónica de barrido. </li></ol> 4.3. Inmunofluorescencia <ol><li> Fijar insertos con enfriado con hielo 4% (w / v) de PFA en PBS durante 20 min, se lava una vez en solución salina tamponada con Tris (TBS; 50 mM de Tris-HCl, pH 7,6, NaCl 154 mM, 0,22 m filtrada). </li><li> Realizar la inmunotinción de las células en la membrana de inserción como se ha descrito anteriormente 26. </li><li> Retire la membrana utilizando un bisturí (corte alrededor del borde de la membrana) y montarlo en agdiapositiva lass con medio de montaje de fluorescencia. Examine membrana mediante microscopía de fluorescencia. </li></ol>

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Invest. 112, 1533-1540 (2003).</li><li>Abu Fanne, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier+permeability+and+tPA-mediated+neurotoxicity.">Blood-brain barrier permeability and tPA-mediated neurotoxicity.</a> Neuropharmacology. 58, 972-980 (1016).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipoprotein+receptor-mediated+induction+of+matrix+metalloproteinase+by+tissue+plasminogen+activator.">Lipoprotein receptor-mediated induction of matrix metalloproteinase by tissue plasminogen activator.</a> Nat. Med. 9, 1313-1317 (2003).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+hemorrhagic+transformation+after+tissue+plasminogen+activator+reperfusion+therapy+for+ischemic+stroke.">Mechanisms of hemorrhagic transformation after tissue plasminogen activator reperfusion therapy for ischemic stroke.</a> Stroke. 35, 2726-2730 (2004).</li><li>Donnan, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+make+better+use+of+thrombolytic+therapy+in+acute+ischemic+stroke.">How to make better use of thrombolytic therapy in acute ischemic stroke.</a> Nat. Rev. Neurol. 7, 400-409 (2011).</li><li>Acheampong, P., Ford, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacokinetics+of+alteplase+in+the+treatment+of+ischaemic+stroke.">Pharmacokinetics of alteplase in the treatment of ischaemic stroke.</a> Expert Opin. Drug Metab. Toxicol. 8, 271-281 (2012).</li><li>Derex, L., Nighoghossian, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracerebral+haemorrhage+after+thrombolysis+for+acute+ischaemic+stroke:+an+update.">Intracerebral haemorrhage after thrombolysis for acute ischaemic stroke: an update.</a> J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry. 79, 1093-1099 (2008).</li><li>Garber, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stroke+treatment--light+at+the+end+of+the+tunnel.">Stroke treatment--light at the end of the tunnel.</a> Nat. Biotechnol. 25, 838-840 (2007).</li><li>Liebeskind, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversing+Stroke+in+the+2010s.">Reversing Stroke in the 2010s.</a> Stroke. 40, 3156-3158 (2009).</li><li>Weksler, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier-specific+properties+of+a+human+adult+brain+endothelial+cell+line.">Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line.</a> FASEB J. 19, 1872-1874 (2005).</li><li>Song, L., Pachter, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+murine+brain+microvascular+endothelial+cells+that+maintain+expression+and+cytoskeletal+association+of+tight+junction-associated+proteins.">Culture of murine brain microvascular endothelial cells that maintain expression and cytoskeletal association of tight junction-associated proteins.</a> In Vitro Cell. Dev. Biol. Anim. 39 (2003), 313-320 (2003).</li><li>Steiner, O., Coisne, C., Engelhardt, B., Lyck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+immortalized+bEnd5+and+primary+mouse+brain+microvascular+endothelial+cells+as+in+vitro+blood-brain+barrier+models+for+the+study+of+T+cell+extravasation.">Comparison of immortalized bEnd5 and primary mouse brain microvascular endothelial cells as in vitro blood-brain barrier models for the study of T cell extravasation.</a> J. Cereb. Blood Flow Metab. 31, 315-327 (2011).</li></ol>

Los autores tienen nada que revelar.

La investigación médica en patologías cerebrales sufre mucha dificultad de traslación. En el área de accidente cerebrovascular isquémico agudo, por ejemplo, muchos fármacos que mostraron una gran promesa en modelos animales fallaron en la clínica 38,39. Las razones de estos resultados decepcionantes son diversos e incluyen la infidelidad de los sistemas de pruebas preclínicas con el escenario de derrame cerebral humana y la exageración de los resultados obtenidos a partir de estudios en animales <su...

