עבודה זו נתמכה על ידי מענקי NIH R01-GM-098,977 וR21-AI-098,122 לCBK וחבית. RSS נתמך בחלקו על ידי לוס קרן מלגה ובחלקו על ידי מלגת תייר חדשנות תכנית מבית הספר תאייר להנדסה.

ארבע פעילויות עיקריות מרכיבות את assay מחייב פפטיד-MHC II: 1-איגוד: פפטידים מבחן להתחרות עם פפטידים שליטה שכותרתו עבור שלב פתרון מחייב של חלבוני MHC II מסיסים. כריכה נמדדת על פני טווח רחב של ריכוזי פפטיד בדיקה. 2-Capture: לאחר התגובה מחייבת גישות שיווי משקל, פפטיד-MHC II מתחמים נלכדים ומופרד מפפטיד מאוגד וחלבון על ידי הכרת קונפורמציה תלויה עם נוגדן משותק. 3 איתור: פפטיד שליטה שנתפס הוא כמותית זוהה באמצעות הקרינה זמן נפתר. 4 ניתוח-: נתונים ספקטרליים מעובדים, זממו ונותחו כדי לקבוע מאפיינים המחייבים תלוי מינון של הפפטיד מבחן וחלבונים MHC II. בשלבים שונים בהליך שלהלן, השימוש ברובוט טיפול נוזל מומלץ אם הוא זמין. במיוחד בפורמט 384 גם, מחלק ודילול של נוזלים אוטומטיים ממזער שגיאת משתמש, תוצאות יותרכרכים עקביים היטב היטב, ומניב רווחי סמך 95% צרים עבור IC 50 ערכים בהשוואה למבחני מדריך ל96 היטב (מידע לא מוצג). אם רובוט טיפול נוזלי אינו זמין, הצעדים מבואר עם &quot;(רובוט נוזל טיפול)&quot; ניתן לעשות זאת באופן ידני. בדומה לכך, אם אפשר, מכונת כביסה צלחת אוטומטית שתואמת לפורמט 384 גם מומלצת. זה למעשה סטנדרטיזציה תהליך הכביסה הצלחת. אם מכונת כביסה צלחת אינה זמינה, הצעדים מבואר עם &quot;(מכונת כביסה צלחת)&quot; ניתן לעשות זאת באופן ידני. 1. מעיל פלייט ELISA (יום 1) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל L243 מניית נוגדן (0.5 מ&quot;ג / מיליליטר) בBorate הצפת לריכוז עבודה של 10 מיקרוגרם / מיליליטר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למעייל צלחת 384 גם יחידה, להוסיף 200 μl של נוגדן המניה ל9.8 מיליליטר של Borate הצפת. (ראה מחשבון גיליון אלקטרוני נוסף לקנה מידה חלופית). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 25 μl של פתרון L243 הנוגדן היטב בכל 384-well גבוה מחייב צלחת ELISA לבנה. (רובוט טיפול נוזלי) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותם את הצלחת עם סרט פוליאסטר ודגירת הלילה בשעה 4 ° C. הערה: כל צלחת ELISA 384 גם יכולה להכיל עד 15 פפטידים מבחן בשמונה דילולים לאחד אלל MHC II, כמו גם בקרות החיוביות ושליליות. זה סופו של דבר יניבו מדידות בשלושה עותקים. </li></ol> 2. הפוך בדיקת פפטיד הדילולים (יום 1) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל עם מניית 10 מ&quot;מ של כל פפטיד מבחן בDMSO, להפיק את סדרת הדילול הבאה בציטראט פוספט הצפת באמצעות צלחות 384 גם פוליפרופילן (טבלת 1). (רובוט טיפול נוזלי) הערה: צלחת פוליפרופילן 384 גם מלאה דורשת שלוש צלחות ELISA נפרדות. שליש מצלחת פוליפרופילן ידרוש רק אחד צלחת ELISA (איור 1). </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody align="center"><tr><td rowspan="2"> מספר דילול </td><td> לא נפחo לקחת מדילול / המניה לפני </td><td> נפח ציטראט הצפת להוסיף </td><td> קונצרט כלשהו. של דילול </td><td> קונצרט כלשהו. בתגובה המחייבת </td><td> קונצרט כלשהו. בנטרלתי ELISA </td></tr><tr><td> (Μl) </td><td> (Μl) </td><td> (מיקרומטר) </td><td> (מיקרומטר) </td><td> (מיקרומטר) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 0.7 </td><td> 35.1 </td><td> 195.531 </td><td> 97.765 </td><td> 48.883 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 14.3 </td><td> 14.3 </td><td> 97.765 </td><td> 48.883 </td><td> 24.441 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 7.1 </td><td> 28.7 </td><td> 19.389 </td><td> 9.695 </td><td> 4.847 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 14.3 </td><td> 14.3 </td><td> 9.695 </td><td> 4.847 </td><td> 2.424 </td></tr><tr><td> 5 </td><td> 7.1 </td><td> 28.7 </td><td> 1.923 </td><td> 0.961 </td><td> 0.481 </td></tr><tr><td> 6 </td><td> 14.3 </td><td> 14.3 </td><td> 0.961 </td><td> 0.481 </td><td> 0.24 </td></tr><tr><td> 7 </td><td> 7.1 </td><td> 28.7 </td><td> 0.191 </td><td> 0.095 </td><td> 0.048 </td></tr><tr><td> 8 </td><td> 14.3 </td><td> 14.3 </td><td> 0.095 </td><td> 0.048 </td><td> 0.024 </td></tr><tr><td colspan="6"> להסיר ולסלק 7.1 μl של פתרון פפטיד ממספר דילול 8. </td></tr></tbody></table> טבלת 1. הכנת סדרת דילול פפטיד מבחן. <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51308/51308fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51308/51308fig1.jpg" /> איור 1. פלייט מפה של פפטיד עקידת Assay. () מפה של דילולים פפטיד בצלחות 384 גם פוליפרופילן. כל צלחת פוליפרופילן יכולה להכיל שלוש קבוצות של 15 פפטידים בתגובות מחייבות תחרות מול שיר<html> אלל le MHC II. (ב) לאחר התגובה מחייבת גישות שיווי משקל, כל קבוצת פפטיד מועברת, בשלושה עותקים, לצלחת 384 גם ELISA נפרד שכבר precoated עם נוגדנים נגד MHC II. 3. הכן את MHC II מיקס מאסטר (יום 1) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך מאגר התגובה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 80 μl של 1 מ&quot;מ Pefa גוש ו60 מ&quot;ג octyl-β-D-glucopyranaside ל3,920 μl של ציטראט פוספט הצפת. (ראה מחשבון גיליון אלקטרוני נוסף לקנה מידה חלופית). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל פתרונות מניות MHC II נבחרו ל101 ננומטר בתגובת הצפת באמצעות צינור 15 מיליליטר חרוטי (טבלה 2). הערה: ריכוז MHC II סופו של דבר להיות 50 ננומטר בתגובה מחייבת ו25 ננומטר בassay ELISA נוטרל. ריכוזי מניית MHC II ישתנו בהתאם למספר הרבה של יצרן. (ראה מחשבון גיליון אלקטרוני משלימה). </li></ol>&quot;&gt; <tbody><tr><td> MHC II אלל DRB1 *: </td><td> 1501 </td></tr><tr><td> ריכוז MHC II במלאי (מ&quot;ג / מיליליטר) </td><td> 1.3 </td></tr><tr><td> ריכוז מניות MHC II (מ&quot;מ) </td><td> 20 </td></tr><tr><td> כרך ב &#39;. המלאי השני MHC להוסיף (מיליליטר) </td><td> 14.65 </td></tr><tr><td> כרך ב &#39;. תגובת הצפת להוספה (מיליליטר): </td><td> 2885.35 </td></tr><tr><td> ריכוז MHC II מיקס מאסטר (ננומטר) </td><td> 101 </td></tr></tbody></table> טבלה 2. הכנת תערובת ההורים MHC II. 4. הכן את הבקרה שלילית וחיובית (יום 1) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 21.5 μl של ציטראט פוספט הצפת אל באר &quot;ביקורת שלילית&quot; של צלחת פוליפרופילן 384 גם משלב 2.1 (איור 1 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 21.5 μl של ציטראט פוספט הצפת אל באר &quot;השליטה חיובית&quot; של צלחת פוליפרופילן 384 גם. הערה: &quot;חיובישליטה מופרזת &quot;תושלם בסעיף 5, בהמשך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר 49.5 μl של MHC II מיקס מאסטר משלב 3.2 וטפטפו לתוך צינור 1.5 מיליליטר Eppendorf. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 0.5 μl של ציטראט הצפת ל49.5 μl של MHC II מיקס מאסטר משלב 4.3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 21.5 μl של הריכוז הותאם MHC II מיקס מאסטר מצעד 4.4 אל באר &quot;ביקורת שלילית&quot; של צלחת פוליפרופילן 384 היטב (איור 1 א). הערה: מדגם זה מייצג את הביקורת שלילית אפס האות המכילה חלבון MHC II, פפטיד אין שליטה, ואין פפטיד הבדיקה. </li></ol> 5. הוסף את בקרת פפטיד המתאים לMHC II מיקס מאסטר (יום 1) <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> MHC II אלל DRB1 * </td><td> Biotinylated הבקרה פפטיד </td><td> (שאריות) </td><td> רצף </td></tr><tr><td> 0101 </td><td> שפעת HA-B </td><td> (306-318) </td><td> ביוטין (AHX) (AHX) PRYVKQNTLKLAT-אמיד </td></tr><tr><td> 0301 </td><td> מיוגלובין </td><td> (137-148) </td><td> ביוטין (AHX) - (AHX)-LFRKDIAAKYKE-OH </td></tr><tr><td> 0401 </td><td> יאר-B </td><td> (1-14) </td><td> ביוטין (AHX) (AHX) YARFQSQTTLKQKT-OH </td></tr><tr><td> 0701 </td><td> TetTox-B </td><td> (830-843) </td><td> ביוטין (AHX) (AHX) QYIKANSKFIGITE-OH </td></tr><tr><td> 1101 </td><td> שפעת HA-B </td><td> (306-318) </td><td> ביוטין (AHX) (AHX) PRYVKQNTLKLAT-אמיד </td></tr><tr><td> 1501 </td><td> MBP-B </td><td> (84-102) </td><td> ביוטין (AHX) (AHX) NPVVHFFKNIVTPRTPPPS-OH </td></tr></tbody></table> * אנו ממליצים הזמנת 10 קנה המידה מ&quot;ג לכלכלה. לוח 3. בקרת פפטידים לאללים MHC II שונים. * <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את הפפטיד הבקרה (מאוחסן ב400 מיקרומטר בDMSO) 1:20 בDMSO הטרי להניב מניית בדילול מלא ב20 מיקרומטר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 25 μl 400 פפטיד שליטת מיקרומטרDMSO μl 475. שים לב: מדובר בעודף גדול, אבל מאפשר טיפול מדויק של פתרונות DMSO צמיג. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יתר על כן לדלל בקרת פפטיד מצעד 5.1 (20 מ&quot;מ) 1:100 לMHC II מיקס מאסטר משלב 3.2. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 28.8 μl השליטה פפטיד מדולל בשלב 5.2 ל2,850.5 μl הנותר של MHC II מיקס מאסטר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 21.5 μl של MHC II מיקס מאסטר עם פפטיד שליטה (צעד 5.2) ולביקורת החיובית של צלחת פוליפרופילן 384 היטב (שלב 4.2) (איור 1 א). הערה: מדגם זה מייצג את הבקרה החיובית גבוהה אות המכילה חלבון MHC II, פפטיד שליטה, ואין פפטיד הבדיקה. </li></ol> 6. הפוך תגובה המחייבת (יום 1) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף את MHC II מאסטר המיקס המכיל בקרת פפטיד (שלב 5.2) לכל אחד מדילולי הבדיקה פפטיד (שלב 2.1) ביחס של 1:1 כדי ליצור את התגובה מחייבת. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 21.5 μl של MHC II מיקס מאסטר מכיל קוןTrol פפטיד מצעד 5.2-21.5 μl של דילול כל הבדיקה פפטיד משלב 2.1. (רובוט טיפול נוזלי) </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותם את התגובה המחייבת עם סרט פוליאסטר ודגירת 12-24 שעות בחממה שאינו CO 2 נשלטה על 37 מעלות צלזיוס בלי לרעוד. </li></ol> 7. לנטרל והעבר את התגובה המחייבת (יום 2) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את צלחת פוליפרופילן 384 גם מכילה את התגובה המחייבת (שלב 6.2) מחממת 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את 01:01 תגובה המחייבת עם נטרול הצפת. (רובוט טיפול נוזלי) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 43 μl של הצפת ניטרול לכל תגובה מחייבת היטב. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את צלחת ELISA (שלב 1.3) מ4 מעלות צלזיוס ולשטוף 3x עם 60 מיליליטר / טוב של PBS-0.05 Tween% 20. (מכונת כביסה צלחת) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברה 25 μl של כל תגובה מחייבת מנוטרלת מצעד 7.2 לתוך בארות בשלושה עותקים של צלחת 384 גם ELISA נוגדן מצופה מצעד 7.3. (איור 1 </(רובוט strong&gt;) נוזל טיפול) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסה את צלחת ELISA עם סרט פוליאסטר ומקום ב37 מעלות צלזיוס חממה ל2.5 שעה או במקרר 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. </li></ol> 8. ELISA פיתוח (יום 2 או 3) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את צלחת ELISA מצעד 7.5, לשטוף 3 פעמים עם 60 μl / טוב של PBS-0.05 Tween%. (מכונת כביסה צלחת) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל פתרון streptavidin-אירופיום המניה (0.1 מ&quot;ג / מיליליטר streptavidin, 7 Eu 3 + / streptavidin) 1,000 פי בDELFIA Assay הצפת. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצלחת אחת 384 גם, לדלל 10 μl Streptavidin-אירופיום ב10 מיליליטר Assay הצפת. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 25 μl של Streptavidin-אירופיום המדולל היטב בכל צלחת 384 גם ELISA מצעד 8.1. (רובוט טיפול נוזלי) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסה את הצלחת עם סרט פוליאסטר ומקום בחושך בטמפרטורת חדר למשך שעה 1. הערה: במהלך הדגירה 1 שעות, להסיר את פתרון שיפור מהמקרר ומניח בצד 10 ​​מיליליטר / צלחת בחושך בroטמפרטורת אום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הדגירה 1-HR, לשטוף את צלחת 384 גם ELISA מצעד 8.3 3x עם 60 μl / טוב של PBS-0.05 Tween%. (מכונת כביסה צלחת) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 25 μl של שיפור פתרון היטב בכל צלחת 384 גם ELISA מצעד 8.5. (רובוט טיפול נוזלי) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסה את צלחת ELISA 384 גם עם סרט פוליאסטר ולאפשר את הצלחת לשבת בחושך בטמפרטורת חדר למשך 10-15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הדגירה דקות 10-15, קרא את הקרינה של צלחת 384 גם ELISA מצעד 8.7 באמצעות זמן לפתור קורא ניאון צלחת עם הגדרות אירופיום (לדוגמא, התחל Int: 200, עצור Int:. 1,000, אקס 340, Em . 615, מפסק: אין, PMT: אוטומטי, קורא / ובכן: 50). </li></ol> 9. ניתוח נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזן את הנתונים בגרף בפורמט XY עם 3 ערכים לשכפל בעמודות Side-by-צד (X = ריכוז הפפטיד בדיקה; Y = מדידת הקרינה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחבר להפוך את ערכי X עבור כל הנתונים: X = יומן (X) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את טרה היומןnsformed נתונים עם המודל מחייב התחרותי אחד באתר כדי לחלץ את ערך IC 50. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להגביל את הערך התחתון לשווי השליטה השלילי הממוצע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעולם להתאים את הערך העליון ולבטח שפרמטר הכושר העולמי הוא מתחת או שווה לביקורת החיובית. </li></ol>

