Este trabajo fue apoyado por subvenciones del NIH R01-GM-098 977 y R21-AI-098 122 para CBK y KEG. RSS fue apoyado en parte por una beca de la Fundación Luce y en parte por una beca del Programa de Innovación Thayer de la Escuela de Ingeniería Thayer.

Cuatro actividades principales comprenden el ensayo de unión péptido-MHC II: 1-Encuadernación: péptidos de ensayo compiten con los péptidos de control marcado por la unión en fase de solución de proteínas MHC II solubles. Encuadernación se mide a través de una amplia gama de concentraciones de péptido de prueba. 2-Captura: Después de la reacción de unión se aproxima al equilibrio, los complejos de péptido-MHC II se capturan y se separan de péptido no unido y la proteína por el reconocimiento dependiente de la conformación con un anticuerpo inmovilizado. 3-Detección: péptido de control capturado se detecta cuantitativamente usando fluorescencia resuelta en el tiempo. 4-Análisis: Los datos espectroscópicos se procesan, representaron gráficamente y se analizaron para determinar propiedades de unión dependientes de la dosis de péptido de prueba y proteínas MHC II. En diversas etapas del procedimiento, se recomienda el uso de un robot de manejo de líquidos si hay alguno disponible. En particular, en un formato de 384 pocillos, de dispensación automatizada y la dilución de los líquidos minimiza el error de usuario, resultados en másconsistentes volúmenes del pozo a pozo, y los rendimientos más estrechos intervalos de confianza del 95% para los valores de CI 50 en comparación con los ensayos de 96 pozos manuales (datos no presentados). Si un robot de manejo de líquidos no está disponible, los pasos anotados con &quot;(robot de manejo de líquidos)&quot; se pueden hacer a mano. Del mismo modo, si es posible, se recomienda un lavador de placas automatizado que es compatible con el formato de 384 pocillos. Esto normaliza eficazmente el proceso de lavado de placas. Si un lavador de placas no está disponible, los pasos anotados con &quot;(lavador de placas)&quot; se pueden hacer a mano. 1. Cubra la placa ELISA (Día 1) <ol><li> Diluir anticuerpo L243 de stock (0,5 mg / ml) en tampón borato a una concentración de trabajo de 10 mg / ml. <ol><li> Para cubrir una sola placa de 384 pocillos, añadir 200 l de anticuerpo de stock a 9,8 ml de tampón borato. (Ver calculadora de hoja de cálculo complementario para escalamiento alternativa). </li></ol></li><li> Añadir 25 l de la solución de anticuerpo L243 a cada pocillo de un 384-Well alta unión a la placa ELISA blanco. (Robot de manejo de líquidos) </li><li> Sellar la placa con una lámina de poliéster y se incuba durante la noche a 4 ° C. Nota: Cada placa de ELISA de 384 pozos con capacidad para 15 péptidos de ensayo en ocho diluciones de un alelo de MHC II, así como los controles positivos y negativos. Esto producirá en última instancia, mediciones por triplicado. </li></ol> 2. Haga la prueba de péptidos diluciones (Día 1) <ol><li> A partir de un almacén 10 mM de cada péptido de ensayo en DMSO, hacer la siguiente serie de dilución en tampón de citrato-fosfato utilizando placas de polipropileno de 384 pocillos (Tabla 1). (Robot de manejo de líquidos) Nota: Un plato lleno de polipropileno de 384 pozos requiere de tres placas de ELISA separadas. Una tercera parte de una placa de polipropileno requerirá sólo una placa de ELISA (Figura 1). </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody align="center"><tr><td rowspan="2"> Número de dilución </td><td> Volumen to tomar desde antes de la dilución / cepa </td><td> Volumen de Tampón de Citrato añadir </td><td> Conc. de Dilución </td><td> Conc. en reacción de unión </td><td> Conc. en neutralizados ELISA </td></tr><tr><td> (L) </td><td> (L) </td><td> (M) </td><td> (M) </td><td> (M) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 0.7 </td><td> 35.1 </td><td> 195.531 </td><td> 97.765 </td><td> 48.883 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 14.3 </td><td> 14.3 </td><td> 97.765 </td><td> 48.883 </td><td> 24.441 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 7.1 </td><td> 28.7 </td><td> 19.389 </td><td> 9.695 </td><td> 4.847 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 14.3 </td><td> 14.3 </td><td> 9.695 </td><td> 4.847 </td><td> 2.424 </td></tr><tr><td> 5 </td><td> 7.1 </td><td> 28.7 </td><td> 1.923 </td><td> 0.961 </td><td> 0.481 </td></tr><tr><td> 6 </td><td> 14.3 </td><td> 14.3 </td><td> 0.961 </td><td> 0.481 </td><td> 0.24 </td></tr><tr><td> 7 </td><td> 7.1 </td><td> 28.7 </td><td> 0.191 </td><td> 0.095 </td><td> 0.048 </td></tr><tr><td> 8 </td><td> 14.3 </td><td> 14.3 </td><td> 0.095 </td><td> 0.048 </td><td> 0.024 </td></tr><tr><td colspan="6"> Retire y deseche 7,1 l de solución de péptido de dilución número 8. </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Preparación de prueba de péptido serie de dilución. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51308/51308fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51308/51308fig1.jpg" /> Figura 1. Plate Mapa del péptido Ensayo de unión. (A) Mapa de las diluciones de péptido en polipropileno placas de 384 pocillos. Cada placa de polipropileno tiene capacidad para tres grupos de 15 péptidos en las reacciones de unión de competición contra un cantar<html> alelo le MHC II. (B) Después de la reacción de unión se aproxima al equilibrio, cada grupo de péptidos por triplicado se transfiere,, a una placa de 384 pocillos de ELISA separada que ha sido pre-revestido con anticuerpo anti-MHC II. 3. Preparar la mezcla maestra MHC II (Día 1) <ol><li> Hacer el tampón de reacción <ol><li> Añadir 80 l de 1 mM de Pefa Bloc y 60 mg de octil-β-D-glucopyranaside a 3.920 l de citrato tampón fosfato. (Ver calculadora de hoja de cálculo complementario para escalamiento alternativa). </li></ol></li><li> Diluir soluciones madre MHC II seleccionados a 101 nM en tampón de reacción utilizando un tubo cónico de 15 ml (Tabla 2). Nota: la concentración de MHC II será en última instancia 50 nM en la reacción de unión y 25 nM en el ensayo ELISA neutralizado. Las concentraciones madre MHC II variarán en función de número de lote del fabricante. (Ver calculadora de hoja de cálculo complementario). </li></ol>&quot;&gt; <tbody><tr><td> MHC II alelo DRB1 *: </td><td> 1501 </td></tr><tr><td> Concentración de la MHC II (mg / ml) </td><td> 1.3 </td></tr><tr><td> MHC II Stock Concentración (mM) </td><td> 20 </td></tr><tr><td> Vol.. II MHC Stock agregar (ml) </td><td> 14.65 </td></tr><tr><td> Vol.. Reaction Buffer agregar (ml): </td><td> 2885.35 </td></tr><tr><td> Concentración de MHC II Master Mix (nM) </td><td> 101 </td></tr></tbody></table> Tabla 2. Preparación de mezcla maestra de MHC II. 4. Preparar los controles positivos y negativos (Día 1) <ol><li> Añadir 