La acreditación es una interfaz especializada entre la circulación de la sangre periférica y el sistema nervioso central, de manera crucial responsable del mantenimiento de la hemostasia cerebro. Se compone de células cerebrales distintas endoteliales microvasculares (BEC) que son funcionalmente influenciada por pocos componentes celulares y acelulares (a continuación) para formar una puerta de entrada ajustado y dinámico en el cerebro. En condiciones fisiológicas la acreditación restringe el paso de las células sanguíneas, componentes del plasma y sustancias nocivas, todos potencialmente neurotóxico, en el cerebro. En paralelo, la acreditación intercambia selectivamente iones y nutrientes (glucosa y amino-ácidos) clave y los productos de desecho metabólicos entre el cerebro y la circulación para mantener con precisión el entorno de 1,2 cerebro. En los últimos años cada vez es más evidente que el fallo de la BBB se produce en una variedad de patologías cerebrales crónicas, tales como enfermedades neurodegenerativas o relacionados con la inflamación (por ejemplo, enfermedad de Alzheimer y multiple esclerosis, respectivamente) 3, así como en condiciones agudas como accidente cerebrovascular isquémico 4. Las propiedades únicas de BBB de las células endoteliales del cerebro (BEC) se inducen en gran medida por su entorno cerebral 5, y en particular por los astrocitos 6,7. Hay una creciente comprensión de que otros tipos de células, tales como pericitos 8, neuronas y microglia 1,3, así como la membrana basal 9, apoyan BEC y juntos forman una unidad funcional denominada &quot;unidad neurovascular&quot; (NVU), que al mismo tiempo parejas neuronal demandas metabólicas a sus capilares que suministran 10. La participación de la acreditación en situaciones patológicas subyace numerosos intentos de desarrollar modelos in vitro de BBB para ayudar en la investigación relacionada con la acreditación 11,12. Estos modelos tienen como objetivo imitar lo más cerca posible in vivo características de BBB de acuerdo con el principio NVU. In vitro </em&gt; modelos de BBB se basan generalmente en una monocapa de las BEC apretado nudo de formación (principalmente de bovino 13, 14 humana, de rata 15, ratón 16, y porcinos 17,18 orígenes), cultivadas en una membrana porosa junto con astrocitos de apoyo (ampliamente revisado por Deli et al. 2005 11). Los astrocitos pueden ser cultivadas en condiciones sin contacto en la parte inferior de un pocillo de cultivo tisular, separado de las BEC (cultivadas en la superficie superior de la membrana) por el medio de cultivo todavía la comunicación con las BEC a través de factores solubles 16. En modelos más avanzados que mejor se asemejan a la estructura anatómica de la BBB in vivo, los astrocitos se mantienen en condiciones de contacto y se cultivaron directamente en el lado opuesto de la membrana en las proximidades de las BEC 13,15,17 (Figura 1). Esta configuración permite el contacto físico entre BEC y astrocitos, establecido cuando el proyecto astrocitossus procesos a través de la membrana porosa. Es importante destacar que, para un verdadero contacto a producirse los poros debe ser ≥ 1μm de diámetro, desde astrocíticos-pies finales no pueden pasar a través de tamaños de poro más pequeños (es decir, 0,4 micras) 14,15. En particular, los sistemas de contacto de BBB se demuestran en algunos estudios para ser superior a sus homólogos sin contacto con respecto a su resistencia eléctrica trans-endotelial (TEER) y los valores de permeabilidad del endotelio de diversos trazadores 13,17,18. Una dimensión adicional de flujo de medios de comunicación se añadió recientemente en un número de modelos in vitro de BBB para aplicar fuerzas de cizallamiento al endotelio para más cerca de la simulación de la vasculatura del cerebro 12,19. Un obstáculo técnico a superar cuando se genera un modelo de contacto acreditación es la siembra de los astrocitos en contra de la gravedad sobre la superficie abluminal de la membrana porosa. Protocolos anteriores 13,20, donde los astrocitos se sembraron en simplemente una gota de medios de comunicación en la parte superior de una eninserto verted, permitió veces sólo a corto siembra (es decir, 10 min 13 o 2 horas 20) que se encuentra en nuestras manos para ser insuficiente para la fijación celular adecuada. El uso de este método básico, un período más largo de fijación de astrocitos requiere un constante monitoreo de los insertos mediante la apertura frecuente de la incubadora (causar fluctuaciones en la temperatura, el pH y la humedad) y también es propensa a la siembra de células irregular debido a las fugas de los medios de comunicación a través de los poros, especialmente Si se emplean poros de más de 1 m. Aquí se describe un protocolo general para la preparación de un modelo de contacto BBB. Nuestro procedimiento incluye un método alternativo para la célula-siembra en inserciones invertidas, que aborda las limitaciones mencionadas anteriormente. El método permite la adherencia sin perturbaciones de los astrocitos en la superficie de la membrana abluminal, en un