이 작품은 NIH 보조금 R01-GM-098977 및 CBK와 KEG에 R21-AI-098122에 의해 지원되었다. RSS는 공학 이어 학교에서 이어 혁신 프로그램 원정대에 의해 루스 재단 원정대에 의해 부분적으로 부분적으로 지원되었다.

네 개의 주요 활동은 펩티드-MHC II 결합 분석을 포함한다 : 1 바인딩 : 시험 펩티드 용액 상 용해 MHC II 단백질의 결합을 표지 제어 펩티드와 경쟁. 바인딩은 테스트 펩티드 농도의 넓은 범위에 걸쳐 측정된다. 2 - 화면 캡쳐 : 바인딩 반응이 평형에 도달 한 후, 펩타이드 MHC II 단지가 캡처 및 고정 된 항체와 형태에 의존하는 인식하여 결합되지 않은 펩타이드와 단백질에서 분리된다. 3 탐지 : 캡처 제어 펩타이드 정량적 시간 분해 형광을 이용하여 검출한다. 4 - 분석 : 분광 데이터를 처리 플롯 및 테스트 펩타이드와 MHC II 단백질의 농도 의존적​​ 결합 특성을 확인하기 위해 분석된다. 가능한 경우 다음 절차의 여러 단계에서, 액체 처리 로봇의 사용을 권장합니다. 특히 384도 형식으로 자동 분배 및 액체의 희석 더에 사용자 오류, 결과를 최소화일관된 잘 행 웰 볼륨 및 수동 96 - 웰 분석 (데이터 미도시)에 비해 IC 50 값 좁아 95 % 신뢰 구간을 산출한다. 액체 처리 로봇을 사용할 수없는 경우, &quot;(액체 처리 로봇)&quot;주석이 단계를 수동으로 수행 할 수 있습니다. 가능하면 마찬가지로, 384 - 웰 형식과 호환되는 자동화 된 와셔를 사용하는 것이 좋습니다. 이것은 효과적으로 플레이트 세척 공정을 표준화. 접시 세척기를 사용할 수없는 경우, &quot;(와셔)&quot;주석이 단계를 수동으로 수행 할 수 있습니다. 1. 코트 ELISA 플레이트 (1 일) <ol><li> 10 ㎍ / ㎖의의 작업 농도로 붕산 버퍼에있는 L243 항체 주식 (0.5 ㎎ / ㎖)을 희석. <ol><li> 코트에 하나의 384 - 웰 플레이트, 붕산염 완충액 9.8 ml로 주식 항체의 200 μl를 추가합니다. (대체 스케일링에 대한 보충 스프레드 시트 계산기를 참조하십시오.) </li></ol></li><li> 384 (W)의 각 웰에 L243 항체 용액 25 μl를 추가합니다엘 흰색 ELISA 플레이트 높은 결합. (액체 처리 로봇) </li><li> 폴리 에스테르 필름과 플레이트를 밀봉하고 4 ℃에서 하룻밤 배양 참고 : 각 384 잘 ELISA 판은 15 테스트 한 MHC II 대립 유전자 8 개의 희석에 펩티드뿐만 아니라 긍정적이고 부정적인 컨트롤까지 수용 할 수 있습니다. 이것은 궁극적 중으로 측정치를 산출 할 것이다. </li></ol> 2. 테스트 펩타이드 희석 (1 일)을 확인 <ol><li> DMSO의 각 테스트 펩티드의 10 mM의 스톡부터는 384 - 웰 폴리 프로필렌 플레이트 (표 1)를 사용 구연산염 포스페이트 완충액에서 다음 일련의 희석을 만든다. (액체 처리 로봇) 참고 : 전체 384 웰 폴리 프로필렌 플레이트는 별도의 세 가지 ELISA 플레이트가 필요합니다. 폴리 프로필렌 플레이트의 3 분의 1은 하나의 ELISA 플레이트 (그림 1)이 필요합니다. </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody align="center"><tr><td rowspan="2"> 희석 수 </td><td> 볼륨 t오 전 희석 / 재고 걸릴 </td><td> 추가 볼륨 구연산 버퍼 </td><td> 진한. 희석의 </td><td> 진한. 바인딩 반응 </td><td> 진한. 중화 ELISA에 </td></tr><tr><td> (μL) </td><td> (μL) </td><td> (μM) </td><td> (μM) </td><td> (μM) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 0.7 </td><td> 35.1 </td><td> 195.531 </td><td> 97.765 </td><td> 48.883 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 14.3 </td><td> 14.3 </td><td> 97.765 </td><td> 48.883 </td><td> 24.441 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 7.1 </td><td> 28.7 </td><td> 19.389 </td><td> 9.695 </td><td> 4.847 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 14.3 </td><td> 14.3 </td><td> 9.695 </td><td> 4.847 </td><td> 2.424 </td></tr><tr><td> 5 </td><td> 7.1 </td><td> 28.7 </td><td> 1.923 </td><td> 0.961 </td><td> 0.481 </td></tr><tr><td> 6 </td><td> 14.3 </td><td> 14.3 </td><td> 0.961 </td><td> 0.481 </td><td> 0.24 </td></tr><tr><td> 7 </td><td> 7.1 </td><td> 28.7 </td><td> 0.191 </td><td> 0.095 </td><td> 0.048 </td></tr><tr><td> 8 </td><td> 14.3 </td><td> 14.3 </td><td> 0.095 </td><td> 0.048 </td><td> 0.024 </td></tr><tr><td colspan="6"> 제거하고 희석 수 8 펩타이드 솔루션의 7.1 μl를 폐기합니다. </td></tr></tbody></table> 테스트 펩티드 희석 시리즈의 표 1. 제조. <img alt="그림 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51308/51308fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51308/51308fig1.jpg" /> 그림 1. 분석을 바인딩 펩타이드의지도를 접시. 폴리 프로필렌 384 - 웰 플레이트에서 펩타이드 희석 (A)지도. 각각의 폴리 프로필렌 판은 노래에 대한 경쟁 결합 반응에 15 펩티드의 세 그룹을 수용 할 수<html> 르 MHC II 대립 유전자. 결합 반응이 평형에 접근 한 후 (B), 각 펩티드 기는 안티 MHC II 항체로 미리 코팅 된 별도의 384 - 웰 ELISA 플레이트에, 중으로 전사된다. 3. MHC II 마스터 믹스 (1 일)를 준비 <ol><li> 반응 완충액 만들기 <ol><li> 구연산 인산 버퍼의 3,920 μL에 1 ㎜ Pefa 공산권의 80 μL 및 옥틸-β-D-glucopyranaside 60 밀리그램을 추가합니다. (대체 스케일링에 대한 보충 스프레드 시트 계산기를 참조하십시오.) </li></ol></li><li> 15 ML 원뿔 튜브 (표 2)를 사용하여 반응 버퍼에서 101 nm의 선택 MHC II의 주식 솔루션을 희석. 참고 : MHC II 농도는 궁극적으로 중화 ELISA 분석에서 결합 반응, 25 nm의 50 nm의 수 있습니다. MHC II의 주식 농도는 제조 로트 번호에 따라 달라집니다. (보충 스프레드 시트 계산기를 참조하십시오.) </li></ol>&quot;&gt; <tbody><tr><td> MHC II 대립 유전자 DRB1 *이 : </td><td> 1501 </td></tr><tr><td> MHC II 스톡 농도 (㎎ / ㎖) </td><td> 1.3 </td></tr><tr><td> MHC II 스톡 농도 (MM) </td><td> (20) </td></tr><tr><td> 권. MHC II 재고 추가하는 (ML) </td><td> 14.65 </td></tr><tr><td> 권. 반응 버퍼에 추가하는 (ML) : </td><td> 2885.35 </td></tr><tr><td> MHC II 마스터 믹스 농도 (NM) </td><td> 101 </td></tr></tbody></table> MHC II의 마스터 믹스의 표 2. 