ההדמיה המיקרוסקופית נערכה באמצעות השירותים של מרכז אוניברסיטת מישיגן למתקדם מיקרוסקופית. יבלת תירס נרכשה ממרכז טרנספורמציה תירס של אוניברסיטת איווה סטייט. המחברים מבקשים להודות לר &#39;ג&#39;פרי Weatherhead של מעבדת מחקר צמח MSU לקבלת הסיוע הטכני שלו על הניתוח של הפחמימות. מחקר זה מומן בנדיבות על ידי תכנית תירס השיווק של מישיגן (CMPM) וConsortium למחקר ביוטכנולוגיה צמח (CPBR).

1. הכנה של מבני dsRNAi משמש לDown-תקנה של ZmCCR1 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פריימרים ספציפיים גן העיצוב כוללים אתרי אנזים הגבלה הכרחיים להכנת dsRNAi לבנות לעקום החוצה את גן ZmCCR1. שתי קבוצות פריימר נועדו להגביר שני מגזרים שבר של ZmCCR1 cDNA:. בר 523 נ&quot;ב מנוקלאוטיד 748-1271, ושבר נ&quot;ב 285 מנוקלאוטיד 986-1271 ZmCCR1 cDNA נמסר מאריזונה מכון הגנום (AGI). פרטים נוספים מתוארים באיור 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להגביר את הבר הגדול על ידי תגובת שרשרת פולימרז (PCR) מתבנית ZmCCR1 cDNA באמצעות ZmCCR1_748F_BglII פריימרים (5&#39;-AGATCTACATCCTCAAGTACCTGGAC-3 &quot;) וZmCCR1_1271R_NcoI (5&#39;-CCATGGTTTACACAGCAGGGGAAGGT-3&quot;). להגביר את הבר הקטן יותר (285 נ&quot;ב) באמצעות ZmCCR1_986F_BglII פריימרים (5&#39;-AGATCTGGAAGCAGCCGTACAAGTTC-3 &quot;) וZmCCR1_1271R_SacI (5R17;-GAGCTCTTTACACAGCAGGGGAAGGT-3 &quot;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בנפרד ולקשור את השברים לתוך pGEM-T קל בעקבות הוראות היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע בידוד פלסמיד דנ&quot;א מיני הכנה מtransformants הבודד, כל אחד שמכיל את pGEM-T בונה באמצעות ערכת פלסמיד מיני הכנה מסחרית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעכל שני pGEM-T :: ZmCCR1 (523 נ&quot;ב) וImpactVector (IV) -1.1 (וקטור ביטוי ציטופלסמה) עם שני BglII וNcoI. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ולקשור את הבר הגדול מתעכל ג&#39;ל מטוהר ZmCCR1 (523 נ&quot;ב) לתוך הג&#39;ל מתעכל מטוהר IV-1.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעכל את pGEM-T :: ZmCCR1 (285 נ&quot;ב) וIV-1.1 :: ZmCCR1 (523 נ&quot;ב) עם שתי BglII וSACI כדי להכניס את הבר הקטן לתוך IV-1.1 :: ZmCCR1 (523 נ&quot;ב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ולקשור את הג&#39;ל מתעכל הקטן בר מטוהר ZmCCR1 (285 נ&quot;ב) לתוך הג&#39;ל מתעכל המטוהרים IV-1.1 :: ZmCCR1 (523 נ&quot;ב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Clone שני נ&quot;ב 523 ו285 fragmen נ&quot;בts לIV-1.1 לעשות RNAi ZmCCR1 לבנות, שבו יש רצף חוזר הפוך 285 נ&quot;ב עם spacer נ&quot;ב 238 באמצע שברים חוזרים ההפוך (ראה איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את זה לבנות לתוך Escherichia coli (E. coli), לגדל אותם ולבצע בידוד פלסמיד דנ&quot;א גודל פוליפוני-הכנה כדי להשיג פלסמיד דנ&quot;א מספיק לשינוי גנטי תירס. </li></ol> 2. תירס טרנספורמציה הגנטית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנה של חלקיקי טונגסטן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח 60 מ&quot;ג של חרוזים טונגסטן (M10) בצינור 1.5 מ&quot;ל ולשטוף עם 1 מיליליטר של אתנול 70% על ידי vortexing למשך 2 דקות. דגירה של 10 דקות ב23 מעלות צלזיוס אז צנטריפוגות ב18,894 XG במשך 2 דקות וזורקים supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 3x עם 1 מיליליטר של 100% אתנול, צנטריפוגה למשך 2 דקות ושלכת supernatant. הוסף 1 מיליליטר של גליצרול 50% סטרילי כדי להביא את ריכוז microparticle 60 מ&quot;ג / מיליליטר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנה של ה-DNA לפצצה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Plאס 50 μl (3 מ&quot;ג) של חרוזים טונגסטן ערוכים גליצרול 50% לתוך צינור 1.5 מיליליטר. הוסף 5 μl (1 מיקרוגרם) של IV-1.1 :: ZmCCR1 RNAi פלסמיד דנ&quot;א, 50 μl של 2.5 M CaCl 2, ו20 μl של 0.1 M spermidine. בקצרה מערבולת בין כל תוספת של חומרים כימיים לעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ורטקס בקצרה טונגסטן חרוז-DNA התערובת ו צנטריפוגות ב XG 18,894 ל30 שניות. יוצקים את supernatant ו resuspend את כדורים ב140 μl של 70% אתנול. הסר את הנוזל וזורק. הוספת 140 μl של 100% אתנול. הסר את הנוזל וזורק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 48 μl של 100% אתנול. להשתמש מייד או לאחסן על קרח לתקופה של עד 4 שעות לפני ההפצצה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפצצה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח calli 3-5 סנטימטר קוטר Hi-II תירס embryogenic (בתנאי ממרכז שינוי תירס של אוניברסיטת איווה סטייט) באמצע 100 מ&quot;מ צלחות פטרי המכילות תקשורת N6OSM 32 (כosmotium) לפחות 4 שעות לפני ההפצצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Preparדואר מכשיר משלוח החלקיקים PSD-1000/He על פי הוראות היצרן 33. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר קיר חדר עם 70% אתנול. טען קרע דיסק 650 psi סטרילי לתוך כובע התמך סטרילי. מורחים 5-6 μl של פתרון M10-DNA על פני השטח של macrocarrier, בקצרה יבש. macrocarrier עומס והפסקת מסך להרכבת השקת microcarrier. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח ההרכבה השקת microcarrier וcalli תירס בחדר במרחק שנבחר מהמסך העצירה (L2 = 6 ס&quot;מ) ודלת נסגרת. להאיץ בחלל ריק של 27 psi נגד מסך רשת תיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על לחצן האש עד פרצי קרע דיסק ולחץ הליום מד יורד לאפס. שחרר את לחצן האש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה calli מופגז בצלחת פטרי המכילה N6OSM (בינוני האוסמוטי) 32 ל16 שעות בחושך ב27 ° C. לשבור את calli לכעשר חתיכות ויעבירו לN6E (בינוני אינדוקציה יבלת) 32 בצלחות פטרי ודגירה במשך 5 ימים אניn החושך ב27 מעלות צלזיוס. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחירה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 5 ימים בN6E, להעביר את calli על מדיום N6S (תקשורת בחירה) 32. תת כל calli על מדיום בחירה כל 30 ימים ל8-12 שבועות מבלי להפריע את מבנה calli. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר כשבועות 8-10, מגזרים צומחים במהירות לבנה יצמחו מתוך שאינו מתרבה וcalli אם נמקים באופן חלקי. בלו הרקמות בצמיחה המהירה הלבנות ותת להם בינוני טרי בחירה (N6S) 32 ותמשיך לדגור כאמור לעיל. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחדשות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר calli העוברי הלבן וגדל במהירות על מדיום התחדשות 32 דגירה כאמור במשך שבוע 1. לעבור calli embryogenic ההתחדשות לתקופה של אור יום שעה 16 ו8 חשוכות שעות ב 25-27 ° C </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את ההתחדשות יורה על ההשתרשות 32 בינוניים במבחנה זכוכית לאחר 3-4 שבועות, תמשיך לדגור כאמור לעיל. לאחר r משמעותיפיתוח oot מופיע, לשטוף את השורשים בזהירות מתחת לברז מים, ולאחר מכן השתלתי את שתילים ל4 &quot;סירים באדמה. כסה את הסירים עם שקיות ניילון כדי לשמור על לחות. לאחר 2 ימים לעשות חורים קטנים בשקיות הפלסטיק. אחרי 5-6 ימים להסיר את שקיות הפלסטיק. תמשיך לדגור כאמור לעוד 5-6 ימים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חממה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את השתילים לתוך סירי &quot;18 באדמה ולשמור באור שמש קיץ מלא או חממת אור. הצמחים מחדש הראשוניים נקראים T 0 ואילו הזרעים הראשונים שייכים לדור T 1. </li></ol></li></ol> 3. Assay היסטולוגית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"><ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן אמצע הצלעות של עלה התירס ב 5 מיליליטר של 10% ניטראלי שנאגרו פורמלין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תהליך ואקום לחדור עם פרפין על מעבד רקמות באמצעות מעבד רקמות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להטביע את הרקמות בפרפין באמצעות תחנת הטבעת HistoCentre III. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את פרפין העודף מהקצוות פעם גושKS הם התקררו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדגם סעיף במיקרומטר 4-5 עם microtome באמצעות microtome. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח סעיפים בשקופיות מיקרוסקופ ויבשים בחממה 56 מעלות צלזיוס במשך שעה 2-24. סעיפים בטוחים להפוך הם דבקו באופן מלא לשקופית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סעיפי Deparaffinize בשני שינויים של קסילן במשך 5 דקות ב23 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מימה מחליקה באמצעות שני שינויים של אתנול 100% למשך 2 דקות ושני שינויים של אתנול 95% למשך 2 דקות ב23 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את החלקים במים זורמים ברז למשך 2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתם עם 0.05% O הכחול toluidine ל1-2 דקות ולשטוף בקצרה עם DDH 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים coverslip על הדגימות עם שמן טבילה והדמיה עם מיקרוסקופ אור. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סריקה מיקרוסקופית אלקטרונים (SEM) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן אמצע הצלעות של עלה תירס מחולק הצולב בglutaraldehyde 4% ו0.1 M חיץ פוספט נתרן (pH 7.4) בשעה 4 מעלות צלזיוס למשך 1-2 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקצרה לשטוף את הדגימות במאגר, המיובש בסדרת אתנול (25%, 50%, 75%, ו95%) ל10-15 דקות בכל הדרגתיות ו100% אתנול עבור 10 דקות, 3x. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ייבש את אמצע צלעות מיובשת בחתך רוחב התירס עלה במייבש נקודה קריטי באמצעות נוזל פחמן דו חמצני כנוזל המעבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר הדגימות המיובשים של ספחי אלומיניום באמצעות כרטיסיות פחמן ואקום גבוה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעיל אמצע הצלעות של עלה התירס רכובים על ספחי אלומיניום עם זהב (כ 20 עובי ננומטר) בcoater גמגום מטוהר עם גז ארגון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבחון את הדגימות מצופים במיקרוסקופ אלקטרונים סורק JEOL שון-6400V (פולט אלקטרונים hexaboride ניתן). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונות דיגיטליות היו בתמונה באמצעות תוכנת ניתוח Pro (גרסת 3.2). </li></ol></li></ol> 4. Klason ליגנין מדידה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיל הדגימות באמצעות מסך 2 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בדיקת לחות כדי לקבוע את תכולת הלחות של כל דגימה ולהקליט את הערך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול את ~ 1.5 גרם של כל דגימה ולהקליט ההמוני. Extract הדגימות באמצעות מים להפקת הראשונה, ואחריו אתנול לחילוץ השני או באמצעות חולץ אוטומטי ממס (3 מחזורים לחילוץ, ~ 14 דקות בכל מחזור) או soxhlet מנגנון (8 שעות לחילוץ). (הערה: צעד זה מסיר extractives שיכול להתעבות במהלך הידרוליזה חומצה ולהפריע למדידה מדויקת ליגנין, להגדיל את התוכן ליגנין Klason הנראית לעין.) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ייבשו את הדגימות שחולצו ב45 מעלות צלזיוס למשך לילה, ולאחר מכן לאפשר להם להתקרר בייבוש, ולשקול שוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת חממה ל30 ° C. מדוד 0.3 גרם של כל דגימה יבשה, מופק לתוך צינורות בלחץ גבוה בורג העליון (triplicates לדגימה מומלץ) ולהקליט את המשקולות ל0.1 מ&quot;ג הקרוב ביותר. הוסף 3 מיליליטר של 72% H 2 SO 4 לכל צינור לחץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את המדגם באמצעות זכוכית או מוט מערבבים טפלון. השאר את המוט ומערבבים בצינור עד שמים מתווספים הבא דגירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים צלוחיות בחממת seלא ל30 מעלות צלזיוס ו150 סל&quot;ד 60 דקות. אחרי שעה 1 להוסיף 84 מיליליטר של מים deionized לדלל את ריכוז החומצה ל -4% ולערבב עם המוט ומערבבים. היזהר שלא להשאיר כמויות גדולות של מדגם בצדדים של הבקבוקון מעל קו המים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חוזקה לאטום את פקקים בכל הבקבוקונים ולהכניס אותם לתוך מתקן מתכת או כוסות גדולות. החיטוי ב 121 מעלות צלזיוס באמצעות מחזור עיקור נוזלי במשך שעה 1. לאפשר להם להתקרר לטמפרטורת חדר לפני הפתיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרום אפר כורי היתוך הסינון בתנור ב575 מעלות צלזיוס במשך לפחות 4 שעות. אפשר לכורים היתוך כדי לקרר בתא ייבוש לשעה לפחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אבק לסנן את הפתרון מצינור שדרך כור היתוך נפרד, תוך שימוש במתאם גומי כדי לאבטח את כור ההיתוך. השתמש במי deionized כדי לשטוף את כל חלקיקים שנותרו מהצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ייבש את השאריות ליגנין ב105 ° C למשך התקופה מינימאלית של 4 שעות. רשום את משקליו של כור ההיתוך והשאריות יבשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם אתם משתמשים במעלות צלזיוס 575, מראשאש הדגימות מעל מבער בונזן עד אין עשן או אפר ולאחר מכן למקם בכבשן ל24 שעות, או אם באמצעות תנור לתכנות, לא מראש אפר ולהשתמש בתכנית הבאה: </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רמפה מטמפרטורת חדר ל105 ° C ולהחזיק עבור 12 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רמפה ל250 מעלות צלזיוס ב 10 ° C / min ולהחזיק למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רמפה ל575 מעלות צלזיוס ב 20 ° C / min ולהחזיק לפחות 180 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את כורי ההיתוך מהתנור ולקרר בתא ייבוש. לשקול את כור ההיתוך ואפר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את שאריות החומצה לא מסיסות באמצעות המשוואה הבאה: </li></ol><img alt="משוואת 1" fo:content-width="300" src="/files/ftp_upload/51340/51340eq1.jpg" width="450" /> M PRE = מסה של ביומסה מופק מראש M POST = מסה של ביומסה הודעה חולץ- M = מסת הבקבוקון של ביומסה חילוץ נוספת לבקבוקון M = מסת שאריות של resid כור ההיתוך וליגניןUE M ASH = מסה של כור היתוך ואפר MC = תכולת רטיבות של ביומסה מופק מראש, הכולל בסיס משקל 5. ניתוח פחמימות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע קיר פחמימות תא ניתוחים הבוסס על פוסטר ואח&#39;.) 2010 (פרוטוקול 31 ב. בקיצור, היכונו שאריות בלתי מסיסות אלכוהול מחומר צמחי הקפאה מיובשת. אז hydrolyze החומר עם חומצת trifluoroacetic ולהתאים את נגזרי monosaccharide solubilized לאצטטים alditol המקביל שלהם. לנתח נגזרים נדיפים אלה על ידי גז כרומטוגרפיה (GC) מחוברת לספקטרומטר מסה מרובע. </li></ol>