21,5 l de citrato tampón fosfato al pozo &quot;control negativo&quot; de la placa de polipropileno de 384 pozos desde el paso 2.1 (Figura 1A). </li><li> Añadir 21,5 l de citrato tampón fosfato al pozo &quot;control positivo&quot; de la placa de polipropileno de 384 pocillos. Nota: La función &quot;Posicontrol efectivo &quot;se completará en la sección 5, a continuación. </li><li> Retire 49,5 l de la MHC II Master Mix desde el paso 3.2 y la pipeta en un tubo Eppendorf de 1,5 ml. </li><li> Añadir 0,5 l de tampón de citrato a los 49,5 l de la MHC II Master Mix desde el paso 4.3. </li><li> Añadir 21,5 l de la concentración ajustada de MHC II Master Mix de la etapa 4.4 para el bienestar &quot;control negativo&quot; de la placa de polipropileno de 384 pocillos (Figura 1A). Nota: Esta muestra representa el control negativo de la señal cero que contiene proteínas MHC II, NO péptido control, y NO péptido de prueba. </li></ol> 5. Añadir el apropiado péptido de control a la MHC II Master Mix (Día 1) <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> MHC II alelo DRB1 * </td><td> Biotinilado de control Péptido </td><td> (Residuos) </td><td> Secuencia </td></tr><tr><td> 0101 </td><td> Gripe-HA-B </td><td> (306-318) </td><td> Biotina-(Ahx) (Ahx) PRYVKQNTLKLAT-amida </td></tr><tr><td> 0301 </td><td> La mioglobina </td><td> (137-148) </td><td> Biotina-(Ahx) - (Ahx)-LFRKDIAAKYKE-OH </td></tr><tr><td> 0401 </td><td> YAR-B </td><td> (1-14) </td><td> Biotina-(Ahx) (Ahx) YARFQSQTTLKQKT-OH </td></tr><tr><td> 0701 </td><td> TetTox-B </td><td> (830-843) </td><td> Biotina-(Ahx) (Ahx) QYIKANSKFIGITE-OH </td></tr><tr><td> 1101 </td><td> Gripe-HA-B </td><td> (306-318) </td><td> Biotina-(Ahx) (Ahx) PRYVKQNTLKLAT-amida </td></tr><tr><td> 1501 </td><td> MBP-B </td><td> (84-102) </td><td> Biotina-(Ahx) (Ahx) NPVVHFFKNIVTPRTPPPS-OH </td></tr></tbody></table> * Recomendamos pedir 10 mg escala para la economía. Tabla 3. Péptidos de control para los diversos alelos de MHC II. * <ol><li> Diluir el péptido de control (almacenado a 400 mM en DMSO) 1:20 en DMSO fresco para producir una acción diluido a 20 mM. <ol><li> Añadir 25 l de 400 mM de control péptido a475 l de DMSO. Nota: este es un gran exceso, pero permite la manipulación precisa de soluciones de DMSO viscosos. </li></ol></li><li> Además diluir el péptido de control del paso 5,1 (20 mM) 1:100 en el MHC II Master Mix desde el paso 3.2. <ol><li> Añadir 28,8 l de control péptido diluido en el paso 5.2 a los 2,850.5 l restantes del MHC II Master Mix. </li></ol></li><li> Añadir 21,5 l de la mezcla maestra de MHC II con el péptido de control (paso 5.2) para el pocillo de control positivo de la placa de polipropileno de 384 pocillos (paso 4,2) (Figura 1A). Nota: Esta muestra representa el control positivo de alta señal que contiene proteínas MHC II, péptido control, y NO péptido de prueba. </li></ol> 6. Hacer la reacción de unión (Día 1) <ol><li> Añadir la mezcla maestra de MHC II que contiene péptido de control (paso 5,2) a cada una de las diluciones de prueba de péptidos (paso 2,1) en una proporción de 1:1 para crear la reacción de unión. <ol><li> Añadir 21,5 l de MHC II Master Mix que contienen de ConPéptido de control de la etapa 5,2-21,5 l de cada dilución de ensayo peptídicos desde el paso 2.1. (Robot de manejo de líquidos) </li></ol></li><li> Selle la reacción de unión con una película de poliéster e incubar 12-24 horas en una incubadora no son CO 2 a 37 ° C sin agitación. </li></ol> 7. Neutralizar y Transferencia de la reacción de unión (Día 2) <ol><li> Retire la placa de polipropileno de 384 pocillos que contiene la reacción de unión (paso 6.2) de la incubadora a 37 ° C. </li><li> Diluir la 1:01 reacción de unión con tampón de neutralización. (Robot de manejo de líquidos) <ol><li> Añadir 43 l de la Neutralization Buffer a cada reacción de unión también. </li></ol></li><li> Retire la placa de ELISA (paso 1.3) del 4 ° C y lavar 3 veces con 60 ml / pocillo de PBS-Tween 20 0,05%. (Lavador de placas) </li><li> Transferencia de 25 l de cada reacción de unión neutralizada desde el paso 7.2 en pocillos por triplicado de la 384 pocillos de placas de ELISA de anticuerpos recubiertos desde el paso 7.3. (Figura 1 </strong&gt;) (robot de manejo de líquidos) </li><li> Cubrir la placa de ELISA con una película de poliéster y el lugar en una incubadora a 37 ° durante 2,5 horas o en el refrigerador de 4 ° C durante la noche. </li></ol> 8. Desarrollo de ELISA (Día 2 o 3) <ol><li> Retire la placa de ELISA de la etapa 7.5, lavar 3 veces con 60 l / pocillo de PBS-Tween al 0,05%. (Lavador de placas) </li><li> Diluir la solución de estreptavidina europio acciones (0,1 mg / ml de estreptavidina, 7 Eu 3 + / estreptavidina) 1000 veces en el tampón de ensayo DELFIA. <ol><li> Para una placa de 384 pocillos, diluya 10 l estreptavidina-europio en 10 ml de tampón de ensayo. </li></ol></li><li> Añadir 25 l de la estreptavidina diluida-europio a cada pocillo de la placa de 384 pocillos de ELISA a partir del paso 8.1. (Robot de manejo de líquidos) </li><li> Cubrir la placa con una lámina de poliéster y el lugar en la oscuridad a temperatura ambiente durante 1 hora. Nota: Durante la incubación de 1 hora, retire la solución de mejora de la nevera y dejar de lado 10 ml / placa en la oscuridad a rotemperatura OM. </li><li> Después de la incubación de 1 hora, se lava la placa de 384 pocillos ELISA desde el paso 8.3 3 veces con 60 l / pocillo de PBS-Tween al 0,05%. (Lavador de placas) </li><li> Añadir 25 l de solución de mejora a cada pocillo de la placa de 384 pocillos de ELISA a partir del paso 8.5. (Robot de manejo de líquidos) </li><li> Cubrir la placa ELISA de 384 pozos con una película de poliéster y permita que la placa para sentarse en la oscuridad a temperatura ambiente durante 10 a 15 min. </li><li> Después de la incubación de 10 a 15 min, lee la fluorescencia de la placa de 384 pocillos ELISA desde el paso 8.7 usando un lector de tiempo resuelto fluorescente plato con configuración de europio (por ejemplo, Empezar Int.: 200, Stop Int.:. 1000, Ex. 340, Em . 615, Límite: Ninguno, PMT: Auto, Lee / Bien: 50). </li></ol> 9. Análisis de Datos <ol><li> Introducir datos en el gráfico en formato XY con 3 valores replicados en columnas de side-by-side (X = concentración de péptido de ensayo; Y = medición de fluorescencia). </li><li> Entrar a transformar los valores de X para todos los datos: X = log (X) </li><li> Montar los tra registronsformed de datos con el modelo de unión competitiva de un solo sitio para extraer el valor de CI 50. </li><li> Restringir el valor inferior al valor medio de control negativo. </li><li> A nivel mundial ajustarse el valor superior y asegurar que el parámetro de ajuste global es menor o igual que el control positivo. </li></ol>

