顕微鏡イメージングは​​、高度な顕微鏡のためのミシガン州立大学センターのサービスを介して行われました。トウモロコシカルスはアイオワ州立大学のトウモロコシ形質転換のセンターから購入した。著者らは、炭水化物分析の彼の技術的な支援のためのMSU植物研究所のジェフリー·R·ウェザーに感謝したいと思います。この研究は、寛大にミシガン州のトウモロコシマーケティングプログラム（CMPM）と植物バイオテクノロジー研究コンソーシアム（CPBR）によって賄われていた。

1。ZmCCR1のダウンレギュレーションに使用dsRNAi構築物の調製<ol><li> dsRNAiノックアウトするZmCCR1遺伝子を構築するために必要な制限酵素部位を含む設計遺伝子特異的プライマー。二つのプライマーセットは、ZmCCR1 cDNAの2フラグメントセグメントを増幅するために設計されました。1271ヌクレオチド748から523塩基対の断片、および1271ヌクレオチド986から285塩基対の断片ZmCCR1 cDNAはアリゾナゲノム研究所（AGI）から提供された。詳細については、 図1に記載されている。 </li><li> ZmCCR1_748F_BglIIプライマー（5&#39;-AGATCTACATCCTCAAGTACCTGGAC-3 &#39;）およびZmCCR1_1271R_NcoI（5&#39;-CCATGGTTTACACAGCAGGGGAAGGT-3&#39;）を用いてZmCCR1 cDNA鋳型からのポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって大断片を増幅する。プライマーZmCCR1_986F_BglII（5&#39;-AGATCTGGAAGCAGCCGTACAAGTTC-3 &#39;）およびZmCCR1_1271R_SacI（5Rを使用してより小さな断片（285塩基対）を増幅17;-GAGCTCTTTACACAGCAGGGGAAGGT-3 &#39;）。 </li><li>個別に製造者の指示に従って、pGEM-T Easyにフラグメントを連結する。 </li><li>個々の形質転換体からミニプレッププラスミドDNAの単離を行うこと、をpGEM-Tを含む各々は、市販のミニプレッププラスミドキットを用いて構築する。 </li><li>両方のダイジェストをBglII及びNcoIの両方とをpGEM-T :: ZmCCR1（523 BP）とImpactVector（IV）-1.1（細胞質発現ベクター）。 </li><li>消化ゲル精製IV-1.1に大型の消化ゲル精製ZmCCR1断片 （523塩基対）を連結する。 </li><li> IV-1.1 :: ZmCCR1（523 bp）の中に小断片を挿入するためにBglII及びSacIで両方とをpGEM-T :: ZmCCR1（285 BP）およびIV-1.1 :: ZmCCR1（523塩基対）のダイジェスト。 </li><li>消化ゲル精製IV-1.1に小さな消化されたゲル精製ZmCCR1断片 （285塩基対）を連結する:: ZmCCR1（523 BP）。 </li><li> 523 bpおよび285 bpのフラグメンテーションの両方のクローンを作成する逆方向反復断片の途中で238 bpのスペーサー（ 図1を参照）で285 bpの逆方向反復配列を有するZmCCR1 RNAi構築物にするのIV-1.1へのTS、。 </li><li>これは、 大腸菌（E.coli）中に構築し、それらを成長させ、トウモロコシ形質転換のための十分なプラスミドDNAを得るために、ミディプレッププラスミドDNAのサイズ分離を行う移す。 </li></ol> 2。遺伝子形質転換トウモロコシ<ol><li>タングステン粒子の調製<ol><li> 1.5mlチューブにタングステンビーズ60mgの（M10）を配置し、2分間ボルテックスすることにより、70％エタノール1mlで洗浄する。 23℃で10分間インキュベートした後、2分間18894×gで遠心分離し、上澄みを捨てる。 </li><li> 100％エタノール1mlで3回洗浄、2分間遠心し、上清を捨てる。 60 mg / mlのに微粒子濃度をもたらすために、無菌の50％グリセロールの1ミリリットルを追加します。 </li></ol></li><li>砲撃のためのDNAの調製<ol><li> PL1.5mlチューブに50％グリセロールで調製したタングステンビーズを50μlの（3 mg）をエース。 IV-1.1の5μL（1μgの）:: ZmCCR1 RNAiのプラスミドDNAを、2.5 M 塩化カルシウムを50μl、および0.1Mスペルミジンの20を添加する。上で簡単に試薬を添加するたび渦。 </li><li>ボルテックス30秒18894×gで、タングステンビーズ-DNA混合簡単に遠心分離。上清を捨て、70％エタノール140μlにペレットを懸濁します。液体を除去し、廃棄します。 100％エタノールを140μLを加える。液体を除去し、廃棄します。 </li><li> 100％エタノールの48を添加する。すぐに使用したり、衝撃に先立って、最大4時間氷上で保存する。 </li></ol></li><li>衝撃<ol><li> 32（osmotiumなど）は、少なくとも4時間前に衝撃をN6OSMメディアを含む100ミリメートルペトリ皿の中央に（アイオワ州立大学のトウモロコシ形質転換のセンターから提供された）3-5センチ、直径のHi-II胚形成トウモロコシカルスを置きます。 </li><li>た準備メーカーの指示33に従ってE PSD-1000/He粒子送達デバイス。 </li><li> 70％エタノールでチャンバ壁を殺菌。無菌保持キャップに無菌650 PSIのラプチャーディスクをロードします。マクロキャリアーの表面にM10-DNA溶液5-6μLを広げ、乾燥簡潔に。ロード·マクロキャリアーおよびマイクロキャリア発射アセンブリに画面を停止する。 </li><li>停止画面（L2 = 6 CM）と近いドアから選択された距離でチャンバ内のマイクロキャリア打ち上げアセンブリおよびトウモロコシカルスを置きます。ワイヤメッシュスクリーンに対して27 psiを真空中で加速する。 </li><li>破裂板が破裂し、ヘリウム圧力計がゼロになるまで、発射ボタンを押してください。発射ボタンを離します。 </li><li> 27℃の暗所での16時間N6OSM（浸透培地）32を含むペトリ皿に砲撃カルスをインキュベート私は約10個にカルスを解除し、ペトリ皿にN6E（カルス誘導培地）32に転送し、5日間インキュベートN 27°Cで暗い。 </li></ol></li><li>選択<ol><li> N6E上の5日後、N6S培地（選択培地）32上にカルスを移す。サブカルチャー選択培地上のすべてのカルスカルス構造を乱すことなく、8〜12週ごとに30日間。 </li><li>約8〜10週間後、白の急成長しているセクターは非増殖し、部分的に壊死した母カルスから成長します。白い急成長している組織を切除し、新鮮な選択培地（N6S）32にそれらを継代培養し、上記のようにインキュベートし続けています。 </li></ol></li><li>再生<ol><li>再生培地32に白と急速に成長し、胚カルスを移し、1週間、上記のようにインキュベートする。 25〜27℃で16時間の昼光と8時間の暗黒の時代に再生胚形成カルスを切り替える</li><li> 3〜4週間後にガラス試験管内発根培地32に再生芽を転送、上記のようにインキュベートし続けています。