<ol>
	<li>Ralph, J., Grabber, J. H., Hatfield, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lignin-ferulate+cross-links+in+grasses+-+Active+incorporation+of+ferulate+polysaccharide+esters+into+ryegrass+lignins.">Lignin-ferulate cross-links in grasses - Active incorporation of ferulate polysaccharide esters into ryegrass lignins.</a> Carbohydrate research. , 275-178 (1995).</li><li>Park, S. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Expediting cellulosic biofuels agenda: Production of high value-low volume co-products and lignin down-regulation of bioenergy crops [Ph.D. thesis]. , (2011).</li><li>Boerjan, W., Ralph, J., Baucher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lignin+biosynthesis.">Lignin biosynthesis.</a> Annual review of plant biology. 54, 519-546 (2003).</li><li>Gibson, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hierarchical+structure+and+mechanics+of+plant+materials.">The hierarchical structure and mechanics of plant materials.</a> Journal of the Royal Society, Interface / the Royal Society. 9, 2749-2766 (2012).</li><li>Dien, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+alfalfa+conversion+efficiencies+for+sugar+recovery+and+ethanol+production+by+altering+lignin+composition.">Enhancing alfalfa conversion efficiencies for sugar recovery and ethanol production by altering lignin composition.</a> Bioresource technology. , 102-6486 (2011).</li><li>Fu, C. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Downregulation+of+Cinnamyl+Alcohol+Dehydrogenase+(CAD)+Leads+to+Improved+Saccharification+Efficiency+in+Switchgrass.">Downregulation of Cinnamyl Alcohol Dehydrogenase (CAD) Leads to Improved Saccharification Efficiency in Switchgrass.</a> Bioenerg Res. 4, 153-164 (2011).</li><li>Grabber, J. H., Ralph, J., Hatfield, R. D., Quideau, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p-hydroxyphenyl,+guaiacyl,+and+syringyl+lignins+have+similar+inhibitory+effects+on+wall+degradability.">p-hydroxyphenyl, guaiacyl, and syringyl lignins have similar inhibitory effects on wall degradability.</a> Journal of agricultural and food chemistry. 45, 2530-2532 (1997).</li><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lignin+monomer+composition+affects+Arabidopsis+cell-wall+degradability+after+liquid+hot+water+pretreatment.">Lignin monomer composition affects Arabidopsis cell-wall degradability after liquid hot water pretreatment.</a> Biotechnology for biofuels. 3, (2010).</li><li>Mansfield, S. D., Kang, K. Y., Chapple, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designed+for+deconstruction--poplar+trees+altered+in+cell+wall+lignification+improve+the+efficacy+of+bioethanol+production.">Designed for deconstruction--poplar trees altered in cell wall lignification improve the efficacy of bioethanol production.</a> The New phytologist. 194, 91-101 (2012).</li><li>Studer, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lignin+content+in+natural+Populus+variants+affects+sugar+release.">Lignin content in natural Populus variants affects sugar release.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 6300-6305 (2011).</li><li>Chen, F., Dixon, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lignin+modification+improves+fermentable+sugar+yields+for+biofuel+production.">Lignin modification improves fermentable sugar yields for biofuel production.</a> Nature. 25, 759-761 (2007).</li><li>Ziebell, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increase+in+4-coumaryl+alcohol+units+during+lignification+in+alfalfa+(Medicago+sativa)+alters+the+extractability+and+molecular+weight+of+lignin.">Increase in 4-coumaryl alcohol units during lignification in alfalfa (Medicago sativa) alters the extractability and molecular weight of lignin.</a> The Journal of biological chemistry. 285, 38961-38968 (2010).</li><li>Park, S. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+quest+for+alternatives+to+microbial+cellulase+mix+production:+corn+stover-produced+heterologous+multi-cellulases+readily+deconstruct+lignocellulosic+biomass+into+fermentable+sugars.">The quest for alternatives to microbial cellulase mix production: corn stover-produced heterologous multi-cellulases readily deconstruct lignocellulosic biomass into fermentable sugars.</a> Journal of Chemical Technolog., and Biotechnology. 86, 633-641 (2011).</li><li>Mol, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+plant+gene+expression+by+antisense+RNA.">Regulation of plant gene expression by antisense RNA.</a> FEBS letters. 268, 427-430 (1990).</li><li>Adamo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgene-mediated+cosuppression+and+RNA+interference+enhance+germ-line+apoptosis+in+Caenorhabditis+elegans.">Transgene-mediated cosuppression and RNA interference enhance germ-line apoptosis in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 3440-3445 (2012).</li><li>Smith, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+silencing+by+intron-spliced+hairpin+RNAs.">Total silencing by intron-spliced hairpin RNAs.</a> Nature. 407, 319-320 (2000).</li><li>Park, S. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Downregulation+of+Maize+Cinnamoyl-Coenzyme+A+Reductase+via+RNA+Interference+Technology+Causes+Brown+Midrib+and+Improves+Ammonia+Fiber+Expansion-Pretreated+Conversion+into+Fermentable+Sugars+for+Biofuels.">Downregulation of Maize Cinnamoyl-Coenzyme A Reductase via RNA Interference Technology Causes Brown Midrib and Improves Ammonia Fiber Expansion-Pretreated Conversion into Fermentable Sugars for Biofuels.</a> Crop Sci. 52, 2687-2701 (2012).</li><li>Altpeter, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle+bombardment+and+the+genetic+enhancement+of+crops:+myths+and+realities.">Particle bombardment and the genetic enhancement of crops: myths and realities.</a> Mol Breeding. 15, 305-327 (2005).</li><li>Pichon, M., Courbou, I., Beckert, M., Boudet, A. M., Grima-Pettenati, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+characterization+of+two+maize+cDNAs+encoding+cinnamoyl-CoA+reductase+(CCR)+and+differential+expression+of+the+corresponding+genes.">Cloning and characterization of two maize cDNAs encoding cinnamoyl-CoA reductase (CCR) and differential expression of the corresponding genes.</a> Plant molecular biology. 38, 671-676 (1998).</li><li>Mansoor, S., Amin, I., Hussain, M., Zafar, Y., Briddon, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+novel+traits+in+plants+through+RNA+interference.">Engineering novel traits in plants through RNA interference.</a> Trends in plant science. 11, 559-565 (2006).</li><li>Hatfield, R. D., Jung, H. -. J. G., Ralph, J., Buxton, D. R., Weimer, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+the+insoluble+residues+produced+by+the+Klason+lignin+and+acid+detergent+lignin+procedures.">A comparison of the insoluble residues produced by the Klason lignin and acid detergent lignin procedures.</a> J Sci Food Agr. 65, 51-58 (1994).</li><li>Sluiter, J. B., Ruiz, R. O., Scarlata, C. J., Sluiter, A. D., Templeton, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compositional+analysis+of+lignocellulosic+feedstocks.+1.+Review+and+description+of+methods.">Compositional analysis of lignocellulosic feedstocks. 1. Review and description of methods.</a> Journal of agricultural and food chemistry. 58, 9043-9053 (2010).</li><li>Sluiter, A., Hames, B., Ruiz, R., Scarlata, C., Sluiter, J., Templeton, D., Crocker, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+structural+carbohydrates+and+lignin+in+biomass.">Determination of structural carbohydrates and lignin in biomass.</a> Laboratory Analytic Procedure. , (2008).</li><li>Bate, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Relationship+between+Phenylalanine+Ammonia-Lyase+Levels+and+Phenylpropanoid+Accumulation+in+Transgenic+Tobacco+Identifies+a+Rate-Determining+Step+in+Natural+Product+Synthesis.">Quantitative Relationship between Phenylalanine Ammonia-Lyase Levels and Phenylpropanoid Accumulation in Transgenic Tobacco Identifies a Rate-Determining Step in Natural Product Synthesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 7608-7612 (1994).</li><li>Hu, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repression+of+lignin+biosynthesis+promotes+cellulose+accumulation+and+growth+in+transgenic+trees.">Repression of lignin biosynthesis promotes cellulose accumulation and growth in transgenic trees.</a> Nature. 17, 808-812 (1999).</li><li>Lapierre, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signatures+of+cinnamyl+alcohol+dehydrogenase+deficiency+in+poplar+lignins.">Signatures of cinnamyl alcohol dehydrogenase deficiency in poplar lignins.</a> Phytochemistry. 65, 313-321 (2004).</li><li>Updegraff, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semimicro+determination+of+cellulose+in+biological+materials.">Semimicro determination of cellulose in biological materials.</a> Anal Biochem. 32, 420-424 (1969).</li><li>Yemm, E. W., Willis, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+estimation+of+carbohydrates+in+plant+extracts+by+anthrone.">The estimation of carbohydrates in plant extracts by anthrone.</a> The Biochemical journal. 57, 508-514 (1954).</li><li>Filomena, A. P., Cherie, W., Geoffrey, B. F., Antony, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+the+polysaccharide+composition+of+plant+cell+walls.">Determining the polysaccharide composition of plant cell walls.</a> Nature. 7, 1590-1607 (2012).</li><li>Foster, C. E., Martin, T. M., Pauly, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+Compositional+Analysis+of+Plant+Cell+Walls+(Lignocellulosic+biomass)+Part+II:+Carbohydrates.">Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls (Lignocellulosic biomass) Part II: Carbohydrates.</a> J. Vis. Exp. (e1837), (2010).</li><li>Department of Agronomy, Iowa State University. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle+bombardment+of+Hi+II+immature+zygotic+embryos+and+recovery+of+transgenic+maize+plants.">Particle bombardment of Hi II immature zygotic embryos and recovery of transgenic maize plants.</a> , (2005).</li><li>Cano-Delgado, A., Penfield, S., Smith, C., Catley, M., Bevan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+cellulose+synthesis+invokes+lignification+and+defense+responses+in+Arabidopsis+thaliana.">Reduced cellulose synthesis invokes lignification and defense responses in Arabidopsis thaliana.</a> The Plant journal : for cell and molecular biology. 34, 351-362 (2003).</li><li>Boudet, A. M., Kajita, S., Grima-Pettenati, J., Goffner, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lignins+and+lignocellulosics:+a+better+control+of+synthesis+for+new+and+improved+uses.">Lignins and lignocellulosics: a better control of synthesis for new and improved uses.</a> Trends in plant science. 8, 576-581 (2003).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

