The authors would like to thank intern Evelyn Von Neida who provided paramount insights regarding the preparation of biomass samples for both of the high-throughput pipelines discussed in this manuscript. Support for the development of this work and manuscript was provided by the BioEnergy Science Center. The BioEnergy Science Center is a U.S. Department of Energy Bioenergy Research Center supported by the Office of Biological and Environmental Research in the DOE Office of Science. The National Renewable Energy Laboratory (NREL) is a national laboratory of the US DOE Office of Energy Efficiency and Renewable Energy, operated for DOE by the Alliance for Sustainable Energy, LLC. This work was supported by the U.S. Department of Energy under Contract No. DE-AC36-08-GO28308 with the National Renewable Energy Laboratory.

1. Alto rendimiento determinación de glucosa y xilosa rendimientos Siguiendo enzimática Sacarificación 9,29 <ol><li> Preparación de la muestra (molienda, De-almidonado, extracción, tratamiento previo) <ol><li> Moler al menos 300 mg de cada muestra de la biomasa utilizando un molino Wiley, de tal manera que las partículas pasan a través de una malla 20 (850 micras) pantalla. Transferencia a zip-top antiestáticas bolsas (normalmente con código de barra) y la información de la muestra registro a la base de datos de código de barras. </li><li> Añadir aproximadamente 250 mg o más de la biomasa aérea de la bolsa antiestática para una numerada (con lápiz, no use tinta o marcador) para bolsitas de té, cuidadosamente enrollar las bolsitas de té, asegurándose de doblar los extremos sobre la biomasa para prevenir pérdida durante de-almidonado y extracción. </li><li> Envuelva la bolsita cerrada con alambre de cobre estañado. Anote el número de la bolsita de té para cada muestra con código de barras. </li><li> Preparar solución de enzima-de almidonar de enzimas comerciales (típicamente, 0,25% (v / v) de la glucoamilasa (AGU ~ 1600 / L) y1,5% (v / v) de alfa-amilasa (~ 2.900 KNU-S / L) en acetato de sodio 0,1 M (pH 5,0)). Preparar 16 ml por g de biomasa a granel o 500 ml por 120 muestras bolsita de té. Nota: Las cargas capaces de eliminar el almidón a partir de biomasa de tierra deben ser determinadas empíricamente mediante pruebas de almidón después de la digestión con una gama de cargas enzimáticas y ratios. </li><li> En un recipiente de plástico, añadir 16 ml de solución de-almidonar enzima por 1 g de biomasa aérea granel. Para un protocolo de-almidonado lotes, añadir 120 bolsitas de té a 500 ml de la solución tampón de la enzima. </li><li> Incubar en un agitador a 55 ° C durante 24 (± 4) horas, a 120 rpm para eliminar posibles almidón. </li><li> Después de la incubación de-almidonar, enjuague y empapar la biomasa en varios litros de agua desionizada durante 30 minutos. Repetir este proceso dos veces más para eliminar las sales tampón que pueden causar la ebullición (formación de burbujas de gas en la solución que puede resultar en un aumento repentino y violento en el nivel de la solución, provocando etanol líquido caliente para cascadafuera del recipiente de reacción) durante la extracción. </li><li> Tras el lavado exhaustivo de la biomasa de-almidonado, colocar las bolsitas de té en la columna de Soxhlet para la extracción. No se requiere un dedal para este paso. </li><li> Configure el reflujo Soxhlet, utilizando etanol al 95% y extraer las muestras durante 24 horas. </li><li> Quite las bolsitas del reactor Soxhlet y se extendió a cabo en una sola capa en una bandeja plana. </li><li> Permita que las muestras se sequen durante la noche a temperatura ambiente en una campana de humos. </li><li> Desenrolle las bolsitas de té y devolver la biomasa seca de bolsas antiestáticas originales con código de barras. Nota: Las bolsas anti-estáticas son eficientes en la reducción de la electricidad estática en la biomasa, lo que mejora las características de manejo. Si se utilizan otras opciones de almacenamiento, biomasa adicional puede ser necesaria debido a la biomasa apego a un lado del recipiente de almacenamiento. </li><li> Transferencia de al menos 50 mg de la biomasa seca a una tolva de código de barras (utilizando más material es mejor para la dispensación precisa). Spueden códigos de barras de bolsas anti-estáticas y la tolva de recepción para asegurar el seguimiento de precisión de muestra. </li><li> Tolvas de carga en sólidos pesando robot, prestando especial atención a la orden de las muestras en los bastidores. Cargar placas reactor suficiente para contener todas las muestras y seleccione el protocolo de dispensación en función del número de placas utilizadas. </li><li> Robóticamente sopesar 5 mg de las muestras secas (± 0,3 mg) en acero inoxidable placas de 96 pocillos resistentes a los ácidos. Pesar 3 réplicas de cada muestra distribuida alrededor de la placa para minimizar las variaciones localizadas. </li><li> Incluya 8 muestras de biomasa de control de un material estándar biomasa bien caracterizado con el fin de realizar un seguimiento de la realización del ensayo. Para múltiples placas, el uso de múltiples tolvas estándar de biomasa será minimizar la deriva del tamaño de partícula causada por tamizado en las tolvas de dispensación durante los ciclos repetidos. Nota: En cada placa, debe haber 24 muestras con 3 repeticiones, 4 espacios en blanco que consisten en agua desionizada y la enzima y 8 controls, usando la biomasa estándar caracterizado previamente. Los 3 pozos de esquina de cada una de las 4 esquinas de la placa están reservados para los estándares de azúcar. </li><li> Compruebe pozos estándar en blanco y azúcar para las partículas de biomasa errantes y quitar si está presente. </li><li> Añadir 250 ml de agua desionizada a cada pocillo, y sellar las placas con politetrafluoroetileno respaldado por adhesivo de silicona (PTFE) cinta. </li><li> Utilizando una punta del soldador de 1/8 &quot;, perfore la cinta de PTFE en cada puerto de vapor (117 en total) para cada plato. Use un plato vacío apilados en la placa del reactor sellado como guía y para restringir el movimiento de PTFE película. </li><li> Sujete las placas firmemente con 0.031 juntas &quot;de espesor reforzado con vidrio de PTFE (pre-perforadas con agujeros para los puertos de vapor) entre las placas y los platos vacíos en la parte superior e inferior de la pila. Trate previamente las muestras usando un reactor de vapor de agua fijada a 180 ° C durante 17,5 min, u otras combinaciones de temperatura / tiempo en base a la severidad deseada. </li><li> Placas de reactores enfriar a 50 °; C por las inundaciones con agua desionizada. </li></ol></li><li> Enzimática Sacarificación <ol><li> Preparar una solución de sacarificación enzimática que consta de 8% (v / v) solución de enzima en 1,0 M de citrato de sodio, pH 5,0. Preparar 5 ml por placa reactor. Nota: La dilución requerida debe determinarse sobre la base de la actividad y contenido de proteína de la solución específica de la enzima. </li><li> Cuando las placas son frescos, centrifúguelas en un rotor de cubeta oscilante a 1500 xg durante 20 min. Retire la película de sellado. Nota: Estas placas son pesados ​​y las especificaciones de centrífuga debe comprobar la compatibilidad. </li><li> Añadir 40 l de la solución de enzima de stock 8% a cada pocillo (70 mg de enzima por g de biomasa). </li><li> Vuelva a cerrar con una nueva cinta de PTFE. Coloque la placa de sellado en pinza placa magnética. </li><li> Mezclar suavemente las muestras por inversión (al menos 15 veces), y se incuba a 50 ° C durante 70 h. </li><li> Cuando la sacarificación ha concluido, mezclar por inversión y centrifugar las placas a 1.500 xg durante 20 min. </li></ol></li><li> Ensayo de Azúcar <ol><li> Prepare un conjunto de 6 de la glucosa y los estándares de calibración de xilosa combinado en tampón M de citrato 0,014 (pH 5,0) que van desde 0 a 0,750 mg / ml (0, 0,2, 0,3, 0,45, 0,65, y 0,75 mg / recomendada ml) y de 0 a 0,600 mg / ml (0, 0,1, 0,2, 0,35, 0,45, y 0,6 mg / ml recomendado) para la glucosa y xilosa, respectivamente. </li><li> Preparar la glucosa oxidasa / peroxidasa (goPod) y xilosa deshidrogenasa (XDH) los reactivos de acuerdo a instrucciones del kit. </li><li> Con una pipeta, retire 200 l de líquido de los 4 pozos de esquina y pozos de borde adyacentes a los pozos de esquina (12 pozos en