かなりの時ROOT開発は土壌と4 &quot;ポットに苗木を移植して、水道の蛇口の下に慎重に根を洗い、表示されます。しっとり保つためにビニール袋に鉢をカバーしています。 2日後には小さな穴ビニール袋を作る。 5-6日後にビニール袋を取り外します。他の5〜6日間、上記のようにインキュベートし続けています。 </li></ol></li><li>温室<ol><li>土を18 &quot;ポットに苗を移し、完全な夏の日差しや温室光の中で維持する。最初のシードがT 1世代に属しながら、初期再生された植物は、T 0と呼ばれます。 </li></ol></li></ol> 3。組織学的アッセイ<ol><li><ol><li> 10％中性緩衝ホルマリン5mlにトウモロコシの葉半ば肋骨を修正します。 </li><li>プロセスは、真空は、組織のプロセッサを使用して、組織プロセッサのパラフィンで浸潤する。 </li><li> HistoCentre III埋め込みステーションを使用してパラフィンに組織を埋め込む。 </li><li>エッジから余分なパラフィンを除去一度圏ksとが冷却される。 </li><li>ミクロトームを用いてミクロトームで4-5ミクロンの切片サンプル。 </li><li> 2月24日時間56℃のインキュベーター内で顕微鏡スライドとドライにセクションを配置。のセクションが完全にスライドに接着されていることを確認します。 </li><li> 23℃で5分間のキシレン2変化脱パラフィン切片</li><li>水和物は、2分間の100％エタノールを2回交換し、23℃で2分間、95％エタノールの2つの変更を介してスライドする</li><li> 2分間水道水の流水中でのセクションを洗浄します。 </li><li> 1〜2分間、0.05％トルイジンブルーOで染色し、蒸留H 2 Oを用いて簡単にすすぐ</li><li>光学顕微鏡とイマージョンオイルと可視化した試料にカバーガラスを配置します。 </li></ol></li><li>電子顕微鏡（SEM）を走査<ol><li> 4％グルタルアルデヒド中で断面したトウモロコシの葉の中間リブを修正し、1〜2時間4℃で0.1 Mリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.4）。 </li><li>簡単に説明すると、バッファ内のサンプルをすすぎ、それらが中で脱水10分間、3回ごとの階調と100％エタノールで10〜15分間、エタノール系列（25％、50％、75％、95％）。 </li><li>過渡的な流体として液体二酸化炭素を使用して、臨界点乾燥機中で脱水断面にトウモロコシの葉の中間リブを乾燥させる。 </li><li>高真空炭素タブを使用してアルミニウムのスタブ上で乾燥させた試料をマウントする</li><li>コー​​トトウモロコシの葉の中間リブはアルゴンガスでパージしたスパッターコーター中に金（約20nm厚）とアルミニウムスタブ上に取り付けられている。 </li><li> JEOL JSM-6400V（六ホウ化ランタン型電子エミッタ）、走査型電子顕微鏡でのコーティングサンプルを調べます。 </li><li>デジタル画像は、分析Proソフトウェア（バージョン3.2）を使用して描かれた。 </li></ol></li></ol> 4。クラソンリグニン測定<ol><li> 2ミリメートルスクリーンを通して粉砕機サンプル。 </li><li>各サンプルの水分含有量を決定し、値を記録する水分計を使用する。 </li><li> 〜各サンプルの1.5グラムを秤量し、質量を記録する。 E自動化された溶剤抽出（抽出あたり3サイクル、サイクルあたり〜14分）、またはソックスレー装置（抽出あたり8時間）のいずれかを使用して第二の抽出のためにエタノールが続く最初の抽出のために水を使用したサンプルXTRACT。 （注：このステップでは、見かけのクラソンリグニン含有量を増加させる、酸加水分解中に凝縮し、正確なリグニン測定を妨害することができます抽出物を除去します。） </li><li>彼らはデシケーター中で冷却し、再度比較検討することができ、その後、45℃で一晩抽出した試料を乾燥させる。 </li><li> 30℃にインキュベーターを設定（サンプルあたり三連を推奨）スクリュートップ高圧チューブにそれぞれ乾燥、抽出されたサンプルの0.3グラムを測定し、最も近い0.1 mgの重量を記録します。各圧力チューブに72％のH 2の3ミリリットルのSO 4を追加します。 </li><li>ガラスやテフロン攪拌棒を使用してサンプルを混ぜる。水はインキュベーション後に追加されるまで、チューブ内の撹拌棒のままにしておきます。 </li><li>インキュベーター内でバイアルを置きSE30°Cまでtおよび60分間150 rpmで。 1時間後に4％に酸濃度を希釈し、攪拌棒で混合するの脱イオン水84ミリリットルを追加します。喫水線上のバイアルの側面にサンプルを大量に残してしないように注意してください。 </li><li>しっかりとすべてのバイアルに栓をシールし、メタルラックや大きなビーカーに入れます。 1時間の液体滅菌サイクルを用いて121℃でオートクレーブ。彼らが開く前に室温まで冷却することができます。 </li><li>少なくとも4時間、575℃で炉内でフィルタリングるつぼをあらかじめ灰。るつぼは、少なくとも1時間デシケーター中で冷却してください。 </li><li>真空は、るつぼを確保するためにゴム製のアダプタを使用して、別個の坩堝を介して各チューブから溶液を濾過する。チューブから残りの粒子を洗浄し、脱イオン水を使用しています。 </li><li> 4時間の最小、105℃でリグニン残基を乾燥させます。ドライるつぼと残留物の重量を記録する。 </li><li> 575°Cを使用した場合は、事前に火災ブンゼンバーナーの上のサンプルがそこには煙や灰がなく、その後24時間、炉内に配置するか、プログラム可能な炉を用いた場合、灰をPREおよび次のプログラムを使用していないまで。 </li><li> 105℃の室温から上昇し、12分間保持する。 </li><li> 10℃/分で250℃まで上昇し、30分間保持する。 </li><li> 20℃/分で575℃まで上昇し、少なくとも180分間保持する。 </li><li>炉からるつぼを取り出して、デシケーター中で冷却する。るつぼと灰を重量を量る。 </li><li>以下の式を用いて、酸不溶性残留物を計算</li></ol><img alt="式（1）" fo:content-width="300" src="/files/ftp_upload/51340/51340eq1.jpg" width="450" />あらかじめ抽出されたバイオマスのM PRE =ミサ ポスト抽出バイオマスのM POST =ミサ バイアルに加え、抽出バイオマスのM VIAL =ミサ るつぼとリグニンの残油のM 残基が =ミサUE るつぼと灰のM ASH =ミサ 抽出される前のバイオマスのMC =含水率、総重量ベース 5。炭水化物分析<ol><li>細胞壁炭水化物フォスターらに基づいて分析しています。（2010）プロトコル31を実行します。簡単に説明すると、凍結乾燥した植物材料からアルコール不溶性残留物を準備します。その後、トリフルオロ酢酸で材料を加水分解し、それらに対応するアルジトールアセテートに可溶化された単糖誘導体と一致する。四重極質量分析計に接続されたガスクロマトグラフィー（GC）により、これらの揮発性誘導体を分析する。 </li></ol>