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	<li>Steere, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotic-refractory+Lyme+arthritis+is+associated+with+HLA-DR+molecules+that+bind+a+Borrelia+burgdorferi+peptide.">Antibiotic-refractory Lyme arthritis is associated with HLA-DR molecules that bind a Borrelia burgdorferi peptide.</a> J. Exp. Med. 203, 961-971 (2006).</li><li>Raddrizzani, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+modes+of+peptide+interaction+enable+HLA-DQ+and+HLA-DR+molecules+to+bind+diverse+peptide+repertoires.">Different modes of peptide interaction enable HLA-DQ and HLA-DR molecules to bind diverse peptide repertoires.</a> J. Immunol. 159, 703-711 (1997).</li><li>Osipovitch, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+analysis+of+immune-evading+enzymes+for+ADEPT+therapy.">Design and analysis of immune-evading enzymes for ADEPT therapy.</a> Protein Eng. Design. 25, 613-623 (2012).</li><li>Moise, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+silico-accelerated+identification+of+conserved+and+immunogenic+variola/vaccinia+T-cell+epitopes.">In silico-accelerated identification of conserved and immunogenic variola/vaccinia T-cell epitopes.</a> Vaccine. 27, 6471-6479 (2009).</li><li>Moise, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+HLA+DR+epitope+de-immunization+of+Factor+VIII+in+vitro+and+in+vivo.">Effect of HLA DR epitope de-immunization of Factor VIII in vitro and in vivo.</a> Clin. Immunol. 142, 320-331 (2012).</li><li>Aggarwal, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What's+fueling+the+biotech+engine-2011+to+2012.">What's fueling the biotech engine-2011 to 2012.</a> Nat. Biotechnol. 30, 1191-1197 (2012).</li><li>Trombetta, E. S., Mellman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+biology+of+antigen+processing+in+vitro+and+in+vivo.">Cell biology of antigen processing in vitro and in vivo.</a> Ann. Rev. Immunol. 23, 975-1028 (2005).</li><li>Warmerdam, P. A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elimination+of+a+human+T-cell+region+in+staphylokinase+by+T-cell+screening+and+computer+modeling.">Elimination of a human T-cell region in staphylokinase by T-cell screening and computer modeling.</a> Thrombosis Haemostasis. 87, 666-673 (2002).</li><li>Jones, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+removal+of+a+promiscuous+CD4+T+cell+epitope+from+the+C1+domain+of+factor+VIII.">Identification and removal of a promiscuous CD4+T cell epitope from the C1 domain of factor VIII.</a> J. Thrombosis Haemostasis. 3, 991-1000 (2005).</li><li>Harding, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+beta-lactamase+with+reduced+immunogenicity+for+the+targeted+delivery+of+chemotherapeutics+using+antibody-directed+enzyme+prodrug+therapy.">A beta-lactamase with reduced immunogenicity for the targeted delivery of chemotherapeutics using antibody-directed enzyme prodrug therapy.</a> Mol. Cancer. 4, 1791-1800 (2005).</li><li>Mazor, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+elimination+of+an+immunodominant+T-cell+epitope+in+recombinant+immunotoxins+based+on+Pseudomonas+exotoxin+A.">Identification and elimination of an immunodominant T-cell epitope in recombinant immunotoxins based on Pseudomonas exotoxin A.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, E3597-E3603 (2012).</li><li>Cantor, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+enzyme+deimmunization+by+combinatorial+T-cell+epitope+removal+using+neutral+drift.">Therapeutic enzyme deimmunization by combinatorial T-cell epitope removal using neutral drift.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 1272-1277 (2011).</li><li>Kern, F., LiPira, G., Gratama, J. W., Manca, F., Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Ag-specific+immune+responses:+understanding+immunopathogenesis+and+improving+diagnostics+in+infectious+disease,+autoimmunity+and+cancer.">Measuring Ag-specific immune responses: understanding immunopathogenesis and improving diagnostics in infectious disease, autoimmunity and cancer.</a> Trends Immunol. 26, 477-484 (2005).</li><li>Li Pira, G., Ivaldi, F., Moretti, P., Manca, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+T+epitope+mapping+and+vaccine+development.">High throughput T epitope mapping and vaccine development.</a> J. Biomed. Biotechnol. 2010, 325720 (2010).</li><li>Hoffmeister, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+T+cell+epitopes+by+flow+cytometry.">Mapping T cell epitopes by flow cytometry.</a> Methods. 29, 270-281 (2003).</li><li>Singh, H., Raghava, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ProPred:+prediction+of+HLA-DR+binding+sites.">ProPred: prediction of HLA-DR binding sites.</a> Bioinformatics. 17, 1236-1237 (2001).</li><li>Guan, P., Doytchinova, I. A., Zygouri, C., Flower, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MHCPred:+bringing+a+quantitative+dimension+to+the+online+prediction+of+MHC+binding.">MHCPred: bringing a quantitative dimension to the online prediction of MHC binding.</a> Appl. Bioinformatics. 2, 63-66 (2003).</li><li>Wan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SVRMHC+prediction+server+for+MHC-binding+peptides.">SVRMHC prediction server for MHC-binding peptides.</a> BMC Bioinformatics. 7, 463 (2006).</li><li>Bui, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+generation+and+evaluation+of+specific+MHC+binding+predictive+tools:+ARB+matrix+applications.">Automated generation and evaluation of specific MHC binding predictive tools: ARB matrix applications.</a> Immunogenetics. 57, 304-314 (2005).</li><li>Nielsen, M., Lundegaard, C., Lund, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+MHC+class+II+binding+affinity+using+SMM-align,+a+novel+stabilization+matrix+alignment+method.">Prediction of MHC class II binding affinity using SMM-align, a novel stabilization matrix alignment method.</a> BMC Bioinformatics. 8, 238 (2007).</li><li>Nielsen, M., Justesen, S., Lund, O., Lundegaard, C., Buus, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NetMHCIIpan-2.0+-+Improved+pan-specific+HLA-DR+predictions+using+a+novel+concurrent+alignment+and+weight+optimization+training+procedure.">NetMHCIIpan-2.0 - Improved pan-specific HLA-DR predictions using a novel concurrent alignment and weight optimization training procedure.</a> Immun. Res. 6, 9 (2010).</li><li>De Groot, A. S., Knopp, P. M., Martin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De-immunization+of+therapeutic+proteins+by+T-cell+epitope+modification.">De-immunization of therapeutic proteins by T-cell epitope modification.</a> Dev. Biol. 122, 171-194 (2005).</li><li>Choi, Y., Griswold, K. E., Bailey-Kellogg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-based+redesign+of+proteins+for+minimal+T-cell+epitope+content.">Structure-based redesign of proteins for minimal T-cell epitope content.</a> J. Comput. Chem. 34, 879-891 (2013).</li><li>Parker, A. S., Choi, Y., Griswold, K. E., Bailey-Kellogg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-guided+deimmunization+of+therapeutic+proteins.">Structure-guided deimmunization of therapeutic proteins.</a> J. Comput. Biol. 20, 152-165 (2013).</li><li>Parker, A. S., Griswold, K. E., Bailey-Kellogg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+therapeutic+proteins+to+delete+T-cell+epitopes+while+maintaining+beneficial+residue+interactions.">Optimization of therapeutic proteins to delete T-cell epitopes while maintaining beneficial residue interactions.</a> J. Bioinform. Comput. Biol. 9, 207-229 (2011).</li><li>Parker, A. S., Zheng, W., Griswold, K. E., Bailey-Kellogg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+algorithms+for+functional+deimmunization+of+therapeutic+proteins.">Optimization algorithms for functional deimmunization of therapeutic proteins.</a> BMC Bioinformatics. 11, 180 (2010).</li><li>De Groot, A. S., Martin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+risk,+improving+outcomes:+Bioengineering+less+immunogenic+protein+therapeutics.">Reducing risk, improving outcomes: Bioengineering less immunogenic protein therapeutics.</a> Clin. Immunol. 131, 189-201 (2009).</li><li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+assessment+of+MHC+class+II+peptide+binding+predictions+and+evaluation+of+a+consensus+approach.">A systematic assessment of MHC class II peptide binding predictions and evaluation of a consensus approach.</a> PLoS Comput. Biol. 4, e1000048 (2008).</li><li>Sette, A., Rappuoli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+vaccinology:+developing+vaccines+in+the+era+of+genomics.">Reverse vaccinology: developing vaccines in the era of genomics.</a> Immunity. 33, 530-541 (2010).</li><li>Moise, L., Cousens, L., Fueyo, J., De Groot, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+the+power+of+genomics+and+immunoinformatics+to+produce+improved+vaccines.">Harnessing the power of genomics and immunoinformatics to produce improved vaccines.</a> Expert Opin. Drug Discov. 6, 9-15 (2011).</li><li>Sturniolo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+tissue-specific+and+promiscuous+HLA+ligand+databases+using+DNA+microarrays+and+virtual+HLA+class+II+matrices.">Generation of tissue-specific and promiscuous HLA ligand databases using DNA microarrays and virtual HLA class II matrices.</a> Nat. Biotechnol. 17, 555-561 (1999).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biologic+drugs+set+to+top+2012+sales.">Biologic drugs set to top 2012 sales.</a> Nat. Med. 18, 636 (2012).</li><li>Seib, K. L., Zhao, X., Rappuoli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+vaccines+in+the+era+of+genomics:+a+decade+of+reverse+vaccinology.">Developing vaccines in the era of genomics: a decade of reverse vaccinology.</a> Clin. Microbiol. Infect. 18, 109-116 (2012).</li><li>Jiang, W., Boder, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+engineering+and+analysis+of+peptide+binding+to+class+II+MHC.">High-throughput engineering and analysis of peptide binding to class II MHC.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 13258-13263 (2010).</li><li>Justesen, S., Harndahl, M., Lamberth, K., Nielsen, L. -. L. B., Buus, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+recombinant+MHC+class+II+molecules+and+high-throughput+peptide-binding+assays.">Functional recombinant MHC class II molecules and high-throughput peptide-binding assays.</a> Immun. 5, 1-20 (2009).</li></ol>