<ol>
	<li>Steere, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotic-refractory+Lyme+arthritis+is+associated+with+HLA-DR+molecules+that+bind+a+Borrelia+burgdorferi+peptide.">Antibiotic-refractory Lyme arthritis is associated with HLA-DR molecules that bind a Borrelia burgdorferi peptide.</a> J. Exp. Med. 203, 961-971 (2006).</li><li>Raddrizzani, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+modes+of+peptide+interaction+enable+HLA-DQ+and+HLA-DR+molecules+to+bind+diverse+peptide+repertoires.">Different modes of peptide interaction enable HLA-DQ and HLA-DR molecules to bind diverse peptide repertoires.</a> J. Immunol. 159, 703-711 (1997).</li><li>Osipovitch, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+analysis+of+immune-evading+enzymes+for+ADEPT+therapy.">Design and analysis of immune-evading enzymes for ADEPT therapy.</a> Protein Eng. Design. 25, 613-623 (2012).</li><li>Moise, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+silico-accelerated+identification+of+conserved+and+immunogenic+variola/vaccinia+T-cell+epitopes.">In silico-accelerated identification of conserved and immunogenic variola/vaccinia T-cell epitopes.</a> Vaccine. 27, 6471-6479 (2009).</li><li>Moise, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+HLA+DR+epitope+de-immunization+of+Factor+VIII+in+vitro+and+in+vivo.">Effect of HLA DR epitope de-immunization of Factor VIII in vitro and in vivo.</a> Clin. Immunol. 142, 320-331 (2012).</li><li>Aggarwal, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What's+fueling+the+biotech+engine-2011+to+2012.">What's fueling the biotech engine-2011 to 2012.</a> Nat. Biotechnol. 30, 1191-1197 (2012).</li><li>Trombetta, E. S., Mellman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+biology+of+antigen+processing+in+vitro+and+in+vivo.">Cell biology of antigen processing in vitro and in vivo.</a> Ann. Rev. Immunol. 23, 975-1028 (2005).</li><li>Warmerdam, P. A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elimination+of+a+human+T-cell+region+in+staphylokinase+by+T-cell+screening+and+computer+modeling.">Elimination of a human T-cell region in staphylokinase by T-cell screening and computer modeling.</a> Thrombosis Haemostasis. 87, 666-673 (2002).</li><li>Jones, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+removal+of+a+promiscuous+CD4+T+cell+epitope+from+the+C1+domain+of+factor+VIII.">Identification and removal of a promiscuous CD4+T cell epitope from the C1 domain of factor VIII.</a> J. Thrombosis Haemostasis. 3, 991-1000 (2005).</li><li>Harding, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+beta-lactamase+with+reduced+immunogenicity+for+the+targeted+delivery+of+chemotherapeutics+using+antibody-directed+enzyme+prodrug+therapy.">A beta-lactamase with reduced immunogenicity for the targeted delivery of chemotherapeutics using antibody-directed enzyme prodrug therapy.</a> Mol. Cancer. 4, 1791-1800 (2005).</li><li>Mazor, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+elimination+of+an+immunodominant+T-cell+epitope+in+recombinant+immunotoxins+based+on+Pseudomonas+exotoxin+A.">Identification and elimination of an immunodominant T-cell epitope in recombinant immunotoxins based on Pseudomonas exotoxin A.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, E3597-E3603 (2012).</li><li>Cantor, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+enzyme+deimmunization+by+combinatorial+T-cell+epitope+removal+using+neutral+drift.">Therapeutic enzyme deimmunization by combinatorial T-cell epitope removal using neutral drift.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 1272-1277 (2011).</li><li>Kern, F., LiPira, G., Gratama, J. W., Manca, F., Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Ag-specific+immune+responses:+understanding+immunopathogenesis+and+improving+diagnostics+in+infectious+disease,+autoimmunity+and+cancer.">Measuring Ag-specific immune responses: understanding immunopathogenesis and improving diagnostics in infectious disease, autoimmunity and cancer.</a> Trends Immunol. 26, 477-484 (2005).</li><li>Li Pira, G., Ivaldi, F., Moretti, P., Manca, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+T+epitope+mapping+and+vaccine+development.">High throughput T epitope mapping and vaccine development.</a> J. Biomed. Biotechnol. 2010, 325720 (2010).</li><li>Hoffmeister, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+T+cell+epitopes+by+flow+cytometry.">Mapping T cell epitopes by flow cytometry.</a> Methods. 29, 270-281 (2003).</li><li>Singh, H., Raghava, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ProPred:+prediction+of+HLA-DR+binding+sites.">ProPred: prediction of HLA-DR binding sites.</a> Bioinformatics. 17, 1236-1237 (2001).</li><li>Guan, P., Doytchinova, I. A., Zygouri, C., Flower, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MHCPred:+bringing+a+quantitative+dimension+to+the+online+prediction+of+MHC+binding.">MHCPred: bringing a quantitative dimension to the online prediction of MHC binding.</a> Appl. Bioinformatics. 2, 63-66 (2003).</li><li>Wan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SVRMHC+prediction+server+for+MHC-binding+peptides.">SVRMHC prediction server for MHC-binding peptides.</a> BMC Bioinformatics. 7, 463 (2006).</li><li>Bui, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+generation+and+evaluation+of+specific+MHC+binding+predictive+tools:+ARB+matrix+applications.">Automated generation and evaluation of specific MHC binding predictive tools: ARB matrix applications.</a> Immunogenetics. 57, 304-314 (2005).</li><li>Nielsen, M., Lundegaard, C., Lund, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+MHC+class+II+binding+affinity+using+SMM-align,+a+novel+stabilization+matrix+alignment+method.">Prediction of MHC class II binding affinity using SMM-align, a novel stabilization matrix alignment method.</a> BMC Bioinformatics. 8, 238 (2007).</li><li>Nielsen, M., Justesen, S., Lund, O., Lundegaard, C., Buus, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NetMHCIIpan-2.0+-+Improved+pan-specific+HLA-DR+predictions+using+a+novel+concurrent+alignment+and+weight+optimization+training+procedure.">NetMHCIIpan-2.0 - Improved pan-specific HLA-DR predictions using a novel concurrent alignment and weight optimization training procedure.</a> Immun. Res. 6, 9 (2010).</li><li>De Groot, A. S., Knopp, P. M., Martin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De-immunization+of+therapeutic+proteins+by+T-cell+epitope+modification.">De-immunization of therapeutic proteins by T-cell epitope modification.</a> Dev. Biol. 122, 171-194 (2005).</li><li>Choi, Y., Griswold, K. E., Bailey-Kellogg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-based+redesign+of+proteins+for+minimal+T-cell+epitope+content.">Structure-based redesign of proteins for minimal T-cell epitope content.</a> J. Comput. Chem. 34, 879-891 (2013).</li><li>Parker, A. S., Choi, Y., Griswold, K. E., Bailey-Kellogg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-guided+deimmunization+of+therapeutic+proteins.">Structure-guided deimmunization of therapeutic proteins.</a> J. Comput. Biol. 20, 152-165 (2013).</li><li>Parker, A. S., Griswold, K. E., Bailey-Kellogg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+therapeutic+proteins+to+delete+T-cell+epitopes+while+maintaining+beneficial+residue+interactions.">Optimization of therapeutic proteins to delete T-cell epitopes while maintaining beneficial residue interactions.</a> J. Bioinform. Comput. Biol. 9, 207-229 (2011).</li><li>Parker, A. S., Zheng, W., Griswold, K. E., Bailey-Kellogg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+algorithms+for+functional+deimmunization+of+therapeutic+proteins.">Optimization algorithms for functional deimmunization of therapeutic proteins.</a> BMC Bioinformatics. 11, 180 (2010).</li><li>De Groot, A. S., Martin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+risk,+improving+outcomes:+Bioengineering+less+immunogenic+protein+therapeutics.">Reducing risk, improving outcomes: Bioengineering less immunogenic protein therapeutics.</a> Clin. Immunol. 131, 189-201 (2009).</li><li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+assessment+of+MHC+class+II+peptide+binding+predictions+and+evaluation+of+a+consensus+approach.">A systematic assessment of MHC class II peptide binding predictions and evaluation of a consensus approach.</a> PLoS Comput. Biol. 4, e1000048 (2008).</li><li>Sette, A., Rappuoli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+vaccinology:+developing+vaccines+in+the+era+of+genomics.">Reverse vaccinology: developing vaccines in the era of genomics.</a> Immunity. 33, 530-541 (2010).</li><li>Moise, L., Cousens, L., Fueyo, J., De Groot, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+the+power+of+genomics+and+immunoinformatics+to+produce+improved+vaccines.">Harnessing the power of genomics and immunoinformatics to produce improved vaccines.</a> Expert Opin. Drug Discov. 6, 9-15 (2011).</li><li>Sturniolo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+tissue-specific+and+promiscuous+HLA+ligand+databases+using+DNA+microarrays+and+virtual+HLA+class+II+matrices.">Generation of tissue-specific and promiscuous HLA ligand databases using DNA microarrays and virtual HLA class II matrices.</a> Nat. Biotechnol. 17, 555-561 (1999).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biologic+drugs+set+to+top+2012+sales.">Biologic drugs set to top 2012 sales.</a> Nat. Med. 18, 636 (2012).</li><li>Seib, K. L., Zhao, X., Rappuoli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+vaccines+in+the+era+of+genomics:+a+decade+of+reverse+vaccinology.">Developing vaccines in the era of genomics: a decade of reverse vaccinology.</a> Clin. Microbiol. Infect. 18, 109-116 (2012).</li><li>Jiang, W., Boder, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+engineering+and+analysis+of+peptide+binding+to+class+II+MHC.">High-throughput engineering and analysis of peptide binding to class II MHC.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 13258-13263 (2010).</li><li>Justesen, S., Harndahl, M., Lamberth, K., Nielsen, L. -. L. B., Buus, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+recombinant+MHC+class+II+molecules+and+high-throughput+peptide-binding+assays.">Functional recombinant MHC class II molecules and high-throughput peptide-binding assays.</a> Immun. 5, 1-20 (2009).</li></ol>

