Este método puede ayudar a responder preguntas clave con respecto a la configuración de la vía metabólica en las células de la leucemia. La principal ventaja de esta técnica es que permite medir el metabolismo de las células primarias de leucemia en tiempo real en células vivas. Comience diluyendo una muestra de médula ósea obtenida de un paciente con leucemia en PBS en una proporción de uno a uno.
Con cuidado, capa seis mililitros de la muestra de médula ósea diluida sobre seis mililitros de medio de gradiente de densidad recién preparado en un tubo cónico de 15 mililitros y separar las células por centrifugación de gradiente de densidad. Utilice una pipeta Pasteur para transferir cuidadosamente la capa de interfaz de las células mononucleares a un nuevo tubo cónico de 50 mililitros que contenga cinco mililitros de PBS para un lavado de centrifugación. Luego, resuspendir el pellet de célula mononuclear en dos mililitros de PBS estéril para el conteo.
Diluir las células a tres veces 10 a las siete células por mililitro de concentración. Y añadir un mililitro de células a cada uno de los dos matraces T75 que contienen 20 mililitros de medio RPMI para una incubación de 16 a 24 horas a 37 grados Celsius y 5%CO2. Mientras tanto, para preparar las placas para el análisis de flujo extracelular, agregue 12,5 microlitros de solución adhesiva celular en cada pozo de dos, ocho placas de analizador de flujo extracelular bien.
Después de 20 minutos, aspirar el adhesivo celular y lavar cada pozo dos veces con 200 microlitros de agua estéril por lavado. Después del segundo lavado, deje las placas en el capó hasta que los pozos estén secos. Y coloque el cartucho del sensor boca abajo en el banco del laboratorio.
Separe la placa de servicio y el cartucho del sensor del analizador de flujo. Y llene cada pozo de la placa de utilidad con 200 microlitros de calibrador y cada foso alrededor del exterior de los pozos con 400 microlitros de calibrador. Vuelva a colocar el cartucho del sensor en la placa de utilidad que ahora contiene el calibrador y coloque el conjunto del cartucho en una incubadora humidificada de 37 grados Centígrados sin CO2 durante la noche.
A continuación, encienda el analizador de flujo extracelular y déjelo calentar a 37 grados Celsius durante la noche. A la mañana siguiente, transfiera las células del matraz a tubos cónicos de 50 mililitros para centrifugación. Y resuspender los pellets en un mililitro del medio experimental apropiado para el conteo.
Resuspender las células a cuatro veces 10 a las seis células en 400 microlitros de concentración media experimental. Y agregue 50 microlitros de células en los pozos B a G de la placa del analizador de flujo. Y 180 microlitros del medio experimental en pozos A y H como los pozos de control de fondo.
Después de la centrifugación lenta y cuidadosamente añadir 130 microlitros del medio experimental a pozos B a través de G.Y confirmar visualmente la adherencia estable de las células a la parte inferior de cada pozo bajo el microscopio. A continuación, devuelva la placa de análisis de flujo a la incubadora humidificada de 37 grados Centígrados sin CO2 durante 30 minutos. 20 minutos antes del final de la incubación, cargue los compuestos en los puertos de inyector apropiados del cartucho de acuerdo con el protocolo experimental como se indica en la tabla.
A continuación, configure el programa de análisis de flujo extracelular adecuado. Inicie el programa y sustituya la placa calibrante por la placa de ensayo cuando se le solicite. En una prueba de estrés de glucólisis, sólo se utiliza medio basal para que las células se ven privadas de nutrientes.
El primer parámetro obtenido es la acidificación basal que debe reflejar la cantidad de glucosa almacenada en las células. Después de la primera inyección, la tasa de acidificación extracelular aumenta a medida que las células utilizan la glucosa y pueden fermentar la glucosa para lactato. La oligomicina A en la segunda inyección inhibe ATP sintasa y por lo tanto dirige a las células a producir ATP principalmente por una glucólisis causando una mayor elevación de la tasa de acidificación extracelular.
Mientras que la inyección de 2-Deoxy-D-glucose inhibe completamente la glucólisis y la tasa de acidificación extracelular disminuye. En la prueba de estrés mito celular, se utiliza un medio complementado con glutamina y glucosa para que las células no se priven de todos los nutrientes. El parámetro de respiración basal refleja su estado metabólico basal.
Después de la primera inyección con oligomicina A, las células inhiben la respiración mitocondrial y cambian a la glucólisis que se representa como una disminución en la tasa de consumo de oxígeno. La segunda y tercera inyecciones de FCCP, sin embargo, desacopla la producción de ATP de la respiración para que las células ahora consuman oxígeno a un ritmo máximo. Y la tasa de consumo de oxígeno sube a su valor más alto.
La última inyección de la mezcla de rotenona y antimicina A inhibe completamente la respiración mitocondrial disminuyendo la tasa de consumo de oxígeno a casi cero. Al intentar este procedimiento, es importante evaluar el porcentaje de explosiones en la muestra para asegurarse de que los parámetros metabólicos de los leucemiablasts sólo se miden. Al implementar este método, se debe aplicar una optimización cuidadosa a las condiciones de cultivo y a la normalización de los datos.