준비. 4. 부정과 긍정적 인 컨트롤 (1 일)를 준비 <ol><li> 2.1 단계에서 384 웰 폴리 프로필렌 플레이트 (그림 1A)의 &quot;대조군&quot;잘에 구연산 인산 버퍼의 21.5 μl를 추가합니다. </li><li> 384 - 웰 폴리 프로필렌 플레이트의 &quot;긍정적 인 제어&quot;잘에 구연산 인산 버퍼의 21.5 μl를 추가합니다. 참고 : &quot;포지를TIVE 컨트롤 &quot;아래 섹션 5에 완료됩니다. </li><li> 1.5 ㎖의 에펜 도르프 튜브에 단계 3.2 피펫에서 MHC II 마스터 믹스의 49.5 μl를 제거합니다. </li><li> 4.3 단계에서 MHC II 마스터 믹스의 49.5 μL에 구연산 버퍼의 0.5 μl를 추가합니다. </li><li> 384 - 웰 폴리 프로필렌 플레이트의 &quot;대조군&quot;잘 (그림 1A)에 단계 4.4에서 MHC II 마스터 믹스를 조정 농도의 21.5 μl를 추가합니다. 참고 :이 샘플은 MHC II 단백질, NO 제어 펩티드, 및 NO 테스트 펩타이드를 포함하는 제로 신호 음의 컨트롤을 나타냅니다. </li></ol> 5. MHC II 마스터 믹스에 적절한 제어 펩타이드 (1 일)를 추가 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> MHC II 대립 유전자 DRB1 * </td><td> 바이오틴 제어 펩타이드 </td><td> (잔류) </td><td> 순서 </td></tr><tr><td> 0101 </td><td> 독감 HA-B </td><td> (306-318) </td><td> 비오틴 (AHX) (AHX) PRYVKQNTLKLAT - 아미드 </td></tr><tr><td> 0301 </td><td> 미오글로빈 </td><td> (137-148) </td><td> 비오틴 (AHX) - (AHX) LFRKDIAAKYKE-OH </td></tr><tr><td> 0401 </td><td> YAR-B </td><td> (1-14) </td><td> 비오틴 (AHX) (AHX) YARFQSQTTLKQKT-OH </td></tr><tr><td> 0701 </td><td> TetTox-B </td><td> (830-843) </td><td> 비오틴 (AHX) (AHX) QYIKANSKFIGITE-OH </td></tr><tr><td> 1101 </td><td> 독감 HA-B </td><td> (306-318) </td><td> 비오틴 (AHX) (AHX) PRYVKQNTLKLAT - 아미드 </td></tr><tr><td> 1501 </td><td> MBP-B </td><td> (84-102) </td><td> 비오틴 (AHX) (AHX) NPVVHFFKNIVTPRTPPPS-OH </td></tr></tbody></table> * 우리는 경제를 위해 10 ㎎의 규모를 주문하는 것이 좋습니다. 표 3. 다양한 MHC II 대립 유전자에 대한 컨트롤 펩티드. * <ol><li> 20 μM에 희석 주식을 산출하는 신선한 DMSO에 (DMSO 400 μM에 저장) 제어 펩타이드 1:20 희석. <ol><li> 25 ㎕를 400 μM 제어 펩타이드에 추가475 μL의 DMSO. 주 :이 과량이지만 점성 DMSO 용액의 정확한 핸들링을 허용한다. </li></ol></li><li> 또한 단계 3.2에서 MHC II 마스터 믹스로 단계 5.1 (20 ㎜) 1:100에서 제어 펩타이드를 희석. <ol><li> MHC II 마스터 믹스의 나머지 2,850.5 μL에 단계 5.2에 희석 제어 펩타이드의 28.8 μl를 추가합니다. </li></ol></li><li> 384 - 웰 폴리 프로필렌 플레이트 (4.2 단계) (그림 1A)의 양의 조절도에 제어 펩타이드 (단계 5.2)와 MHC II 마스터 믹스의 21.5 μl를 추가합니다. 주 :이 표본은 MHC II 단백질, 조절 펩티드, 및 NO 테스트 펩티드를 함유하는 높은 신호 양성 대조군을 나타낸다. </li></ol> 6. 바인딩 반응 (1 일)을 확인 <ol><li> 바인딩 반응을 생성하기 위해 1:1 비율로 시험 펩타이드 희석 (2.1 단계)에 각각 제어 펩타이드 (단계 5.2)를 포함하는 MHC II 마스터 믹스를 추가합니다. <ol><li> 콘을 포함하는 MHC II 마스터 믹스의 21.5 μl를 추가2.1 단계에서 각각의 테스트 펩타이드 희석의 21.5 μL로 단계 5.2에서 TROL 펩타이드. (액체 처리 로봇) </li></ol></li><li> 폴리 에스테르 필름과 바인딩 반응을 밀봉하고 흔들림없이 37 ° C에서 비-CO 2 제어 배양기에서 12 ~ 24 시간을 배양한다. </li></ol> 7. 중화 바인딩 반응 (2 일)을 전송 <ol><li> 37 ° C 배양기에서 바인딩 반응 (단계 6.2)를 포함 384 - 웰 폴리 프로필렌 플레이트를 제거합니다. </li><li> 중화 버퍼와 바인딩 반응 1:1 희석. (액체 처리 로봇) <ol><li> 물론 각 바인딩 반응에 중화 버퍼의 43 μl를 추가합니다. </li></ol></li><li> 4 ° C에서 ELISA 플레이트 (단계 1.3)를 제거하고 PBS-0.05 % 트윈 20 60 ㎖ / 잘으로 배를 세척한다. (와셔) </li><li> 이전 단계 7.3에서 항체 코팅 된 384 웰 ELISA 플레이트의 세중의 우물에 단계 7.2에서 각 중화 바인딩 반응 25 μL. (그림 1 </강한&gt;) (액체 처리 로봇) </li><li> 밤새 2.5 시간 동안 37 ° C의 배양기 또는 4 ° C 냉장고에있는 폴리 에스테르 필름 및 장소 ELISA 플레이트를 커버. </li></ol> 8. ELISA 개발 (2 일 또는 3) <ol><li> 단계 7.5에서 ELISA 플레이트를 제거, 60 μL / 잘 PBS-0.05 % 트윈로 3 회 세척한다. (와셔) </li><li> DELFIA 분석 버퍼에 스트렙 타비 딘 - 유로퓸 원액 (0.1 ㎎ / ㎖ 스트렙 타비 딘, 7 Eu를 3 + / 스트렙 타비 딘) 1,000 배 희석. <ol><li> 하나의 384 - 웰 플레이트를 들어, 10 ㎖ 분석 버퍼에 10 ㎕의 스트렙 타비 딘 - 유로퓸을 희석. </li></ol></li><li> 단계 8.1에서 384도 ELISA 플레이트의 각 웰에 희석 스트렙 타비 딘 - 유로퓸의 25 μl를 추가합니다. (액체 처리 로봇) </li><li> 실온에서 1 시간 동안 어둠 속에서, 폴리 에스테르 필름 및 장소 플레이트 커버. 참고 : 1 시간 배양 동안 냉장고에서 향상 솔루션을 제거하고 RO의 어둠 속에서 10 ㎖ / 판 따로톰 온도. </li><li> 1 시간 배양 한 후, 60 μL / 잘 PBS-0.05 % 트윈으로 단계 8.3 배에서 384도 ELISA 플레이트를 세척한다. (와셔) </li><li> 단계 8.5에서 384도 ELISA 플레이트의 각 웰에 향상 솔루션의 25 μl를 추가합니다. (액체 처리 로봇) </li><li> 폴리 에스테르 필름 : 384 - 웰 ELISA 플레이트를 커버 플레이트는 15 분 동안 실온에서 어두운 곳에서 앉을 수있다. </li><li> (200), 정지이자 :. 1,000 예 (340), 엠 15 분 배양 한 다음, 한 번 예를 들어, 유로퓸 설정으로 해결 형광 플레이트 리더 (시작이자를 사용하여 단계 8.7에서 384도 ELISA 플레이트의 형광을 읽고 . 615, 차단 : 없음, PMT : 자동 / 잘 읽습니다 : 50). </li></ol> 9. 데이터 분석 <ol><li> 나란히 열에서 3 복제 값 (, Y = 형광 측정 X = 테스트 펩타이드 농도)와 XY 형식의 그래프에 데이터를 입력합니다. </li><li> 모든 데이터의 X 값을 변환 로그 : X = 로그 (X) </li><li> 로그 TRA를 장착IC 50 값을 추출 할 수있는 하나의 현장 경쟁력있는 결합 모델과 데이터를 nsformed. </li><li> 음성 대조군의 평균 값에 하한값을 제한. </li><li> 세계적으로 최고 값에 맞게 글로벌 맞는 매개 변수 아래 또는 양성 대조군 같다는 것을 확실히한다. </li></ol>