לאונרד מואיז הוא מועסק על ידי ומחזיק באופציות מניות בEpiVax, Inc, חברת הביוטכנולוגיה בבעלות פרטית הממוקמת בפרובידנס, רוד איילנד. העבודה הכלולה בדוח מחקר זה היא חופשי מכל הטיה שעלולה להיות קשורות למטרות מסחריות של החברה.

Biotherapeutics הקימו את עצמם כפינה של רפואה המודרנית, המייצג את ארבעה מחמש התרופות הנמכרות ביותר בשנת 2012 32. Biopharmaceutics המגזר הראה צמיחה מתמשכת במשך כמה שנות 6, והפיתוח המתמשך של סוכני רומן, כמו גם את הופעתה של biosimilars הרחיב צינורות ביולוגיות. במבט לעתיד, הערכה ומקלי i...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/51308/a-high-throughput-mhc-ii-binding-assay-for-quantitative-analysis">A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes</a>.&#160; There were typos in the Protocol section and Table 2.
Step 3.1.1 in the Protocol was updated from:
Add 80 &#181;l of 1 mM Pefa Bloc and 60 mg of octyl-&#946;-D-glucopyranaside to 3,920 &#181;l of Citrate Phosphate Buffer. (See supplemental spreadsheet calculator for alternative scaling).
to:
Add 80 &#181;l of 1 mM Pefa Bloc and 60 &#181;g of octyl-&#946;-D-glucopyranaside to 3,920 &#181;l of Citrate Phosphate Buffer. (See supplemental spreadsheet calculator for alternative scaling).
Step 5.2&#160;in the Protocol was updated from:
Further dilute the Control Peptide from step 5.1 (20 mM) 1:100 into the MHC II Master Mix from step 3.2.
to:
Further dilute the Control Peptide from step 5.1 (20 &#181;M) 1:100 into the MHC II Master Mix from step 3.2.
Table 2 was updated from:
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="376">
	<tbody>
		<tr>
			<td>MHC II Allele DRB1*:</td>
			<td>1501</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MHC II Stock Concentration (mg/ml)</td>
			<td>1.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MHC II Stock Concentration (mM)</td>
			<td>20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vol. MHC II Stock to Add (ml)</td>
			<td>14.65</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vol. Reaction Buffer to Add (ml):</td>
			<td>2885.35</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MHC II Master Mix Concentration (nM)</td>
			<td>101</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
to:
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="376">
	<tbody>
		<tr>
			<td>MHC II Allele DRB1*:</td>
			<td>1501</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MHC II Stock Concentration (mg/ml)</td>
			<td>1.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MHC II Stock Concentration (&#956;M)</td>
			<td>20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vol. MHC II Stock to Add (&#956;l)</td>
			<td>14.65</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vol. Reaction Buffer to Add (&#956;l):</td>
			<td>2885.35</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MHC II Master Mix Concentration (nM)</td>
			<td>101</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/51308/a-high-throughput-mhc-ii-binding-assay-for-quantitative-analysis">A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes</a>.&#160; There were typos in the Protocol section and Table 2.