total) de la placa del reactor. </li><li> Con una pipeta, dispensar 180 l de agua desionizada a cada pocillo de una placa de dilución de fondo plano de poliestireno de 96 pocillos. No añadir agua a los pozos convencionales y esquina 12 de azúcar (quitar estos consejos si se utiliza un cabezal de 96 canales). </li><li> Con una pipeta, dispense 180 l de reactivo goPod a cada pocillo de la prueba de glucosa en plcomió. </li><li> Con una pipeta, dispensar reactivo XDH 180 l a cada pocillo de la placa de ensayo xilosa. </li><li> Con una pipeta, transferir 20 l alícuotas de hidrolizado de la placa del reactor de 96 pocillos de la placa de dilución. Pipetear de la sección superior de los pocillos para evitar los sólidos de biomasa y líquido residual en los pozos de esquina. Mezclar por trituración durante al menos 10 ciclos. </li><li> Con una pipeta, transferir 110 l de estándares de azúcar, por duplicado, a los pozos de esquina de la placa de dilución. </li><li> Con una pipeta, transferir 20 alícuotas de la placa de dilución para los de glucosa y xilosa placas de ensayo. Mezclar por trituración. </li><li> Incubar las glucosa y xilosa placas de ensayo a temperatura ambiente durante 30 min. Romper con cuidado las burbujas de la superficie antes de leer. Una pistola de calor pasó brevemente sobre la superficie de la placa funciona bien. </li><li> El uso de un lector de placas de 96 pocillos ultravioleta / visible, ajuste la longitud de onda medida a 510 nm y registrar la absorbancia contra un blanco de reactivo.Esta medición supervisa la formación de quinonimina, que es proporcional a la concentración de glucosa. La concentración de glucosa se calcula a partir de la curva de calibración basada en los estándares de calibración preparadas en 1.3.1. </li><li> El uso de un lector de placas de 96 pocillos ultravioleta / visible, ajuste la longitud de onda medida a 340 nm y registrar la absorbancia. Esta medición supervisa la reducción de NAD + a NADH, que es proporcional a la concentración de xilosa. La concentración de xilosa se calcula a partir de la curva de calibración en base a los estándares de calibración preparadas en 1.3.1. </li></ol></li></ol> 2. Alto rendimiento Determinación del total de lignina y lignina contenido monomérico Usando pyMBMS 28 <ol><li> Preparación de la muestra <ol><li> Moler y extraer la biomasa utilizando los métodos descritos en los pasos 1.1.1, y 1.1.6-1.1.8. Esto incluye la molienda y extracción de un conjunto de normas para usar como controles experimentales. Nota: El measur pyMBMSelemen- no dependen del tamaño de partícula, por lo que si solamente utilizando el protocolo pyMBMS, la preparación de biomasa deben llevarse a cabo para permitir que la muestra para encajar en el soporte de la muestra, &lt;4 mm. </li><li> Usando una pequeña espátula de dispensación de aproximadamente 4 mg (3 a 5 mg preferidos) de la biomasa preparada en una taza de acero inoxidable de 80 l diseñado para la auto-muestreador. </li><li> Asegúrese de que al menos el 10% de las muestras que se analizan son las normas de control, como las disponibles en el Instituto Nacional de Estándares y Tecnología (bagazo de caña de azúcar-8491; álamo-8492; de pino-8493; o el trigo de la paja-8494). El estándar también puede ser cualquier especie análogas a las muestras a analizar que ya han sido caracterizados utilizando métodos estándar. </li><li> Aleatoriamente cargar las muestras en las copas de auto-sampler utilizando pinzas para evitar el sesgo debido a la posible deriva espectrómetro con el tiempo. Nota: Una aleatorización típica de las muestras sería incluir la medición de todas las muestras de una vez, seguido de un re-aleatorizacióndel orden de las muestras para una medición por duplicado. Programas de aleatorización están disponibles en línea. </li><li> Usando un taladro estándar, producir manualmente discos de filtro de vidrio de tipo láminas de fibra de vidrio A / D, sin aglutinante. Sujete el filtro de fibra de vidrio redonda con pinzas, centrarlo sobre la copa de la muestra, y empuje en la muestra utilizando una llave Allen de 3,5 mm para confinar el material en cada taza durante el experimento. </li></ol></li><li> Protocolo Instrumental <ol><li> Calibrar el espectrómetro de masas usando un estándar conocido que tiene intensidades de los picos en toda la gama de compuestos que pueden existir para las muestras experimentales. Para las muestras típicas de biomasa, utilice perfluorotributilamina (PFTBA). </li><li> Ajuste la velocidad de flujo del gas portador de helio a 0,9 L / min utilizando un medidor de flujo de gas. </li><li> Ajuste el horno de auto-muestreador a una temperatura de pirólisis de 500 ° C y la temperatura de interfaz a 350 ° C utilizando el software de auto-muestreador. Nota: A &quot;de acero inoxidable 1/8 calientalínea de transferencia de calor envuelto en cinta que conecta el auto-muestreador al espectrómetro de masas se controla mediante un controlador térmico a 250 ° C. </li><li> Comience la adquisición de datos en el espectrómetro de masas y espere al menos 60 segundos para obtener datos suficientes para la recopilación de antecedentes espectros. </li><li> Comience el método de auto-muestreador automático con las especificaciones de 2.2.2. Nota: La auto-muestreador gotas de cada muestra individualmente en el horno de auto-muestreador. El tiempo total de adquisición de datos es de aproximadamente 1,5 min; Sin embargo, la pirólisis de una típica muestra de 4 mg es completa después de 30 seg. </li><li> Contenido Registro de iones totales (TIC) de cada muestra utilizando el software espectrómetro de masas en la velocidad de barrido de 0,5 seg. Intensidades de Registros entre m / z 30-450. Nota: los compuestos de biomasa típicas utilizan ionización suave a 17 eV. El instrumento puede grabar intervalos mayores de m / z 1 a 1000; Sin embargo, la tasa de exploración estará limitada por el poder de la CPU del ordenador. </li><li> Eliminar fondo de los espectros utilizando el manual mejorar función en el software. Nota: Una porción 60 de barrido de la línea de base al comienzo de la recogida de datos se utiliza para calcular un valor medio de fondo. Este promedio espectros de fondo se quita de los espectros de la muestra experimental automáticamente en el software espectrómetro de masas. </li><li> Importe el archivo de texto de una sola columna creado por el software espectrómetro de masas que contiene los datos espectrales para cada muestra, en un programa de base de datos y combinar todas las muestras en una sola base de datos. Añadir los metadatos aplicables a la hoja de cálculo. Importe los datos con formato de hoja de cálculo (archivo / CSV) en un paquete de software estadístico y la media de normalizar el espectro para dar cuenta de la variación en las masas de muestra pirolizados. </li><li> Use un paquete de software estadístico para llevar a cabo un análisis de componentes principales (PCA) usando los datos espectrales para analizar agrupación de las muestras replicadas estándar utilizados en las mediciones, así como para evaluar qué picos son parte integral de la clasificación de los productos químicoscompuestos en las cargas parcela 28. Nota: Los grupos de PCA las muestras en base a la similitud de sus espectros, y permite una verificación de los estándares para medir el error experimental debido a la deriva instrumento durante la carrera. </li><li> Para calcular la siringil lignina (S) / guayacil (G) ratio, sumar las áreas de los picos S (m / z = 154, 167, 168, 182, 194, 208, y 210) y se divide por la suma de G picos en 124, 137, 138, 150, 164, y 178. </li><li> Para calcular el contenido total de lignina, sumar los picos de lignina con m / z = 120, 124, 137, 138, 150, 152, 154, 164, 167, 178, 180, 182, 194, y 210. </li><li> Calcular un factor de corrección para escalar la medición pyMBMS a un método estándar para la estimación de la lignina total de, como Klason lignina. Divida el valor lignina Klason de la norma individual del contenido total de lignina medido para esa muestra estándar utilizando pyMBMS. </li><li> Aplique este factor de corrección a todas las especies como en el conjunto de datos. Repita el procedimiento para cada tipo de biomasa analizada. Nota: El factor de corrección puede variar en función significativa en la S / G de la biomasa analizada. </li></ol></li></ol>