הנגישות של cellulases חיידקים לשתול דופן תא סוכרים תלויה במידה רבה על המידה שבה הם קשורים עם פולימרים פנוליות 23. יחס ההמרה מביומסה lignocellulosic לתסיס סוכר מתואם שלילי עם תוכן ליגנין הופקד בקירות תא secondadry צמח. קשר זה מיוחס למאפיינים הפיזיים של ליגנין כגון הידרופוביות 2...

הייצור של דלק ביולוגי מביומסה lignocellulosic רצוי מאוד בשל השפע הנוכחי שלה בארה&quot;ב 1, ובמקרה של קציר קיימא של שאריות חקלאיות וייעור, את היכולת לא להתחרות ישירות לשדה יבול המשמש לייצור מזון למזון ובעלי חיים. עם זאת, בניגוד לגרעיני תירס, המהווה את המקור העיקרי של דלק ביולוגי שנוצר כיום בארה&quot;ב, חומרי lignocellulosic באופן משמעותי יותר מורכב וקשה לשבור. בנוסף לפחמימות ארוכת שרשרת, תאית hemicellulose, שהם המקורות העיקריים של סוכרים במהלך התסיסה של חומרי lignocellulosic, סוגים רבים של קירות תא הצמח מכילים גם ליגנין, פולימר phenylpropanoid המספק כוח, הגנה מפני התקפת הפתוגן, והידרופוביות לקירות תא. אמנם הכרחי לגידול צמחים והישרדות, ליגנין גם מציג מכשול משמעותי להמרה האנזימטית המוצלחת של התאית וhemicelluלהפסיד לסוכרים מסיסים. חומרים בעלי תוכן ליגנין גבוה הם בדרך כלל חומרים פחות רצויים עבור שני הדלק הביולוגי (דרך מסלולי גיור ביולוגי) ותעשיות עיסת נייר בשל ההשפעות השליליות על מאפייני עיבוד ואיכות מוצר. לפיכך, מניפולציה גנטית של חומרים צמחיים ליגנין הפחתה ברמה שלא תפריע לכוח מבני יבול ומערכות הגנה עשויה להיות חשובה לצמצום עלויות ייצור עבור שני הדלק הביולוגי lignocellulosic ותעשיות עיסת נייר. בתירס (Zea mays), ליגנין הוא קוולנטית צולבים לhemicellulose בקיר התא הראשוני באמצעות ferulate וגשרי diferulate 2. מורכב ליגנין-hemicellulose נקשר microfibrils תאית באמצעות קשרי מימן, ויוצר מטריצה ​​מורכבת שמעניקה שלמות וכוח לקיר התא המשני. החוזק המכני של קירות תא הצמח נקבע במידה רבה על ידי הסוג של lignin יחידות משנה 3-5. במחקרים קודמים, לשנות את הפרופורציות של יחידות משנה ליגנין לא הראה מגמה ברורה בעיכול אנזימטי 6-11. עם זאת, ירידות בתוכן ליגנין בדרך כלל מראות שיפור בהמרות 12,13 ועשוי להיות מפתח להגדלת הנעכלות של חומר צמחי על ידי אנזימי hydrolytic כולל endocellulases, cellobiohydrolases, וβ-glucosidases 14. הנדסה גנטית כדי לווסת את רמת הביטוי של תעתיקים כבר התאמנה באופן נרחב כדי לשפר את יבול תכונות. טכניקות מתקדמות, ובכלל זה נגד תחושה 15 ושיתוף דיכוי 16 טכנולוגיות, מאפשרות יעילות למטה רגולציה של גנים המטרה. עקום החוצה גן שלם גם הושג באמצעות בונה גן מקודד RNA-שחבור אינטרון עם מבנה סיכת ראש 17. יתר על כן, התערבות RNA פעמיים תקועה טכניקה (dsRNAi), כלומר תקשורת ביטוי גנים חזקה ויעילהטור שעובד או על ידי השפלת תמליל מיקוד או דיכוי תרגום, מספק אמצעים חזקים כדי לגרום למגוון רחב של תופעות דיכוי על היעד mRNA 18. טכניקות השתקת גנים להראות כמה מגבלות. טכניקות אלו דווקא לא לווסת את הרמה של שעתוק וזה יכול לגרום לתופעות בלתי צפויות בהשתקת גנים הומולוגיים אחרים. בשיטה זו, אנו מועסקים הפצצת חלקיקים לבצע dsRNAi בונה לתוך הגנום התירס. נכון להיום, מגוון רחב של מיני צמחים כבר שינה בהצלחה באמצעות הפצצת חלקיקים, שינוי בתיווך Agrobacterium, electroporation, ושיטות microinjection. בשינוי גנטי תירס, שיטת הפצצת חלקיקים יש יתרון על פני כל השיטות האחרות, מכיוון שהוא יעיל ביותר. הפצצת חלקיקים אינה תלויה בחיידקים, ולכן השיטה היא ללא אילוצים ביולוגיים כגון הגודל של הגן, מינים של גן אוigin, או גנוטיפ הצמח. מערכת מסירת transgene הפיסית מאפשרת DNA משקל מולקולרי גבוה ומספר רבים של גנים כדי להיות הציגה לתוך הגנום של צמח, ובמקרים מסוימים לכלורופלסטים ביעילות שינוי גבוה 19. הפחתת ליגנין במערכת כלי הדם של אמצע צלע העלים ניתן דמיינו באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM) אשר מועילה לבחינת הטופוגרפיה ואת ההרכב של דגימות. בצמחי תירס, שתיים מרדוקטאז cinnamoyl-CoA (ZmCCR1: X98083 וZmCCR2: Y15069) גנים נמצאו בגנום התירס 20. רדוקטאז Cinnamoyl-CoA מזרז את ההמרה של אסטרים hydroxycinnamoyl-CoA לאלדהידים cinnamyl. אנחנו בחרנו בגן ZmCCR1 ללמטה לווסת אנזים זה, כי הגן מתבטא בכל רקמות lignifying. 