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E., Bailey-Kellogg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-guided+deimmunization+of+therapeutic+proteins.">Structure-guided deimmunization of therapeutic proteins.</a> J. Comput. Biol. 20, 152-165 (2013).</li><li>Parker, A. S., Griswold, K. E., Bailey-Kellogg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+therapeutic+proteins+to+delete+T-cell+epitopes+while+maintaining+beneficial+residue+interactions.">Optimization of therapeutic proteins to delete T-cell epitopes while maintaining beneficial residue interactions.</a> J. Bioinform. Comput. Biol. 9, 207-229 (2011).</li><li>Parker, A. S., Zheng, W., Griswold, K. E., Bailey-Kellogg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+algorithms+for+functional+deimmunization+of+therapeutic+proteins.">Optimization algorithms for functional deimmunization of therapeutic proteins.</a> BMC Bioinformatics. 11, 180 (2010).</li><li>De Groot, A. S., Martin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+risk,+improving+outcomes:+Bioengineering+less+immunogenic+protein+therapeutics.">Reducing risk, improving outcomes: Bioengineering less immunogenic protein therapeutics.</a> Clin. Immunol. 131, 189-201 (2009).</li><li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+assessment+of+MHC+class+II+peptide+binding+predictions+and+evaluation+of+a+consensus+approach.">A systematic assessment of MHC class II peptide binding predictions and evaluation of a consensus approach.</a> PLoS Comput. Biol. 4, e1000048 (2008).</li><li>Sette, A., Rappuoli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+vaccinology:+developing+vaccines+in+the+era+of+genomics.">Reverse vaccinology: developing vaccines in the era of genomics.</a> Immunity. 33, 530-541 (2010).</li><li>Moise, L., Cousens, L., Fueyo, J., De Groot, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+the+power+of+genomics+and+immunoinformatics+to+produce+improved+vaccines.">Harnessing the power of genomics and immunoinformatics to produce improved vaccines.</a> Expert Opin. Drug Discov. 6, 9-15 (2011).</li><li>Sturniolo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+tissue-specific+and+promiscuous+HLA+ligand+databases+using+DNA+microarrays+and+virtual+HLA+class+II+matrices.">Generation of tissue-specific and promiscuous HLA ligand databases using DNA microarrays and virtual HLA class II matrices.</a> Nat. Biotechnol. 17, 555-561 (1999).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biologic+drugs+set+to+top+2012+sales.">Biologic drugs set to top 2012 sales.</a> Nat. Med. 18, 636 (2012).</li><li>Seib, K. L., Zhao, X., Rappuoli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+vaccines+in+the+era+of+genomics:+a+decade+of+reverse+vaccinology.">Developing vaccines in the era of genomics: a decade of reverse vaccinology.</a> Clin. Microbiol. Infect. 18, 109-116 (2012).</li><li>Jiang, W., Boder, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+engineering+and+analysis+of+peptide+binding+to+class+II+MHC.">High-throughput engineering and analysis of peptide binding to class II MHC.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 13258-13263 (2010).</li><li>Justesen, S., Harndahl, M., Lamberth, K., Nielsen, L. -. L. B., Buus, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+recombinant+MHC+class+II+molecules+and+high-throughput+peptide-binding+assays.">Functional recombinant MHC class II molecules and high-throughput peptide-binding assays.</a> Immun. 5, 1-20 (2009).</li></ol>