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	<li>Perlack, R. D., Stokes, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> U.S. Billion-Ton Update: Biomass Supply for a Bioenergy and Bioproducts Industry. , (2011).</li><li>Henry, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+5.">Ch. 5.</a> Plant Resources for Food, Fuel and Conservation. , 53-80 (2009).</li><li>Henry, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+plant+biomass+resources+available+for+replacement+of+fossil+oil.">Evaluation of plant biomass resources available for replacement of fossil oil.</a> Plant Biotechnol. J. 8 (3), 288-293 (2010).</li><li>Furtado, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modifying+plants+for+biofuel+and+biomaterial+production.">Modifying plants for biofuel and biomaterial production.</a> Plant Biotechnol. J. 12 (9), 1246-1258 (2014).</li><li>Sluiter, J. B., Ruiz, R. O., Scarlata, C. J., Sluiter, A. D., Templeton, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compositional+analysis+of+lignocellulosic+feedstocks.+1.+Review+and+description+of+methods.">Compositional analysis of lignocellulosic feedstocks. 1. Review and description of methods.</a> J. Agric. Food Chem. 58 (16), 9043-9053 (2010).</li><li>Lupoi, J. S., Singh, S., Simmons, B. A., Henry, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+Lignocellulosic+Biomass+Using+Analytical+Spectroscopy:+an+Evolution+to+High-Throughput+Techniques.">Assessment of Lignocellulosic Biomass Using Analytical Spectroscopy: an Evolution to High-Throughput Techniques.</a> Bioenerg. Res. 7 (1), 1-23 (2014).</li><li>Lapierre, C., Monties, B., Rolando, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thioacidolysis+of+lignin:+comparison+with+acidolysis.">Thioacidolysis of lignin: comparison with acidolysis.</a> J. Wood Chem. Technol. 5 (2), 277-292 (1985).</li><li>DeMartini, J. D., Studer, M. H., Wyman, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-scale+and+automatable+high-throughput+compositional+analysis+of+biomass.">Small-scale and automatable high-throughput compositional analysis of biomass.</a> Biotechnol. Bioeng. 108 (2), 306-312 (2010).</li><li>Selig, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+determination+of+glucan+and+xylan+fractions+in+lignocelluloses.">High throughput determination of glucan and xylan fractions in lignocelluloses.</a> Biotechnol. Lett. 33 (5), 961-967 (2011).</li><li>Selig, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lignocellulose+recalcitrance+screening+by+integrated+high-throughput+hydrothermal+pretreatment+and+enzymatic+saccharification.">Lignocellulose recalcitrance screening by integrated high-throughput hydrothermal pretreatment and enzymatic saccharification.</a> Ind. Biotechnol. 6 (2), 104-111 (2010).</li><li>Studer, M. H., De Martini, J. D., Brethauer, S., McKenzie, H. L., Wyman, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+a+high-throughput+screening+system+to+identify+cellulosic+biomass,+pretreatments,+and+enzyme+formulations+that+enhance+sugar+release.">Engineering of a high-throughput screening system to identify cellulosic biomass, pretreatments, and enzyme formulations that enhance sugar release.</a> Biotechnol. Bioeng. 105 (2), 231-238 (2009).</li><li>Gjersing, E., Happs, R. M., Sykes, R. W., Doeppke, C., Davis, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+determination+of+sugar+content+in+biomass+hydrolysates+using+nuclear+magnetic+resonance+spectroscopy.">Rapid determination of sugar content in biomass hydrolysates using nuclear magnetic resonance spectroscopy.</a> Biotechnol. Bioeng. 110 (3), 721-728 (2013).</li><li>Templeton, D. W., Sluiter, A. D., Hayward, T. K., Hames, B. R., Thomas, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+corn+stover+composition+and+sources+of+variability+via+NIRS.">Assessing corn stover composition and sources of variability via NIRS.</a> Cellulose (Dordrecht, Netherlands). 16 (4), 621-639 (2009).</li><li>Tucker, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fourier+transform+infrared+quantification+of+sugars+in+pretreated+biomass+liquors.">Fourier transform infrared quantification of sugars in pretreated biomass liquors.</a> Appl. Biochem. Biotechnol. 84-86, 39-50 (2000).</li><li>Wolfrum, E. J., Sluiter, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+multivariate+calibration+models+for+corn+stover+feedstock+and+dilute-acid+pretreated+corn+stover.">Improved multivariate calibration models for corn stover feedstock and dilute-acid pretreated corn stover.</a> Cellulose (Dordrecht, Netherlands). 16 (4), 567-576 (2009).</li><li>Ona, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-destructive+determination+of+wood+constituents+by+Fourier-transform+Raman+spectroscopy.">Non-destructive determination of wood constituents by Fourier-transform Raman spectroscopy.</a> J. Wood Chem. Technol. 17 (4), 399-417 (1997).</li><li>Ona, T., Sonoda, T., Ohshima, J., Yokota, S., Yoshizawa, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+quantitative+method+to+assess+eucalyptus+wood+properties+for+kraft+pulp+production+by+FT-Raman+spectroscopy.">A rapid quantitative method to assess eucalyptus wood properties for kraft pulp production by FT-Raman spectroscopy.</a> J. Pulp Pap. Sci. 29 (1), 6-10 (2003).</li><li>Hames, B. R., Thomas, S. R., Sluiter, A. D., Roth, C. J., Templeton, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+biomass+analysis.+New+tools+for+compositional+analysis+of+corn+stover+feedstocks+and+process+intermediates+from+ethanol+production.">Rapid biomass analysis. New tools for compositional analysis of corn stover feedstocks and process intermediates from ethanol production.</a> Appl. Biochem. Biotechnol. 105-108, 5-16 (2003).</li><li>Studer, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lignin+content+in+natural+Populus+variants+affects+sugar+release.">Lignin content in natural Populus variants affects sugar release.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108 (15), 6300-6305 (2011).</li><li>Chen, M., Zhao, J., Xia, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+four+different+chemical+pretreatments+of+corn+stover+for+enhancing+enzymatic+digestibility.">Comparison of four different chemical pretreatments of corn stover for enhancing enzymatic digestibility.</a> Biomass Bioenergy. 33 (10), 1381-1385 (2009).</li><li>Davison, B. H., Drescher, S. R., Tuskan, G. A., Davis, M. F., Nghiem, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+of+S/G+ratio+and+lignin+content+in+a+Populus.+family+influences+the+release+of+xylose+by+dilute+acid+hydrolysis.">Variation of S/G ratio and lignin content in a Populus. family influences the release of xylose by dilute acid hydrolysis.</a> Appl. Biochem. Biotechnol. 129-132, 427-435 (2006).</li><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lignin+monomer+composition+affects+Arabidopsis+cell-wall+degradability+after+liquid+hot+water+pretreatment.">Lignin monomer composition affects Arabidopsis cell-wall degradability after liquid hot water pretreatment.</a> Biotechnol. Biofuels. 3, 27-33 (2010).</li><li>Lupoi, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+prediction+of+eucalypt+lignin+syringyl/guaiacyl+content+using+multivariate+analysis:+a+comparison+between+mid-infrared,+near-infrared,+and+Raman+spectroscopies+for+model+development.">High-throughput prediction of eucalypt lignin syringyl/guaiacyl content using multivariate analysis: a comparison between mid-infrared, near-infrared, and Raman spectroscopies for model development.</a> Biotechnol. Biofuels. 7, 93 (2014).</li><li>Lupoi, J. S., Smith, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+woody+and+herbaceous+biomasses+lignin+composition+with+1064+nm+dispersive+multichannel+Raman+spectroscopy.">Characterization of woody and herbaceous biomasses lignin composition with 1064 nm dispersive multichannel Raman spectroscopy.</a> Appl. Spectro. 66 (8), 903-910 (2012).</li><li>Sun, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+determination+of+syringyl:guaiacyl+ratios+using+FT-Raman+spectroscopy.">Rapid determination of syringyl:guaiacyl ratios using FT-Raman spectroscopy.</a> Biotechnol. Bioeng. 109 (3), 647-656 (2012).</li><li>Lupoi, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+prediction+of+Acacia+and+eucalypt+lignin+syringyl/guaiacyl+content+using+FT-Raman+spectroscopy+and+partial+least+squares+modeling.">High-throughput prediction of Acacia and eucalypt lignin syringyl/guaiacyl content using FT-Raman spectroscopy and partial least squares modeling.</a> Bioenerg. Res. in press, (2015).</li><li>Sykes, R., Kodrzycki, B., Tuskan, G., Foutz, K., Davis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Within+tree+variability+of+lignin+composition+in+Populus.">Within tree variability of lignin composition in Populus.</a> Wood Sci. Technol. 42 (8), 649-661 (2008).</li><li>Sykes, R., Mielenz, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+12.+High-Throughput+Screening+of+Plant+Cell-Wall+Composition+Using+Pyrolysis+Molecular+Beam+Mass+Spectroscopy.">Ch. 12. High-Throughput Screening of Plant Cell-Wall Composition Using Pyrolysis Molecular Beam Mass Spectroscopy.</a> Biofuels: Methods and Protocols. 581, 169-183 (2009).</li><li>Decker, S., Himmel, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+17.+Reducing+the+effect+of+variable+starch+levels+in+biomass+recalcitrance+screening).">Ch. 17. Reducing the effect of variable starch levels in biomass recalcitrance screening).</a> Biomass Conversion. 908, 181-195 (2012).</li><li>Evans, R. J., Milne, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+the+pyrolysis+of+biomass.">Molecular characterization of the pyrolysis of biomass.</a> Energy Fuels. 1 (2), 123-137 (1987).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Los pasos clave de preparación de muestras para la obtención de datos precisa y reproducible cuando se realizan experimentos de selección de alto rendimiento son las siguientes: Azúcar Ensayo de lanzamiento: En general, las muestras se preparan en lotes que van desde unas pocas docenas a varios miles a la vez. Cada paso importante se lleva a cabo típicamente para todas las muestras antes de mover hacia adelante con el fin de minimizar las variaciones en la p...