523 נוקלאוטידים בתחנה הסופית של &#39;3 של גן ZmCCR1 נבחרו לdsRNAi לבנות כי הרצפים שנראהמגוון יותר בהשוואה לאלו של ZmCCR2. לפיכך, מבנה dsRNAi הייתי דווקא להיקשר רק לZmCCR1, הימנעות מחוץ יעד השתקת 21. מבנה ZmCCR1_RNAi תוכנן לImpactVector1.1 תג מערכת ביטוי cytoplasmic (IV 1.1) המכיל את אמרגן הרקמות הספציפי הירוק, ribulose-1, oxygenase 5-bisphosphate carboxylase (RuBisCO). כדי לחקור את ההשפעות של dsRNAi לבנות על צמחים מהונדסים, תוכן ליגנין היה לכמת. המדידה ליגנין Klason (חומצה לא מסיס) ידועה להיות מדויקים יותר בהשוואה לשיטות הכימות ליגנין חומר ניקוי החומצה שsolubilize כמה ליגנין 22. לכן, ליגנין Klason נמדד בגבעולי תירס מהונדסים. הליך זה מורכב מחומצת הידרוליזה שני שלבים שממירה פחמימות פולימריים למונוסכרידים מסיס 23. ביומסה שעברה הידרוליזה הייתה אז מופרדת לmateri מסיסה ובלתי מסיסה החומצהals וליגנין מסיס החומצה נמדדו על פי מחקרים קודמים 23,24. באופן אידיאלי, ניתוח ליגנין צריך לכלול עקירות עם מים ואתנול לפני צעד הידרוליזה, על מנת להסיר חומרים מסיסים שיכול להטות את התוצאות, ובעירה שלאחר הידרוליזה של שאריות ליגנין לתת דין וחשבון לכל אפר נוכח בשאריות. ללא צעדים אלה, תוכן ליגנין של המדגם יכול להיות מנופח באופן מלאכותי. השיטה המלאה מוצגת כאן, עם זאת לניסויים שלנו לא הצליחו לבצע את שני הצעדים האלה בשל ההיקף הקטן של חומר זמין לבדיקות שני מרכיבים אחרים של דופן תא, תאית hemicellulose נותחו גם בליגנין קווי תירס מהונדס למטה מוסדר. זה כבר דווח כי צמחים מהונדסים שהיו למטה מוסדר באו אמונית האנזים זה פנילאלנין (PAL) 25, 4 coumarate-: האנזים CoA (4CL) 26, או cinnamylדהידרוגנז lcohol (CAD) 27 להראות עלייה ברכיבים מבניים דופן תא אחרים. כצעד ראשון במחקרים שלנו, תאית גבישים נמדד תוך שימוש בשיטת Updegraff 28. שיטה זו תוכננה במקור לקביעת תאית במספר רב של חיידקים ופטריות cellulolytic. בקצרה, טופלו מניות התירס הסתובבו עם מגיב Updegraff (חומצה אצטית: חומצה חנקתית: מים) כדי להסיר hemicellulose, ליגנין, וxylosans. תאית גבישים הייתה הידרוליזה לחלוטין לגלוקוז באמצעות הידרוליזה Saeman על ידי הוספת H 2 SO 4. תאית גבישים הייתה אז assayed בשיטת anthrone colorimetric 29. כדי לוודא אם תוכן hemicellulose שונו, תמציות monosaccharide מגבעולים הסתובבו היו הידרוליזה באמצעות חומצת trifluoroacetic, derivatized בשיטה אצטט alditol ולאחר מכן נותחו על ידי גז כרומטוגרפיה (GC) 30. הנהלים מפורטים עבור טלפונים סלולר גבישיםניתוחי הרכב סוכרים תוכן ומטריצת lulose מתוארים בפוסטר et al. (2010) ביום 31. כאן, אנו מתארים את הנהלים המשמשים ליגנין למטה רגולציה בתירס באמצעות טכנולוגיית RNAi, שינוי הפצצת חלקיקים, וניתוח ליגנין לפירוק מואץ של ביומסה lignocellulosic תירס לסוכרים תסיס לדלק ביולוגי.

<table><tbody><tr><td>N6OSM (Osmotic medium)</td><td></td><td></td><td>Made in-house</td></tr><tr><td>N6E (Callus induction)</td><td></td><td></td><td>Made in-house</td></tr><tr><td>N6S media (Selection media)</td><td></td><td></td><td>Made in-house</td></tr><tr><td>Regeneration medium</td><td></td><td></td><td>Made in-house</td></tr><tr><td>Rooting medium</td><td></td><td></td><td>Made in-house</td></tr><tr><td>10% Neutral buffered formalin (1 L)</td><td></td><td></td><td>Made in-house</td></tr><tr><td>Bio-Rad PSD-1000/He Particle Delivery device</td><td>Hercules, CA, United States</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zeiss PASCAL confocal laser scanning microscope</td><td>Carl Zeiss, Jena, Germany</td><td></td><td>For brightfield microscopy, the images were recorded using a Zeiss (Jena, Germany) PASCAL confocal laser scanning microscope with a 488 nm excitation mirror, a 560 nm emission filter, and a 505-530 nm emission filter. Image analysis was performed using Laser scanning microscope PASCAL LSM version 3.0 SP3 software.</td></tr><tr><td>Excelsior ES Tissue Processor</td><td>Thermo Scientific, Pittsburgh, PA, United States</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HistoCentre III Embedding Station</td><td>Thermo Scientific, Pittsburgh, PA, United States</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microtome Model Reichert 2030</td><td>Reichert, Depew, NY, United States</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Emscope Sputter Coater model SC 500</td><td>Ashford, Kent, England</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JEOL JSM-6400V Scanning Electron Microscope</td><td>JEOL Ltd., Tokyo, Japan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fitzpatrick JT-6 Homoloid mill</td><td>Continental Process Systems, Inc., Westmont, IL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MA35 Moisture Analyzer</td><td>Sartorius</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Critical point dryer, Balzers CPD</td><td>Leica Microsysstems Inc, Buffalo Grove, IL, United States</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Screw-top high pressure tubes</td><td>Ace Glass, Vineland, NJ</td><td>#8648-27</td><td></td></tr><tr><td>Screw-top high pressure tube plugs</td><td>Ace Glass, Vineland, NJ</td><td>#5845-47</td><td></td></tr></tbody></table>