incubador equilibrado, durante un período prolongado de tiempo. Como resultado, se consigue una siembra uniforme de los astrocitos que aumenta la calidad de barreray minimiza las variaciones de permeabilidad basales entre insertos. A medida que el uso de células humanas es importante para la investigación humana correspondiente 21, que, además demostramos en este artículo la utilización específica de una novedosa combinación de las BEC humanos primarios e inmortalizado astrocitos humanos para el establecimiento de un modelo de acreditación de contacto humano con una alta capacidad de rastreo de . Desde la visualización de las células en membranas porosas puede ser, nosotros también las técnicas de tinción de detalles difíciles que pueden ayudar en la determinación de la confluencia y la morfología de las células de las membranas porosas. Finalmente, se ejemplifican cómo nuestro modelo de acreditación humano puede ser utilizado para examinar el efecto de tipo activador del plasminógeno tisular (t-PA) - una enzima para disolver coágulos que sirve como una opción de tratamiento único para el accidente cerebrovascular isquémico agudo - en la acreditación.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="863">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Attachment Factor</td>
			<td style="width:193px;">Cell-Systems Corporation</td>
			<td style="width:171px;">4Z0-210</td>
			<td style="width:243px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Brain microvascular endothelial cells (BECs), primary, human</td>
			<td style="width:193px;">Cell-Systems Corporation</td>
			<td style="width:171px;">ACBRI 376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Complete medium</td>
			<td style="width:193px;">Cell-Systems Corporation</td>
			<td style="width:171px;">4Z0-500</td>
			<td style="width:243px;">Supplemented with CSC JetFuel</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Complete serum-free medium</td>
			<td style="width:193px;">Cell-Systems Corporation</td>
			<td style="width:171px;">SF-4Z0-500</td>
			<td style="width:243px;">Supplemented with CSC RocketFue</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">DMEM/F-12 with 15 mM HEPES</td>
			<td style="width:193px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:171px;">11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Endothelial cells growth supplement (from bovine origin)</td>
			<td style="width:193px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:171px;">E2759-15MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">External silicone tubing</td>
			<td style="width:193px;">Watson-Marlow</td>
			<td style="width:171px;">913.A080.016</td>
			<td style="width:243px;">Pumpsil brand, 8 mm internal diameter, 1.6 mm wall</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Foetal calf serum</td>
			<td style="width:193px;">Lonza</td>
			<td style="width:171px;">14-501F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Gentamycin sulfate</td>
			<td style="width:193px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:171px;">15750-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Heparin sodium</td>
			<td style="width:193px;">Pfizer</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:243px;">1,000 U/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Hexamethyldisilazane (HMDS)</td>
			<td style="width:193px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:171px;">H4875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Human brain microvascular endothelial cells</td>
			<td style="width:193px;">Cell-Systems Corporation</td>
			<td style="width:171px;">ACBRI 376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Internal silicone tubing</td>
			<td style="width:193px;">Watson-Marlow</td>
			<td style="width:171px;">913.A032.016</td>
			<td style="width:243px;">Pumpsil brand, 3.2 mm internal diameter, 1.6 mm wall</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:193px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:171px;">25030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Mayer&#8217;s hematoxylin solution</td>
			<td style="width:193px;">Amber Scientific</td>
			<td style="width:171px;">MH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Minimum essential medium with Earle&#8217;s balanced salt solution</td>
			<td style="width:193px;">HyClone Laboratories</td>
			<td style="width:171px;">SH30244.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:193px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:171px;">15140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Rat collagen I</td>
			<td style="width:193px;">Trevigen</td>
			<td style="width:171px;">3440-100-01</td>
			<td style="width:243px;">Cultrex brand</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:257px;">Tissue culture inserts</td>
			<td style="width:193px;">Corning Life Sciences</td>
			<td style="width:171px;">3472</td>
			<td style="width:243px;">Transwell brand, 6.5 mm in diameter, with polyester porous membrane, 3 &#181;m pore-size</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