A medida que la oferta mundial de combustibles no renovables y sus productos disminuciones asociadas, los científicos se han cuestionado para crear combustibles y productos químicos similares a partir de fuentes de origen vegetal 1. Un aspecto clave de este trabajo es determinar qué especies de plantas pueden ser adecuados para la producción de biocombustibles y biomateriales 2,3. Típicamente, estas materias primas se evalúan para la lignina, celulosa, hemicelulosa y el contenido; así como su susceptibilidad a la deconstrucción (recalcitrancia) a través de pretratamiento térmico, mecánico y / o químico con o sin posterior enzima de sacarificación. Análisis más detallados se usan para determinar la composición específica de las fracciones de lignina y hemicelulosa, así como actividades óptimas enzima necesaria. Modificaciones transgénicas de plantas que no poseen intrínsecamente características ideales para la conversión bioquímica o termoquímica a los productos básicos deseados han proporcionado a los investigadores con una fuente de gran expansión de la ollamaterias primas ciales 4. Los métodos analíticos estándar para la cuantificación de los rasgos químicos de una planta, mientras que muy útil para pequeños conjuntos de muestras, no son adecuadas para la detección rápida de cientos o miles de muestras 5-7. Los métodos descritos en este documento HTP se han desarrollado para evaluar rápida y eficazmente un gran número de variantes de biomasa para los cambios en la pared celular recalcitrante a la degradación termoquímica y / o enzimática. Es fundamental entender que los ensayos de selección HTP descritos en este documento no han sido diseñados para maximizar la conversión o rendimiento. El objetivo es determinar las diferencias relativas en el recalcitrante intrínseca de muestras de biomasa relacionados. Como resultado, muchos de los pasos de análisis difieren de los ensayos de conversión de biomasa &quot;típicos&quot;, donde el objetivo es obtener la máxima tasa de conversión o extensión. Por ejemplo, severidades de pretratamiento más bajas y tiempos más cortos de la enzima de hidrólisis se utilizan para maximizar diferircias entre las muestras. En la mayoría de los casos, las cargas relativamente altas de enzimas se utilizan para reducir las diferencias debidas a la variación experimental en la actividad enzimática, lo que podría alterar los resultados de manera significativa. Técnicas rápidas para determinar la composición de la planta paredes celulares y los azúcares monoméricos liberados tras la sacarificación enzimática incluyen robótica,, placas de 96 pocillos termoquímicamente compatibles personalizados, y modificaciones de los métodos de laboratorio estándar 8-11 y protocolos instrumentales, como la espectroscopia vibracional (infrarrojos (IR), de infrarrojo cercano (NIR), o Raman) y resonancia magnética nuclear (RMN) 12-17. Estas metodologías son la clave para el aislamiento de las materias primas con alto contenido de celulosa o bajos de lignina, o los previstos para obtener el más alto de glucosa, xilosa, etanol, etc. Estos métodos han permitido a los análisis a escala reducida que emplean pequeñas cantidades de biomasa y consumibles, lo que lleva a la reducción de experimental costa 18 </sarriba&gt;. Otra característica de este enfoque metodológico es que diversas condiciones experimentales pueden ser rápidamente, y en algunos casos de forma simultánea, evaluado. Por ejemplo, una variedad de diferentes estrategias de tratamiento previo o cócteles de enzimas puede ser probado, permitiendo que los parámetros experimentales más óptimas para identificar y emplear rápidamente. Materias primas populares, como el rastrojo de maíz 9, álamo 8,10, bagazo de caña 8, y el pasto varilla 8 se han evaluado con éxito el uso de estos métodos HTP. Lignina total y la composición monomérica lignina también son comúnmente cuantificados rasgos de biomasa. Las reducciones en el contenido de lignina se ha demostrado que aumentar la digestibilidad enzimática de polisacáridos 19,20. El papel que la relación lignina monomérica (a menudo reportado como siringil / guayacil (S / G) contenido) juega en la deconstrucción de la pared celular vegetal es todavía bajo investigación. Algunos informes han indicado que las reducciones en la S / Grelación condujo a un aumento de los rendimientos de glucosa después de la hidrólisis de 21 años, mientras que otros estudios revelan la tendencia opuesta 19,22. Métodos de alto rendimiento para la evaluación de la lignina y sus monómeros incluyen espectroscopia vibracional (IR, NIR y Raman 23-26), junto con el análisis multivariado, y pirólisis espectrometría de masas de haz molecular (pyMBMS) 27,28. En el desarrollo de métodos HTP para el cribado de la biomasa, varias consideraciones integrales deben mantenerse en mente. Un aspecto clave es la complejidad del método. ¿Cuál es el nivel de habilidad requerida para la técnica? Análisis quimiométricos, por ejemplo, requieren habilidades específicas para construir, evaluar y mantener modelos predictivos. Los métodos estándar exhiben pasos de análisis preparatorio o de datos indeseables o emplean reactivos tóxicos. Desarrollo de los modelos es un proceso continuo, donde los nuevos datos se incorpora en el modelo a través del tiempo para aumentar la robustez del modelo. Otra considración es el ahorro de costes y la disminución de los tiempos de análisis experimentales de los métodos de alto rendimiento propuestos. Si el método es bastante rápida, pero muy costoso, puede que no sea una técnica viable para muchos laboratorios a adoptar. Los métodos ilustrados en este manuscrito son variantes de técnicas estandarizadas, modificados para amplificar las capacidades de rendimiento. Estos protocolos miden cuantitativamente los rasgos de biomasa de interés sin necesidad de la elaboración de modelos predictivos. Este es un atributo clave de estas técnicas, ya que los métodos de predicción, mientras que exhiben fuertes correlaciones con el estándar de análisis utilizados para desarrollar los modelos, no son tan precisos como medir realmente la cantidad de interés para las muestras. Considerando que los métodos utilizados son esencialmente reducido versiones de los métodos estándar de análisis a escala de laboratorio, la exactitud y la precisión se negocian para la velocidad y el rendimiento. Sobre todo, este resultado se debe a errores mayores en pequeña pipeta de volumen y un peso; así como una mayor samplia heterogeneidad como tamaño de la muestra