저자는 Drs에 많은 감사를하고 싶습니다. 작은 물고기와 양서류이 문화 프로토콜의 개발과 응용 프로그램에서 자신의 전문 지식에 대한 호셉 Planas와 후안 카스티요. 덕분에, 때문에 끊임없이 마태, Delci 크리스텐슨, 재커리 파울러, 브룩 프란 젠, 나단 프뢰 리히, 키라 마샬 충전 등 많은 물고기 (종 및 숫자 모두)에서 근육 조직의 박리와 해리에 지원 한 수많은 개인도 있습니다 벤 마이어, 이단 Remily 및 Sinibaldo 로메로. 이 작품은 생물 창업 자금 버밍엄학과, 프로테아제 연구 NIH 그랜트 # 2P20 RR015566, NIH NIAMS 그랜트 # R03AR055350 센터에서 알라바마 대학의 지원 및 PRB에 NDSU 사전 FORWARD NSF 그랜트 # HRD-0811239했다. 지원도 UAB 영양 비만 연구 센터 수상 # 1 P30DK056336, NIH NIDDK에 의해 제공되었다. 그 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 그 필요는 없습니다NIH의 공식 견해를 나타냅니다.

윤리 문 : 여기에 설명 척추 동물을 포함한 모든 실험은 버밍햄에 위치한 앨라배마 대학의 기관 동물 케어 및 사용위원회의 사전 승인 및 실험 동물 복지, 미국 국립 보건 연구소의 사무실에 의해 설립 된 가이드 라인과 일치했다 보건 복지부. 문화 1. 준비 <ol><li> (2 L 당 26.96 g 13.48 g / L) 9 mM의 탄산 수소 나트륨 (2 L 당 1.51 g), DMEM에서 20 mM의 HEPES (2 L 당 9.53 g)을 다음과 같이 기본 매체를 준비합니다. <ol><li> 산도를 결정하고 염산 또는 수산화 나트륨과 7.40로 조정합니다. </li><li> 삼투압을 결정하고 (필요한 경우) NaCl로 ~ 300 mOsm로 조정합니다. </li><li> 필터는 최대 2 ~ 3 개월 빛으로부터 보호 4 ° C에서 (2) 1 L의 진공 살균 시스템과 저장소를 사용하여 소독. 참고 : 전체 시약 표 1과 표 2를 참조, 도구, consum의당했을 및 장비 정보를 제공합니다. </li></ol></li><li> 초순수 멸균 물 50 ㎖에 γ-조사 폴리-L-라이신의 5 밀리그램 (&gt; 30 MW)를 용해하여 폴리-L-라이신 처리 접시를 준비합니다. 리신 중합체의 완전한 용해를 보장하는, 실온에서 10 분 동안 반전에 의해 부드럽게 혼합한다. </li><li> 판형 (표 3)에있어서, 각 웰에 폴리-L-라이신 용액의 필요량을 피펫. 플레이트는 5 분 동안 층류 후드에 서 할 수 있습니다. </li><li> 다음으로, 폴리-L-라이신 솔루션을 제거하고 멸균 물로 2 회 세척한다. 20 분 동안 층류 후드의 건조 공기 판을 허용합니다. </li><li> 라미닌의 1 MG (Engelbreth-홀름 - 떼 원점)를 얻어 20 μg / ML의 최종 농도에 기초 배지 50 ㎖에 용해. / cm 2 μg에 폴리-L-라이신 처리 된 세포 배양 접시에 라미닌 솔루션을 적용합니다. (다른 접시 크기의 표 3 참조) </li><li> 부드럽게 쿵푸을 보장하기 위해 솔루션을 소용돌이적용 잘거야. 24 시간 동안 실험실 테이프와 인큐베이터에있는 장소 플레이트를 밀봉. 인큐베이터는 사용되는 종에 적합한 온도 (표 7 참조)로 설정되어야하고, 추가 가스 배양기에 첨가 할 필요가 없다. 참고 : 라미닌이 세포를 파종하기 전에 24 시간 동안 플레이트에 부착 할 수 있어야합니다. 이렇게하는 실패는 세포 부착에별로 발생합니다. </li><li> 표 4에 설명 된대로 미디어를 준비합니다. 완료 미디어는 최고의 사용의 하루를 준비한다. </li><li> 조직 분리를위한 준비에서 다음 항목과 오토 클레이브 조립 : 300 ~ 500 ㎖의 비이커 (들); 유리 페트리 접시; 메스 핸들; 집게 (미세하고 거친); 해부 가위; 물 방수제 오토 클레이브 종이를 여러 장. 