improved method for the preparation of a human cell-based, contact model of the blood-brain barrier

La barrera sangre-cerebro (BBB) ​​comprende impermeables pero adaptables capilares del cerebro que controlan estrechamente el medio ambiente cerebro. El fallo de la BBB ha sido implicado en la etiología de muchas patologías cerebrales, creando una necesidad para el desarrollo de humano en modelos in vitro de BBB para ayudar en la investigación clínica relevante. Entre los numerosos modelos de BBB descritas hasta ahora, una estática (sin flujo), en contacto con la acreditación modelo, donde los astrocitos y las células endoteliales del cerebro (BEC) se co-cultivaron en los lados opuestos de una membrana porosa, surgió como un sistema todavía auténtica simplificado para simular el acreditación con capacidad de cribado de alto rendimiento. Sin embargo, la generación de dicho modelo presenta unos desafíos técnicos. Aquí se describe un protocolo para la preparación de un modelo de acreditación contacto humano que utiliza una combinación nueva de BEC humanos primarios y astrocitos humanos inmortalizados. Concretamente, se detalla un método innovador para la célula-siembra en inserciones invertidas, así como especificar la insercióntécnicas y tinción camisetas ejemplifican cómo usamos nuestro modelo para la investigación relacionada con la acreditación.

Con el fin de establecer un modelo de contacto acreditación humana tuvimos que cultivar IVS y BEC en membranas porosas con un tamaño de poro de 3 micras, que se muestra para permitir el paso de astrocitos finales pies para el contacto con las células endoteliales 14,15,27,28. Una representación esquemática del modelo de contacto completa se ilustra en la Figura 1 (la ilustración de la izquierda). El principal desafío técnico presentado por un sistema de contacto es la necesidad de sem...

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Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

Establecimiento de modelos humanos de la barrera sangre-cerebro (BBB) ​​puede beneficiar a la investigación de las condiciones del cerebro asociadas con la acreditación fracaso. Se describe aquí una técnica mejorada para la preparación de un modelo de acreditación de contacto, que permite que el cocultivo de astrocitos humanos y las células endoteliales del cerebro en los lados opuestos de una membrana porosa.

Método mejorado para la preparación de una base de células, Contacto Modelo Humano de la barrera hematoencefálica

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

improved-method-for-preparation-human-cell-based-contact-model-blood

Research

JoVE Journal

Bioengineering

16.2K vistas.  Monash University.  Establecimiento de modelos humanos de la barrera sangre-cerebro (BBB) ​​puede beneficiar a la investigación de las condiciones del cerebro asociadas con la acreditación fracaso. Se describe aquí una técnica mejorada para la preparación de un modelo de acreditación de contacto, que permite que el cocultivo de astrocitos humanos y las células endoteliales del cerebro en los lados opuestos de una membrana porosa. 

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Constant Pressure-controlled Extrusion Method for the Preparation of Nano-sized Lipid Vesicles