Leonard Moise está empleado y tiene opciones sobre acciones en EpiVax, Inc., una compañía de biotecnología de propiedad privada con sede en Providence, RI. El trabajo contenido en este informe de investigación es libre de cualquier sesgo que podría asociarse con los objetivos comerciales de la empresa.

Biotherapeutics se han establecido como uno de los pilares de la medicina moderna, que representan cuatro de las cinco principales drogas que venden en 2012 32. El sector de la biofarmacia ha mostrado un crecimiento sostenido durante varios años y 6, y el desarrollo continuo de nuevos agentes, así como la aparición de los biosimilares se ha expandido ductos biofarmacéuticos. Mirando hacia el futuro, evaluar y mitigar la inmunogenicidad de las proteínas terapéuticas se convertirá en una parte...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/51308/a-high-throughput-mhc-ii-binding-assay-for-quantitative-analysis">A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes</a>.&#160; There were typos in the Protocol section and Table 2.
Step 3.1.1 in the Protocol was updated from:
Add 80 &#181;l of 1 mM Pefa Bloc and 60 mg of octyl-&#946;-D-glucopyranaside to 3,920 &#181;l of Citrate Phosphate Buffer. (See supplemental spreadsheet calculator for alternative scaling).
to:
Add 80 &#181;l of 1 mM Pefa Bloc and 60 &#181;g of octyl-&#946;-D-glucopyranaside to 3,920 &#181;l of Citrate Phosphate Buffer. (See supplemental spreadsheet calculator for alternative scaling).
Step 5.2&#160;in the Protocol was updated from:
Further dilute the Control Peptide from step 5.1 (20 mM) 1:100 into the MHC II Master Mix from step 3.2.
to:
Further dilute the Control Peptide from step 5.1 (20 &#181;M) 1:100 into the MHC II Master Mix from step 3.2.
Table 2 was updated from:
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="376">
	<tbody>
		<tr>
			<td>MHC II Allele DRB1*:</td>
			<td>1501</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MHC II Stock Concentration (mg/ml)</td>
			<td>1.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MHC II Stock Concentration (mM)</td>
			<td>20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vol. MHC II Stock to Add (ml)</td>
			<td>14.65</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vol. Reaction Buffer to Add (ml):</td>
			<td>2885.35</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MHC II Master Mix Concentration (nM)</td>
			<td>101</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
to:
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="376">
	<tbody>
		<tr>
			<td>MHC II Allele DRB1*:</td>
			<td>1501</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MHC II Stock Concentration (mg/ml)</td>
			<td>1.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MHC II Stock Concentration (&#956;M)</td>
			<td>20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vol. MHC II Stock to Add (&#956;l)</td>
			<td>14.65</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vol. Reaction Buffer to Add (&#956;l):</td>
			<td>2885.35</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MHC II Master Mix Concentration (nM)</td>
			<td>101</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/51308/a-high-throughput-mhc-ii-binding-assay-for-quantitative-analysis">A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes</a>.&#160; There were typos in the Protocol section and Table 2.