레너드 모이는에 의해 고용 및 EpiVax, 주식, 프로비던스,로드 아일랜드에있는 개인 소유의 생명 공학 회사의 스톡 옵션을 보유하고 있습니다. 이 연구 보고서에 포함 된 작품은 회사의 상업적인 목표와 연관 될 수있는 편견이다.

Biotherapeutics에 2012 년 32에서 상위 5 개 판매 약의 네를 대표하는 현대 의학의 초석로 자신을 설립했다. 바이오 의약 부문은 몇 년 6 지속 성장을 보여 왔으며, 새로운 에이전트의 지속적인 발전뿐만 아니라 바이오시 밀러의 등장은 바이오 의약품 파이프 라인을 확장했다. , 미래를 찾고 평가하고 단백질 치료제의 면역 원성을 완화하는 것은 초기 단계의 biotherapeutic 개발의 중요한 부...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/51308/a-high-throughput-mhc-ii-binding-assay-for-quantitative-analysis">A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes</a>.&#160; There were typos in the Protocol section and Table 2.
Step 3.1.1 in the Protocol was updated from:
Add 80 &#181;l of 1 mM Pefa Bloc and 60 mg of octyl-&#946;-D-glucopyranaside to 3,920 &#181;l of Citrate Phosphate Buffer. (See supplemental spreadsheet calculator for alternative scaling).
to:
Add 80 &#181;l of 1 mM Pefa Bloc and 60 &#181;g of octyl-&#946;-D-glucopyranaside to 3,920 &#181;l of Citrate Phosphate Buffer. (See supplemental spreadsheet calculator for alternative scaling).
Step 5.2&#160;in the Protocol was updated from:
Further dilute the Control Peptide from step 5.1 (20 mM) 1:100 into the MHC II Master Mix from step 3.2.
to:
Further dilute the Control Peptide from step 5.1 (20 &#181;M) 1:100 into the MHC II Master Mix from step 3.2.
Table 2 was updated from:
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="376">
	<tbody>
		<tr>
			<td>MHC II Allele DRB1*:</td>
			<td>1501</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MHC II Stock Concentration (mg/ml)</td>
			<td>1.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MHC II Stock Concentration (mM)</td>
			<td>20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vol. MHC II Stock to Add (ml)</td>
			<td>14.65</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vol. Reaction Buffer to Add (ml):</td>
			<td>2885.35</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MHC II Master Mix Concentration (nM)</td>
			<td>101</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
to:
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="376">
	<tbody>
		<tr>
			<td>MHC II Allele DRB1*:</td>
			<td>1501</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MHC II Stock Concentration (mg/ml)</td>
			<td>1.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MHC II Stock Concentration (&#956;M)</td>
			<td>20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vol. MHC II Stock to Add (&#956;l)</td>
			<td>14.65</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vol. Reaction Buffer to Add (&#956;l):</td>
			<td>2885.35</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MHC II Master Mix Concentration (nM)</td>
			<td>101</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/51308/a-high-throughput-mhc-ii-binding-assay-for-quantitative-analysis">A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes</a>.&#160; There were typos in the Protocol section and Table 2.