disminuye. Mientras que los grandes conjuntos de muestras pueden ser examinados y comparados, el gran cuidado debe ejercerse cuando se hacen comparaciones entre campañas separadas y con los resultados a escala de laboratorio. Las mayoría de los pasos que consumen tiempo implican la manipulación física de la biomasa. Muestras de molienda puede tardar varios minutos por muestra, incluyendo la limpieza de la fábrica entre las muestras. Carga manual, la descarga, y tolvas de limpieza y llenado y vaciado de bolsas de té y bolsas de muestras también es muy intensivo en mano de obra. Si bien cada paso puede tardar un minuto o más, haciendo miles de muestras pueden tomar muchas horas o incluso días. Los robots pueden cargar un plato típico reactor con la biomasa en aproximadamente de 3 a 4 horas o 6 para placas de 8 días -1 -1 robot. Esta situación depende de los parámetros de precisión utilizados, así como el tipo y la cantidad de biomasa a ser probado. Llenar placas de reactores con agua, ácido diluido, o enzima se hace rápidamente usando un robot de manipulación de líquidos. Pretratamiento de una pila de placas (de 1 a 20 placas de reactores) tarda entre 1 y 3 horas cuando el conjunto, enfríe y desmontaje incluido. Hidrólisis enzimática tarda 3 días y el análisis de azúcar requiere alrededor de 1 hora de tiempo de preparación más 10 minutos por plato reactor para completar el ensayo y leer los resultados. Un programa semanal de establecidos días previos al tratamiento y análisis de capacidad para un horario de trabajo razonable, minimizando extraña horas y los fines de esfuerzos para el componente humano de la prueba y permite el procesamiento ~ 800 a 1000 muestras por semana de manera continua. El rendimiento máximo depende de varios factores, sobre todo de cómo están disponibles para hacer el trabajo manual tanto de hardware (robots, placas de reactores, etc.) y la cantidad de &quot;software&quot; (es decir, la dotación de personal). El límite superior práctico es 2500 a 3000 muestras / semana; sin embargo, que la producción requiere un funcionamiento 7 días a la semana y varios becarios y técnicos de los estudiantes. En comparación, 3.000 muestras por HPLC requerirían aproximadamente 125 días de samanálisis PLE más la mano de obra adicional de pesaje manualmente muestras en los reactores y las muestras de filtrado antes del análisis.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Wiley mill</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>3375E15 (Model 4), or 3383L20 (Mini-mill)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-static bags</td>
			<td>Minigrip*</td>
			<td>MGST4P02503</td>
			<td>2.5x3&#34;, multiple suppliers available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tin-coated copper wire</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>8871K84</td>
			<td>0.016&#34; diameter, bend-and-stay wire</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tea-bags</td>
			<td>Herbco</td>
			<td>press n&#39; brew teabags</td>
			<td>3.5x5 inches</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gluco-amylase</td>
			<td>Novozymes</td>
			<td>Spirizyme Fuel&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alpha-amylase</td>
			<td>Novozymes</td>
			<td>Liquozyme SC DS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">
			<table cellpadding="0" cellspacing="0">
				<tbody>
					<tr>
						<td>sodium acetate trihydrate</td>
					</tr>
				</tbody>
			</table>
			</td>
			<td>any chemical supplier</td>
			<td></td>
			<td>reagent grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acetic acid</td>
			<td>any chemical supplier</td>
			<td></td>
			<td>reagent grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>190 proof (95%) ethanol</td>
			<td>any chemical supplier</td>
			<td></td>
			<td>reagent grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hoppers</td>
			<td>Freeslate</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well C-276 Hastelloy plates</td>
			<td>Aspen Machining (Lafayette, Colorado)</td>
			<td>N/A (custom built)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/8&#8221; soldering iron tip</td>
			<td>Sears</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>silicone-adhesive backed Teflon tape</td>
			<td>3M</td>
			<td>5180</td>
			<td>3&#34; wide (36-yard rolls)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>enzyme solution</td>
			<td>Novozymes</td>
			<td></td>
			<td>Cellic CTec2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>citric acid monohydrate</td>
			<td>any chemical supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trisodium citrate dihydrate</td>
			<td>any chemical supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>disposable, polystyrene 96-well plates</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>655101</td>
			<td>or equivalent; multiple suppliers available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glucose oxidase/peroxidase&#160;</td>
			<td>Megazyme</td>
			<td>K-Gluc</td>
			<td>Megazyme D-glucose assay kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xylose dehydrogenase</td>
			<td>Megazyme</td>
			<td>K-Xylose</td>
			<td>Megazyme D-xylose assay kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glucose standard solution</td>
			<td>Megazyme</td>
			<td>K-Gluc</td>
			<td>Megazyme D-glucose assay kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xylose standard solution</td>
			<td>Megazyme</td>
			<td>K-Xylose</td>
			<td>Megazyme D-xylose assay kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stainless steel sample cups</td>
			<td>Frontier Laboratories</td>
			<td>PY1-EC80F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass fiber sheets</td>
			<td>Pall</td>
			<td>66227</td>
			<td>8x10&#34; sheets--circles punched with standard hole punch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sugarcane Bagasse Whole Biomass Feedstock</td>
			<td>NIST</td>
			<td>8491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eastern Cottonwood (poplar) Whole Biomass Feedstock</td>
			<td>NIST</td>
			<td>8492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monterey Pine Whole Biomass Feedstock</td>
			<td>NIST</td>
			<td>8493</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheat Straw Whole Biomass Feedstock</td>
			<td>NIST</td>
			<td>8494</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput screening of recalcitrance variations in lignocellulosic biomass: total lignin, lignin monomers, and enzymatic sugar release