Erratum: A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes

Las proteínas son la clase de más rápido crecimiento de agentes terapéuticos 6, y la rápida expansión de ductos bioterapéuticos se ha centrado cada vez más atención en los retos asociados con el desarrollo y el uso de fármacos de proteínas. Una consideración único surge del hecho de que, en un sistema inmunológico saludable y en funcionamiento, todas las proteínas extracelulares son muestreadas por las células presentadoras de antígeno (APCs). Una vez internalizado por las APC, una proteína se escinde en pequeños fragmentos de péptidos, y los segmentos inmunogénicos putativos se cargan en la ranura de clase II proteínas principales complejos de histocompatibilidad (MHC II). Los complejos de péptido-MHC II se muestran entonces en la superficie de APC, y verdaderos péptidos inmunogénicos, denominados epítopos de células T, formar complejos ternarios receptor de células MHC II-péptido-T con receptores de la superficie celular T CD4 afines 7. Este evento crítico reconocimiento molecular inicia una cascada compleja de señalización, lo que resulta en la activación de células T, la liberación de citoquinas, CD4 T mediada por células B maduración de las células, y en última instancia, la producción de anticuerpos IgG circulantes que se unen y restablezcan la proteína exógena infractor. Por lo tanto, las proteínas inmunogénicas pueden ser desinmunogénico mediante la identificación de constituyentes epítopos de células T y la mutación de residuos clave responsables de la formación de complejos de MHC II. Vale la pena observar, sin embargo, que los epítopos de células T pueden ser numerosos y ampliamente distribuida en toda proteínas inmunogénicas, y la mayoría de las mutaciones epítopo borrar es probable que causen una pérdida inadvertida de la función de proteínas o la estabilidad. Por lo tanto, la ingeniería desinmunogénico bioterapias pueden ser un objetivo complejo y técnicamente difícil, pero existen varios ejemplos de éxito T epítopos de células proyectos de eliminación 3,5,8-12. A diferencia de injerto a base de &quot;humanización&quot;, que se limita en gran medida a la terapéutica de anticuerpos, eliminación epítopo se puede aplicar a esencialmente cualquier proteína objetivo, independientemente de la secuencia, estructura, función, o la disponibilidad de homólogonos andamios humanos. El primer paso para la implementación de un enfoque de este tipo es la identificación de epítopos peptídicos clave incrustados dentro de la secuencia de la proteína diana. Ensayos bioquímicos alto rendimiento usando péptidos sintéticos y moléculas recombinantes humanas MHC II pueden proporcionar rápidas penetraciones preliminares sobre identificación y mitigación epítopo 1,3-5. Estos ensayos de tipo ELISA pueden ser un poderoso complemento a otras de diseño y desarrollo de proteínas / vacunas herramientas. Por ejemplo, un método experimental bien establecido para el mapeo de epítopos se basa en el tiempo, el trabajo y muchos recursos ex vivo ensayos de proliferación celular intensivos 15. Brevemente, la secuencia primaria de una proteína diana se divide primero en un panel de péptidos solapantes, a menudo 15-meros con 12 residuos de solapamiento entre los péptidos adyacentes. El panel de péptido se sintetiza químicamente y la inmunogenicidad de cada péptido se prueba en uno de los varios inmunoensayos que emplean diferentes Bloo periféricacélulas mononucleares de d (PBMC) aisladas de donantes humanos 13,14. Para proporcionar una mayor confianza en los resultados, los péptidos se prueban típicamente por duplicado con PBMC de 50 o más donantes diferentes. En los casos en que desinmunización es el objetivo final, el trabajo se complica aún más por la necesidad de producir paneles adicionales de péptidos mutados y probar los nuevos paneles de péptidos en ensayos de PBMC antes de introducir cualquier mutación deimmunizing a la proteína de longitud completa para el análisis funcional posterior 10. Si bien estos ensayos celulares siguen siendo el estándar de oro para evaluar el potencial inmunogénico en pacientes humanos, la eficacia de este enfoque exhaustiva podría ser mejorado por prefiltrado epítopos inmunogénicos putativos utilizando un rendimiento rápido y alta ensayo de unión de MHC II-péptido. Del mismo modo, los ensayos de unión péptido-MHC II bioquímicos se pueden combinar con predictivo métodos in silico para acelerar radicalmente el proceso de identificación epítopo.Existen una variedad de herramientas computacionales para la predicción epítopo de células T, e incluye ProPred 16, MHCPred 17, SVRMHC 18, ARB 19, SMM-alinear 20, NetMHCIIpan 21, así como las herramientas propietarias como EpiMatrix por EpiVax 22. Del mismo modo, los predictores de epítopos recientemente se han combinado con otras herramientas de bioinformática y modelado molecular para producir algoritmos desinmunización proteínas integradas diseñadas para mitigar el riesgo de que las mutaciones deimmunizing pudiesen afectar a la estructura y función de proteínas 23-26. Mientras que varios predictores de epítopos han demostrado ser razonablemente exacta 27,28, resultados computacionales invariablemente requieren validación experimental. Métodos experimentales rápido, de alto rendimiento y rentables son los más adecuados como filtro preliminar para las predicciones de epítopos silico. En una línea similar, los predictores de epítopos pueden conducir la selección de antígenos para vaccinolo inversagy 29,30. Por ejemplo, los avances en la bioinformática han arrojado entero genoma pantallas que identifican rápidamente vacunas candidatas en forma de proteínas enteras o epítopos de péptidos extraídos de proteomas de agentes patógenos. Si bien esta tecnología está dando nueva forma que permite el descubrimiento y desarrollo de vacunas protectoras, introduce un nuevo reto en forma de incurablemente grandes listas de candidatos a vacunas inmunogénicas. Ensayos de unión de alto rendimiento de péptido-MHC II pueden guiar la selección epítopo mediante la cuantificación de la afinidad de unión del péptido y la promiscuidad de unión entre los múltiples alelos de MHC II. Al igual que con desinmunización proteínas, tales métodos experimentales son, en última instancia requieren para validar la predicción computacional de clientes potenciales de vacunas prometedoras. Aquí, se describe un ensayo de unión péptido-MHC II a escala al formato de 384 pocillos. El protocolo es altamente paralelizado y reduce los costes de reactivos en un 75% en comparación con el anteriormente descrito de 96 pocillos formatos de placa 1,3-5. El uso de un solo liquid robot de manipulación, este método permite a un investigador para analizar fácilmente aproximadamente noventa péptidos de ensayo por triplicado en un rango de concentraciones de ocho y cuatro tipos de alelos de MHC II en menos de 48 horas. En este artículo se describe la instalación de una placa de 384 pocillos de ELISA para el análisis de los siete péptidos experimentales contra un alelo MHC II, pero las calculadoras de hoja de cálculo se proporcionan como material complementario a fin de escalar fácilmente el experimento a cualquier número de péptidos y / o MHC deseados II moléculas.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:587px;">Sodium Tetraborate Decahydrate</td>
			<td style="width:357px;">Sigma</td>
			<td style="width:217px;">221732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Citric Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Dibasic Sodium Phosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Trizma HCl</td>
			<td>OmniPur</td>
			<td>9310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Tween-20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">100% DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Octyl-&#946;-D-Glucopyranaside</td>
			<td>Fischer</td>
			<td>29836-26-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Pefa Bloc SCF</td>
			<td>Roche</td>
			<td>1158591600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Dulbecco&#8217;s 10X Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14200-166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">DELFIA Assay Buffer</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>4002-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">DELFIA Enhancement Buffer</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>4001-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Europium Labelled Streptavidin</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>1244-360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">L243 anti-HLA-DR antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>307602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Biotinylated tracer peptides</td>
			<td>21st Century Biochemicals</td>
			<td>Custom Order</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Test peptides (1-4mg, 85% purity)</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>Custom Order</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Purified HLA-DRB1 monomers (non-biotinylated)</td>
			<td>Benaroya Research Institute*</td>
			<td>Custom Order</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">384-well white EIA/RIA plate</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>460372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Polypropylene 384-well plate</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Film, AxySeal, 80 &#181;m, ELISA Applicator&#160;</td>
			<td>Axygen Asicentific</td>
			<td>PCR-SP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">MilliQ Water</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Epimotion Liquid Handler (or similar)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Select TS Plate Washer (or similar)</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">SpectraMax Gemini Microplate Reader (or similar)</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4" height="98" style="height:99px;width:1161px;">*Recombinant human MHC II molecules can be obtained from the Benaroya Tetramer Core Laboratory. See: https://www.benaroyaresearch.org/our-research/core-resources/tetramer-core-laboratory</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high throughput mhc ii binding assay for quantitative analysis of peptide epitopes