Erratum: A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes

단백질 치료제 6의 가장 빠르게 성장하고있는 클래스이며, biotherapeutic 파이프 라인의 급속한 확장은 단백질 의약품의 개발 및 사용과 관련된 문제에 대한 증가하는 관심을 집중하고있다. 하나의 고유 한 고려 사항은 건강 기능 면역 시스템의 모든 세포 단백질이 항원 제시 세포 (APC를)에 의해 샘플링되고 있다는 사실에서 유래한다. 일단 장갑차에 의해 내면화, 단백질은 작은 펩타이드 조각으로 절단하고, 추정 면역 원성 세그먼트 클래스 II 주요 조직 적합성 복합체 단백질 (MHC II)의 홈에로드됩니다. 펩티드-MHC II 복합체 후 APC 표면 상에 표시하고, 진정한 면역 원성 펩티드는, 동족 CD4 T 세포 표면 수용체 7과의 삼원 MHC II-펩티드-T 세포 수용체 복합체를 형성하고, T 세포 에피토프를 지칭한다. 이 중요한 분자 인식 이벤트는 T 세포 활성화에 결과 복잡한 신호 폭포, 사이토 카인의 방출을 시작합니다의, CD4 T 세포 매개 성 B 세포의 성숙, 그리고 바인딩과 잘못된 외래 단백질을 취소의 IgG 항체를 순환 궁극적으로 생산. 따라서, 면역 원성 단백질을 구성하는 T 세포의 항원을 확인하고 MHC II 복합체 형성에 대한 책임이 키 잔류 돌연변이에 의해 deimmunized 될 수 있습니다. 이는 T 세포 에피토프가 많고 광범위 면역 원성 단백질에 걸쳐 분산 될 수 있다는 것은 주목 부담 및 에피토프 삭제 돌연변이의 대부분은 단백질 기능 또는 안정성의 부주의 손실이 발생할 가능성이있다. 따라서 엔지니어링 biotherapies가 복잡하고 기술적으로 도전적인 목표 일 수있다 deimmunized하지만, 성공적인 T 세포 에피토프 삭제 프로젝트 3,5,8-12의 몇 가지 예는 존재한다. 큰폭 항체 치료제에 한정되는 그라프 기반 &quot;인간화&quot;달리 에피토프 삭제 불문 서열, 구조, 기능을 본질적으로 임의의 단백질 표적에 적용될 수 있고, 또는 homologo의 가용성우리 인간의 골격. 이러한 접근 방식을 구현하는 첫 번째 단계는 표적 단백질 서열 내에 삽입 키 펩티드 에피토프의 확인이다. 합성 펩티드 및 재조합 인간 MHC II 분자를 사용하여 높은 처리량 생화학 적 분석은 에피토프 식별 및 완화 1,3-5에 빠른 예비 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 이 ELISA 유형 분석은 다른 단백질 / 백신 설계와 개발 도구의 강력한 보완 할 수 있습니다. 예를 들어, 에피토프 매핑 한 잘 설립 된 실험 방법은 시간, 노동에 의존하고 집중적 인 생체 세포 증식 시험 법 (15) 자원. 요약하면, 표적 단백질의 기본 시퀀스가​​ 제 겹치는 펩타이드의 패널로 분할되고, 12 잔기 종종 15 머는 인접한 펩티드에 대한 중복. 펩티드 패널은 화학적으로 합성되는 각 펩티드의 면역 원성은 주연 bloo 사용해 여러 면역 분석법 중 하나에서 시험된다인간 공여자로부터 단리 13,14 D 단핵 세포 (PBMC). 결과에 더 큰 신뢰를 제공하기 위해, 펩티드는 일반적으로 50 개 이상의 다른 기증자로부터 PBMC와 복제에 시험한다. deimmunization 궁극적 인 목표입니다 경우, 작업은 변이 된 펩티드의 추가 패널을 생산하고 이후의 기능 분석 (10)의 전체 길이의 단백질로 어떤 deimmunizing 돌연변이를 도입하기 전에 PBMC의 분석에 새로운 펩타이드 패널을 테스트하기 위해 필요에 의해 더욱 악화된다. 이러한 세포의 분석은 인간의 환자에서 면역 원성 가능성을 평가하기위한 황금 표준 남아 있지만, 이러한 철저한 접근 방식의 효율성은 신속하고 높은 처리량 MHC II-펩타이드 결합 분석을 이용하여 추정 면역 원성 항원을 사전 필터링에 의해 개선 될 수 있습니다. 마찬가지로, 생화학 펩티드-MHC II 결합 분석은 라디칼 에피토프 식별 프로세스를 가속화하기 위해 실리 방법의 예측과 조합 될 수있다.T 세포 에피토프 예측을위한 전산 다양한 도구가 존재, 예 ProPred (16)를 포함, MHCPred 17 SVRMHC 18, ARB 19, 20 SMM-정렬, NetMHCIIpan 21뿐만 아니라 EpiVax (22)에 의해 같은 EpiMatrix 같은 독점 도구를 제공합니다. 마찬가지로, 에피토프의 예측은 최근에 다른 생물 정보학 및 deimmunizing 돌연변이가 단백질의 구조와 기능 23-26를 중단시킬 위험을 완화하도록 설계된 통합 단백질 deimmunization 알고리즘을 생성하는 분자 모델링 도구와 결합되었습니다. 여러 가지 에피토프 예측이 합리적으로 정확한 27,28 것으로 입증되었지만, 계산 결과는 변함없이 실험적인 검증을 필요로한다. 빠른, 높은 처리량 및 비용 효과적인 실험 방법은 실리 에피토프 예측에 대한 예비 필터로 가장 적합합니다. 비슷한 맥락에서, 에피토프 예측 역 vaccinolo에 대한 항원의 선택을 구동 할 수있다GY (29, 30). 예를 들어, 생물 정보학의 발전은 빠르게 병원체 프로테옴에서 추출한 전체 단백질이나 펩티드 에피토프의 형태로 백신 후보를 식별하는 전체 게놈 화면을 수득했다. 이 가능하게 기술 보호 백신의 발견과 개발을 재편하는 동안, 그것은 면역 백신 후보의 intractably 큰 목록의 형태로 새로운 도전을 소개합니다. 높은 처리량 펩티드-MHC II 결합 분석은 펩타이드 결합 친화도를 정량화하고 여러 MHC II 대립 유전자 사이에 성행위를 결합하여 항원의 선택을 안내 할 수 있습니다. 단백질 deimmunization와 마찬가지로, 이러한 실험 방법은 궁극적으로 유망한 백신 리드의 계산 예측을 검증해야합니다. 여기에, 384도 형식으로 축소 펩타이드 MHC II 결합 분석을 설명한다. 이 프로토콜은 고도로 병렬화 이전에 96 - 웰 플레이트 형식 1,3-5 설명에 비해 최대 75 %에 의해 시약 비용을 절감 할 수 있습니다. 단일 LIQUI 사용D 로봇을 처리,이 방법은 하나의 연구자가 쉽게 미만 48 시간에서 여덟 농도와 네 MHC II 대립 유전자 유형의 범위 세중 약 구십 테스트 펩티드를 분석 할 수 있습니다. 이 문서는 하나의 MHC II 대립 유전자에 대한 일곱 실험 펩타이드의 분석을위한 하나의 384 - 웰 ELISA 플레이트의 설치를 설명하지만 쉽게 원하는 펩타이드 및 / 또는 MHC의 숫자로 실험을 확장 할 수 있도록 확산 시트 계산기는 보충 자료로 제공됩니다 II 분자.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:587px;">Sodium Tetraborate Decahydrate</td>
			<td style="width:357px;">Sigma</td>
			<td style="width:217px;">221732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Citric Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Dibasic Sodium Phosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Trizma HCl</td>
			<td>OmniPur</td>
			<td>9310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Tween-20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">100% DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Octyl-&#946;-D-Glucopyranaside</td>
			<td>Fischer</td>
			<td>29836-26-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Pefa Bloc SCF</td>
			<td>Roche</td>
			<td>1158591600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Dulbecco&#8217;s 10X Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14200-166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">DELFIA Assay Buffer</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>4002-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">DELFIA Enhancement Buffer</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>4001-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Europium Labelled Streptavidin</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>1244-360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">L243 anti-HLA-DR antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>307602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Biotinylated tracer peptides</td>
			<td>21st Century Biochemicals</td>
			<td>Custom Order</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Test peptides (1-4mg, 85% purity)</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>Custom Order</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Purified HLA-DRB1 monomers (non-biotinylated)</td>
			<td>Benaroya Research Institute*</td>
			<td>Custom Order</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">384-well white EIA/RIA plate</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>460372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Polypropylene 384-well plate</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Film, AxySeal, 80 &#181;m, ELISA Applicator&#160;</td>
			<td>Axygen Asicentific</td>
			<td>PCR-SP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">MilliQ Water</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Epimotion Liquid Handler (or similar)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Select TS Plate Washer (or similar)</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">SpectraMax Gemini Microplate Reader (or similar)</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4" height="98" style="height:99px;width:1161px;">*Recombinant human MHC II molecules can be obtained from the Benaroya Tetramer Core Laboratory. See: https://www.benaroyaresearch.org/our-research/core-resources/tetramer-core-laboratory</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high throughput mhc ii binding assay for quantitative analysis of peptide epitopes