The conversion of lignocellulosic biomass to fuels, chemicals, and other commodities has been explored as one possible pathway toward reductions in the use of non-renewable energy sources. In order to identify which plants, out of a diverse pool, have the desired chemical traits for downstream applications, attributes, such as cellulose and lignin content, or monomeric sugar release following an enzymatic saccharification, must be compared. The experimental and data analysis protocols of the standard methods of analysis can be time-consuming, thereby limiting the number of samples that can be measured. High-throughput (HTP) methods alleviate the shortcomings of the standard methods, and permit the rapid screening of available samples to isolate those possessing the desired traits. This study illustrates the HTP sugar release and pyrolysis-molecular beam mass spectrometry pipelines employed at the National Renewable Energy Lab. These pipelines have enabled the efficient assessment of thousands of plants while decreasing experimental time and costs through reductions in labor and consumables.

El efecto combinado del pretratamiento termoquímico y posterior enzima de sacarificación se mide como una función de la masa de glucosa y xilosa liberado al final del ensayo. Los resultados se reportan en términos de miligramos de glucosa y xilosa liberados por gramo de biomasa. Esto está en marcado contraste con los datos reportados a partir de ensayos a escala de banco, que generalmente se reporta como por ciento de rendimiento teórico basado en análisis de la composición del material de partida. Como todavía...

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High-throughput Screening of Recalcitrance Variations in Lignocellulosic Biomass: Total Lignin, Lignin Monomers, and Enzymatic Sugar Release

Plant cell wall structure and chemistry traits are evaluated to identify ideal feedstocks for biofuels and bio-materials. Standard methods have limitations when applied to large data sets. These high-throughput pretreatment, enzyme saccharification, and pyrolysis-molecular beam mass spectrometry methods compare large numbers of biomass samples with decreased experimental time and cost.

Selección de alto rendimiento de las Variaciones obstinación en lignocelulósica Biomasa: Total lignina, lignina Monómeros y enzimática Azúcar de lanzamiento

The conversion of lignocellulosic biomass to fuels, chemicals, and other commodities has been explored as one possible pathway toward reductions in the ...

high-throughput-screening-recalcitrance-variations-lignocellulosic

Research

JoVE Journal

Environment

9.9K vistas.  National Renewable Energy Laboratory. Plant cell wall structure and chemistry traits are evaluated to identify ideal feedstocks for biofuels and bio-materials. Standard methods have limitations when applied to large data sets. These high-throughput pretreatment, enzyme saccharification, and pyrolysis-molecular beam mass spectrometry methods compare large numbers of biomass samples with decreased experimental time and cost.

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Determination of Microbial Extracellular Enzyme Activity in Waters, Soils, and Sediments using High Throughput Microplate Assays

Much of the nutrient cycling and carbon processing in natural environments occurs through the activity of extracellular enzymes released by microorganisms. Thus, measurement of the activity of these extracellular enzymes can give insights into the rates of ecosystem level processes, such as organic matter decomposition or nitrogen and phosphorus mineralization. Assays of extracellular enzyme activity in environmental samples typically involve exposing the samples to artificial colorimetric or fluorometric substrates and tracking the rate of substrate hydrolysis. Here we describe microplate based methods for these procedures that allow the analysis of large numbers of samples within a short time frame. Samples are allowed to react with artificial substrates within 96-well microplates or deep well microplate blocks, and enzyme activity is subsequently determined by absorption or fluorescence of the resulting end product using a typical microplate reader or fluorometer. Such high throughput procedures not only facilitate comparisons between spatially separate sites or ecosystems, but also substantially reduce the cost of such assays by reducing overall reagent volumes needed per sample.

Microplate based procedures are described for the colorimetric or fluorometric analysis of extracellular enzyme activity. These procedures allow for the rapid assay of such activity in large numbers of environmental samples within a manageable time frame.

Determinación de la actividad enzimática extracelular microbiana en aguas, suelos y sedimentos de los que utilizan y alto rendimiento de microplacas Ensayos

Much of the nutrient cycling and carbon  processing in natural environments occurs through the activity of extracellular  enzymes released by ...

Investigación

Medio ambiente

High-throughput Fluorometric Measurement of Potential Soil Extracellular Enzyme Activities

Microbes in soils and other environments produce extracellular enzymes to depolymerize and hydrolyze organic macromolecules so that they can be assimilated for energy and nutrients. Measuring soil microbial enzyme activity is crucial in understanding soil ecosystem functional dynamics. The general concept of the fluorescence enzyme assay is that synthetic C-, N-, or P-rich substrates bound with a fluorescent dye are added to soil samples. When intact, the labeled substrates do not fluoresce. Enzyme activity is measured as the increase in fluorescence as the fluorescent dyes are cleaved from their substrates, which allows them to fluoresce. Enzyme measurements can be expressed in units of molarity or activity. To perform this assay, soil slurries are prepared by combining soil with a pH buffer. The pH buffer (typically a 50 mM sodium acetate or 50 mM Tris buffer), is chosen for the buffer&#39;s particular acid dissociation constant (pKa) to best match the soil sample pH. The soil slurries are inoculated with a nonlimiting amount of fluorescently labeled (i.e. C-, N-, or P-rich) substrate. Using soil slurries in the assay serves to minimize limitations on enzyme and substrate diffusion. Therefore, this assay controls for differences in substrate limitation, diffusion rates, and soil pH conditions; thus detecting potential enzyme activity rates as a function of the difference in enzyme concentrations (per sample).
Fluorescence enzyme assays are typically more sensitive than spectrophotometric (i.e. colorimetric) assays,&#160;but can suffer from interference caused by impurities and the instability of many fluorescent compounds when exposed to light; so caution is required when handling fluorescent substrates. Likewise, this method only assesses potential enzyme activities under laboratory conditions when substrates are not limiting. Caution should be used when interpreting the data representing cross-site comparisons with differing temperatures or soil types, as in situ soil type and temperature can influence enzyme kinetics.