참고 : 해부 과정을 지원 각 사람의 경우, (2) 메스 핸들, (1) 집게 (유형은 개인의 취향에 따라), (1) 해부 가위, 물 방수제 오토 클레이브 용지 (5 ~ 10) 시트는충분. </li><li> 상기 멸균 항목 이외에, 70 % 에탄올, 중량 밸런스, 멸균 50 ㎖ 원추형 튜브 (번호 배양 크기에 의존한다), 그리고 얼음을 조립한다. </li></ol> 2. 조직의 해부 <ol><li> 시작하기 전에, 물고기의 충분한 재고를 사용할 수 있는지 확인합니다. 참고 : 사용하는 물고기의 나이는 매우 중요합니다. 두 개의 서로 다른 종의 물고기가 비슷한 무게의 수 있지만, 한 종의 어린 물고기는 다른 종의 이전 물고기보다 더 MPC를 소유합니다. 일반적인 규칙, 연어류 작업, 특히 어린 물고기로, 최고입니다. 나이 4~6개월 이하 (최대 15 g)을 연어류 최적 동안 danionins를 들어 일년만큼이나 오래된 생선, 최적 이용 될 수있다. </li><li> 멸균 50 ML 원뿔 관에 격리 매체의 나누어지는 25 ML을 해부하는 조직의 각 5g하십시오. </li><li> 기록 질량 및 숫자 튜브 (들)의 무게. 얼음에 튜브를 놓습니다. </li><li> 2 ~ 3 물고기를 안락사&gt; 300 ㎎ / L 중탄산 나트륨 - 완충 tricaine 메탄에 침수시. &gt; 5 분 동안 정지 한 다음 30 초 동안 (멸균 비이커에 포함) 70 % 에탄올에서 물고기를 물속에 가라 앉히다하는 아가미 운동을 할 수 있습니다. </li><li> 70 % 에탄올에서 물고기를 제거하고 물 방수제 오토 클레이브 용지에 배치합니다. 직접 너덜 거림 뒤에, 표면, 얕은 절개를 만들기 위해 메스를 사용합니다. 상기 절개의 피부를 잡고 비늘과 피부를 제거하고 물고기의 꼬리쪽으로 잡아 당깁니다. </li><li> 피부를 제거 후, ​​epaxial, 양쪽에서 물고기의 빠른 당분 &#39;화이트&#39;근육 (옆 선 근처에있는 느린 산화 &#39;빨간색&#39;근육을 방지) 및 절연 매체에 자리를 절제. 기관에 의해 요구되는 어류의 나머지를 버린다. 참고 : epaxial m에서 격리는 빨간색 근육에서 발생하는 문화 MPC를 전적으로 가능하지만, 경골하여 MPC를 사용하여 거의 모든 출판물 활용했다 세포yotome. </li><li> 근육의 충분한 양을 얻을 때까지 반복 2.4-2.6 단계를 반복합니다. 해부 동안 풀링 된 근육 조직은 세포 생존을 유지하기 위해 얼음에 남아 있는지 확인합니다. </li></ol> 3. 기계 해리 <ol><li> 유리 페트리 접시에 근육 조직 25 ㎖ / 5 g을 하나의 튜브를 붓는다. 두 메스를 사용하여 첨부와 # 10 메스 블레이드, 슬러리 또는 퓨레 일관성을 말하다 조직으로 처리합니다. 서로 과거 메스 블레이드를 당기는 &quot;전후&quot;운동이 가장 적합합니다. 주 : 조직 균질 적절한 보이지만 폐지되지 않은 경우, 생존 세포의 수를 극적으로 감소 될 것이다. </li><li> 25 ㎖ 혈청 피펫 혈청학 피펫을 사용하여, 슬러리 화 조직을 제거하고 원래의 원뿔형 튜브에 교체한다. </li><li> 모든 튜브의 모든 조직이 기계적으로 해리 될 때까지 반복 3.1-3.2 단계를 반복합니다. </li><li> 300 XG에서 5 분, 10 ℃에서 원심 분리 조직 </li><li> FOLL원심 분리 때문에, 25 ㎖의 혈청 피펫, 진공 흡입기, 또는주의 디캔팅로와 미디어 상층 액 25 ㎖를 폐기합니다. </li><li> 각 튜브에 resuspend 조직에 세척 매체의 25 ML을 추가, 상기와 같이 recentrifuge. </li><li> 상층 액을 각 시간을 제거, 세척 매체로 두 번 씻으십시오. </li></ol> 4. 