Erratum: A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes

חלבונים הם ברמת הצמיחה המהירה ביותר של סוכנים טיפוליים 6, וההתרחבות המהירה של צינורות biotherapeutic התמקדה תשומת לב הולכת וגובר על האתגרים הקשורים בהתפתחות ושימוש בתרופות חלבון. שיקול אחד ייחודי נובע מהעובדה כי במערכת חיסונית בריאה ומתפקדת, כל החלבונים תאיים נדגמים על ידי תאי המציגים אנטיגנים (נגמ&quot;שים). הפנים פעם על ידי נגמ&quot;שים, חלבון הוא ביקע לרסיסי פפטיד קטנים, ומגזרי immunogenic משוערים נטענים לתוך החריץ של הכיתה השנייה חלבונים עיקריים histocompatibility המורכבים (MHC II). פפטיד-MHC II מתחמים לאחר מכן מוצגים על פני APC, ופפטידים immunogenic אמיתיים, המכונים אפיטופים תא T, יצירת קומפלקסי קולטן תא משולש MHC II-peptide-T עם קולטנים בתא שטח מאותו מקור T מסוג CD4 7. אירוע הוקרה זה קריטי מולקולרי יוזם מפל מורכב איתות, שהתוצאה של הפעלת תאי T, את שחרורו של ציטוקיניםים, התבגרות תא T מסוג CD4 תא בתיווך ב &#39;, וסופו של דבר ייצור של מחזורי נוגדני IgG אשר נקלטות על ידי ולנקות את חלבון אקסוגני הפוגע. לפיכך, חלבוני immunogenic עשויים להיות deimmunized ידי זיהוי אפיטופים תא T מכונן ומוטצית שאריות מרכזיות שהיו אחראיות להיווצרות מורכבת MHC II. זה ראוי לציין, עם זאת, כי אפיטופים תא T יכולים להיות רבים ורחב בפריסת חלבוני immunogenic, והרוב המכריע של מוטציות מחיקה-epitope עלול לגרום לאובדן לא מכוון של תפקוד חלבון או יציבות. לכן, הנדסת deimmunized biotherapies יכול להיות אובייקטיבי מורכבת ומאתגרת מבחינה טכנית, אך קיימות מספר דוגמאות לפרויקטים המוצלחים T epitope תא מחיקה 3,5,8-12. שלא כמו &quot;האנשה&quot; המבוסס על השתלה, אשר מוגבלת במידה רבה לרפויות נוגדן, מחיקת epitope יכולה להיות מיושמת למעשה כל יעד חלבון ללא קשר לרצף, מבנה, תפקוד, או הזמינות של homologoשלנו פיגומים אנושיים. הצעד הראשון ליישום גישה כזו הוא זיהוי של אפיטופים פפטיד מפתח מוטבעים בתוך רצף חלבון המטרה. מבחני ביוכימיים תפוקה גבוהה באמצעות פפטידים סינטטיים ומולקולות MHC II רקומביננטי אדם יכולים לספק תובנות ראשוניות מהירה לזיהוי אפיטופ והפחתה 1,3-5. מבחני מסוג ELISA אלה יכולים להיות חזק כדי להשלים כלי עיצוב ופיתוח חלבון / חיסון אחרים. לדוגמא, אחד גישה ניסויית מבוססת היטב למיפוי epitope מסתמכת על זמן, עבודה ומשאבי מבחני אינטנסיביים vivo לשעבר התפשטות תאי 15. בקצרה, הרצף הראשוני של חלבון מטרה מחולק ראשונה לפנל של פפטידים חופפים, לעתים קרובות 15 מרס עם 12 שאריות חפיפה בין פפטידים סמוכים. פנל פפטיד הוא סינתזה כימית וimmunogenicity של כל הפפטיד נבדק באחד מכמה immunoassays שונה המעסיקות bloo ההיקפיתאים מונונוקלארים ד (PBMC) מבודדים מתורמים אנושיים 13,14. כדי לספק ביטחון רב יותר בתוצאות, פפטידים שנבדקו בדרך כלל בלשכפל עם PBMC מ50 או יותר תורמים שונים. במקרים בהם deimmunization הוא המטרה הסופית, העבודה מורכבת עוד יותר על ידי הצורך לייצר פנלים נוספים של פפטידים שעברו מוטציה ולבדוק את לוחות פפטיד החדשים במבחני PBMC לפני החדרת כל מוטציות deimmunizing לחלבון באורך מלא עבור הניתוח פונקציונלי הבא 10. בעוד מבחני הסלולריים אלה נשארים תקן הזהב להערכת פוטנציאל immunogenic בחולים אנושיים, את היעילות של גישה כזו ממצה ניתן לשפר על ידי prefiltering אפיטופים immunogenic משוערת באמצעות תפוקה מהירה וגבוהה assay מחייב MHC II-peptide. כמו כן, ניתן לשלב מבחני פפטיד-MHC II ביוכימיים מחייבים עם חזוי בשיטות סיליקו כדי להאיץ את תהליך זיהוי אפיטופ באופן קיצוני.קיים מגוון רחב של כלים חישוביים לחיזוי epitope תא T; דוגמאות כוללות 16 ProPred, 17 MHCPred, 18 SVRMHC, ARB 19, SMM ליישר 20, NetMHCIIpan 21 כמו גם כלים קניינית כגון EpiMatrix ידי 22 EpiVax. כמו כן, מנבאי epitope לאחרונה בשילוב עם ביואינפורמטיקה וכלים אחרים הדמיה מולקולריות להניב אלגוריתמי deimmunization משולבים חלבון שנועדו לצמצם את הסיכון שמוטציות deimmunizing עלולות לשבש את מבנה חלבון ותפקוד 23-26. בעוד כמה מנבאי epitope הוכיחו להיות 27,28 מדויק למדי, תוצאות חישובית תמיד דורשות אימות ניסיוני. שיטות ניסיוניות מהיר, תפוקה גבוהה, וחסכונית הם מתאימים ביותר כמסנן ראשוני לתחזיות epitope סיליקו. ברוח דומה, מנבאי epitope יכולים לנהוג בחירת אנטיגן לvaccinolo ההפוךGY 29,30. לדוגמא, התקדמות ביואינפורמטיקה הניבה מסכי הגנום כולו, כי במהירות לזהות מועמדי חיסון בצורה של חלבונים שלמים או אפיטופים פפטיד המופקים מproteomes הפתוגן. בעוד טכנולוגיה שמאפשרת את זה הוא עיצוב מחדש גילוי ופיתוח של חיסוני מגן, הוא מציג אתגר חדש בצורה של רשימות גדולות intractably של מועמדי חיסון immunogenic. מבחני מחייבים תפוקה גבוהה פפטיד-MHC II יכולים להדריך את בחירת epitope ידי כימותי זיקה מחייבת פפטיד ומחייב הפקרות בין אללים MHC II מרובים. כמו עם deimmunization חלבון, שיטות ניסיוניות כאלה סופו של דבר נדרשו כדי לאמת את הניבוי חישובית של מוביל חיסון מבטיח. הנה, assay מחייב פפטיד-MHC השני טיפס לפורמט 384 גם הוא תאר. הפרוטוקול הוא למקבל ביותר ומפחית את העלויות מגיב על ידי 75% בהשוואה שלתואר קודם לכן 96 היטב פורמטי צלחת 1,3-5. שימוש של נוזלים אחתד טיפול ברובוט, שיטה זו מאפשרת לחוקר אחד לנתח בקלות כ תשעים פפטידים מבחן בשלושה עותקים על פני טווח של שמונה ריכוזים וארבעה סוגי MHC II אלל בפחות מ 48 שעות. מאמר זה מתאר את ההתקנה של צלחת 384 גם ELISA אחד לניתוח של שבעה פפטידים ניסיוניים נגד אחד אלל MHC II, אבל מחשבוני גיליון להפיץ מסופקים כחומר משלים כדי להתרחב בקלות את הניסוי לכל מספר של פפטידים ו / או MHC רצויים השני מולקולות.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:587px;">Sodium Tetraborate Decahydrate</td>
			<td style="width:357px;">Sigma</td>
			<td style="width:217px;">221732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Citric Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Dibasic Sodium Phosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Trizma HCl</td>
			<td>OmniPur</td>
			<td>9310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Tween-20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">100% DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Octyl-&#946;-D-Glucopyranaside</td>
			<td>Fischer</td>
			<td>29836-26-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Pefa Bloc SCF</td>
			<td>Roche</td>
			<td>1158591600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Dulbecco&#8217;s 10X Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14200-166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">DELFIA Assay Buffer</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>4002-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">DELFIA Enhancement Buffer</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>4001-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Europium Labelled Streptavidin</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>1244-360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">L243 anti-HLA-DR antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>307602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Biotinylated tracer peptides</td>
			<td>21st Century Biochemicals</td>
			<td>Custom Order</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Test peptides (1-4mg, 85% purity)</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>Custom Order</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Purified HLA-DRB1 monomers (non-biotinylated)</td>
			<td>Benaroya Research Institute*</td>
			<td>Custom Order</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">384-well white EIA/RIA plate</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>460372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Polypropylene 384-well plate</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Film, AxySeal, 80 &#181;m, ELISA Applicator&#160;</td>
			<td>Axygen Asicentific</td>
			<td>PCR-SP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">MilliQ Water</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Epimotion Liquid Handler (or similar)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Select TS Plate Washer (or similar)</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">SpectraMax Gemini Microplate Reader (or similar)</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4" height="98" style="height:99px;width:1161px;">*Recombinant human MHC II molecules can be obtained from the Benaroya Tetramer Core Laboratory. See: https://www.benaroyaresearch.org/our-research/core-resources/tetramer-core-laboratory</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high throughput mhc ii binding assay for quantitative analysis of peptide epitopes