lignin down-regulation of zea mays via dsrnai and klason lignin analysis

כדי להקל על השימוש בביומסה lignocellulosic כמשאב יואנרגיה חלופי, במהלך תהליכי גיור ביולוגיים, יש צורך בצעד מקדים לפתוח את המבנה של דופן תא צמח, הגדלת הנגישות של דופן תא הפחמימות. ליגנין, חומרי polyphenolic נוכח סוגים רבים דופן תא, ידוע להיות מכשול משמעותי לאנזים גישה. ירידה בתוכן יגנין לרמה שאינו מפריעה למערכת יושרה והגנה המבנית של הצמח עשויה להיות צעד חשוב כדי להפחית את עלויות ייצור bioethanol. במחקר זה, יש לנו למטה מוסדר מבחינה גנטית אחד מהגנים הקשורים לביוסינתזה ליגנין, רדוקטאז cinnamoyl-CoA (ZmCCR1) באמצעות טכניקת התערבות גדילים כפולה RNA. מבנה ZmCCR1_RNAi שולב בגנום התירס בשיטת הפצצת חלקיקים. צמחי תירס מהונדסים גדלו בדרך כלל בהשוואה לצמחי ביקורת הפראית מהסוג ללא בterfering עם צמיחה ביומסה או מנגנוני הגנה, הפרט להצגה של חום צבע באמצע צלעות מהונדסות עלה צמחים, קליפות, וגבעולים. הניתוחים המיקרוסקופיים, בשיתוף עם assay היסטולוגית, גילו כי סיבי sclerenchyma העלה היו דלילים אך המבנה והגודל של רכיבי מערכת כלי דם גדולים אחרים לא שונו. תוכן ליגנין בתירס המהונדס הופחת ב 7-8.7%, התוכן תאית גבישים הוגדל בתגובה להפחתת ליגנין, וhemicelluloses נותר ללא שינוי. הניתוחים עשויים להצביע על כך זרימת פחמן שאולי הייתה זזה מביוסינתזה יגנין לביוסינתזה תאית. מאמר זה מפרט את הנהלים המשמשים ללמטה להסדיר את תוכן ליגנין בתירס באמצעות טכנולוגיית RNAi, ואת דופן תא ההלחנה ניתוחים משמש לאימות את ההשפעה של השינויים בתא קיר המבנה.

אנחנו הוכיחו הפחתה בתוכן יגנין בצמחי תירס באמצעות RNAi. שיטת שינוי הפצצת החלקיקים הניבה סביב 30% יעילות trnasformation. השתקת הגן של ZmCCR1 נצפתה באופן עקבי בדורות T0-T2. Transgenics ליגנין המופחת גדל באופן דומה לצמחי תירס wildtype פרט להצגת גוון חום באמצע עלה צלעות, הקליפה והגזע. Assay היס?...

Watch this Scientific Journal Video about Lignin Down-regulation of Zea mays via dsRNAi and Klason Lignin Analysis at JoVE.com

Lignin Down-regulation of Zea mays via dsRNAi and Klason Lignin Analysis

טכניקת התערבות RNA פעמיים תקועה (dsRNAi) היא מועסק ללמטה להסדיר את אנזים cinnamoyl תירס רדוקטאז גן (ZmCCR1) לתוכן ליגנין צמח נמוך יותר. ליגנין למטה תקנה מקיר התא דמיינו ידי ניתוח מיקרוסקופי ולכמת בשיטת Klason. שינויי הלחנה בhemicellulose ותאיים גבישים מנותחים.

ליגנין Down-תקנה של<em&gt; Zea mays</em&gt; באמצעות dsRNAi וKlason ליגנין ניתוח

To facilitate the use of lignocellulosic biomass as an alternative bioenergy resource, during biological conversion processes, a pretreatment step is ...

lignin-down-regulation-zea-mays-via-dsrnai-klason-lignin

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Lignin Down-regulation of Zea mays via dsRNAi and Klason Lignin Analysis

13.3K Views.  University of Arizona.  טכניקת התערבות RNA פעמיים תקועה (dsRNAi) היא מועסק ללמטה להסדיר את אנזים cinnamoyl תירס רדוקטאז גן (ZmCCR1) לתוכן ליגנין צמח נמוך יותר. ליגנין למטה תקנה מקיר התא דמיינו ידי ניתוח מיקרוסקופי ולכמת בשיטת Klason. שינויי הלחנה בhemicellulose ותאיים גבישים מנותח...

Video: Lignin Down-regulation of Zea mays via dsRNAi and Klason Lignin Analysis

The Use of Induced Somatic Sector Analysis (ISSA) for Studying Genes and Promoters Involved in Wood Formation and Secondary Stem Development

Secondary stem growth in trees and associated wood formation are significant both from biological and commercial perspectives. However, relatively little is known about the molecular control that governs their development. This is in part due to physical, resource and time limitations often associated with the study of secondary growth processes. A number of in vitro techniques have been used involving either plant part or whole plant system in both woody and non-woody plant species. However, questions about their applicability for the study of secondary stem growth processes, the recalcitrance of certain species and labor intensity are often prohibitive for medium to high throughput applications. Also, when looking at secondary stem development and wood formation the specific traits under investigation might only become measurable late in a tree&#39;s lifecycle after several years of growth. In addressing these challenges alternative in vivo protocols have been developed, named Induced Somatic Sector Analysis, which involve the creation of transgenic somatic tissue sectors directly in the plant&#39;s secondary stem. The aim of this protocol is to provide an efficient, easy and relatively fast means to create transgenic secondary plant tissue for gene and promoter functional characterization that can be utilized in a range of tree species. Results presented here show that transgenic secondary stem sectors can be created in all live tissues and cell types in secondary stems of a variety of tree species and that wood morphological traits as well as promoter expression patterns in secondary stems can be readily assessed facilitating medium to high throughput functional characterization.

The Use of Induced Somatic Sector Analysis ISSA for Studying Genes and Promoters Involved in Wood Formation and Secondary Stem Development

Here we present a protocol that facilitates the medium to high throughput functional characterization of gene and promoter constructs in tree secondary stem tissue within comparatively short time frames. It is efficient, easy to use and widely applicable to a range of tree species.

השימוש בניתוח מגזר סומטיים מושרה (ISSA) לימוד גנים ומקדמי המעורבים ביצירת עץ ופיתוח גזע משניים

Secondary stem growth in trees and associated wood formation are significant both from biological and commercial perspectives. However, relatively little ...

Genetics

Experimental Design for Laser Microdissection RNA-Seq: Lessons from an Analysis of Maize Leaf Development

Genes with important roles in development frequently have spatially and/or temporally restricted expression patterns. Often these gene transcripts are not detected or are not identified as differentially expressed (DE) in transcriptomic analyses of whole plant organs. Laser Microdissection RNA-Seq (LM RNA-Seq) is a powerful tool to identify genes that are DE in specific developmental domains. However, the choice of cellular domains to microdissect and compare, and the accuracy of the microdissections are crucial to the success of the experiments. Here, two examples illustrate design considerations for transcriptomics experiments; a LM RNA-seq analysis to identify genes that are DE along the maize leaf proximal-distal axis, and a second experiment to identify genes that are DE in liguleless1-R (lg1-R) mutants compared to wild-type. Key elements that contributed to the success of these experiments were detailed histological and in situ hybridization analyses of the region to be analyzed, selection of leaf primordia at equivalent developmental stages, the use of morphological landmarks to select regions for microdissection, and microdissection of precisely measured domains. This paper provides a detailed protocol for the analysis of developmental domains by LM RNA-Seq. The data presented here illustrate how the region selected for microdissection will affect the results obtained.