효소 해리 <ol><li> 3.4 단계 동안 (0.11 g/0.22 ML 또는 충분한 양의) 유형 IV 콜라​​게나 제의 0.22 g의 기본 매체의 44 ML을 결합하여 콜라겐 분해 효소 용액을 제조. </li><li> 4 ℃에서 10 ~ 15 분 비커에 저어 필터는 50 ML의 주사기와 0.45 μm의 주사기 필터로 살균. 참고 : 하나 이상의 주사기 필터는 콜라게나 준비에 따라 필요할 수 있습니다. 워딩 턴 생물 이외의 공급 업체로부터 얻은 콜라게나 여과하는 동안 더 어려움을 포즈. 콜라는 endomysium을 구성하는 콜라겐 펩타이드 결합을 해리하는 데 사용됩니다. 이소화는 근섬유의 보호 장벽을 제거합니다. </li><li> 근조직의 각 g를 들어, 0.2 % 콜라게나 제 용액에서 조직을 재현 탁. 근육 조직의 5g를 들어, 콜라게나 제 용액 10 ㎖ 및 기본 매체의 15 ML을 추가합니다. </li><li> 콜라게나 솔루션 /베이스 매체 (25 ㎖에 예를 들어, 250 μL)의 ML 당 PSF의 10 μl를 추가합니다. 이 소화 효소의 효율성에 영향을 미치기 때문에, 조직이 잘 중지되어 있는지 확인합니다. </li><li> 부드러운 락을 18 ° C에서 60 분 콜라의 근육 조직을 품어. 이 세포 생존에 영향을 미칠 수 있지만, 기계적 해리 종의 정도에 따라, 콜라게나 제 소화가 90 분으로 연장 될 수있다. </li><li> 12 ℃에서 5 분 동안 300 XG에 콜라게나 제 소화, 원심 분리기 원뿔 튜브에 따라 세척 매체의 25 ML에 뜨는에 resuspend 조직을 폐기하십시오. </li><li> Recentrifuge 5 분 동안 300 X g에서 12시6, C. 세정 매체를 두 번 반복합니다. </li><li> 세척 조직 두 번, 10 ㎖ 혈청 피펫 세척 매체 씹다 25 ㎖에 재현 탁의 근육 조직은 조직 / 매체 균질 상대적으로 쉽게 피펫 안팎으로 통과 할 때까지 한. 5-10 triturations은 일반적으로 충분하다. <ol><li> 5 ㎖ 혈청 피펫 다음 주사기에 부착 된 16 게이지 금속 캐 뉼러와 함께 반복합니다. </li></ol></li><li> 12 ℃에서 5 분 동안 300 XG에 원심 분리기 원뿔 튜브 뜨는을 가만히 따르다. </li><li> 상기 5 분 동안 원심 분리, 기초 배지 5 ㎖로 트립신 0.25 g을 조합하여 트립신 분해 용액을 제조 하였다. </li><li> 10-15분 및 필터 20 ML의 주사기와 0.45 μm의 주사기 필터로 살균을 위해 4 ° C에서 교반. </li><li> 원뿔 튜브를 검색하고 모든 튜브에 근육 조직의 모든 1g에 트립신 용액 100 μL와 해리 매체의 4.9 ML를 추가합니다. EXA에 대한엠플, 트립신 용액 500 μL와 근육 조직 5 g의 분리 매체의 24.5 ML을 추가합니다. NOTE : 트립신은 기저판 근육 조직에서 전구체 세포를 분리한다 세린 프로테아제이다. </li><li> 을 Resuspend 트립신 / 해리 조직 중간으로. 18 ℃에서 20 분 동안 품어 </li><li> 12 ℃에서 1 분 300 XG에 처음 트립신 배양, 원심 분리기 원뿔 튜브에 따라 </li><li> 분리 매질 중에서 볼륨 상등액 1 부피의 농도로 분리 매체와 상청액을 조합하여 트립신을 중화. 