Liposomes are artificially prepared vesicles consisting of natural and synthetic phospholipids that are widely used as a cell membrane mimicking platform to study protein-protein and protein-lipid interactions3, monitor drug delivery4,5, and encapsulation4. Phospholipids naturally create curved lipid bilayers, distinguishing itself from a micelle.6 Liposomes are traditionally classified by size and number of bilayers, i.e. large unilamellar vesicles (LUVs), small unilamellar vesicles (SUVs) and multilamellar vesicles (MLVs)7. In particular, the preparation of homogeneous liposomes of various sizes is important for studying membrane curvature that plays a vital role in cell signaling, endo- and exocytosis, membrane fusion, and protein trafficking8. Several groups analyze how proteins are used to modulate processes that involve membrane curvature and thus prepare liposomes of diameters &lt;100 - 400 nm to study their behavior on cell functions3. Others focus on liposome-drug encapsulation, studying liposomes as vehicles to carry and deliver a drug of interest9. Drug encapsulation can be achieved as reported during liposome formation9. Our extrusion step should not affect the encapsulated drug for two reasons, i.e. (1) drug encapsulation should be achieved prior to this step and (2) liposomes should retain their natural biophysical stability, securely carrying the drug in the aqueous core. These research goals further suggest the need for an optimized method to design stable sub-micron lipid vesicles.
Nonetheless, the current liposome preparation technologies (sonication10, freeze-and-thaw10, sedimentation) do not allow preparation of liposomes with highly curved surface (i.e. diameter &lt;100 nm) with high consistency and efficiency10,5, which limits the biophysical studies of an emerging field of membrane curvature sensing. Herein, we present a robust preparation method for a variety of biologically relevant liposomes.
Manual extrusion using gas-tight syringes and polycarbonate membranes10,5 is a common practice but heterogeneity is often observed when using pore sizes &lt;100 nm due to due to variability of manual pressure applied. We employed a constant pressure-controlled extrusion apparatus to prepare synthetic liposomes whose diameters range between 30 and 400 nm. Dynamic light scattering (DLS)10, electron microscopy11 and nanoparticle tracking analysis (NTA)12 were used to quantify the liposome sizes as described in our protocol, with commercial polystyrene (PS) beads used as a calibration standard. A near linear correlation was observed between the employed pore sizes and the experimentally determined liposomes, indicating high fidelity of our pressure-controlled liposome preparation method. Further, we have shown that this lipid vesicle preparation method is generally applicable, independent of various liposome sizes. Lastly, we have also demonstrated in a time course study that these prepared liposomes were stable for up to 16 hours. A representative nano-sized liposome preparation protocol is demonstrated below.

This protocol describes an extrusion method for preparing lipid vesicles of sub-micron sizes with a high degree of homogeneity. This method uses a pressure-controlled system with controlled nitrogen flow rates for liposome preparation. The lipid preparation1,2, liposome extrusion, and size characterization will be presented herein.

Presión constante controlada por extrusión Método para la preparación de vesículas de lípidos de tamaño nano-

Liposomes are artificially prepared vesicles consisting of natural and synthetic phospholipids that are widely used as a cell membrane mimicking platform ...

Investigación

Bioingeniería

An Improved Method for the Preparation of Type I Collagen From Skin

Soluble type 1 collagen (COL1) is used extensively as an adhesive substrate for cell cultures and as a cellular scaffold for regenerative applications. Clinically, this protein is widely used for cosmetic surgery, dermal injections, bone grafting, and reconstructive surgery. The sources of COL1 for these procedures are commonly nonhuman, which increases the potential for inflammation and rejection as well as xenobiotic disease transmission. In view of this, a method to efficiently and quickly purify COL1 from limited quantities of autologously-derived tissues would circumvent many of these issues; however, standard isolation protocols are lengthy and often require large quantities of collagenous tissues. Here, we demonstrate an efficient COL1 extraction method that reduces the time needed to isolate and purify this protein from about 10 days to less than 3 hr. We chose the dermis as our tissue source because of its availability during many surgical procedures. This method uses traditional extraction buffers combined with forceful agitation and centrifugal filtration to obtain highly-pure, soluble COL1 from small amounts of corium. Briefly, dermal biopsies are washed thoroughly in ice-cold dH2O after removing fat, connective tissue, and hair. The skin samples are stripped of noncollagenous proteins and polysaccharides using 0.5 M sodium acetate and a high speed bench-top homogenizer. Collagen from residual solids is subsequently extracted with a 0.075 M sodium citrate buffer using the homogenizer. These extracts are purified using 100,000 MW cut-off centrifugal filters that yield COL1 preparations of comparable or superior quality to commercial products or those obtained using traditional procedures. We anticipate this method will facilitate the utilization of autologously-derived COL1 for a multitude of research and clinical applications.