Many developmentally important genes have cell- or tissue-specific expression patterns. This paper describes LM RNA-seq experiments to identify genes that are differentially expressed at the maize leaf blade-sheath boundary and in lg1-R mutants compared to wild-type. The experimental considerations discussed here apply to transcriptomic analyses of other developmental phenomena.

עיצוב ניסיוני עבור לייזר Microdissection RNA-seq: לקחים מניתוח התפתחות תירס ליף

Genes with important roles in development frequently have spatially and/or temporally restricted expression patterns. Often these gene transcripts are not ...

Biochemistry

High-throughput Screening of Recalcitrance Variations in Lignocellulosic Biomass: Total Lignin, Lignin Monomers, and Enzymatic Sugar Release

The conversion of lignocellulosic biomass to fuels, chemicals, and other commodities has been explored as one possible pathway toward reductions in the use of non-renewable energy sources. In order to identify which plants, out of a diverse pool, have the desired chemical traits for downstream applications, attributes, such as cellulose and lignin content, or monomeric sugar release following an enzymatic saccharification, must be compared. The experimental and data analysis protocols of the standard methods of analysis can be time-consuming, thereby limiting the number of samples that can be measured. High-throughput (HTP) methods alleviate the shortcomings of the standard methods, and permit the rapid screening of available samples to isolate those possessing the desired traits. This study illustrates the HTP sugar release and pyrolysis-molecular beam mass spectrometry pipelines employed at the National Renewable Energy Lab. These pipelines have enabled the efficient assessment of thousands of plants while decreasing experimental time and costs through reductions in labor and consumables.

Plant cell wall structure and chemistry traits are evaluated to identify ideal feedstocks for biofuels and bio-materials. Standard methods have limitations when applied to large data sets. These high-throughput pretreatment, enzyme saccharification, and pyrolysis-molecular beam mass spectrometry methods compare large numbers of biomass samples with decreased experimental time and cost.

הקרנת תפוקה גבוהה של וריאציות סרבנות בlignocellulosic יומסה: סה&quot;כ ליגנין, מונומרים ליגנין, ואנזימתי שחרור סוכר

The conversion of lignocellulosic biomass to fuels, chemicals, and other commodities has been explored as one possible pathway toward reductions in the ...

Environment

Visualizing Lignification Dynamics in Plants with Click Chemistry: Dual Labeling is BLISS!

Lignin is one of the most prevalent biopolymers on the planet and a major component of lignocellulosic biomass. This phenolic polymer plays a vital structural and protective role in the development and life of higher plants. Although the intricate mechanisms regulating lignification processes in vivo strongly impact the industrial valorization of many plant-derived products, the scientific community still has a long way to go to decipher them. In a simple three-step workflow, the dual labeling protocol presented herein enables bioimaging studies of actively lignifying zones of plant tissues. The first step consists in the metabolic incorporation of two independent chemical reporters, surrogates of the two native monolignols that give rise to lignin H- and G-units. After incorporation into growing lignin polymers, each reporter is then specifically labeled with its own fluorescent probe via a sequential combination of bioorthogonal SPAAC/CuAAC click reactions. Combined with lignin autofluorescence, this approach leads to the generation of three-color localization maps of lignin within plant cell walls by confocal fluorescence microscopy and provides precise spatial information on the presence or absence of active lignification machinery at the scale of plant tissues, cells and different cell wall layers.

BLISS, a dual labeling protocol for studying lignification dynamics, was developed. Using synthetic monolignol reporters and a sequential combination of SPAAC and CuAAC bioorthogonal click reactions, this methodology paves the way to in-depth analysis of the factors that regulate the biogenesis of lignins in planta.

להמחיש Lignification Dynamics בצמחים עם לחץ על כימיה: תיוג כפולה היא האושר!

Lignin is one of the most prevalent biopolymers on the planet and a major component of lignocellulosic biomass. This phenolic polymer plays a vital ...

Chemistry

Measuring Interactions between Fluorescent Probes and Lignin in Plant Sections by sFLIM Based on Native Autofluorescence

In lignocellulosic biomass (LB), the activity of enzymes is limited by the appearance of non-specific interactions with lignin during the hydrolysis process, which maintains enzymes far from their substrate. Characterization of these complex interactions is thus a challenge in complex substrates such as LB. The method here measures molecular interactions between fluorophore-tagged molecules and native autofluorescent lignin, to be revealed by F&#246;rster resonance energy transfer (FRET). Contrary to FRET measurements in living cells using two exogenous fluorophores, FRET measurements in plants using lignin is not trivial due to its complex autofluorescence. We have developed an original acquisition and analysis pipeline with correlated observation of two complementary properties of fluorescence: fluorescence emission and lifetime. sFLIM (spectral and fluorescent lifetime imaging microscopy) provides the quantification of these interactions with high sensitivity, revealing different interaction levels between biomolecules and lignin.

This protocol describes an original setup combining spectral and fluorescence lifetime measurements to evaluate F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) between rhodamine-based fluorescent probes and lignin polymer directly in thick plant sections.

מדידת אינטראקציות בין הפלורסנט לליגנין בסעיפים צמחיים על ידי sFLIM בהתבסס על מבוסס על קרינה פלואורסצנטית מקורית

In lignocellulosic biomass (LB), the activity of enzymes is limited by the appearance of non-specific interactions with lignin during the hydrolysis ...

Estimation of Plant Biomass Lignin Content using Thioglycolic Acid (TGA)

Lignin is a natural polymer that is the second most abundant polymer on Earth after cellulose. Lignin is mainly deposited in plant secondary cell walls and is an aromatic heteropolymer primarily composed of three monolignols with significant industrial importance. Lignin plays an important role in plant growth and development, protects&#160;from biotic and abiotic stresses, and in the quality of animal fodder, the wood, and industrial lignin products. Accurate estimation of lignin content is essential for both fundamental understanding of the lignin biosynthesis and industrial applications of biomass. The thioglycolic acid (TGA) method is a highly reliable method of estimating the total lignin content in the plant biomass. This method estimates the lignin content by forming thioethers with the benzyl alcohol groups of lignin, which are soluble in alkaline conditions and insoluble in acidic conditions. The total lignin content is estimated using a standard curve generated from commercial bamboo lignin.

Estimation of Plant Biomass Lignin Content using Thioglycolic Acid TGA

Here, we present a modified TGA method for estimation of lignin content in herbaceous plant biomass. This method estimates the lignin content by forming specific thioether bonds with lignin and presents an advantage over the Klason method, as it requires a relatively small sample for lignin content estimation.

הערכת תכולת ביומסה ליגנין צמחית באמצעות חומצה תיוגליקולית (TGA)

Lignin is a natural polymer that is the second most abundant polymer on Earth after cellulose. Lignin is mainly deposited in plant secondary cell walls ...