Ensayos bioquímicos con moléculas recombinantes humanas MHC II pueden proporcionar rápidas, ideas cuantitativos en la identificación epítopo inmunogénico, eliminación, o el diseño de 1,2. Aquí, un ensayo de unión péptido-MHC II se escala al formato de 384 pocillos. El protocolo reducido reduce los costes de reactivos en un 75% y es mayor rendimiento que se ha descrito anteriormente protocolos de 96 pocillos 1,3-5. Específicamente, el diseño experimental permite el análisis robusto y reproducible de hasta 15 péptidos contra un alelo de MHC II por 384 pocillos de placas de ELISA. El uso de un solo robot de manejo de líquidos, este método permite a un investigador para analizar aproximadamente noventa péptidos de ensayo por triplicado en un rango de concentraciones de ocho y cuatro tipos de alelos de MHC II en menos de 48 horas. Otros trabajan en los campos de la desinmunización proteína o el diseño y desarrollo de vacunas que encuentre el protocolo para ser útil en la facilitación de su propio trabajo. En particular, las instrucciones paso a paso y el formato visualde Jove debe permitir que otros usuarios establecer rápida y fácilmente esta metodología en sus propios laboratorios.

La secuencia de péptido maduro de Enterobacter cloacae P99 de beta-lactamasa (bla) (GenBank ID # X07274.1) se analizó con ProPred 16 para aglutinantes de péptidos putativos a MHC II alelo DRB1 * 1501 (Tabla 4). ProPred identificado péptidos nonamer 117 con un residuo de anclaje P1 obligatoria (es decir, un M, L, I, V, F, Y, o W en la posición 1, que se requiere para MHC II de unión 31). En el umbral del 5%, sólo los péptidos con puntajes mayores o iguales ...

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A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes

Ensayos bioquímicos con moléculas recombinantes humanas MHC II pueden proporcionar rápidas, ideas cuantitativos en la identificación epítopo inmunogénico, eliminación o diseño. Aquí, se describe un ensayo de unión péptido-MHC II a escala para placas de 384 pocillos. Este formato rentable puede ser muy útil en los campos de desinmunización proteínas y diseño y desarrollo de vacunas.

Un ensayo de unión de alto rendimiento MHC II para el análisis cuantitativo del péptido epítopos

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or ...

a-high-throughput-mhc-ii-binding-assay-for-quantitative-analysis

Research

JoVE Journal

Biology

14.8K vistas.  Dartmouth College.  Ensayos bioquímicos con moléculas recombinantes humanas MHC II pueden proporcionar rápidas, ideas cuantitativos en la identificación epítopo inmunogénico, eliminación o diseño. Aquí, se describe un ensayo de unión péptido-MHC II a escala para placas de 384 pocillos. Este formato rentable puede ser muy útil en los campos de desinmunización proteínas y diseño y desarrollo de vacunas. 