두 번째 트립신 소화하는 동안 4 ° C에 보관하십시오. </li><li> 조직의 나머지 펠렛으로, 반복은 첫 번째 트립신 소화에서 뜨는 / 분리 매체와 단계 4.15 다음 상층 액을 결합, 4.12-4.15 단계를 반복합니다. </li><li> 양자 택일 : 콜라게나 트립신 digestions 세포 수율을 극대화하기 위해 결합 될 수있다. &lt;올&gt; <li> 이를 위해, 파쇄가 용이하게 통과 할 때까지 캐 뉼러 콜라게나 제는 20 ㎖ 주사기에 부착 된 금속 (길이 10와 16 게이지 가장 적합) 캐 뉼러를 사용하여 다이제스트 씹다. </li><li> 균질로 (단계 4.10에서 제조) 트립신 용액 500 μl를 추가하고 20 분 동안 18 ° C에서 알을 품다. </li><li> 12 ℃에서 1 분 동안 300 XG에서 배양, 원심 분리기 원뿔 튜브에 따라 </li><li> 분리 매질 중에서 볼륨 상등액 1 부피의 농도로 분리 매체와 상청액을 조합하여 트립신을 중화. </li><li> 두 번째 트립신 소화하는 동안 4 ° C에 보관하십시오. </li><li> 표준 프로토콜과 같은 단계 4.18을 진행합니다. </li></ol></li><li> 300 XG에 50 ML 원뿔 튜브와 원심 분리기에 최종 상층 액 / 절연 매체 혼합물을 분배 12 ° C에서 10 분 동안 </li><li> 제거 셀을 방해하지 돌보는 상층 액펠렛. 피펫 각 세포 펠렛을 용해 각 튜브에 완전 배지 2 ㎖,. </li><li> 한 50 ML 원뿔 관에 완전 배지에 현탁 세포를 결합합니다. </li><li> 이전에 재현 탁 세포의 풀과 결합, 완전 배지 1 ㎖와 각 튜브를 씻어. </li><li> 금속 캐 뉼러와 씹다 ~ 10 번을 주사기. </li><li> 완전 배지로 세척, 100 μm의 셀 스트레이너를 통해 세포 현탁액을 필터링합니다. </li><li> 40 μm의 셀 스트레이너를 통해 세포 현탁액을 필터. </li><li> 50 ㎖에 충분한 완전한 매체를 추가하고 15 ℃에서 10 분 동안 300 XG에 원심 분리기 </li></ol> 5. 계수, 희석, 및 세포의 파종 <ol><li> 단계 4.25의 최종 원심 분리 후,주의 디캔팅 또는 혈청 피펫으로 뜨는을 제거합니다. 완전 배지 5 ㎖에 세포 펠렛을 재현 탁. </li><li> 세포가 완전히 재현 탁으로, 20 μl를 제거; 1.5 밀리리터 microcentrifuge 관의 세포 현탁액 및 장소. </li><li> 트리 판 블루 염색의 5 μl를 추가하고 5 분 기다립니다. 혈구를 사용하여 생존 세포의 수를 결정한다. </li><li> 판정시에, 필요한 농도로 세포를 희석. 경골 MPC를 가장 잘 cm 2 당 150,000-200,000 세포에 씨앗을 품고있다. 여섯 잘 도금 전략, 1.5 × 10 6 세포를 희석 - ML 당 2.0 × 10 6 충분 증식과 분화를 지원합니다. </li><li> 폴리-L-라이신 처리, 라미닌 코팅 플레이트와 씨앗 세포를 검색합니다. (판 별 희석 및 도금 볼륨에 대한 표 5 참조). 참고 : 표 6은 다양한 경골 종에서 고립 근육 조직의 그램 당 고립 된 세포의 평균 수를 나타낸다. 무지개 송어 (O.는 mykiss) 할 제브라 피쉬 (D. rerio)보다 근육 조직의 그램 당 더 적은 MPC를 전시함으로써 적절한 시드에서 격리하는 물고기를 더 필요합니다. </li><li> 적절한 온도로 냉각 인큐베이터에있는 실험실 테이프와 장소 플레이트를 밀봉. (마우스 저장) 여기에 나열된 모든 종에서 MPC를 이산화탄소 (CO 2)의 보완없이 대기압 조건에서 배양 할 수있다. (표 7 참조). </li><li> 양자 택일로 일부 연구소는 MPC를 40 분 동안 문화의 기층을 준수 할 수 있도록 요구 프로토콜을 채택했습니다. <ol><li> 그런 다음, 느슨하게 부착 및 비 부착 세포를 제거하는 세정 매체와 접시를 씻어. 경고 :이 단계는 문화의 기층에 다른 세포의 &quot;비특이적&quot;부착 (예를 들어, 섬유 아 세포)를 방지하는 것이 매우 중요합니다. </li><li> 인큐베이터에서 전체 미디어 및 장소 세포를 추가하고 아래에 설명 된대로에 대한 관리. </li></ol></li></ol>

공개 아무것도 없다.