Label-free in situ Imaging of Lignification in Plant Cell Walls

Meeting growing energy demands safely and efficiently is a pressing global challenge. Therefore, research into biofuels production that seeks to find cost-effective and sustainable solutions has become a topical and critical task. Lignocellulosic biomass is poised to become the primary source of biomass for the conversion to liquid biofuels1-6. However, the recalcitrance of these plant cell wall materials to cost-effective and efficient degradation presents a major impediment for their use in the production of biofuels and chemicals4. In particular, lignin, a complex and irregular poly-phenylpropanoid heteropolymer, becomes problematic to the postharvest deconstruction of lignocellulosic biomass. For example in biomass conversion for biofuels, it inhibits saccharification in processes aimed at producing simple sugars for fermentation7. The effective use of plant biomass for industrial purposes is in fact largely dependent on the extent to which the plant cell wall is lignified. The removal of lignin is a costly and limiting factor8 and lignin has therefore become a key plant breeding and genetic engineering target in order to improve cell wall conversion.
Analytical tools that permit the accurate rapid characterization of lignification of plant cell walls become increasingly important for evaluating a large number of breeding populations. Extractive procedures for the isolation of native components such as lignin are inevitably destructive, bringing about significant chemical and structural modifications9-11. Analytical chemical in situ methods are thus invaluable tools for the compositional and structural characterization of lignocellulosic materials. Raman microscopy is a technique that relies on inelastic or Raman scattering of monochromatic light, like that from a laser, where the shift in energy of the laser photons is related to molecular vibrations and presents an intrinsic label-free molecular "fingerprint" of the sample. Raman microscopy can afford non-destructive and comparatively inexpensive measurements with minimal sample preparation, giving insights into chemical composition and molecular structure in a close to native state. Chemical imaging by confocal Raman microscopy has been previously used for the visualization of the spatial distribution of cellulose and lignin in wood cell walls12-14. Based on these earlier results, we have recently adopted this method to compare lignification in wild type and lignin-deficient transgenic Populus trichocarpa (black cottonwood) stem wood15. Analyzing the lignin Raman bands16,17 in the spectral region between 1,600 and 1,700 cm-1, lignin signal intensity and localization were mapped in situ. Our approach visualized differences in lignin content, localization, and chemical composition. Most recently, we demonstrated Raman imaging of cell wall polymers in Arabidopsis thaliana with lateral resolution that is sub-&mu;m18. Here, this method is presented affording visualization of lignin in plant cell walls and comparison of lignification in different tissues, samples or species without staining or labeling of the tissues.

Label-free in situ Imaging of Lignification in Plant Cell Walls

A method based on confocal Raman microscopy is presented that affords label-free visualization of lignin in plant cell walls and comparison of lignification in different tissues, samples or species.

ללא תווית באתרו הדמיה של Lignification בתוך קירות התא הצמח

Meeting growing energy demands safely and efficiently is a pressing global challenge. Therefore, research into biofuels production that seeks to find ...

Biology

Histochemical Staining of Arabidopsis thaliana Secondary Cell Wall Elements

Arabidopsis thaliana is a model organism commonly used to understand and manipulate various cellular processes in plants, and it has been used extensively in the study of secondary cell wall formation. Secondary cell wall deposition occurs after the primary cell wall is laid down, a process carried out exclusively by specialized cells such as those forming vessel and fiber tissues. Most secondary cell walls are composed of cellulose (40&#8211;50%), hemicellulose (25&#8211;30%), and lignin (20&#8211;30%). Several mutations affecting secondary cell wall biosynthesis have been isolated, and the corresponding mutants may or may not exhibit obvious biochemical composition changes or visual phenotypes since these mutations could be masked by compensatory responses. Staining procedures have historically been used to show differences on a cellular basis. These methods are exclusively visual means of analysis; nevertheless their role in rapid and critical analysis is of great importance. Congo red and calcofluor white are stains used to detect polysaccharides, whereas M&#228;ule and phloroglucinol are commonly used to determine differences in lignin, and toluidine blue O is used to differentially stain polysaccharides and lignin. The seemingly simple techniques of sectioning, staining, and imaging can be a challenge for beginners. Starting with sample preparation using the A. thaliana model, this study details the protocols of a variety of staining methodologies that can be easily implemented for observation of cell and tissue organization in secondary cell walls of plants.

Histochemical Staining of Arabidopsis thaliana Secondary Cell Wall Elements

Plant cell wall composition varies between tissue types and can include lignin, cellulose, hemicelluloses, and pectin. Various staining techniques have been developed to visualize differences at the cell-type level. This paper is a compilation of commonly used cell wall staining techniques.

הכתמה histochemical של<em&gt; Thaliana ארבידופסיס</em&gt; תא המשני בוול אלמנטים

Arabidopsis thaliana is a model organism commonly used to understand and manipulate various cellular processes in plants, and it has been used extensively ...

Lateral Root Inducible System in Arabidopsis and Maize

Lateral root development contributes significantly to the root system, and hence is crucial for plant growth. The study of lateral root initiation is however tedious, because it occurs only in a few cells inside the root and in an unpredictable manner. To circumvent this problem, a Lateral Root Inducible System (LRIS) has been developed. By treating seedlings consecutively with an auxin transport inhibitor and a synthetic auxin, highly controlled lateral root initiation occurs synchronously in the primary root, allowing abundant sampling of a desired developmental stage. The LRIS has first been developed for Arabidopsis thaliana, but can be applied to other plants as well. Accordingly, it has been adapted for use in maize (Zea mays). A detailed overview of the different steps of the LRIS in both plants is given. The combination of this system with comparative transcriptomics made it possible to identify functional homologs of Arabidopsis lateral root initiation genes in other species as illustrated here for the CYCLIN B1;1 (CYCB1;1) cell cycle gene in maize. Finally, the principles that need to be taken into account when an LRIS is developed for other plant species are discussed.

Lateral Root Inducible System in Arabidopsis and Maize

The Lateral Root Inducible System (LRIS) allows for synchronous induction of lateral roots and is presented for Arabidopsis thaliana and maize.

מערכת עין מתנהל שורש לרוחב ב<em&gt; ארבידופסיס</em&gt; ותירס

Lateral root development contributes significantly to the root system, and hence is crucial for plant growth. The study of lateral root initiation is ...

פיתוח טרנספורמציה גנטית ושיטות עריכה בבמבוק

In Planta Gene Expression and Gene Editing in Moso Bamboo Leaves

A novel in planta gene transformation method was developed for bamboo, which avoids the need for time-consuming and labor-intensive callus induction and regeneration processes. This method involves Agrobacterium-mediated gene expression via wounding and vacuum for bamboo seedlings. It successfully demonstrated the expression of exogenous genes, such as the RUBY reporter and Cas9 gene, in bamboo leaves. The highest transformation efficiency for the accumulation of betalain in RUBY seedlings was achieved using the GV3101 strain, with a percentage of 85.2% after infection. Although the foreign DNA did not integrate into the bamboo genome, the method was efficient in expressing the exogenous genes. Furthermore, a gene editing system has also been developed with a native reporter using this method, from which an in situ mutant generated by the edited bamboo violaxanthin de-epoxidase gene (PeVDE) in bamboo leaves, with a mutation rate of 17.33%. The mutation of PeVDE resulted in decreased non-photochemical quenching (NPQ) values under high light, which can be accurately detected by a fluorometer. This makes the edited PeVDE a potential native reporter for both exogenous and endogenous genes in bamboo. With the reporter of PeVDE, a cinnamoyl-CoA reductase gene was successfully edited with a mutation rate of 8.3%. This operation avoids the process of tissue culture or callus induction, which is quick and efficient for expressing exogenous genes and endogenous gene editing in bamboo. This method can improve the efficiency of gene function verification and will help reveal the molecular mechanisms of key metabolic pathways in bamboo.

מחבר זרקור: קידום עריכה גנטית בעלי במבוק לתחליפי פלסטיק בני קיימא 

In this study, a novel in planta gene expression and gene editing method mediated by Agrobacterium was developed in bamboo. This method greatly improved the efficiency of gene function validation in bamboo, which has significant implications for accelerating the process of bamboo breeding.

ב Planta ביטוי גנים ועריכת גנים בעלי במבוק מוסו

A novel in planta gene transformation method was developed for bamboo, which avoids the need for time-consuming and labor-intensive callus induction and ...

ליגנין Down-תקנה של

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video