<ol>
	<li>Ralph, J., Grabber, J. H., Hatfield, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lignin-ferulate+cross-links+in+grasses+-+Active+incorporation+of+ferulate+polysaccharide+esters+into+ryegrass+lignins.">Lignin-ferulate cross-links in grasses - Active incorporation of ferulate polysaccharide esters into ryegrass lignins.</a> Carbohydrate research. , 275-178 (1995).</li><li>Park, S. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Expediting cellulosic biofuels agenda: Production of high value-low volume co-products and lignin down-regulation of bioenergy crops [Ph.D. thesis]. , (2011).</li><li>Boerjan, W., Ralph, J., Baucher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lignin+biosynthesis.">Lignin biosynthesis.</a> Annual review of plant biology. 54, 519-546 (2003).</li><li>Gibson, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hierarchical+structure+and+mechanics+of+plant+materials.">The hierarchical structure and mechanics of plant materials.</a> Journal of the Royal Society, Interface / the Royal Society. 9, 2749-2766 (2012).</li><li>Dien, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+alfalfa+conversion+efficiencies+for+sugar+recovery+and+ethanol+production+by+altering+lignin+composition.">Enhancing alfalfa conversion efficiencies for sugar recovery and ethanol production by altering lignin composition.</a> Bioresource technology. , 102-6486 (2011).</li><li>Fu, C. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Downregulation+of+Cinnamyl+Alcohol+Dehydrogenase+(CAD)+Leads+to+Improved+Saccharification+Efficiency+in+Switchgrass.">Downregulation of Cinnamyl Alcohol Dehydrogenase (CAD) Leads to Improved Saccharification Efficiency in Switchgrass.</a> Bioenerg Res. 4, 153-164 (2011).</li><li>Grabber, J. H., Ralph, J., Hatfield, R. D., Quideau, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p-hydroxyphenyl,+guaiacyl,+and+syringyl+lignins+have+similar+inhibitory+effects+on+wall+degradability.">p-hydroxyphenyl, guaiacyl, and syringyl lignins have similar inhibitory effects on wall degradability.</a> Journal of agricultural and food chemistry. 45, 2530-2532 (1997).</li><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lignin+monomer+composition+affects+Arabidopsis+cell-wall+degradability+after+liquid+hot+water+pretreatment.">Lignin monomer composition affects Arabidopsis cell-wall degradability after liquid hot water pretreatment.</a> Biotechnology for biofuels. 3, (2010).</li><li>Mansfield, S. D., Kang, K. Y., Chapple, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designed+for+deconstruction--poplar+trees+altered+in+cell+wall+lignification+improve+the+efficacy+of+bioethanol+production.">Designed for deconstruction--poplar trees altered in cell wall lignification improve the efficacy of bioethanol production.</a> The New phytologist. 194, 91-101 (2012).</li><li>Studer, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lignin+content+in+natural+Populus+variants+affects+sugar+release.">Lignin content in natural Populus variants affects sugar release.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 6300-6305 (2011).</li><li>Chen, F., Dixon, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lignin+modification+improves+fermentable+sugar+yields+for+biofuel+production.">Lignin modification improves fermentable sugar yields for biofuel production.</a> Nature. 25, 759-761 (2007).</li><li>Ziebell, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increase+in+4-coumaryl+alcohol+units+during+lignification+in+alfalfa+(Medicago+sativa)+alters+the+extractability+and+molecular+weight+of+lignin.">Increase in 4-coumaryl alcohol units during lignification in alfalfa (Medicago sativa) alters the extractability and molecular weight of lignin.</a> The Journal of biological chemistry. 285, 38961-38968 (2010).</li><li>Park, S. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+quest+for+alternatives+to+microbial+cellulase+mix+production:+corn+stover-produced+heterologous+multi-cellulases+readily+deconstruct+lignocellulosic+biomass+into+fermentable+sugars.">The quest for alternatives to microbial cellulase mix production: corn stover-produced heterologous multi-cellulases readily deconstruct lignocellulosic biomass into fermentable sugars.</a> Journal of Chemical Technolog., and Biotechnology. 86, 633-641 (2011).</li><li>Mol, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+plant+gene+expression+by+antisense+RNA.">Regulation of plant gene expression by antisense RNA.</a> FEBS letters. 268, 427-430 (1990).</li><li>Adamo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgene-mediated+cosuppression+and+RNA+interference+enhance+germ-line+apoptosis+in+Caenorhabditis+elegans.">Transgene-mediated cosuppression and RNA interference enhance germ-line apoptosis in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 3440-3445 (2012).</li><li>Smith, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+silencing+by+intron-spliced+hairpin+RNAs.">Total silencing by intron-spliced hairpin RNAs.</a> Nature. 407, 319-320 (2000).</li><li>Park, S. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Downregulation+of+Maize+Cinnamoyl-Coenzyme+A+Reductase+via+RNA+Interference+Technology+Causes+Brown+Midrib+and+Improves+Ammonia+Fiber+Expansion-Pretreated+Conversion+into+Fermentable+Sugars+for+Biofuels.">Downregulation of Maize Cinnamoyl-Coenzyme A Reductase via RNA Interference Technology Causes Brown Midrib and Improves Ammonia Fiber Expansion-Pretreated Conversion into Fermentable Sugars for Biofuels.</a> Crop Sci. 52, 2687-2701 (2012).</li><li>Altpeter, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle+bombardment+and+the+genetic+enhancement+of+crops:+myths+and+realities.">Particle bombardment and the genetic enhancement of crops: myths and realities.</a> Mol Breeding. 15, 305-327 (2005).</li><li>Pichon, M., Courbou, I., Beckert, M., Boudet, A. M., Grima-Pettenati, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+characterization+of+two+maize+cDNAs+encoding+cinnamoyl-CoA+reductase+(CCR)+and+differential+expression+of+the+corresponding+genes.">Cloning and characterization of two maize cDNAs encoding cinnamoyl-CoA reductase (CCR) and differential expression of the corresponding genes.</a> Plant molecular biology. 38, 671-676 (1998).</li><li>Mansoor, S., Amin, I., Hussain, M., Zafar, Y., Briddon, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+novel+traits+in+plants+through+RNA+interference.">Engineering novel traits in plants through RNA interference.</a> Trends in plant science. 11, 559-565 (2006).</li><li>Hatfield, R. D., Jung, H. -. J. G., Ralph, J., Buxton, D. R., Weimer, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+the+insoluble+residues+produced+by+the+Klason+lignin+and+acid+detergent+lignin+procedures.">A comparison of the insoluble residues produced by the Klason lignin and acid detergent lignin procedures.</a> J Sci Food Agr. 65, 51-58 (1994).</li><li>Sluiter, J. B., Ruiz, R. O., Scarlata, C. J., Sluiter, A. D., Templeton, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compositional+analysis+of+lignocellulosic+feedstocks.+1.+Review+and+description+of+methods.">Compositional analysis of lignocellulosic feedstocks. 1. Review and description of methods.</a> Journal of agricultural and food chemistry. 58, 9043-9053 (2010).</li><li>Sluiter, A., Hames, B., Ruiz, R., Scarlata, C., Sluiter, J., Templeton, D., Crocker, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+structural+carbohydrates+and+lignin+in+biomass.">Determination of structural carbohydrates and lignin in biomass.</a> Laboratory Analytic Procedure. , (2008).</li><li>Bate, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Relationship+between+Phenylalanine+Ammonia-Lyase+Levels+and+Phenylpropanoid+Accumulation+in+Transgenic+Tobacco+Identifies+a+Rate-Determining+Step+in+Natural+Product+Synthesis.">Quantitative Relationship between Phenylalanine Ammonia-Lyase Levels and Phenylpropanoid Accumulation in Transgenic Tobacco Identifies a Rate-Determining Step in Natural Product Synthesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 7608-7612 (1994).</li><li>Hu, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repression+of+lignin+biosynthesis+promotes+cellulose+accumulation+and+growth+in+transgenic+trees.">Repression of lignin biosynthesis promotes cellulose accumulation and growth in transgenic trees.</a> Nature. 17, 808-812 (1999).</li><li>Lapierre, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signatures+of+cinnamyl+alcohol+dehydrogenase+deficiency+in+poplar+lignins.">Signatures of cinnamyl alcohol dehydrogenase deficiency in poplar lignins.</a> Phytochemistry. 65, 313-321 (2004).</li><li>Updegraff, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semimicro+determination+of+cellulose+in+biological+materials.">Semimicro determination of cellulose in biological materials.</a> Anal Biochem. 32, 420-424 (1969).</li><li>Yemm, E. W., Willis, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+estimation+of+carbohydrates+in+plant+extracts+by+anthrone.">The estimation of carbohydrates in plant extracts by anthrone.</a> The Biochemical journal. 57, 508-514 (1954).</li><li>Filomena, A. P., Cherie, W., Geoffrey, B. F., Antony, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+the+polysaccharide+composition+of+plant+cell+walls.">Determining the polysaccharide composition of plant cell walls.</a> Nature. 7, 1590-1607 (2012).</li><li>Foster, C. E., Martin, T. M., Pauly, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+Compositional+Analysis+of+Plant+Cell+Walls+(Lignocellulosic+biomass)+Part+II:+Carbohydrates.">Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls (Lignocellulosic biomass) Part II: Carbohydrates.</a> J. Vis. Exp. (e1837), (2010).</li><li>Department of Agronomy, Iowa State University. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle+bombardment+of+Hi+II+immature+zygotic+embryos+and+recovery+of+transgenic+maize+plants.">Particle bombardment of Hi II immature zygotic embryos and recovery of transgenic maize plants.</a> , (2005).</li><li>Cano-Delgado, A., Penfield, S., Smith, C., Catley, M., Bevan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+cellulose+synthesis+invokes+lignification+and+defense+responses+in+Arabidopsis+thaliana.">Reduced cellulose synthesis invokes lignification and defense responses in Arabidopsis thaliana.</a> The Plant journal : for cell and molecular biology. 34, 351-362 (2003).</li><li>Boudet, A. M., Kajita, S., Grima-Pettenati, J., Goffner, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lignins+and+lignocellulosics:+a+better+control+of+synthesis+for+new+and+improved+uses.">Lignins and lignocellulosics: a better control of synthesis for new and improved uses.</a> Trends in plant science. 8, 576-581 (2003).</li></ol>