To measure potential rates of soil extracellular enzyme activities, synthetic substrates that are bound to a fluorescent dye are added to soil samples. Enzyme activity is measured as the fluorescent dye is released from the substrate by an enzyme-catalyzed reaction, where higher fluorescence indicates more substrate degradation.

De Alto Rendimiento Fluorometric Medición de Potencial del Suelo extracelulares enzimáticos Actividades

Microbes in soils and other environments produce extracellular enzymes to depolymerize and hydrolyze organic macromolecules so that they can be ...

Semi-High Throughput Screening for Potential Drought-tolerance in Lettuce (Lactuca sativa) Germplasm Collections

This protocol describes a method by which a large collection of the leafy green vegetable lettuce (Lactuca sativa L.) germplasm was screened for likely drought-tolerance traits. Fresh water availability for agricultural use is a growing concern across the United States as well as many regions of the world. Short-term drought events along with regulatory intervention in the regulation of water availability coupled with the looming threat of long-term climate shifts that may lead to reduced precipitation in many important agricultural regions has increased the need to hasten the development of crops adapted for improved water use efficiency in order to maintain or expand production in the coming years. This protocol is not meant as a step-by-step guide to identifying at either the physiological or molecular level drought-tolerance traits in lettuce, but rather is a method developed and refined through the screening of thousands of different lettuce varieties. The nature of this screen is based in part on the streamlined measurements focusing on only three water-stress indicators: leaf relative water content, wilt, and differential plant growth following drought-stress. The purpose of rapidly screening a large germplasm collection is to narrow the candidate pool to a point in which more intensive physiological, molecular, and genetic methods can be applied to identify specific drought-tolerant traits in either the lab or field. Candidates can also be directly incorporated into breeding programs as a source of drought-tolerance traits.

Semi-High Throughput Screening for Potential Drought-tolerance in Lettuce Lactuca sativa Germplasm Collections

This protocol was developed to screen a large germplasm collection of the leafy vegetable lettuce (Lactuca sativa L.) for drought-tolerance, in order to identify a small candidate pool of lettuce for use in physiological, molecular, and genetic studies to identify underlying drought-tolerance traits along with breeding programs.

Semi-Alto rendimiento para Screening Potencial Sequía-tolerancia en lechuga (<em&gt; Lactuca sativa</em&gt;) colecciones de germoplasma

This protocol describes a method by which a large collection of the leafy green vegetable lettuce (Lactuca sativa L.) germplasm was screened for likely ...

Pretreatment of Lignocellulosic Biomass with Low-cost Ionic Liquids

A number of ionic liquids (ILs) with economically attractive production costs have recently received growing interest as media for the delignification of a variety of lignocellulosic feedstocks. Here we demonstrate the use of these low-cost protic ILs in the deconstruction of lignocellulosic biomass (Ionosolv pretreatment), yielding cellulose and a purified lignin. In the most generic process, the protic ionic liquid is synthesized by accurate combination of aqueous acid and amine base. The water content is adjusted subsequently. For the delignification, the biomass is placed into a vessel with IL solution at elevated temperatures to dissolve the lignin and hemicellulose, leaving a cellulose-rich pulp ready for saccharification (hydrolysis to fermentable sugars). The lignin is later precipitated from the IL by the addition of water and recovered as a solid. The removal of the added water regenerates the ionic liquid, which can be reused multiple times. This protocol is useful to investigate the significant potential of protic ILs for use in commercial biomass pretreatment/lignin fractionation for producing biofuels or renewable chemicals and materials.

The pretreatment of lignocellulosic biomass with protic low-cost ionic liquids is shown, resulting in a delignified cellulose-rich pulp and a purified lignin. The pulp gives rise to high glucose yields after enzymatic saccharification.

El pretratamiento de la biomasa lignocelulósica con bajo costo líquidos iónicos

A number of ionic liquids (ILs) with economically attractive production costs have recently received growing interest as media for the delignification of ...

Ammonia Fiber Expansion (AFEX) Pretreatment of Lignocellulosic Biomass

Lignocellulosic materials are plant-derived feedstocks, such as crop residues (e.g., corn stover, rice straw, and sugar cane bagasse) and purpose-grown energy crops (e.g., miscanthus, and switchgrass) that are available in large quantities to produce biofuels, biochemicals, and animal feed. Plant polysaccharides (i.e., cellulose, hemicellulose, and pectin) embedded within cell walls are highly recalcitrant towards conversion into useful products. Ammonia fiber expansion (AFEX) is a thermochemical pretreatment that increases accessibility of polysaccharides to enzymes for hydrolysis into fermentable sugars. These released sugars can be converted into fuels and chemicals in a biorefinery. Here, we describe a laboratory-scale batch AFEX process to produce pretreated biomass on the gram-scale without any ammonia recycling. The laboratory-scale process can be used to identify optimal pretreatment conditions (e.g., ammonia loading, water loading, biomass loading, temperature, pressure, residence time, etc.) and generates sufficient quantities of pretreated samples for detailed physicochemical characterization and enzymatic/microbial analysis. The yield of fermentable sugars from enzymatic hydrolysis of corn stover pretreated using the laboratory-scale AFEX process is comparable to pilot-scale AFEX process under similar pretreatment conditions. This paper is intended to provide a detailed standard operating procedure for the safe and consistent operation of laboratory-scale reactors for performing AFEX pretreatment of lignocellulosic biomass.

Ammonia Fiber Expansion AFEX Pretreatment of Lignocellulosic Biomass

Ammonia fiber expansion (AFEX) is a thermochemical pretreatment technology that can convert lignocellulosic biomass (e.g., corn stover, rice straw, and sugarcane bagasse) into a highly digestible feedstock for both biofuels and animal feed applications. Here, we describe a laboratory-scale method for conducting AFEX pretreatment on lignocellulosic biomass.

Expansión de fibra de amoníaco (AFEX) Pretratamiento de biomasa lignocelulósica

Lignocellulosic materials are plant-derived feedstocks, such as crop residues (e.g., corn stover, rice straw, and sugar cane bagasse) and purpose-grown ...

A Novel Method for the Pentosan Analysis Present in Jute Biomass and Its Conversion into Sugar Monomers Using Acidic Ionic Liquid

Recently, ionic liquids (ILs) are used for biomass valorization into valuable chemicals because of their remarkable properties such as thermal stability, lower vapor pressure, non-flammability, higher heat capacity, and tunable solubility and acidity. Here, we demonstrate a method for the synthesis of C5 sugars (xylose and arabinose) from the pentosan present in jute biomass in a one-pot process by utilizing a catalytic amount of Br&#248;nsted acidic 1-methyl-3-(3-sulfopropyl)-imidazolium hydrogen sulfate IL. The acidic IL is synthesized in the lab and characterized using NMR spectroscopic techniques for understanding its purity. The various properties of BAIL are measured such as acid strength, thermal and hydrothermal stability, which showed that the catalyst is stable at a higher temperature (250 &#176;C) and possesses very high acid strength (Ho 1.57). The acidic IL converts over 90% of pentosan into sugars and furfural. Hence, the presenting method in this study can also be employed for the evaluation of pentosan concentration in other kinds of lignocellulosic biomass.

We present a protocol for the synthesis of C5 sugars (xylose and arabinose) from a renewable non-edible lignocellulosic biomass (i.e., jute) with the presence of Br&#248;nsted acidic ionic liquids (BAILs) as the catalyst in water. The BAILs catalyst exhibited better catalytic performance than conventional mineral acid catalysts (H2SO4 and HCl).