מבחני ביוכימיים עם מולקולות MHC II רקומביננטי אדם יכולים לספק תובנות מהירים, כמותיים לזיהוי אפיטופ immunogenic, מחיקה, או עיצוב 1,2. הנה, assay מחייב פפטיד-MHC II ישתנה לפורמט 384 גם. פרוטוקול scaled למטה מפחית עלויות מגיב על ידי 75% ותפוקה גבוהה יותר מאשר שתואר קודם לכן פרוטוקולי 96 היטב 1,3-5. באופן ספציפי, תכנון הניסוי מאפשר ניתוח חזק ושחזור של עד 15 פפטידים נגד אחד אלל MHC II לכל צלחת ELISA 384 גם. באמצעות רובוט טיפול נוזל יחיד, שיטה זו מאפשרת לחוקר אחד כדי לנתח כ תשעים פפטידים מבחן בשלושה עותקים על פני טווח של שמונה ריכוזים וארבעה סוגי MHC II אלל בפחות מ 48 שעות. אחרים עובדים בתחומי deimmunization חלבון או עיצוב ופיתוח חיסון עשויים למצוא את הפרוטוקול כדי להיות שימושי בהנחיית העבודה שלהם. בפרט, הוראות והפורמט ויזואלי צעד אחר צעדשל יופיטר צריך לאפשר למשתמשים אחרים, כדי לקבוע במהירות ובקלות במתודולוגיה זו במעבדות שלהם.

רצף פפטיד הבוגר של Enterobacter P99 cloacae בטא lactamase (BLA) (# X07274.1 GenBank ID) נותח עם ProPred 16 לקלסרים פפטיד המשוערת לMHC II אלל DRB1 * 1501 (לוח 4). ProPred זיהה 117 פפטידים nonamer עם שאריות עוגן P1 חובה (כלומר, M, L, I, V, F, Y או W בעמדה 1, אשר נדרש עבור MHC II מחייב ביום 31). בסף של 5%, ...

Watch this Scientific Journal Video about A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes at JoVE.com

A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes

מבחני ביוכימיים עם מולקולות MHC II רקומביננטי אדם יכולים לספק תובנות מהירים, כמותיים לזיהוי אפיטופ immunogenic, מחיקה, או עיצוב. הנה, assay מחייב פפטיד-MHC השני טיפס לצלחות 384 גם הוא תאר. פורמט חסכוני זה צריך להיות שימושי בתחומי deimmunization חלבון ועיצוב חיסון ופיתוח.

Assay עקידת התפוקה גבוה MHC II לניתוח כמותי של פפטיד אפיטופים

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or ...

a-high-throughput-mhc-ii-binding-assay-for-quantitative-analysis

Research

JoVE Journal

Biology

14.8K Views.  Dartmouth College.  מבחני ביוכימיים עם מולקולות MHC II רקומביננטי אדם יכולים לספק תובנות מהירים, כמותיים לזיהוי אפיטופ immunogenic, מחיקה, או עיצוב. הנה, assay מחייב פפטיד-MHC השני טיפס לצלחות 384 גם הוא תאר. פורמט חסכוני זה צריך להיות שימושי בתחומי deimmunization חלבון ועיצוב חיס?...