利害の対立が宣言されていません。

細胞壁多糖類を植える微生物セルラーゼのアクセス可能性は、それらがフェノール系ポリマー23と関連している度合いに大きく依存する。糖を発酵するためのリグノセルロース系バイオマスの転化率は負secondadry植物細胞壁に堆積リグニン含量と相関している。この相関は、このような疎水性24、化学異質性と通常の加水分解性体間の連携25の欠如などのリグニンの物理...

リグノセルロース系バイオマスからのバイオ燃料の生産は、米国の1年に現在の豊かさに、農業と林業残渣の持続可能な収穫、食品や動物飼料の生産のために使用される耕地に直接競合しない能力の場合には非常に望ましい。しかし、現在、米国で発生したバイオ燃料の主な情報源であるトウモロコシの穀物とは異なり、リグノセルロース材料が大幅に分解するより複雑で困難である。長鎖炭水化物、セルロースおよびヘミセルロース、リグノセルロース材料の発酵中の糖の主な供給源であり、植物細胞壁の多種類のリグニンを含有し、病原体の攻撃に対する強度、防御を提供するフェニルプロパノイドポリマー、および疎水性に加えて、細胞壁である。植物の成長と生存に必要な一方で、リグニンはまた、セルロースとhemicelluの成功酵素変換に大きな障害を提示可溶性糖に負け。高リグニン含量を有する材料は、一般に、以下（生物学的変換経路を介して）、バイオ燃料および加工特性および製品の品質に負の影響に起因する紙パルプ産業の両方にとって望ましい材料である。したがって、作物構造強度および防衛システムと干渉しないレベルでのリグニンの削減のための植物材料の遺伝子操作は、リグノセルロースバイオ燃料や紙パルプ産業の両方の製造コストの削減のために重要である可能性があります。 メイズ（ トウモロコシ ）において、リグニンは共有結合フェルラ酸及びdiferulateブリッジ2を介して一次細胞壁中のヘミセルロースに架橋されている。リグニン - ヘミセルロース複合体は、二次細胞壁の完全性および強度を付与する複合マトリックスを形成する、水素結合を介してセルロースミクロフィブリルに結合する。植物細胞壁の機械的強度は、主にリチウムのタイプによって決定されるgninサブユニット3-5。これまでの研究では、リグニンサブユニットの割合を変更すると、酵素消化率6月11日には明確な傾向を示さなかった。しかしながら、リグニン含量の減少は、一般的にコンバージョン12,13の改善を示し、エンドセルラーゼ、セロビオヒドロラーゼ及びβ-グルコシダーゼ14を含む加水分解酵素により植物材料の消化率を増加させるための鍵であってもよい。 転写産物の発現レベルを調節する遺伝子操作は、広範囲の作物の形質を改善するために行われている。アンチセンス15および16共抑制技術など高度な技術が、ダウンレギュレーション標的遺伝子の効果的な可能にする。完全な遺伝子ノックアウトはまた、ヘアピン構造17を有するイントロンスプライシングRNAをコードする遺伝子構築物を用いて達成された。さらに、二本鎖RNA干渉（dsRNAi）技術、 すなわち 、強力で効果的な遺伝子発現メディア標的転写産物の分解または翻訳抑制のいずれかによって動作する器は、標的mRNAの18抑制効果の広範囲を誘導する強力な手段を提供する。遺伝子サイレンシング技術はいくつかの限界を示している。これらの技術は、正確に転写レベルを調節していない、それは他の相同な遺伝子上の予想外の消音効果を引き起こす可能性があります。 この方法では、dsRNAiトウモロコシゲノムに構築物を運ぶために粒子ボンバードメントを用いた。今日まで、植物種の広大な配列が正常に粒子ボンバードメント、 アグロバクテリウム媒介形質転換、エレクトロポレーション、およびマイクロインジェクション法を用いて形質転換されている。それが最も効率的であるため、トウモロコシの遺伝的形質転換では、パーティクルボンバードメント法は、すべての他の方法よりも有利である。粒子衝突は、細菌に依存しないので、この方法は、このような遺伝子の遺伝子、種の大きさやなどの生物学的制約のないゲンテン、または植物の遺伝子型。物理的な導入遺伝子送達系は、高い形質転換効率が19で葉緑体への植物のゲノムに、ある場合に導入される高分子量のDNAおよび複数の遺伝子を可能にする。葉の中間リブの血管系におけるリグニンの減少は、サンプルの地形や組成を調べるために有益である走査電子顕微鏡（SEM）を介して可視化することができる。 トウモロコシ植物では、シンナモイル-CoA還元酵素の2（ZmCCR1：X98083とZmCCR2：Y15069）の遺伝子はトウモロコシゲノム20で発見された。シンナモイル-CoA還元酵素は、シンナミルアルデヒドにヒドロキシシン-CoAエステルへの変換を触媒する。我々は、遺伝子がすべての木質化組織で発現されるので、この酵素をダウンレギュレートするZmCCR1遺伝子を選んだ。配列があるように見えたので、ZmCCR1遺伝子の3 &#39;末端の523ヌクレオチドはdsRNAi構築物のために選択したZmCCR2のものと比較してより多様。このように、dsRNAi構築物は、正確に21サイレンオフターゲット回避のみZmCCR1に結合する。 ZmCCR1_RNAi構築物は、緑色組織特異的プロモーター、リブロース1,5 -ビスリ ​​ン酸カルボキシラーゼオキシゲナーゼ（ルビスコ）を含む細胞質発現系ImpactVector1.1タグ（IV 1.1）中に操作した。 dsRNAiがトランスジェニック植物に構築物の効果を研究するために、リグニン含量を定量した。クラソン（酸不溶性）リグニン測定は、リグニン22の一部を可溶化酸性デタージェントリグニン定量法と比較して、より正確であることが知られている。そのため、クラソンリグニンは、トランスジェニックトウモロコシの茎で測定した。この手順では、水溶性の単糖類への23のポリマー炭水化物を変換する二段階の酸加水分解からなる。加水分解されたバイオマスは、酸可溶性および不溶性materiに分画したALSと酸不溶性リグニンはこれまでの研究23,24に従って測定した。理想的には、リグニン分析の結果に干渉する可能性可溶性物質を除去するため、およびリグニン残渣後の加水分解燃焼残留物中に存在する任意の灰分を考慮するために、従来の加水分解工程に水及びエタノールで抽出を含むべきである。これらのステップがなければ、サンプルのリグニン含量を人為的に膨張させることができた。フル方法は、しかし、我々の実験のために我々が原因でテストに利用可能な材料の少量にこれらのステップの両方を実行することができませんでした、ここで提示されている二つの他の細胞壁成分、セルロース及びヘミセルロースはリグニンのダウンレギュレートトランスジェニックトウモロコシ系統において分析した。 CoAリガーゼ（4CL）26、又はシンナミルaは：これは、トランスジェニック植物は、それらのいずれかのフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（PAL）25と 、4 -クマレートにおいてダウンレギュレートされていることが報告されているlcoholデヒドロゲナーゼ（CAD）27、他の細胞壁の構造成分の増加を示す。我々の研究における最初のステップとして、結晶セルロースをアップダグラフ法28を用いて測定した。この方法は、もともとセルロース分解細菌および真菌の多数のセルロースの決定のために考案された。ヘミセルロース、リグニン、およびxylosansを取り除くために簡単に説明すると、粉砕されたトウモロコシストックをアップダグラフ試薬（水：硝酸酢酸）で処理した。結晶セルロースを完全にH 2 SO 4を添加することによりSaeman加水分解を介してグルコースに加水分解した。結晶セルロースは、その後、比色アンスロン法29を用いてアッセイした。ヘミセルロースの内容が変更されたかどうかを確認するために、粉砕された茎から単糖抽出物は、トリフルオロ酢酸を用いて加水分解アルジトールアセテート法を用いて誘導体化した後、ガスクロマトグラフィー（GC）によって分析した30。結晶セル画のための詳細な手順luloseコンテンツやマトリックス多糖組成分析はフォスターらに記載されている。（2010）31。 ここでは、バイオ燃料の発酵性糖にトウモロコシリグノセルロース系バイオマスの加速解体のためのRNAi技術、粒子衝撃の変換、およびリグニン分析によってトウモロコシにおけるダウンレギュレーションリグニンのために使用される手順について説明します。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Media</td>
			<td>Chemical compositions</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N6OSM</td>
			<td>4 g/l N6 salts</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(Osmotic medium)</td>
			<td>1 ml/l N6 vitamin stock</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>2 mg/l 2,4-D</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>100 mg/l myo-inositol</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>0.69 g/L proline</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>30 g/l sucrose</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>100 mg/L casein hydrolysate</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>36.4 g/l sorbitol</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>36.4 g/l mannitol</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>2.5g/l gelrite, pH 5.8</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Add filter sterilized silver nitrate (25uM) after autoclaving</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N6E</td>