Un nuevo método para el análisis de este presente en la biomasa de yute y su transformación en monómeros de azúcar con ácido líquido iónico

Recently, ionic liquids (ILs) are used for biomass valorization into valuable chemicals because of their remarkable properties such as thermal stability, ...

High-throughput, Microscale Protocol for the Analysis of Processing Parameters and Nutritional Qualities in Maize (Zea mays L.)

Maize is an important grain crop in the United States and worldwide. However, maize grain must be processed prior to human consumption. Furthermore, whole grain composition and processing characteristics vary among maize hybrids and can impact the quality of the final processed product. Therefore, in order to produce healthier processed food products from maize, it is necessary to know how to optimize processing parameters for particular sets of germplasm to account for these differences in grain composition and processing characteristics. This includes a better understanding of how current processing techniques impact the nutritional quality of the final processed food product. Here, we describe a microscale protocol that both simulates the processing pipeline to produce cornflakes from large flaking grits and allows for the processing of multiple grain samples simultaneously. The flaking grits, the intermediate processed products, or final processed product, as well as the corn grain itself, can be analyzed for nutritional content as part of a high-throughput analytical pipeline. This procedure was developed specifically for incorporation into a maize breeding research program, and it can be modified for other grain crops. We provide an example of the analysis of insoluble-bound ferulic acid and p-coumaric acid content in maize. Samples were taken at five different processing stages. We demonstrate that sampling can take place at multiple stages during microscale processing, that the processing technique can be utilized in the context of a specialized maize breeding program, and that, in our example, most of the nutritional content was lost during food product processing.

High-throughput, Microscale Protocol for the Analysis of Processing Parameters and Nutritional Qualities in Maize Zea mays L.

Here, we present a microscale protocol for processing grain samples and for incorporating this microscale approach into a high-throughput analytical pipeline. This is a higher throughput adaptation of currently available protocols.

Alto rendimiento, microescala protocolo para el análisis de los parámetros de procesamiento y cualidades nutritivas en maíz (Zea mays L.)

Maize is an important grain crop in the United States and worldwide. However, maize grain must be processed prior to human consumption. Furthermore, whole ...

A 3-dimensional (3D)-printed Template for High Throughput Zebrafish Embryo Arraying

The zebrafish is a globally recognized fresh water organism frequently used in developmental biology, environmental toxicology, and human disease related research fields. Thanks to its unique features, including large fecundity, embryo translucency, rapid and simultaneous development, etc., zebrafish embryos are often used for large scale toxicity assessment of chemicals and drug/compound screening. A typical screening procedure involves adult zebrafish spawning, embryos selection, and arraying the embryos into multi-well plates. From there, embryos are subjected to exposure and the toxicity of chemical, or the effectiveness of the drugs/compounds can be evaluated relatively quickly based on phenotypic observations. Among these processes, embryos arraying is one of the most time-consuming and labor-intensive steps that limits the throughput level. In this protocol, we present an innovative approach that makes use of a 3D-printed arraying template coupled with vacuum manipulation to speed up this laborious step. The protocol herein describes the overall design of the arraying template, a detailed experimental setup and step-by-step procedure, followed by representative results. When implemented, this approach should prove beneficial in a variety of research applications using zebrafish embryos as testing subjects.

A 3-dimensional 3D-printed Template for High Throughput Zebrafish Embryo Arraying

Here, we present a protocol to design and fabricate a zebrafish embryo arraying template, followed by a detailed procedure on the use of such template for high throughput zebrafish embryo arraying into a 96-well plate.

3 dimensiones (3D)-impreso la plantilla para alto rendimiento embrión de pez cebra matriz

The zebrafish is a globally recognized fresh water organism frequently used in developmental biology, environmental toxicology, and human disease related ...

A High-throughput Assay for the Prediction of Chemical Toxicity by Automated Phenotypic Profiling of Caenorhabditis elegans

Applying toxicity testing of chemicals in higher order organisms, such as mice or rats, is time-consuming and expensive, due to their long lifespan and maintenance issues. On the contrary, the nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) has advantages to make it an ideal choice for toxicity testing: a short lifespan, easy cultivation, and efficient reproduction. Here, we describe a protocol for the automatic phenotypic profiling of C. elegans in a 384-well plate. The nematode worms are cultured in a 384-well plate with liquid medium and chemical treatment, and videos are taken of each well to quantify the chemical influence on 33 worm features. Experimental results demonstrate that the quantified phenotype features can classify and predict the acute toxicity for different chemical compounds and establish a priority list for further traditional chemical toxicity assessment tests in a rodent model.

A High-throughput Assay for the Prediction of Chemical Toxicity by Automated Phenotypic Profiling of Caenorhabditis elegans

A quantitative method has been developed to identify and predict the acute toxicity of chemicals by automatically analyzing the phenotypic profiling of Caenorhabditis elegans. This protocol describes how to treat worms with chemicals in a 384-well plate, capture videos, and quantify toxicological related phenotypes.

Un análisis de alto rendimiento para la predicción de toxicidad química por perfiles fenotípicos automatizado de Caenorhabditis elegans

Applying toxicity testing of chemicals in higher order organisms, such as mice or rats, is time-consuming and expensive, due to their long lifespan and ...

High-throughput Siderophore Screening from Environmental Samples: Plant Tissues, Bulk Soils, and Rhizosphere Soils

Siderophores (low-molecular weight metal chelating compounds) are important in various ecological phenomenon ranging from iron (Fe) biogeochemical cycling in soils, to pathogen competition, plant growth promotion, and cross-kingdom signaling. Furthermore, siderophores are also of commercial interest in bioleaching and bioweathering of metal-bearing minerals and ores. A rapid, cost effective, and robust means of quantitatively assessing siderophore production in complex samples is key to identifying important aspects of the ecological ramifications of siderophore activity, including, novel siderophore producing microbes. The method presented here was developed to assess siderophore activity of in-tact microbiome communities, in environmental samples, such as soil or plant tissues. The samples were homogenized and diluted in a modified M9 medium (without Fe), and enrichment cultures were incubated for 3 days. Siderophore production was assessed in samples at 24, 48, and 72 hours (h) using a novel 96-well microplate CAS (Chrome azurol sulphonate)-Fe agar assay, an adaptation of the traditionally tedious and time-consuming colorimetric method of assessing siderophore activity, performed on individual cultivated microbial isolates. We applied our method to 4 different genotypes/Lines of wheat (Triticum aestivum L.), including Lewjain, Madsen, and PI561725, and PI561727 commonly grown in the inland Pacific Northwest. Siderophore production was clearly impacted by the genotype of wheat, and in the specific types of plant tissues observed. We successfully used our method to rapidly screen for the influence of plant genotype on siderophore production, a key function in terrestrial and aquatic ecosystems. We produced many technical replicates, yielding very reliable statistical differences in soils and within plant tissues. Importantly, the results show the proposed method can be used to rapidly examine siderophore production in complex samples with a high degree of reliability, in a manner that allows communities to be preserved for later work to identify taxa and functional genes.

We present a protocol for rapid screening of environmental samples for siderophore potential contributing to micronutrient bioavailability and turnover in terrestrial systems.

Pseudobactina high-throughput Screening de muestras ambientales: los tejidos, a granel suelos y rizosfera de suelos de la planta

Siderophores (low-molecular weight metal chelating compounds) are important in various ecological phenomenon ranging from iron (Fe) biogeochemical cycling ...