Traditional procedures for the isolation of soluble type 1 collagen (COL1) require about 10 days from start to finish because of lengthy buffer incubations and laborious resuspensions of fibrils. Here, we describe a means to purify COL1 from small dermal biopsies in less than 3 hr.

Un método mejorado para la preparación de colágeno tipo I De Piel

Soluble type 1 collagen (COL1) is used extensively as an adhesive substrate for cell cultures and as a cellular scaffold for regenerative applications. ...

Development of a Multicellular Three-dimensional Organotypic Model of the Human Intestinal Mucosa Grown Under Microgravity

Because cells growing in a three-dimensional (3-D) environment have the potential to bridge many gaps of cell cultivation in 2-D environments (e.g., flasks or dishes). In fact, it is widely recognized that cells grown in flasks or dishes tend to de-differentiate and lose specialized features of the tissues from which they were derived. Currently, there are mainly two types of 3-D culture systems where the cells are seeded into scaffolds mimicking the native extracellular matrix (ECM): (a) static models and (b) models using bioreactors. The first breakthrough was the static 3-D models. 3-D models using bioreactors such as the rotating-wall-vessel (RWV) bioreactors are a more recent development. The original concept of the RWV bioreactors was developed at NASA&#39;s Johnson Space Center in the early 1990s and is believed to overcome the limitations of static models such as the development of hypoxic, necrotic cores. The RWV bioreactors might circumvent this problem by providing fluid dynamics that allow the efficient diffusion of nutrients and oxygen. These bioreactors consist of a rotator base that serves to support and rotate two different formats of culture vessels that differ by their aeration source type: (1) Slow Turning Lateral Vessels (STLVs) with a co-axial oxygenator in the center, or (2) High Aspect Ratio Vessels (HARVs) with oxygenation via a flat, silicone rubber gas transfer membrane. These vessels allow efficient gas transfer while avoiding bubble formation and consequent turbulence. These conditions result in laminar flow and minimal shear force that models reduced gravity (microgravity) inside the culture vessel. Here we describe the development of a multicellular 3-D organotypic model of the human intestinal mucosa composed of an intestinal epithelial cell line and primary human lymphocytes, endothelial cells and fibroblasts cultured under microgravity provided by the RWV bioreactor.

Cells growing in a three-dimensional (3-D) environment represent a marked improvement over cell cultivation in 2-D environments (e.g., flasks or dishes). Here we describe the development of a multicellular 3-D organotypic model of the human intestinal mucosa cultured under microgravity provided by rotating-wall-vessel (RWV) bioreactors.

Desarrollo de un Modelo Organotípicos multicelular tridimensional de la mucosa intestinal humanas cultivadas en condiciones de microgravedad

Because cells growing in a three-dimensional (3-D) environment have the potential to bridge many gaps of cell cultivation in 2-D environments (e.g., ...

In Vitro Permeation of FITC-loaded Ferritins Across a Rat Blood-brain Barrier: a Model to Study the Delivery of Nanoformulated Molecules

Brain microvascular endothelial cells, supported by pericytes and astrocytes endfeet, are responsible for the low permeation of large hydrosoluble drugs through the blood-brain barrier (BBB), causing difficulties for effective pharmacological therapies. In recent years, different strategies for promoting brain targeting have aimed to improve drug delivery and activity at this site, including innovative nanosystems for drug delivery across the BBB. In this context, an in vitro approach based on a simplified cellular model of the BBB provides a useful tool to investigate the effect of nanoformulations on the trans-BBB permeation of molecules. This study describes the development of a double-layer BBB, consisting of co-cultured commercially available primary rat brain microvascular endothelial cells and astrocytes. A multiparametric approach for the validation of the model, based on the measurement of the transendothelial electrical resistance and the apparent permeability of a high molecular weight dextran, is also described. As proof of concept for the employment of this BBB model to study the effect of different nanoformulations on the translocation of fluorescent molecules across the barrier, we describe the use of fluorescein isothiocyanate (FITC), loaded into ferritin nanoparticles. The ability of ferritins to improve the trans-BBB permeation of FITC was demonstrated by flux measurements and confocal microscopy analyses. The results suggest this is a useful system for validating nanosystems for delivery of drugs across the BBB.

