El objetivo general de esta metodología es expandirse más allá del límite óptico de la mayoría de los citometros de flujo al permitir que un investigador registre cinco marcadores adicionales para interrogar poblaciones celulares complejas. Utilizando esta técnica, es posible lograr un inmunofenotipado profundo cuando se trabaja con instrumento con un bajo número de detectores o muestra con un número limitado de células. Comience este procedimiento transfiriendo cuidadosamente la sangre extraída a un tubo cónico de 50 mililitros.
Diluir la sangre con la misma cantidad de PBS sin calcio y magnesio. Agregue 15 mililitros de medio de gradiente de densidad al fondo de un nuevo tubo cónico de 50 mililitros. Superponga cuidadosamente la sangre diluida en la parte superior del medio de gradiente de densidad, evitando cualquier mezcla entre el medio de gradiente de densidad y la sangre diluida.
Centrifugar a 400 veces g durante 30 minutos a temperatura ambiente sin freno para evitar la interrupción de la interfaz. Después de la centrifugación, utilice una pipeta para aspirar y desechar cuidadosamente la capa superior, prestando atención a no eliminar las células en la interfaz entre el plasma y el medio de gradiente de densidad. Recoger tantas células mononucleares de sangre periférica, o PBMC, como sea posible desde la interfaz sin tocar el pellet de glóbulos rojos en la parte inferior del tubo cónico de 50 mililitros, y transferir a un nuevo tubo.
Agregue PBS para llevar el volumen final a 25 mililitros e invierta varias veces para mezclar. A continuación, lave los PBMC dos veces como se indica en el texto. Después de eliminar las plaquetas y contar los PBMC como se describe en el texto, resuspendir las células en PBS, 0.1%azida sódica a una concentración de uno por 10 a las séptimas células por mililitro.
Para preparar los PBMC para la tinción, transfiera 100 microlitros de cada muestra a una placa inferior en V de 96 pozos. Centrifugar la placa a 350 g durante tres minutos a temperatura ambiente. Aspirar cuidadosamente el sobrenadante sin alterar el pellet celular.
A cada pozo, agregue 100 microlitros de PBS que contengan un tinte fijable vivo/muerto que reaccione con amina libre en proteínas, y resusppend cuidadosamente la mezcla de PBMC. Posteriormente, deje que la placa se siente durante 10 minutos a temperatura ambiente para el etiquetado de las células muertas. Para cada muestra, prepare 30 microlitros de una mezcla que contenga los siete anticuerpos.
En esta etapa, también se pueden añadir anticuerpos valorados contra diferentes moléculas diana y en diferentes fluorocromos. Centrifugar la placa de 96 pozos a 350 veces g durante tres minutos a temperatura ambiente, y aspirar cuidadosamente el sobrenadante sin alterar el pellet celular. Añadir el cóctel de anticuerpos a cada pozo, y resuspender cuidadosamente sin generar burbujas.
Incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Después de 30 minutos, agregue 150 microlitros de tampón de tinción a cada pozo, y centrifugar la placa a 350 veces g durante tres minutos a temperatura ambiente. Aspirar cuidadosamente el sobrenadante sin alterar el pellet celular, y resuspender las células en 200 microlitros de PBS.
Las células ahora están listas para el análisis de citometría de flujo. Los anticuerpos anti-CD3, CD8, CD14, CD19 y TCR gamma delta se valora con una curva de índice de tinción máxima. La valoración de anticuerpos es el paso más crítico de este protocolo para identificar correctamente siete subconjuntos de células inmunitarias utilizando dos fluorocromos.
Para preparar una dilución de anticuerpos doble, llene 10 pocillos de una placa de 96 pocillos con 40 microlitros de tampón de tinción por pozo. A los efectos de este vídeo, solo se mostrará la valoración de anti-CD8. En el primer pozo, aumentar el volumen final a 80 microlitros de tampón de tinción, y añadir anti-CD8 a una concentración cuatro veces la concentración sugerida por el fabricante.
Mezcle bien y transfiera 40 microlitros al segundo pozo. Mezcla bien y repite este paso para todos los demás pozos. Mancha 10 muestras de PBMC o sangre entera con 30 microlitros de las 10 diferentes diluciones dobles de anti-CD8 siguiendo el protocolo demostrado anteriormente.