			<td>4 g/l N6 salts</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(Callus induction)</td>
			<td>1 ml/l (1000X) N6 vitamin stock</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>2 mg/l 2,4-D</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>100 mg/l myo-inositol</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>2.76 g/l proline</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>30 g/l sucrose</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>100 mg/l casein hydrolysate</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>2.5g/l gelrite, pH 5.8.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Add filter sterilized silver nitrate (25uM) after autoclaving</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N6S media</td>
			<td>4 g/l N6 salts</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(Selection media)</td>
			<td>1 ml/l N6 vitamin stock</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>2 mg/l 2,4-D</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>100 mg/l myo-inositol</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>0.69 g/L proline</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>30 g/L sucrose</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>100 mg/L casein hydrolysate</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>36.4 g/l sorbitol</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>36.4 g/l mannitol</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>2.5g/l gelrite, pH 5.8</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Add filter sterilized silver nitrate (25uM) after autoclaving</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regeneration medium</td>
			<td>4.3 g/L MS salts</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>1 ml/L (1000X) MS vitamin stock</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>100 mg/L myo-inositol</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>60 g/L sucrose</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>3 g/L gelrite, pH 5.8 (100x25 mm petri-plates)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Add filter sterilized bialaphos (3 mg/L) added after autoclaving.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rooting medium</td>
			<td>4.3 g/L MS salts</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>1 ml/L MS vitamin stock</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>100 mg/L myo-inositol</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>30 g/L sucrose</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>3g/L gelrite, pH 5.8 (100x25 mm petri-plates).</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specific materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw-top high pressure tubes</td>
			<td>Pressure tube (#8648-27); Ace Glass, Vineland, NJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Plug (#5845-47); Ace Glass, Vineland, NJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Neutral buffered formalin&#160;</td>
			<td>100ml of formalin</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(1 liter)</td>
			<td>900ml of ddH2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>4.0 g of Sodium dihydrogen phosphate, monohydrate&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>(NaH2PO4.H2O)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad PSD-1000/He Particle Delivery device (Hercules, CA, United States)&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss PASCAL confocal laser scanning microscope (Carl Zeiss, Jena, Germany)&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excelsior ES Tissue Processor (Thermo Scientific, Pittsburgh, PA, United States).</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HistoCentre III Embedding Station (Thermo Scientific, Pittsburgh, PA, United States)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Microtome Model Reichert 2030 (Reichert, Depew, NY, United States)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emscope Sputter Coater model SC 500 (Ashford, Kent, England)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JEOL JSM-6400V Scanning Electron Microscope (JEOL Ltd., Tokyo, Japan)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fitzpatrick JT-6 Homoloid mill; Continental Process Systems, Inc., Westmont, IL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MA35 Moisture Analyzer; Sartorius</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Critical point dryer, Balzers CPD (Leica Microsysstems Inc, Buffalo Grove, IL, United States)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lignin down-regulation of zea mays via dsrnai and klason lignin analysis