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Visualizing Antigen Specific CD4+ T Cells using MHC Class II Tetramers

Major histocompatibility complex (MHC) class II tetramers allow the direct visualization of antigen specific CD4+ T cells by flow cytometry.  This method relies on the highly specific interaction between peptide loaded MHC and the corresponding T-cell receptor.  While the affinity of a single MHC/peptide molecule is low, cross-linking MHC/peptide complexes with streptavidin increases the avidity of the interaction, enabling their use as staining reagents.  Because of the relatively low frequencies of CD4+ T cells (~1 in 300,000 for a single specificity) this assay utilizes an in vitro amplification step to increase its threshold of detection.  Mononuclear cells are purified from peripheral blood by Ficoll underlay.  CD4+ cells are then separated by negative selection using biotinylated antibody cocktail and anti-biotin labeled magnetic beads.  Using adherent cells from the CD4- cell fraction as antigen presenting cells, CD4+ T cells are expanded in media by adding an antigenic peptide and IL-2.  The expanded cells are stained with the corresponding class II tetramer by incubating at 37 C for one hour and subsequently stained using surface antibodies such as anti-CD4, anti-CD3, and anti-CD25.  After labeling, the cells can be directly analyzed by flow cytometry.  The tetramer positive cells typically form a distinct population among the expanded CD4+ cells.  Tetramer positive cells are usually CD25+ and often CD4 high.  Because the level of background tetramer staining can vary, positive staining results should always be compared to the staining of the same cells with an irrelevant tetramer.  Multiple variations of this basic assay are possible.  Tetramer positive cells may be sorted for further phenotypic analysis, inclusion in ELISPOT or proliferation assays, or other secondary assays.  Several groups have also demonstrated co-staining using tetramers and either anti-cytokine or anti-FoxP3 antibodies.  

This procedure demonstrates the purification and in vitro expansion of antigen specific CD4+ T cells from whole peripheral blood and their visualization using MHC class II tetramers. Tetramers permit the direct visualization of T cells with a single antigen specificity and defined MHC class II restriction.

Visualización de antígeno específico de células T CD4 + con MHC de clase II tetrámeros

Major histocompatibility complex (MHC) class II tetramers allow the direct visualization of antigen specific CD4+ T cells by flow cytometry.  This method ...

Investigación

Biología

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

A neuronales y astrocitos Co-cultivo de ensayo para el análisis de alto contenido de neurotoxicidad

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying potassium (referred to as GIRK) channels, which are important for regulating the excitability of neurons. There are four different mammalian GIRK channel subunits (GIRK1-GIRK4) - we focus on GIRK2 because it forms a homotetramer. Stimulation of different types of G protein-coupled receptors (GPCRs), such as the muscarinic receptor (M2R), leads to activation of GIRK channels. Alcohol also directly activates GIRK channels. We will show how to mutate one amino acid by specifically changing one or more nucleotides in the cDNA for the GIRK channel. This mutated cDNA sequence will be amplified in bacteria, purified, and the presence of the point mutation will be confirmed by DNA sequencing. The cDNAs for the mutated and wild-type GIRK channels will be transfected into human embryonic kidney HEK293T cells cultured in vitro. Lastly, whole-cell patch-clamp electrophysiology will be used to study the macroscopic potassium currents through the ectopically expressed wild-type or mutated GIRK channels. In this experiment, we will examine the effect of a L257W mutation in GIRK2 channels on M2R-dependent and alcohol-dependent activation.

We will demonstrate how to study the effect of a single point mutation on the function of an ion channel.

Mutagénesis y análisis funcional de los canales iónicos heteróloga se expresa en células de mamífero

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

High-throughput Saccharification Assay for Lignocellulosic Materials

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing a biorefinery. These raw materials would constitute a new industrial platform, which is both sustainable and carbon neutral, to replace 
the current dependency on fossil fuel. The recalcitrance to deconstruction observed in lignocellulosic materials is produced by several intrinsic properties 
of plant cell walls. Crystalline cellulose is embedded in matrix polysaccharides such as xylans and arabinoxylans, and the whole structure is encased by the 
phenolic polymer lignin, that is also difficult to digest 1. In order to improve the digestibility of plant materials we need to discover the main bottlenecks 
for the saccharification of cell walls and also screen mutant and breeding populations to evaluate the variability in saccharification 2. These tasks require 
a high throughput approach and here we present an analytical platform that can perform saccharification analysis in a 96-well plate format. This platform has 
been developed to allow the screening of lignocellulose digestibility of large populations from varied plant species. We have scaled down the reaction volumes 
for gentle pretreatment, partial enzymatic hydrolysis and sugar determination, to allow large numbers to be assessed rapidly in an automated system.
This automated platform works with milligram amounts of biomass, performing ball milling under controlled conditions to reduce the plant 
materials to a standardised particle size in a reproducible manner. Once the samples are ground, the automated formatting robot dispenses specified and recorded 
amounts of material into the corresponding wells of 96 deep well plate (Figure 1). Normally, we dispense the same material into 4 wells to have 4 replicates for 
analysis. Once the plates are filled with the plant material in the desired layout, they are manually moved to a liquid handling station (Figure 2). In this 
station the samples are subjected to a mild pretreatment with either dilute acid or alkaline and incubated at temperatures of up to 90&deg;C. The pretreatment solution 
is subsequently removed and the samples are rinsed with buffer to return them to a suitable pH for hydrolysis. The samples are then incubated with an enzyme
mixture for a variable length of time at 50&deg;C. An aliquot is taken from the hydrolyzate and the reducing sugars are automatically determined by the MBTH 
colorimetric method.

A simple, rapid method for determining the saccharification potential of large numbers of plant biomass samples is described. The automated platform for this analysis involves the preparation of the plant biomass for analysis in 96 well plates and the subsequent performance of pretreatment, hydrolysis and quantification of the sugars released.

De alto rendimiento de sacarificación de ensayo para materiales lignocelulósicos

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing ...

A Quantitative Fitness Analysis Workflow

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is an experimental and computational workflow for comparing fitnesses of microbial cultures grown in parallel1,2,3,4. QFA can be applied to focused observations of single cultures but is most useful for genome-wide genetic interaction or drug screens investigating up to thousands of independent cultures. The central experimental method is the inoculation of independent, dilute liquid microbial cultures onto solid agar plates which are incubated and regularly photographed. Photographs from each time-point are analyzed, producing quantitative cell density estimates, which are used to construct growth curves, allowing quantitative fitness measures to be derived. Culture fitnesses can be compared to quantify and rank genetic interaction strengths or drug sensitivities. The effect on culture fitness of any treatments added into substrate agar (e.g. small molecules, antibiotics or nutrients) or applied to plates externally (e.g. UV irradiation, temperature) can be quantified by QFA.
The QFA workflow produces growth rate estimates analogous to those obtained by spectrophotometric measurement of parallel liquid cultures in 96-well or 200-well plate readers. Importantly, QFA has significantly higher throughput compared with such methods. QFA cultures grow on a solid agar surface and are therefore well aerated during growth without the need for stirring or shaking.
QFA throughput is not as high as that of some Synthetic Genetic Array (SGA) screening methods5,6. However, since QFA cultures are heavily diluted before being inoculated onto agar, QFA can capture more complete growth curves, including exponential and saturation phases3. For example, growth curve observations allow culture doubling times to be estimated directly with high precision, as discussed previously1.
Here we present a specific QFA protocol applied to thousands of S. cerevisiae cultures which are automatically handled by robots during inoculation, incubation and imaging. Any of these automated steps can be replaced by an equivalent, manual procedure, with an associated reduction in throughput, and we also present a lower throughput manual protocol. The same QFA software tools can be applied to images captured in either workflow.
We have extensive experience applying QFA to cultures of the budding yeast S. cerevisiae but we expect that QFA will prove equally useful for examining cultures of the fission yeast S. pombe and bacterial cultures.