Video: A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes

Visualizing Antigen Specific CD4+ T Cells using MHC Class II Tetramers

Major histocompatibility complex (MHC) class II tetramers allow the direct visualization of antigen specific CD4+ T cells by flow cytometry.  This method relies on the highly specific interaction between peptide loaded MHC and the corresponding T-cell receptor.  While the affinity of a single MHC/peptide molecule is low, cross-linking MHC/peptide complexes with streptavidin increases the avidity of the interaction, enabling their use as staining reagents.  Because of the relatively low frequencies of CD4+ T cells (~1 in 300,000 for a single specificity) this assay utilizes an in vitro amplification step to increase its threshold of detection.  Mononuclear cells are purified from peripheral blood by Ficoll underlay.  CD4+ cells are then separated by negative selection using biotinylated antibody cocktail and anti-biotin labeled magnetic beads.  Using adherent cells from the CD4- cell fraction as antigen presenting cells, CD4+ T cells are expanded in media by adding an antigenic peptide and IL-2.  The expanded cells are stained with the corresponding class II tetramer by incubating at 37 C for one hour and subsequently stained using surface antibodies such as anti-CD4, anti-CD3, and anti-CD25.  After labeling, the cells can be directly analyzed by flow cytometry.  The tetramer positive cells typically form a distinct population among the expanded CD4+ cells.  Tetramer positive cells are usually CD25+ and often CD4 high.  Because the level of background tetramer staining can vary, positive staining results should always be compared to the staining of the same cells with an irrelevant tetramer.  Multiple variations of this basic assay are possible.  Tetramer positive cells may be sorted for further phenotypic analysis, inclusion in ELISPOT or proliferation assays, or other secondary assays.  Several groups have also demonstrated co-staining using tetramers and either anti-cytokine or anti-FoxP3 antibodies.  

This procedure demonstrates the purification and in vitro expansion of antigen specific CD4+ T cells from whole peripheral blood and their visualization using MHC class II tetramers. Tetramers permit the direct visualization of T cells with a single antigen specificity and defined MHC class II restriction.

Antigen CD4 + הדמיה ספציפיות תאים T באמצעות MHC Class II Tetramers

Major histocompatibility complex (MHC) class II tetramers allow the direct visualization of antigen specific CD4+ T cells by flow cytometry.  This method ...

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

עצב Astrocyte שותף תרבות Assay לניתוח תכולה גבוהה של neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying potassium (referred to as GIRK) channels, which are important for regulating the excitability of neurons. There are four different mammalian GIRK channel subunits (GIRK1-GIRK4) - we focus on GIRK2 because it forms a homotetramer. Stimulation of different types of G protein-coupled receptors (GPCRs), such as the muscarinic receptor (M2R), leads to activation of GIRK channels. Alcohol also directly activates GIRK channels. We will show how to mutate one amino acid by specifically changing one or more nucleotides in the cDNA for the GIRK channel. This mutated cDNA sequence will be amplified in bacteria, purified, and the presence of the point mutation will be confirmed by DNA sequencing. The cDNAs for the mutated and wild-type GIRK channels will be transfected into human embryonic kidney HEK293T cells cultured in vitro. Lastly, whole-cell patch-clamp electrophysiology will be used to study the macroscopic potassium currents through the ectopically expressed wild-type or mutated GIRK channels. In this experiment, we will examine the effect of a L257W mutation in GIRK2 channels on M2R-dependent and alcohol-dependent activation.

We will demonstrate how to study the effect of a single point mutation on the function of an ion channel.

Mutagenesis וניתוח פונקציונלי של תעלות יונים הביעו Heterologously בתאי יונקים

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

High-throughput Saccharification Assay for Lignocellulosic Materials

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing a biorefinery. These raw materials would constitute a new industrial platform, which is both sustainable and carbon neutral, to replace 
the current dependency on fossil fuel. The recalcitrance to deconstruction observed in lignocellulosic materials is produced by several intrinsic properties 
of plant cell walls. Crystalline cellulose is embedded in matrix polysaccharides such as xylans and arabinoxylans, and the whole structure is encased by the 
phenolic polymer lignin, that is also difficult to digest 1. In order to improve the digestibility of plant materials we need to discover the main bottlenecks 
for the saccharification of cell walls and also screen mutant and breeding populations to evaluate the variability in saccharification 2. These tasks require 
a high throughput approach and here we present an analytical platform that can perform saccharification analysis in a 96-well plate format. This platform has 
been developed to allow the screening of lignocellulose digestibility of large populations from varied plant species. We have scaled down the reaction volumes 
for gentle pretreatment, partial enzymatic hydrolysis and sugar determination, to allow large numbers to be assessed rapidly in an automated system.
This automated platform works with milligram amounts of biomass, performing ball milling under controlled conditions to reduce the plant 
materials to a standardised particle size in a reproducible manner. Once the samples are ground, the automated formatting robot dispenses specified and recorded 
amounts of material into the corresponding wells of 96 deep well plate (Figure 1). Normally, we dispense the same material into 4 wells to have 4 replicates for 
analysis. Once the plates are filled with the plant material in the desired layout, they are manually moved to a liquid handling station (Figure 2). In this 
station the samples are subjected to a mild pretreatment with either dilute acid or alkaline and incubated at temperatures of up to 90&deg;C. The pretreatment solution 
is subsequently removed and the samples are rinsed with buffer to return them to a suitable pH for hydrolysis. The samples are then incubated with an enzyme
mixture for a variable length of time at 50&deg;C. An aliquot is taken from the hydrolyzate and the reducing sugars are automatically determined by the MBTH 
colorimetric method.

A simple, rapid method for determining the saccharification potential of large numbers of plant biomass samples is described. The automated platform for this analysis involves the preparation of the plant biomass for analysis in 96 well plates and the subsequent performance of pretreatment, hydrolysis and quantification of the sugars released.

תפוקה גבוהה Saccharification Assay חומרים Lignocellulosic

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing ...

A Quantitative Fitness Analysis Workflow

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is an experimental and computational workflow for comparing fitnesses of microbial cultures grown in parallel1,2,3,4. QFA can be applied to focused observations of single cultures but is most useful for genome-wide genetic interaction or drug screens investigating up to thousands of independent cultures. The central experimental method is the inoculation of independent, dilute liquid microbial cultures onto solid agar plates which are incubated and regularly photographed. Photographs from each time-point are analyzed, producing quantitative cell density estimates, which are used to construct growth curves, allowing quantitative fitness measures to be derived. Culture fitnesses can be compared to quantify and rank genetic interaction strengths or drug sensitivities. The effect on culture fitness of any treatments added into substrate agar (e.g. small molecules, antibiotics or nutrients) or applied to plates externally (e.g. UV irradiation, temperature) can be quantified by QFA.
The QFA workflow produces growth rate estimates analogous to those obtained by spectrophotometric measurement of parallel liquid cultures in 96-well or 200-well plate readers. Importantly, QFA has significantly higher throughput compared with such methods. QFA cultures grow on a solid agar surface and are therefore well aerated during growth without the need for stirring or shaking.
QFA throughput is not as high as that of some Synthetic Genetic Array (SGA) screening methods5,6. However, since QFA cultures are heavily diluted before being inoculated onto agar, QFA can capture more complete growth curves, including exponential and saturation phases3. For example, growth curve observations allow culture doubling times to be estimated directly with high precision, as discussed previously1.
Here we present a specific QFA protocol applied to thousands of S. cerevisiae cultures which are automatically handled by robots during inoculation, incubation and imaging. Any of these automated steps can be replaced by an equivalent, manual procedure, with an associated reduction in throughput, and we also present a lower throughput manual protocol. The same QFA software tools can be applied to images captured in either workflow.
We have extensive experience applying QFA to cultures of the budding yeast S. cerevisiae but we expect that QFA will prove equally useful for examining cultures of the fission yeast S. pombe and bacterial cultures.