代替的なバイオエネルギー資源としてのリグノセルロース系バイオマスの使用を容易にするために、生物学的変換プロセス中、前処理工程は、細胞壁炭水化物のアクセシビリティを増大させる、植物細胞壁の構造を開くために必要とされる。リグニンは、多くの細胞壁中に存在するポリフェノールの種類の材料は、アクセス酵素ために重要な障害となることが知られている。植物の構造的完全性と防御システムと干渉しないレベルまでリグニン含量の減少は、バイオエタノール生産のコストを削減するための貴重なステップとなる可能性があります。本研究では、遺伝的に二本鎖RNA干渉法を介してリグニン生合成関連遺伝子の一つ、シンナモイル-CoAレダクターゼ（ZmCCR1）をダウンレギュレートしている。 ZmCCR1_RNAi構築物は、粒子ボンバードメント法を用いてトウモロコシゲノムに組み込まれた。トランスジェニックトウモロコシ植物ではない野生型対照植物と比較して正常に生育トランスジェニック植物の葉の中間リブに褐色着色の表示を除いて、バイオマス成長又は防御機構でterfering殻、茎。顕微鏡分析は、組織学的アッセイと組み合わせて、リーフ厚壁繊維が間引かれたが、他の主要な血管系部品の構造及びサイズは変化しなかったことを明らかにした。トランスジェニックトウモロコシにおけるリグニン含量が7から8.7パーセント減少した、結晶セルロース、リグニン含量を減少に応じて増加し、ヘミセルロースは不変のままであった。分析は、炭素の流れは、セルロース生合成にリグニン生合成からシフトされているかもしれないことを示すことができる。この記事では、RNAi技術を介してトウモロコシのリグニン含量をダウンレギュレートするために使用される手順の輪郭を描く、および細胞壁の組成は、細胞壁の構造上の修飾の効果を検証するために使用される分析。

我々は、RNAiを介したトウモロコシ植物におけるリグニン含量の減少を示した。粒子衝撃形質転換法は、約30％のtrnasformation効率が得られた。 ZmCCR1の遺伝子サイレンシングは、一貫してT0-T2世代で観察された。リグニン減少トランスジェニックは、リーフ半ばリブ、殻、茎に褐色の表示を除いて野生型トウモロコシ植物と同じように成長した。組織学的なアッセイは、突然変異系統は、?...

Watch this Scientific Journal Video about Lignin Down-regulation of Zea mays via dsRNAi and Klason Lignin Analysis at JoVE.com

Lignin Down-regulation of Zea mays via dsRNAi and Klason Lignin Analysis

二本鎖RNA干渉（dsRNAi）技術は、より低い植物リグニン含量にトウモロコシシンナモイル補酵素Aレダクターゼ（ZmCCR1）遺伝子をダウンレギュレートするために採用される。細胞壁からのリグニンのダウンレギュレーションは、顕微鏡分析によって可視化しクラソン法により定量される。ヘミセルロースおよび結晶セルロース中の組成変化を分析する。

のリグニンダウンレギュレーション<em&gt;トウモロコシ</em&gt; dsRNAiとクラソンリグニン分析によって

To facilitate the use of lignocellulosic biomass as an alternative bioenergy resource, during biological conversion processes, a pretreatment step is ...

lignin-down-regulation-zea-mays-via-dsrnai-klason-lignin

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Lignin Down-regulation of Zea mays via dsRNAi and Klason Lignin Analysis

13.3K ビュー.  University of Arizona. 二本鎖RNA干渉（dsRNAi）技術は、より低い植物リグニン含量にトウモロコシシンナモイル補酵素Aレダクターゼ（ZmCCR1）遺伝子をダウンレギュレートするために採用される。細胞壁からのリグニンのダウンレギュレーションは、顕微鏡分析によって可視化しクラソン法により定量される。ヘミセルロースおよび結晶セルロース中の組成変化を分析する?...

ビデオ: Lignin Down-regulation of Zea mays via dsRNAi and Klason Lignin Analysis

Contrast Ultrasound Targeted Treatment of Gliomas in Mice via Drug-Bearing Nanoparticle Delivery and Microvascular Ablation

We are developing minimally-invasive contrast agent microbubble based therapeutic approaches in which the permeabilization and/or ablation of the microvasculature are controlled by varying ultrasound pulsing parameters.  Specifically, we are testing whether such approaches may be used to treat malignant brain tumors through drug delivery and microvascular ablation.  Preliminary studies have been performed to determine whether targeted drug-bearing nanoparticle delivery can be facilitated by the ultrasound mediated destruction of "composite" delivery agents comprised of 100nm poly(lactide-co-glycolide) (PLAGA) nanoparticles that are adhered to albumin shelled microbubbles. We denote these agents as microbubble-nanoparticle composite agents (MNCAs). When targeted to subcutaneous C6 gliomas with ultrasound, we observed an immediate 4.6-fold increase in nanoparticle delivery in MNCA treated tumors over tumors treated with microbubbles co-administered with nanoparticles and a 8.5 fold increase over non-treated tumors. Furthermore, in many cancer applications, we believe it may be desirable to perform targeted drug delivery in conjunction with ablation of the tumor microcirculation, which will lead to tumor hypoxia and apoptosis. To this end, we have tested the efficacy of non-theramal cavitation-induced microvascular ablation, showing that this approach elicits tumor perfusion reduction, apoptosis, significant growth inhibition, and necrosis. Taken together, these results indicate that our ultrasound-targeted approach has the potential to increase therapeutic efficiency by creating tumor necrosis through microvascular ablation and/or simultaneously enhancing the drug payload in gliomas.

Insonation of microbubbles is a promising strategy for tumor ablation at reduced time-averaged acoustic powers, as well as for the targeted delivery of therapeutics. The purpose of the present study is to develop low duty cycle ultrasound pulsing strategies and nanocarriers to maximize non-thermal microvascular ablation and payload delivery to subcutaneous C6 gliomas.

コントラストの超音波は、薬剤ベアリングナノ粒子デリバリーと微小血管アブレーションを経由してマウスの神経膠腫の治療を対象と

We are developing minimally-invasive contrast agent microbubble based therapeutic approaches in which the permeabilization and/or ablation of the ...

生物工学

Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a combinatorial library of materials to be screened in a parallel, high throughput format1. Herein is described the formation and characterization of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique 2. This involves mixing monomers at varied ratios to produce a library of monomer solutions, transferring the solution to a glass slide format using a robotic printing device and curing with UV irradiation. This format is readily amenable to many biological assays, including stem cell attachment and proliferation, cell sorting and low bacterial adhesion, allowing the ready identification of 'hit' materials that fulfill a specific biological criterion3-5. Furthermore, the use of high throughput surface characterization (HTSC) allows the biological performance to be correlated with physio-chemical properties, hence elucidating the biological-material interaction6. HTSC makes use of water contact angle (WCA) measurements, atomic force microscopy (AFM), X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) and time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS). In particular, ToF-SIMS provides a chemically rich analysis of the sample that can be used to correlate the cell response with a molecular moiety. In some cases, the biological performance can be predicted from the ToF-SIMS spectra, demonstrating the chemical dependence of a biological-material interaction, and informing the development of hit materials5,3.

A description of the formation of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique. The high throughput surface characterization using atomic force microscopy, water contact angle measurements, X-ray photoelectron spectroscopy and time of flight secondary ion mass spectrometry and a cell attachment assay is also described.

バイオマテリアルのハイスループット検出用高分子マイクロアレイ

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting 3D cellular construct can often be more relevant to studying the molecular events and cell-cell interactions than similar experiments studied in 2D. To create effective 3D cultures with high cell viability throughout the scaffold the culture conditions such as oxygen and pH need to be carefully controlled as gradients in analyte concentration can exist throughout the 3D construct. Here we describe the methods of preparing biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors and their incorporation into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds along with their subsequent preparation for the culture of mammalian cells. The pH responsive scaffolds can be used as tools to determine microenvironmental pH within a 3D cellular construct. Furthermore, we detail the delivery of pH responsive nanosensors to the intracellular environment of mammalian cells whose growth was supported by electrospun PLGA scaffolds. The cytoplasmic location of the pH responsive nanosensors can be utilized to monitor intracellular pH (pHi) during ongoing experimentation.

Biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors can be incorporated into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds. The produced self-reporting scaffolds can be used for in&#160;situ monitoring of microenvironmental conditions whilst culturing cells upon the scaffold. This is beneficial as the 3D cellular construct can be monitored in real-time without disturbing the experiment.

3次元細胞培養のための自己申告足場

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Quantification of Global Diastolic Function by Kinematic Modeling-based Analysis of Transmitral Flow via the Parametrized Diastolic Filling Formalism

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised the only means available, the development of noninvasive imaging modalities (echocardiography, MRI, CT) having high temporal and spatial resolution provide a new window for quantitative diastolic function assessment. Echocardiography is the agreed upon standard for diastolic function assessment, but indexes in current clinical use merely utilize selected features of chamber dimension (M-mode) or blood/tissue motion (Doppler) waveforms without incorporating the physiologic causal determinants of the motion itself.&#160;The recognition that all left ventricles (LV) initiate filling by serving as mechanical suction pumps allows global diastolic function to be assessed based on laws of motion that apply to all chambers. What differentiates one heart from another are the parameters of the equation of motion that governs filling. Accordingly, development of the Parametrized Diastolic Filling (PDF) formalism&#160;has shown that the entire range of clinically observed early transmitral flow (Doppler E-wave) patterns are extremely well fit by the laws of damped oscillatory motion.&#160;This permits analysis of individual E-waves in accordance with a causal mechanism (recoil-initiated suction) that yields three (numerically) unique lumped parameters whose physiologic analogues are chamber stiffness (k), viscoelasticity/relaxation (c), and load (xo).&#160;The recording of transmitral flow (Doppler E-waves) is standard practice in clinical cardiology and, therefore, the echocardiographic recording method is only briefly reviewed. Our focus is on determination of the PDF parameters from routinely recorded E-wave data.&#160;As the highlighted results indicate, once the PDF parameters have been obtained from a suitable number of load varying E-waves, the investigator is free to use the parameters or construct indexes from the parameters (such as stored energy 1/2kxo2, maximum A-V pressure gradient kxo, load independent index of diastolic function, etc.) and select the aspect of physiology or pathophysiology to be quantified.

Accurate, causality-based quantification of global diastolic function has been achieved by kinematic modeling-based analysis of transmitral flow via the Parametrized Diastolic Filling (PDF) formalism. PDF generates unique stiffness, relaxation,&#160;and load parameters and elucidates &#39;new&#39; physiology while providing sensitive and specific indexes of dysfunction.

パラメータ化拡張期充満フォーマリズムを経由Transmitral流れの運動学的モデルベースの​​解析によるグローバル拡張期機能の定量化

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised ...

Studying Soft-matter and Biological Systems over a Wide Length-scale from Nanometer and Micrometer Sizes at the Small-angle Neutron Diffractometer KWS-2

The KWS-2 SANS diffractometer is dedicated to the investigation of soft matter and biophysical systems covering a wide length scale, from nm to &#181;m. The instrument is optimized for the exploration of the wide momentum transfer Q range between 1x10-4 and 0.5 &#197;-1 by combining classical pinhole, focusing (with lenses), and time-of-flight (with chopper) methods, while simultaneously providing high-neutron intensities with an adjustable resolution. Because of its ability to adjust the intensity and the resolution within wide limits during the experiment, combined with the possibility to equip specific sample environments and ancillary devices, the KWS-2 shows a high versatility in addressing the broad range of structural and morphological studies in the field. Equilibrium structures can be studied in static measurements, while dynamic and kinetic processes can be investigated over time scales between minutes to tens of milliseconds with time-resolved approaches. Typical systems that are investigated with the KWS-2 cover the range from complex, hierarchical systems that exhibit multiple structural levels (e.g., gels, networks, or macro-aggregates) to small and poorly-scattering systems (e.g., single polymers or proteins in solution). The recent upgrade of the detection system, which enables the detection of count rates in the MHz range, opens new opportunities to study even very small biological morphologies in buffer solution with weak scattering signals close to the buffer scattering level at high Q.
In this paper, we provide a protocol to investigate samples with characteristic size levels spanning a wide length scale and exhibiting ordering in the mesoscale structure using KWS-2. We present in detail how to use the multiple working modes that are offered by the instrument and the level of performance that is achieved.

Here, we present a protocol to investigate soft matter and biophysical systems over a wide mesoscopic length scale, from nm to &#181;m that involves the use of the KWS-2 SANS diffractometer at high intensities and an adjustable resolution.

小角中性子回折計KWS-2でのナノおよびマイクロメータサイズからワイド長さスケール上でソフトマターと生物学的システムを学びます

The KWS-2 SANS diffractometer is dedicated to the investigation of soft matter and biophysical systems covering a wide length scale, from nm to &#181;m. ...

Rapid, Scalable Assembly and Loading of Bioactive Proteins and Immunostimulants into Diverse Synthetic Nanocarriers Via Flash Nanoprecipitation

Nanomaterials present a wide range of options to customize the controlled delivery of single and combined molecular payloads for therapeutic and imaging applications. This increased specificity can have significant clinical implications, including decreased side effects and lower dosages with higher potency. Furthermore, the in situ targeting and controlled modulation of specific cell subsets can enhance in vitro and in vivo investigations of basic biological phenomena and probe cell function. Unfortunately, the required expertise in nanoscale science, chemistry and engineering often prohibit laboratories without experience in these fields from fabricating and customizing nanomaterials as tools for their investigations or vehicles for their therapeutic strategies. Here, we provide protocols for the synthesis and scalable assembly of a versatile non-toxic block copolymer system amenable to the facile formation and loading of nanoscale vehicles for biomedical applications. Flash nanoprecipitation is presented as a methodology for rapid fabrication of diverse nanocarriers from poly(ethylene glycol)-bl-poly(propylene sulfide) copolymers. These protocols will allow laboratories with a wide range of expertise and resources to easily and reproducibly fabricate advanced nanocarrier delivery systems for their applications. The design and construction of an automated instrument that employs a high-speed syringe pump to facilitate the flash nanoprecipitation process and to allow enhanced control over the homogeneity, size, morphology and loading of polymersome nanocarriers is described.

Nanomaterials provide versatile mechanisms of controlled therapeutic delivery for both basic science and translational applications, but their fabrication often requires expertise that is unavailable in most biomedical laboratories. Here, we present protocols for the scalable fabrication and therapeutic loading of diverse self-assembled nanocarriers using flash nanoprecipitation.

高速でスケーラブルなアセンブリおよびフラッシュ Nanoprecipitation を介して多様な合成ナノキャリアへ生理活性タンパク質や生理の読み込み

Nanomaterials present a wide range of options to customize the controlled delivery of single and combined molecular payloads for therapeutic and imaging ...