In Vitro Permeation of FITC-loaded Ferritins Across a Rat Blood-brain Barrier: a Model to Study the Delivery of Nanoformulated Molecules

A method to establish an in vitro model of blood-brain barrier based on a co-culture of rat brain microvascular endothelial cells and astrocytes is described and validated. This system proved to be a valid tool to study the effect of nanoformulation on the trans-barrier permeation of fluorescent molecules.

In vitro de permeación de ferritinas cargados con FITC través de una barrera sangre-cerebro de rata: un modelo para estudiar la entrega de moléculas Nanoformulated

Brain microvascular endothelial cells, supported by pericytes and astrocytes endfeet, are responsible for the low permeation of large hydrosoluble drugs ...

Lucifer Yellow - A Robust Paracellular Permeability Marker in a Cell Model of the Human Blood-brain Barrier

The blood-brain barrier BBB consists of endothelial cells that form a barrier between the systemic circulation and the brain to prevent the exchange of non-essential ions and toxic substances. Tight junctions (TJ) effectively seal the paracellular space in the monolayers resulting in an intact barrier. This study describes a LY-based fluorescence assay that can be used to determine its apparent permeability coefficient (Papp) and in turn can be used to determine the kinetics of the formation of confluent monolayers and the resulting tight junction barrier integrity in hCMEC/D3 monolayers. We further demonstrate an additional utility of this assay to determine TJ functional integrity in transfected cells. Our data from the LY Papp assay shows that the hCMEC/D3 cells seeded in a transwell setup effectively limit LY paracellular transport 7 days-post culture. As an additional utility of the presented assay, we also demonstrate that the DNA nanoparticle transfection does not alter LY paracellular transport in hCMEC/D3 monolayers.

We present a fluorescence assay to demonstrate that Lucifer Yellow (LY) is a robust marker to determine the apparent paracellular permeability of hCMEC/D3 cell monolayers, an in vitro model of the human blood-brain barrier. We used this assay to determine the kinetics of a confluent monolayer formation in cultured hCMEC/D3 cells.

Lucifer Yellow - Un marcador de permeabilidad paracelular robusto en un modelo celular de la barrera hematoencefálica humana

The blood-brain barrier BBB consists of endothelial cells that form a barrier between the systemic circulation and the brain to prevent the exchange of ...

Simultaneous Quantification of Selected Kynurenines Analyzed by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry in Medium Collected from Cancer Cell Cultures

The kynurenine pathway and the tryptophan catabolites called kynurenines have received increased attention for their involvement in immune regulation and cancer biology. An in vitro cell culture assay is often used to learn about the contribution of different tryptophan catabolites in a disease mechanism and for testing therapeutic strategies. Cell culture medium that is rich in secreted metabolites and signaling molecules reflects the status of tryptophan metabolism and other cellular events. New protocols for the reliable quantification of multiple kynurenines in the complex cell culture medium are desired to allow for a reliable and quick analysis of multiple samples. This can be accomplished with liquid chromatography coupled with mass spectrometry. This powerful technique is employed in many clinical and research laboratories for the quantification of metabolites and can be used for measuring kynurenines.
Presented here is the use of liquid chromatography coupled with single quadrupole mass spectrometry (LC-SQ) for the simultaneous determination of four kynurenines, i.e., kynurenine, 3-hydroxykynurenine, 3-hydroxyanthranilic, and xanthurenic acid in the medium collected from in vitro cultured cancer cells. SQ detector is simple to use and less expensive compared to other mass spectrometers. In the SQ-MS analysis, multiple ions from the sample are generated and separated according to their specific mass-to-charge ratio (m/z), followed by the detection using a Single Ion Monitoring (SIM) mode.
This paper draws the attention on the advantages of the reported method and indicates some weak points. It is focused on critical elements of LC-SQ analysis including sample preparation along with chromatography and mass spectrometry analysis. The quality control, method calibration conditions and matrix effect issues are also discussed. We described a simple application of 3-nitrotyrosine as one analog standard for all target analytes. As confirmed by experiments with human ovary and breast cancer cells, the proposed LC-SQ method&#160;generates reliable results and can be further applied to other in vitro cellular models.