재조합 인간 MHC II 분자와 생화학 적 분석은 신속하고 정량적 인 면역 원성 항원 인식에 대한 통찰력, 삭제, 또는 디자인 1,2를 제공 할 수 있습니다. 여기, 펩타이드 MHC II 결합 분석은 384도 형식으로 조정됩니다. 축소 프로토콜 75 %의 시약 비용을 절감하고 이전에 96 - 웰 프로토콜 1,3-5 기술보다 더 높은 처리량입니다. 특히, 실험 설계는 384도 ELISA 플레이트 당 하나의 MHC II 대립 유전자에 대해 최대 15 펩티드의 강력하고 재현성있는 분석을 허용합니다. 하나의 액체 처리 로봇을 사용하여,이 방법은 하나의 연구자 미만 48 시간에서 여덟 농도와 네 MHC II 대립 유전자 유형의 범위 세중 약 구십 테스트 펩티드를 분석 할 수 있습니다. 단백질 deimmunization 또는 백신의 설계 및 개발 분야에서 일하는 다른 프로토콜이 자신의 작업을 촉진하는데 유용하게 찾을 수 있습니다. 특히, 단계별 지침과 시각적 형식주피터의 다른 사용자가 빠르고 쉽게 자신의 실험실에서이 방법을 확립 할 수 있도록해야한다.

엔테로 박터 클로 아카 P99 베타 - 락타 마제 (BLA) (Genbank에 ID 번호의 X07274.1)의 성숙 펩타이드 서열은 MHC II 대립 유전자 DRB1 * 1501 (표 4)으로 추정 펩타이드 바인더 ProPred (16)를 분석 하였다. ProPred은 필수 P1 앵커 잔류 물 117 nonamer 펩티드를 확인 (즉, M, L, I, V, F, Y, 31 바인딩 MHC II에 필요한 위치 1에서 W). 5 %의 임계 값으로 만보다 큰 득점 2.6 같은지 가능성 바인...

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A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes

재조합 인간 MHC II 분자와 생화학 적 분석은 신속하고 정량적 인 면역 원성 항원 인식에 대한 통찰력, 삭제, 디자인을 제공 할 수 있습니다. 여기에, 384 - 웰 플레이트를 확장 펩타이드 MHC II 결합 분석을 설명한다. 이 비용 효과적인 포맷은 단백질 deimmunization 백신 디자인 및 개발의 분야에서 유용한다.

펩티드 에피토프의 정량 분석​​을위한 높은 처리량 MHC II 결합 분석

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or ...

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Research

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Biology

14.8K 조회수.  Dartmouth College.  재조합 인간 MHC II 분자와 생화학 적 분석은 신속하고 정량적 인 면역 원성 항원 인식에 대한 통찰력, 삭제, 디자인을 제공 할 수 있습니다. 여기에, 384 - 웰 플레이트를 확장 펩타이드 MHC II 결합 분석을 설명한다. 이 비용 효과적인 포맷은 단백질 deimmunization 백신 디자인 및 개발의 분야에서 유용한다. 

비디오: A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes

Visualizing Antigen Specific CD4+ T Cells using MHC Class II Tetramers

Major histocompatibility complex (MHC) class II tetramers allow the direct visualization of antigen specific CD4+ T cells by flow cytometry.  This method relies on the highly specific interaction between peptide loaded MHC and the corresponding T-cell receptor.  While the affinity of a single MHC/peptide molecule is low, cross-linking MHC/peptide complexes with streptavidin increases the avidity of the interaction, enabling their use as staining reagents.  Because of the relatively low frequencies of CD4+ T cells (~1 in 300,000 for a single specificity) this assay utilizes an in vitro amplification step to increase its threshold of detection.  Mononuclear cells are purified from peripheral blood by Ficoll underlay.  CD4+ cells are then separated by negative selection using biotinylated antibody cocktail and anti-biotin labeled magnetic beads.  Using adherent cells from the CD4- cell fraction as antigen presenting cells, CD4+ T cells are expanded in media by adding an antigenic peptide and IL-2.  The expanded cells are stained with the corresponding class II tetramer by incubating at 37 C for one hour and subsequently stained using surface antibodies such as anti-CD4, anti-CD3, and anti-CD25.  After labeling, the cells can be directly analyzed by flow cytometry.  The tetramer positive cells typically form a distinct population among the expanded CD4+ cells.  Tetramer positive cells are usually CD25+ and often CD4 high.  Because the level of background tetramer staining can vary, positive staining results should always be compared to the staining of the same cells with an irrelevant tetramer.  Multiple variations of this basic assay are possible.  Tetramer positive cells may be sorted for further phenotypic analysis, inclusion in ELISPOT or proliferation assays, or other secondary assays.  Several groups have also demonstrated co-staining using tetramers and either anti-cytokine or anti-FoxP3 antibodies.  

This procedure demonstrates the purification and in vitro expansion of antigen specific CD4+ T cells from whole peripheral blood and their visualization using MHC class II tetramers. Tetramers permit the direct visualization of T cells with a single antigen specificity and defined MHC class II restriction.