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is a complementary series of experimental and computational methods for estimating microbial culture fitnesses. QFA estimates the effect of genetic mutations, drugs or other applied treatments on microbe growth. Experiments scaling from focussed analysis of single cultures to thousands of parallel cultures can be designed.

כושר ניתוח כמותי של זרימת עבודה

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is an experimental and computational workflow for comparing fitnesses of microbial cultures grown in parallel1,2,3,4. ...

High-throughput Functional Screening using a Homemade Dual-glow Luciferase Assay

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with Parkinson&#39;s disease. 293T cells are transiently transfected with plasmids from an arrayed ORF expression library, together with luciferase reporter plasmids, in a one-gene-per-well microplate format. Firefly luciferase activity is assayed after 48 hr to determine the effects of each library gene upon alpha-synuclein transcription, normalized to expression from an internal control construct (a hCMV promoter directing Renilla luciferase). This protocol is facilitated by a bench-top robot enclosed in a biosafety cabinet, which performs aseptic liquid handling in 96-well format. Our automated transfection protocol is readily adaptable to high-throughput lentiviral library production or other functional screening protocols requiring triple-transfections of large numbers of unique library plasmids in conjunction with a common set of helper plasmids. We also present an inexpensive and validated alternative to commercially-available, dual luciferase reagents which employs PTC124, EDTA, and pyrophosphate to suppress firefly luciferase activity prior to measurement of Renilla luciferase. Using these methods, we screened 7,670 human genes and identified 68 regulators of alpha-synuclein. This protocol is easily modifiable to target other genes of interest.

We present a rapid and inexpensive screening method for identifying transcriptional regulators using high-throughput robotic transfections and a homemade dual-glow luciferase assay. This protocol rapidly generates direct side-by-side functional data for thousands of genes and is easily modifiable to target any gene of interest.

הקרנה פונקציונלית תפוקה גבוהה באמצעות assay בלוציפראז Dual-זוהר תוצרת בית

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with ...

Flow Cytometric Analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation: A High Throughput Quantitative Method to Study Protein-protein Interaction

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC is based on the production of fluorescence using two non-fluorescent fragments of a fluorescent protein (Venus, a Yellow Fluorescent Protein variant, is used here). Non-fluorescent Venus fragments (VN and VC) are fused to two interacting proteins (in this case, AKAP-Lbc and PDE4D3), yielding fluorescence due to VN-AKAP-Lbc-VC-PDE4D3 interaction and the formation of a functional fluorescent protein inside cells.
BiFC provides information on the subcellular localization of protein complexes and the strength of protein interactions based on fluorescence intensity. However, BiFC analysis using microscopy to quantify the strength of protein-protein interaction is time-consuming and somewhat subjective due to heterogeneity in protein expression and interaction. By coupling flow cytometric analysis with BiFC methodology, the fluorescent BiFC protein-protein interaction signal can be accurately measured for a large quantity of cells in a short time. Here, we demonstrate an application of this methodology to map regions in PDE4D3 that are required for the interaction with AKAP-Lbc. This high throughput methodology can be applied to screening factors that regulate protein-protein interaction.

Flow cytometric analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation provides a high throughput quantitative method to study protein-protein interaction. This methodology can be applied to mapping protein binding sites and for screening factors that regulate protein-protein interaction.

ניתוח תזרים cytometric של שלמת הקרינה bimolecular: שיטה כמותית תפוקה גבוהה לחקר אינטראקציה בין חלבונים

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

הקרנת תפוקה גבוהה עבור כימית מאפננים של גני Post-תעתיק מוסדר

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic chromosome, synIII1, and one synthetic chromosome arm, synIXR2, have been constructed and their in vivo function validated in the absence of the corresponding wild type chromosomes. An important design feature of Sc2.0 chromosomes is the introduction of PCRTags, which are short, re-coded sequences within open reading frames (ORFs) that enable differentiation of synthetic chromosomes from their wild type counterparts. PCRTag primers anneal selectively to either synthetic or wild type chromosomes and the presence/absence of each type of DNA can be tested using a simple PCR assay. The standard readout of the PCRTag assay is to assess presence/absence of amplicons by agarose gel electrophoresis. However, with an average PCRTag amplicon density of one per 1.5 kb and a genome size of ~12 Mb, the completed Sc2.0 genome will encode roughly 8,000 PCRTags. To improve throughput, we have developed a real time PCR-based detection assay for PCRTag genotyping that we call qPCRTag analysis. The workflow specifies 500 nl reactions in a 1,536 multiwell plate, allowing us to test up to 768 PCRTags with both synthetic and wild type primer pairs in a single experiment.

Designer chromosomes of the Synthetic Yeast Genome project, Sc2.0, can be distinguished from their native counterparts using a PCR-based genotyping assay called PCRTagging, which has a presence/absence endpoint. Here we describe a high-throughput real time PCR detection method for PCRTag genotyping.

qPCRTag ניתוח - תפוקה גבוהה, בזמן אמת PCR Assay עבור Genotyping Sc2.0

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...

High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

Zebrafish are an important model organism with inherent advantages that have the potential to make zebrafish a widely applied model for the study of energy homeostasis and obesity. The small size of zebrafish allows for assays on embryos to be conducted in a 96- or 384-well plate format, Morpholino and CRISPR based technologies promote ease of genetic manipulation, and drug treatment by bath application is viable. Moreover, zebrafish are ideal for forward genetic screens allowing for novel gene discovery. Given the relative novelty of zebrafish as a model for obesity, it is necessary to develop tools that fully exploit these benefits. Herein, we describe a method to measure energy expenditure in thousands of embryonic zebrafish simultaneously. We have developed a whole animal microplate platform in which we use 96-well plates to isolate individual fish and we assess cumulative NADH2 production using the commercially available cell culture viability reagent alamarBlue. In poikilotherms the relationship between NADH2 production and energy expenditure is tightly linked. This energy expenditure assay creates the potential to rapidly screen pharmacological or genetic manipulations that directly alter energy expenditure or alter the response to an applied drug (e.g. insulin sensitizers).

High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

Zebrafish are an important model organism for the study of energy homeostasis. By utilizing a NADH2 sensitive redox indicator, alamar Blue, we have developed an assay that measures the metabolic rate of zebrafish larvae in a 96 well plate format and can be applied to drug or gene discovery.

תפוקה גבוהה<em&gt; Danio rerio</em&gt; Assay הוצאה אנרגיה

Zebrafish are an important model organism with inherent advantages that have the potential to make zebrafish a widely applied model for the study of ...