Described here is a protocol for the determination of four different tryptophan metabolites generated in the kynurenine pathway (kynurenine, 3-hydroxykynurenine, xanthurenic acid, 3-hydroxyanthranilic acid) in the medium collected from cancer cell cultures analyzed by liquid chromatography coupled with a single quadrupole mass spectrometry.

Cuantificación simultánea de kynureninas seleccionadas analizadas por cromatografía líquida-espectrometría de masas en medio recogido de cultivos celulares oncológicos

The kynurenine pathway and the tryptophan catabolites called kynurenines have received increased attention for their involvement in immune regulation and ...

Transplantation of a 3D Bioprinted Patch in a Murine Model of Myocardial Infarction

Testing regenerative properties of 3D bioprinted cardiac patches in vivo using murine models of heart failure via permanent left anterior descending (LAD) ligation is a challenging procedure and has a high mortality rate due to its nature. We developed a method to consistently transplant bioprinted patches of cells and hydrogels onto the epicardium of an infarcted mouse heart to test their regenerative properties in a robust and feasible way. First, a deeply anesthetized mouse is carefully intubated and ventilated. Following left lateral thoracotomy (surgical opening of the chest), the exposed LAD is permanently ligated and the bioprinted patch transplanted onto the epicardium. The mouse quickly recovers from the procedure after chest closure. The advantages of this robust and quick approach include a predicted 28-day mortality rate of up to 30% (lower than the 44% reported by other studies using a similar model of permanent LAD ligation in mice). Moreover, the approach described in this protocol is versatile and could be adapted to test bioprinted patches using different cell types or hydrogels where high numbers of animals are needed to optimally power studies. Overall, we present this as an advantageous approach which may change preclinical testing in future studies for the field of cardiac regeneration and tissue engineering.

This protocol aims to transplant a 3D bioprinted patch onto the epicardium of infarcted mice modeling heart failure. It includes details regarding anesthesia, the surgical chest opening, permanent ligation of the left anterior descending (LAD) coronary artery and application of a bioprinted patch onto the infarcted area of the heart.

Trasplante de un parche bioimpreso 3D en un modelo murino de infarto de miocardio

Testing regenerative properties of 3D bioprinted cardiac patches in vivo using murine models of heart failure via permanent left anterior descending (LAD) ...

Un nuevo método de inyección lenta mínimamente invasivo para reducir la lesión tisular

A Novel Cell Injection Method with Minimum Invasion

Directly injecting cells into tissues is a necessary process in cell administration and/or replacement therapy. The cell injection requires a sufficient amount of suspension solution to allow the cells to enter the tissue. The volume of the suspension solution affects the tissue, and this can cause major invasive injury as a result of the cell injection. This paper reports on a novel cell injection method, called slow injection, that aims to avoid this injury. However, pushing out the cells from the needle tip requires a sufficiently high injection speed according to Newton's law of shear force. To solve the above contradiction, a non-Newtonian fluid, such as gelatin solution, was used as the cell suspension solution in this work. Gelatins solution have temperature sensitivity, as their form changes from gel to sol at approximately 20 &#176;C. Therefore, to maintain the cell suspension solution in the gel form, the syringe was kept cooled in this protocol; however, once the solution was injected into the body, the body temperature converted it to a sol. The interstitial tissue fluid flow can absorb excess solution. In this work, the slow injection technique allowed cardiomyocyte balls to enter the host myocardium and engraft without surrounding fibrosis. This study employed a slow injection method to inject purified and ball-formed neonatal rat cardiomyocytes into a remote area of myocardial infarction in the adult rat heart. At 2 months following the injection, the hearts of the transplanted groups showed significantly improved contractile function. Furthermore, histological analyses of the slow-injected hearts revealed seamless connections between the host and graft cardiomyocytes via intercalated disks containing gap junction connections. This method could contribute to next-generation cell therapies, particularly in cardiac regenerative medicine.

Autor destacado: Un nuevo método de inyección de células con una invasión mínima  

This method eliminates any major invasion during cell injections caused by the cell suspension solution.

Un nuevo método de inyección celular con una invasión mínima

Directly injecting cells into tissues is a necessary process in cell administration and/or replacement therapy. The cell injection requires a sufficient ...