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is a complementary series of experimental and computational methods for estimating microbial culture fitnesses. QFA estimates the effect of genetic mutations, drugs or other applied treatments on microbe growth. Experiments scaling from focussed analysis of single cultures to thousands of parallel cultures can be designed.

Un flujo de trabajo de Análisis Cuantitativo Gimnasio

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is an experimental and computational workflow for comparing fitnesses of microbial cultures grown in parallel1,2,3,4. ...

High-throughput Functional Screening using a Homemade Dual-glow Luciferase Assay

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with Parkinson&#39;s disease. 293T cells are transiently transfected with plasmids from an arrayed ORF expression library, together with luciferase reporter plasmids, in a one-gene-per-well microplate format. Firefly luciferase activity is assayed after 48 hr to determine the effects of each library gene upon alpha-synuclein transcription, normalized to expression from an internal control construct (a hCMV promoter directing Renilla luciferase). This protocol is facilitated by a bench-top robot enclosed in a biosafety cabinet, which performs aseptic liquid handling in 96-well format. Our automated transfection protocol is readily adaptable to high-throughput lentiviral library production or other functional screening protocols requiring triple-transfections of large numbers of unique library plasmids in conjunction with a common set of helper plasmids. We also present an inexpensive and validated alternative to commercially-available, dual luciferase reagents which employs PTC124, EDTA, and pyrophosphate to suppress firefly luciferase activity prior to measurement of Renilla luciferase. Using these methods, we screened 7,670 human genes and identified 68 regulators of alpha-synuclein. This protocol is easily modifiable to target other genes of interest.

We present a rapid and inexpensive screening method for identifying transcriptional regulators using high-throughput robotic transfections and a homemade dual-glow luciferase assay. This protocol rapidly generates direct side-by-side functional data for thousands of genes and is easily modifiable to target any gene of interest.

Selección de alto rendimiento funcional utilizando un doble resplandor de ensayo de luciferasa Homemade

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with ...

Flow Cytometric Analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation: A High Throughput Quantitative Method to Study Protein-protein Interaction

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC is based on the production of fluorescence using two non-fluorescent fragments of a fluorescent protein (Venus, a Yellow Fluorescent Protein variant, is used here). Non-fluorescent Venus fragments (VN and VC) are fused to two interacting proteins (in this case, AKAP-Lbc and PDE4D3), yielding fluorescence due to VN-AKAP-Lbc-VC-PDE4D3 interaction and the formation of a functional fluorescent protein inside cells.
BiFC provides information on the subcellular localization of protein complexes and the strength of protein interactions based on fluorescence intensity. However, BiFC analysis using microscopy to quantify the strength of protein-protein interaction is time-consuming and somewhat subjective due to heterogeneity in protein expression and interaction. By coupling flow cytometric analysis with BiFC methodology, the fluorescent BiFC protein-protein interaction signal can be accurately measured for a large quantity of cells in a short time. Here, we demonstrate an application of this methodology to map regions in PDE4D3 that are required for the interaction with AKAP-Lbc. This high throughput methodology can be applied to screening factors that regulate protein-protein interaction.

Flow cytometric analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation provides a high throughput quantitative method to study protein-protein interaction. This methodology can be applied to mapping protein binding sites and for screening factors that regulate protein-protein interaction.

El análisis por citometría de Complementación fluorescencia Bimolecular: A High Throughput Método cuantitativo para estudiar la interacción proteína-proteína

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

Selección de alto rendimiento para moduladores químicos de genes post-transcripcionalmente regulados

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic chromosome, synIII1, and one synthetic chromosome arm, synIXR2, have been constructed and their in vivo function validated in the absence of the corresponding wild type chromosomes. An important design feature of Sc2.0 chromosomes is the introduction of PCRTags, which are short, re-coded sequences within open reading frames (ORFs) that enable differentiation of synthetic chromosomes from their wild type counterparts. PCRTag primers anneal selectively to either synthetic or wild type chromosomes and the presence/absence of each type of DNA can be tested using a simple PCR assay. The standard readout of the PCRTag assay is to assess presence/absence of amplicons by agarose gel electrophoresis. However, with an average PCRTag amplicon density of one per 1.5 kb and a genome size of ~12 Mb, the completed Sc2.0 genome will encode roughly 8,000 PCRTags. To improve throughput, we have developed a real time PCR-based detection assay for PCRTag genotyping that we call qPCRTag analysis. The workflow specifies 500 nl reactions in a 1,536 multiwell plate, allowing us to test up to 768 PCRTags with both synthetic and wild type primer pairs in a single experiment.

Designer chromosomes of the Synthetic Yeast Genome project, Sc2.0, can be distinguished from their native counterparts using a PCR-based genotyping assay called PCRTagging, which has a presence/absence endpoint. Here we describe a high-throughput real time PCR detection method for PCRTag genotyping.

Análisis qPCRTag - Un alto rendimiento, Tiempo real ensayo PCR para Sc2.0 Genotipado

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...

High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

Zebrafish are an important model organism with inherent advantages that have the potential to make zebrafish a widely applied model for the study of energy homeostasis and obesity. The small size of zebrafish allows for assays on embryos to be conducted in a 96- or 384-well plate format, Morpholino and CRISPR based technologies promote ease of genetic manipulation, and drug treatment by bath application is viable. Moreover, zebrafish are ideal for forward genetic screens allowing for novel gene discovery. Given the relative novelty of zebrafish as a model for obesity, it is necessary to develop tools that fully exploit these benefits. Herein, we describe a method to measure energy expenditure in thousands of embryonic zebrafish simultaneously. We have developed a whole animal microplate platform in which we use 96-well plates to isolate individual fish and we assess cumulative NADH2 production using the commercially available cell culture viability reagent alamarBlue. In poikilotherms the relationship between NADH2 production and energy expenditure is tightly linked. This energy expenditure assay creates the potential to rapidly screen pharmacological or genetic manipulations that directly alter energy expenditure or alter the response to an applied drug (e.g. insulin sensitizers).

High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

Zebrafish are an important model organism for the study of energy homeostasis. By utilizing a NADH2 sensitive redox indicator, alamar Blue, we have developed an assay that measures the metabolic rate of zebrafish larvae in a 96 well plate format and can be applied to drug or gene discovery.

High Throughput<em&gt; Danio rerio</em&gt; Ensayo gasto energético

Zebrafish are an important model organism with inherent advantages that have the potential to make zebrafish a widely applied model for the study of ...