Adquiera datos con un citometro de flujo y trace la señal de cada dilución. Después de calcular el índice de manchas para cada concentración de anticuerpos como se detalla en el texto, trazar el índice de manchas frente a la concentración de anticuerpos expresada como una fracción de la dilución de anticuerpos e identificar la concentración de anticuerpos con el valor máximo del índice de manchas. Para valorar los anticuerpos anti-CD4 y anti-CD56, comience con la estrategia de dilución doble demostrada anteriormente, añadiendo concentraciones adicionales en el medio para identificar finamente el rango de concentración que permitirá la separación de células T CD4 positivas y células NK de las otras poblaciones celulares.
Valore el anticuerpo anti-CD4 colocando la señal anti-CD4 entre la doble señal CD8 positiva, CD3 positiva y la población positiva única CD3. Valorar el anticuerpo anti-CD56 siguiendo una estrategia similar a la valoración de anticuerpos anti-CD4, colocando células NK entre las poblaciones CD3 negativas y CD3 positivas. Para comenzar esta estrategia de gating de dos fluorocromos y siete marcadores, seleccione la puerta de linfocitos y cree una gráfica de puntos con uno de los dos fluorocromos utilizados en este protocolo en cada eje.
Puerta en células T CD8 positivas identificadas como células positivas dobles CD3 y CD8 en la esquina superior derecha de la gráfica de puntos. Excluya la población DIM CD8 que podría contener células NKT. Puerta en células T CD4 positivas identificadas como la población entre los t células T CD8 positivas y las poblaciones positivas únicas de CD3.
Puerta en células T gamma delta identificadas como células CD3 altas. Subdivide las células T gamma delta a CD8 positivas y CD8 negativas. Puerta en las células NK identificadas como la población entre células CD3 positivas y CD3 negativas.
Subdividir las células NK a CD8 positivo y CD8 negativo. Puerta en las células B identificadas como la población CD3 negativa, CD19-positiva en la esquina inferior derecha de la gráfica de puntos. Seleccione la puerta de monocitos y cree una gráfica de puntos con uno de los dos fluorocromos utilizados en este protocolo en cada eje.
Puerta en la población CD3 negativa, CD14-positiva. Usando esta estrategia, los linfocitos de un paciente con mieloma múltiple fueron cerrados sobre la base de su dispersión hacia adelante y dispersión lateral y su perfil citométrico de flujo. Las subpoblaciones de memoria CD8 positivas y las células T ingenuas se identificaron mediante la expresión de CD45RA y CCR7.
La expresión de HLA-DR y CD57 se utilizó para estudiar la activación de células T en células CD8 positivas ingenuas, memoria, memoria central, memoria del efector y células de memoria de efector CD45RA positivas. De manera similar, se identificaron células T ingenuas y de memoria CD4 positivas. Dentro de la población de memoria, CCR4 y CCR6 se utilizaron para identificar subpoblaciones de ayuda T en células T CD4 positivas.
Las subpoblaciones de células NK se caracterizaron por la expresión CD16 y CD57. Esta estrategia se utilizó para investigar la dinámica en poblaciones inmunitarias de muestras longitudinales de un donante con mieloma múltiple que recibe un trasplante de células madre. La caracterización de las subpoblaciones CD8 y CD4 a lo largo del tiempo mostró una activación sostenida de células T CD4 positivas y CD8 positivas y un sesgo de T helper a un fenotipo T-helper-one.
Pero en el día 60, el porcentaje de células B aumentó drásticamente, prediciendo la recaída del paciente. La preparación celular adecuada y la valoración de anticuerpos son pasos críticos para lograr resultados fiables utilizando esta técnica. Se pueden añadir anticuerpos dirigidos a otros marcadores para lograr un análisis de citometría de flujo más profundo y para crear paneles citométricos de flujo modular dirigidos a varios linajes al mismo tiempo.
Enfoques similares destinados a ampliar el número de marcadores grabables también podrían desarrollarse utilizando diferentes conjuntos de marcadores o para su uso en diferentes modelos animales. No olvide que el azida sódica puede causar quemaduras en la piel y los ojos. Por lo tanto, siempre se debe usar una capa de laboratorio, gafas protectoras y guantes cuando se manipule este reactivo.