Substructure Analyzer: A User-Friendly Workflow for Rapid Exploration and Accurate Analysis of Cellular Bodies in Fluorescence Microscopy Images

The last decade has been characterized by breakthroughs in fluorescence microscopy techniques illustrated by spatial resolution improvement but also in live-cell imaging and high-throughput microscopy techniques. This led to a constant increase in the amount and complexity of the microscopy data for a single experiment. Because manual analysis of microscopy data is very time consuming, subjective, and prohibits quantitative analyses, automation of bioimage analysis is becoming almost unavoidable. We built an informatics workflow called Substructure Analyzer to fully automate signal analysis in bioimages from fluorescent microscopy. This workflow is developed on the user-friendly open-source platform Icy and is completed by functionalities from ImageJ. It includes the pre-processing of images to improve the signal to noise ratio, the individual segmentation of cells (detection of cell boundaries) and the detection/quantification of cell bodies enriched in specific cell compartments. The main advantage of this workflow is to propose complex bio-imaging functionalities to users without image analysis expertise through a user-friendly interface. Moreover, it is highly modular and adapted to several issues from the characterization of nuclear/cytoplasmic translocation to the comparative analysis of different cell bodies in different cellular sub-structures. The functionality of this workflow is illustrated through the study of the Cajal (coiled) Bodies under oxidative stress (OS) conditions. Data from fluorescence microscopy show that their integrity in human cells is impacted a few hours after the induction of OS. This effect is characterized by a decrease of coilin nucleation into characteristic Cajal Bodies, associated with a nucleoplasmic redistribution of coilin into an increased number of smaller foci. The central role of coilin in the exchange between CB components and the surrounding nucleoplasm suggests that OS induced redistribution of coilin could affect the composition and the functionality of Cajal Bodies.

We present a freely available workflow built for rapid exploration and accurate analysis of cellular bodies in specific cell compartments in fluorescence microscopy images. This user-friendly workflow is designed on the open-source software Icy and also uses ImageJ functionalities. The pipeline is affordable without knowledge in image analysis.

サブ構造アナライザー:蛍光顕微鏡画像における細胞体の迅速な探査と正確な分析のためのユーザフレンドリーなワークフロー

The last decade has been characterized by breakthroughs in fluorescence microscopy techniques illustrated by spatial resolution improvement but also in ...

Electric and Magnetic Field Devices for Stimulation of Biological Tissues

Electric fields (EFs) and magnetic fields (MFs) have been widely used by tissue engineering to improve cell dynamics such as proliferation, migration, differentiation, morphology, and molecular synthesis. However, variables such stimuli strength and stimulation times need to be considered when stimulating either cells, tissues or scaffolds. Given that EFs and MFs vary according to cellular response, it remains unclear how to build devices that generate adequate biophysical stimuli to stimulate biological samples. In fact, there is a lack of evidence regarding the calculation and distribution when biophysical stimuli are applied. This protocol is focused on the design and manufacture of devices to generate EFs and MFs and implementation of a computational methodology to predict biophysical stimuli distribution inside and outside of biological samples. The EF device was composed of two parallel stainless-steel electrodes located at the top and bottom of biological cultures. Electrodes were connected to an oscillator to generate voltages (50, 100, 150 and 200 Vp-p) at 60 kHz. The MF device was composed of a coil, which was energized with a transformer to generate a current (1 A) and voltage (6 V) at 60 Hz. A polymethyl methacrylate support was built to locate the biological cultures in the middle of the coil. The computational simulation elucidated the homogeneous distribution of EFs and MFs inside and outside of biological tissues. This computational model is a promising tool that can modify parameters such as voltages, frequencies, tissue morphologies, well plate types, electrodes and coil size to estimate the EFs and MFs to achieve a cellular response.

This protocol describes the step-by-step process to build both electrical and magnetic stimulators used to stimulate biological tissues. The protocol includes a guideline to simulate computationally electric and magnetic fields and manufacture of stimulator devices.

生体組織の刺激のための電界・磁場装置

Electric fields (EFs) and magnetic fields (MFs) have been widely used by tissue engineering to improve cell dynamics such as proliferation, migration, ...

Inactivation of Pathogens via Visible-Light Photolysis of Riboflavin-5&#8242;-Phosphate

Riboflavin-5&#39;-phosphate (or flavin mononucleotide; FMN) is sensitive to visible light. Various compounds, including reactive oxygen species (ROS), can be generated from FMN photolysis upon irradiation with visible light. The ROS generated from FMN photolysis are harmful to microorganisms, including pathogenic bacteria such as Staphylococcus aureus (S. aureus). This article presents a protocol for deactivating S. aureus, as an example, via photochemical reactions involving FMN under visible light irradiation. The superoxide radical anion (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63531/63531eq01v3.png" style="margin: auto;" />) generated during the FMN photolysis is evaluated via nitro blue tetrazolium (NBT) reduction. The microbial viability of S. aureus that is attributed to reactive <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63531/63531eq01v3.png" style="margin: auto;" /> species was used to determine the effectiveness of the process. The bacterial inactivation rate is proportional to FMN concentration. Violet light is more efficient in inactivating S. aureus than blue light irradiation, while the red or green light does not drive FMN photolysis. The present article demonstrates FMN photolysis as a simple and safe method for sanitary processes.

Inactivation of Pathogens via Visible-Light Photolysis of Riboflavin-5&amp;#8242;-Phosphate

Here, we present a protocol to inactivate pathogenic bacteria with reactive oxygen species produced during photolysis of flavin mononucleotide (FMN) under blue and violet light irradiation of low intensity. FMN photolysis is demonstrated to be a simple and safe method for sanitary processes.

リボフラビン-5′-リン酸の可視光光分解 による 病原体の不活化

Riboflavin-5&#39;-phosphate (or flavin mononucleotide; FMN) is sensitive to visible light. Various compounds, including reactive oxygen species (ROS), can ...

Engineering Antiviral Agents via Surface Plasmon Resonance

Surface plasmon resonance (SPR) is used to measure hemagglutinin (HA) binding to domain-swapped Cyanovirin-N (CV-N) dimer and to monitor interactions between mannosylated peptides and CV-N's high-affinity binding site. Virus envelope spikes gp120, HA, and Ebola glycoprotein (GP) 1,2 have been reported to bind both high- and low-affinity binding sites on dimeric CVN2. Dimannosylated HA peptide is also bound at the two low-affinity binding sites to an engineered molecule of CVN2, which is bearing a high-affinity site for the respective ligand and mutated to replace a stabilizing disulfide bond in the carbohydrate-binding pocket, thus confirming multivalent binding. HA binding is shown to one high-affinity binding site of pseudo-antibody CVN2 at a dissociation constant (KD) of 275 nM that further neutralizes human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) through oligomerization. Correlating the number of disulfide bridges in domain-swapped CVN2, which are decreased from 4 to 2 by substituting cystines into polar residue pairs of glutamic acid and arginine, results in reduced binding affinity to HA. Among the strongest interactions, Ebola GP1,2 is bound by CVN2 with two high-affinity binding sites in the lower nanomolar range using the envelope glycan without a transmembrane domain. In the present study, binding of the multispecific monomeric CV-N to severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) spike (S) glycoprotein is measured at KD = 18.6 &#181;M as compared with nanomolar KD to those other virus spikes, and via its receptor-binding domain in the mid-&#181;-molar range.

Engineering Antiviral Agents via Surface Plasmon Resonance

The present protocol describes new tools for SPR binding assays to examine CV-N binding to HA, S glycoprotein, related hybrid-type glycans, and high-mannose oligosaccharides. SPR is used to determine the KD for binding either dimeric or monomeric CV-N to these glycans.

表面プラズモン共鳴 による 抗ウイルス剤のエンジニアリング

Surface plasmon resonance (SPR) is used to measure hemagglutinin (HA) binding to domain-swapped Cyanovirin-N (CV-N) dimer and to monitor interactions ...