머릿속 항원 특정 CD4 + MHC 클래스 II Tetramers를 사용하여 T 세포

Major histocompatibility complex (MHC) class II tetramers allow the direct visualization of antigen specific CD4+ T cells by flow cytometry.  This method ...

연구

생물학

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

Neurotoxicity 높은 컨텐츠 분석의 연결 및 Astrocyte 공동 문화 분석

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying potassium (referred to as GIRK) channels, which are important for regulating the excitability of neurons. There are four different mammalian GIRK channel subunits (GIRK1-GIRK4) - we focus on GIRK2 because it forms a homotetramer. Stimulation of different types of G protein-coupled receptors (GPCRs), such as the muscarinic receptor (M2R), leads to activation of GIRK channels. Alcohol also directly activates GIRK channels. We will show how to mutate one amino acid by specifically changing one or more nucleotides in the cDNA for the GIRK channel. This mutated cDNA sequence will be amplified in bacteria, purified, and the presence of the point mutation will be confirmed by DNA sequencing. The cDNAs for the mutated and wild-type GIRK channels will be transfected into human embryonic kidney HEK293T cells cultured in vitro. Lastly, whole-cell patch-clamp electrophysiology will be used to study the macroscopic potassium currents through the ectopically expressed wild-type or mutated GIRK channels. In this experiment, we will examine the effect of a L257W mutation in GIRK2 channels on M2R-dependent and alcohol-dependent activation.

We will demonstrate how to study the effect of a single point mutation on the function of an ion channel.

이온 채널의 돌연변이 유발과 기능 분석 Heterologously 포유 동물 세포에 표현

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

High-throughput Saccharification Assay for Lignocellulosic Materials

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing a biorefinery. These raw materials would constitute a new industrial platform, which is both sustainable and carbon neutral, to replace 
the current dependency on fossil fuel. The recalcitrance to deconstruction observed in lignocellulosic materials is produced by several intrinsic properties 
of plant cell walls. Crystalline cellulose is embedded in matrix polysaccharides such as xylans and arabinoxylans, and the whole structure is encased by the 
phenolic polymer lignin, that is also difficult to digest 1. In order to improve the digestibility of plant materials we need to discover the main bottlenecks 
for the saccharification of cell walls and also screen mutant and breeding populations to evaluate the variability in saccharification 2. These tasks require 
a high throughput approach and here we present an analytical platform that can perform saccharification analysis in a 96-well plate format. This platform has 
been developed to allow the screening of lignocellulose digestibility of large populations from varied plant species. We have scaled down the reaction volumes 
for gentle pretreatment, partial enzymatic hydrolysis and sugar determination, to allow large numbers to be assessed rapidly in an automated system.
This automated platform works with milligram amounts of biomass, performing ball milling under controlled conditions to reduce the plant 
materials to a standardised particle size in a reproducible manner. Once the samples are ground, the automated formatting robot dispenses specified and recorded 
amounts of material into the corresponding wells of 96 deep well plate (Figure 1). Normally, we dispense the same material into 4 wells to have 4 replicates for 
analysis. Once the plates are filled with the plant material in the desired layout, they are manually moved to a liquid handling station (Figure 2). In this 
station the samples are subjected to a mild pretreatment with either dilute acid or alkaline and incubated at temperatures of up to 90&deg;C. The pretreatment solution 
is subsequently removed and the samples are rinsed with buffer to return them to a suitable pH for hydrolysis. The samples are then incubated with an enzyme
mixture for a variable length of time at 50&deg;C. An aliquot is taken from the hydrolyzate and the reducing sugars are automatically determined by the MBTH 
colorimetric method.

A simple, rapid method for determining the saccharification potential of large numbers of plant biomass samples is described. The automated platform for this analysis involves the preparation of the plant biomass for analysis in 96 well plates and the subsequent performance of pretreatment, hydrolysis and quantification of the sugars released.

리그노셀룰로오스성 자료에 대한 높은 처리량 당화 분석

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing ...

A Quantitative Fitness Analysis Workflow

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is an experimental and computational workflow for comparing fitnesses of microbial cultures grown in parallel1,2,3,4. QFA can be applied to focused observations of single cultures but is most useful for genome-wide genetic interaction or drug screens investigating up to thousands of independent cultures. The central experimental method is the inoculation of independent, dilute liquid microbial cultures onto solid agar plates which are incubated and regularly photographed. Photographs from each time-point are analyzed, producing quantitative cell density estimates, which are used to construct growth curves, allowing quantitative fitness measures to be derived. Culture fitnesses can be compared to quantify and rank genetic interaction strengths or drug sensitivities. The effect on culture fitness of any treatments added into substrate agar (e.g. small molecules, antibiotics or nutrients) or applied to plates externally (e.g. UV irradiation, temperature) can be quantified by QFA.
The QFA workflow produces growth rate estimates analogous to those obtained by spectrophotometric measurement of parallel liquid cultures in 96-well or 200-well plate readers. Importantly, QFA has significantly higher throughput compared with such methods. QFA cultures grow on a solid agar surface and are therefore well aerated during growth without the need for stirring or shaking.
QFA throughput is not as high as that of some Synthetic Genetic Array (SGA) screening methods5,6. However, since QFA cultures are heavily diluted before being inoculated onto agar, QFA can capture more complete growth curves, including exponential and saturation phases3. For example, growth curve observations allow culture doubling times to be estimated directly with high precision, as discussed previously1.
Here we present a specific QFA protocol applied to thousands of S. cerevisiae cultures which are automatically handled by robots during inoculation, incubation and imaging. Any of these automated steps can be replaced by an equivalent, manual procedure, with an associated reduction in throughput, and we also present a lower throughput manual protocol. The same QFA software tools can be applied to images captured in either workflow.
We have extensive experience applying QFA to cultures of the budding yeast S. cerevisiae but we expect that QFA will prove equally useful for examining cultures of the fission yeast S. pombe and bacterial cultures.

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is a complementary series of experimental and computational methods for estimating microbial culture fitnesses. QFA estimates the effect of genetic mutations, drugs or other applied treatments on microbe growth. Experiments scaling from focussed analysis of single cultures to thousands of parallel cultures can be designed.

양적 휘트니스 분석 워크플로우

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is an experimental and computational workflow for comparing fitnesses of microbial cultures grown in parallel1,2,3,4. ...

High-throughput Functional Screening using a Homemade Dual-glow Luciferase Assay

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with Parkinson&#39;s disease. 293T cells are transiently transfected with plasmids from an arrayed ORF expression library, together with luciferase reporter plasmids, in a one-gene-per-well microplate format. Firefly luciferase activity is assayed after 48 hr to determine the effects of each library gene upon alpha-synuclein transcription, normalized to expression from an internal control construct (a hCMV promoter directing Renilla luciferase). This protocol is facilitated by a bench-top robot enclosed in a biosafety cabinet, which performs aseptic liquid handling in 96-well format. Our automated transfection protocol is readily adaptable to high-throughput lentiviral library production or other functional screening protocols requiring triple-transfections of large numbers of unique library plasmids in conjunction with a common set of helper plasmids. We also present an inexpensive and validated alternative to commercially-available, dual luciferase reagents which employs PTC124, EDTA, and pyrophosphate to suppress firefly luciferase activity prior to measurement of Renilla luciferase. Using these methods, we screened 7,670 human genes and identified 68 regulators of alpha-synuclein. This protocol is easily modifiable to target other genes of interest.

We present a rapid and inexpensive screening method for identifying transcriptional regulators using high-throughput robotic transfections and a homemade dual-glow luciferase assay. This protocol rapidly generates direct side-by-side functional data for thousands of genes and is easily modifiable to target any gene of interest.

집에서 만든 듀얼 글로우 루시 페라 제 분석 실험을 사용하여 높은 처리량 기능 검사

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with ...

Flow Cytometric Analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation: A High Throughput Quantitative Method to Study Protein-protein Interaction

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC is based on the production of fluorescence using two non-fluorescent fragments of a fluorescent protein (Venus, a Yellow Fluorescent Protein variant, is used here). Non-fluorescent Venus fragments (VN and VC) are fused to two interacting proteins (in this case, AKAP-Lbc and PDE4D3), yielding fluorescence due to VN-AKAP-Lbc-VC-PDE4D3 interaction and the formation of a functional fluorescent protein inside cells.
BiFC provides information on the subcellular localization of protein complexes and the strength of protein interactions based on fluorescence intensity. However, BiFC analysis using microscopy to quantify the strength of protein-protein interaction is time-consuming and somewhat subjective due to heterogeneity in protein expression and interaction. By coupling flow cytometric analysis with BiFC methodology, the fluorescent BiFC protein-protein interaction signal can be accurately measured for a large quantity of cells in a short time. Here, we demonstrate an application of this methodology to map regions in PDE4D3 that are required for the interaction with AKAP-Lbc. This high throughput methodology can be applied to screening factors that regulate protein-protein interaction.

Flow cytometric analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation provides a high throughput quantitative method to study protein-protein interaction. This methodology can be applied to mapping protein binding sites and for screening factors that regulate protein-protein interaction.

이분자 형광 보완의 유세포 분석 : 단백질 - 단백질 상호 작용을 연구하는 높은 처리량 정량 방법

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

후 전사적으로 규제 유전자의 화학 변조기에 대한 높은 처리량 검사

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic chromosome, synIII1, and one synthetic chromosome arm, synIXR2, have been constructed and their in vivo function validated in the absence of the corresponding wild type chromosomes. An important design feature of Sc2.0 chromosomes is the introduction of PCRTags, which are short, re-coded sequences within open reading frames (ORFs) that enable differentiation of synthetic chromosomes from their wild type counterparts. PCRTag primers anneal selectively to either synthetic or wild type chromosomes and the presence/absence of each type of DNA can be tested using a simple PCR assay. The standard readout of the PCRTag assay is to assess presence/absence of amplicons by agarose gel electrophoresis. However, with an average PCRTag amplicon density of one per 1.5 kb and a genome size of ~12 Mb, the completed Sc2.0 genome will encode roughly 8,000 PCRTags. To improve throughput, we have developed a real time PCR-based detection assay for PCRTag genotyping that we call qPCRTag analysis. The workflow specifies 500 nl reactions in a 1,536 multiwell plate, allowing us to test up to 768 PCRTags with both synthetic and wild type primer pairs in a single experiment.

Designer chromosomes of the Synthetic Yeast Genome project, Sc2.0, can be distinguished from their native counterparts using a PCR-based genotyping assay called PCRTagging, which has a presence/absence endpoint. Here we describe a high-throughput real time PCR detection method for PCRTag genotyping.

qPCRTag 분석 - 높은 처리량, Sc2.0 유전형에 대한 실시간 PCR 분석

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...

High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

Zebrafish are an important model organism with inherent advantages that have the potential to make zebrafish a widely applied model for the study of energy homeostasis and obesity. The small size of zebrafish allows for assays on embryos to be conducted in a 96- or 384-well plate format, Morpholino and CRISPR based technologies promote ease of genetic manipulation, and drug treatment by bath application is viable. Moreover, zebrafish are ideal for forward genetic screens allowing for novel gene discovery. Given the relative novelty of zebrafish as a model for obesity, it is necessary to develop tools that fully exploit these benefits. Herein, we describe a method to measure energy expenditure in thousands of embryonic zebrafish simultaneously. We have developed a whole animal microplate platform in which we use 96-well plates to isolate individual fish and we assess cumulative NADH2 production using the commercially available cell culture viability reagent alamarBlue. In poikilotherms the relationship between NADH2 production and energy expenditure is tightly linked. This energy expenditure assay creates the potential to rapidly screen pharmacological or genetic manipulations that directly alter energy expenditure or alter the response to an applied drug (e.g. insulin sensitizers).

High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

Zebrafish are an important model organism for the study of energy homeostasis. By utilizing a NADH2 sensitive redox indicator, alamar Blue, we have developed an assay that measures the metabolic rate of zebrafish larvae in a 96 well plate format and can be applied to drug or gene discovery.

높은 처리량<em&gt; 다니오 레 리오 (rerio)</em&gt; 에너지 지출 분석

Zebrafish are an important model organism with inherent advantages that have the potential to make zebrafish a widely applied model for the study of ...

펩티드 에피토프의 정량 분석​​을위한 높은 처리량 MHC II 결합 분석

펩티드 에피토프의 정량 분석을위한 높은 처리량 MHC II 결합 분석