근육 조직이 프로그램은, 어느 검사 종, 가장 쉽게 체외 시스템을 통해 공부하실 수 있습니다. 사실, 격리에, 근원 성 전구 세포 (MPC를) 생선이나 포유류의 myosatellite 세포 (중간 엽 줄기 세포는) 쉽게 증식, 세포주기 취소 될 수 있으며, 근육 아세포의 단말 차별화 및 초기 myotubes에 그 근원 세포의 융합을 포함하는이 규제가 심한 과정을 입력합니다. (제브라 피쉬 (67) 및 무지개 송어 <s...

포유 동물의 근육 생성의 상당한 이해 C2C12 5, 모두 기본 마우스 (뮤스 musculus)의 근 모세포 문화와 잘 설명 마우스 유래 세포주에이 과정의 반복 설을 통해 얻을 수있다. 1950 년대 6 년부터이 문화가 다른 척추 동물의 확장, 근육 생성에 의해, murinemyogenic 프로그램의 이해에 많은 발전을 주도하고있다. 또한, 하나의 세포 근섬유 이식편 기술은 위성 세포와 주변 근섬유 7-9 사이의 상호 작용에 대한 이해를 증가하고있다. 세포 배양은 근육 생성의 조사에 특히 인해 짧은 시간에 전구체로부터 분화 된 세포 10, RNAi를위한 형질의 상대적 용이성 11 ~ 14, 15, 16 및 과발현 형질 전환 연구 14,17,18, 체외에서 생체 이식 18 ~ 20 다음에 확장, 심지어 샘플분류군 (21, 22)에서, 근원 전구 세포와 그 통제 요원의 Arison는. 때문에 문화 시스템의 인공 환경에 차이가 5,23을 설명 하였지만, 이러한 생체 시스템은 다핵의 형성을 지배하는 복잡한 프로그램을 우리의 해부에 필수적인적일 수있다, 말기 차별화 된 myofibersfrom는 myosatellite로 알려진 증식 전구 세포를 mononucleated 포유 동물 사이 세포 (중간 엽 줄기 세포). 클래스 포유의 이상으로, 그러나, 근육 생성을 제어하는 메커니즘의 보존 및 / 또는 분기 저조한 인해 크게 다양한 생물 군에서 근육 조직 전구 세포 (MPC를) 및 근육 아세포를 배양의 어려움으로 이해된다. 사실, 기본 근원 세포 배양은 3 새 24 ~ 26, 하나의 파충류 (27), 몇 양서류 28-30, 일부 물고기 1,3,4,31-33에 설명되어있다. 했습니다에서 연속 근육 조직 세포 라인설치류 34-36 이외의 rtebrates 일본 메추라기 (Cortunix 자포니카)에서 파생되는 유일한 비 포유 동물의 근육 조직 세포 라인, QM7 37 더욱 드물다. 불멸화에서 많은 시도에도 불구하고, 경골, 근원 세포 라인은 애매 남아 이러한 세포의 효율적인 형질 전환을위한 프로토콜은 올해 15 출판되었다. 따라서, 척추 동물의 다양한 기본하여 MPC와 근육 아세포를 배양하기위한 명확하고 잘 최적화 된 프로토콜은 매우 더 근육 조직 프로그램의 진화에 대한 우리의 지식을 확장 할뿐만 아니라에서 돌파구를 만들기 위해 비교 생리학의 힘을 사용하는 데 필요한 인간 골격근 질환 및 장애의 치료. 문학은 MPC / 근원 세포 분리 38-49의 많은 보고서가 포함되어 있지만, 그것은 저자는 간단한 종종 불완전, 형식 등의 절연 부에 대한 프로토콜을 설명하는 일반적입니다. 또한, 대부분의 교훈 프로토콜 REPOrted 쥐 50-53를 위해 개발되었으며, 이들 중 일부는 이러한 프로토콜을 사용할 수 없게하거나 근육의 생물 학자에 의해 이용 허무 가장 깊은 비 설치류하고, 항체의 선택 (54, 55) 또는 형광 형질 전환 유전자 56, 57에 의존하고 있습니다. 시청각지도와 함께와 관계가 먼 종에서 입증 효율성을 설명 셨나요, 양서류 및 파충류 근육 생성, 상세하고 철저한 프로토콜에 대해 거의 알려진으로, 현장에 가장 도움이 될 것입니다. 1989 58 파월과 동료에 의해 ​​설명, 다음과 같은 프로토콜은 처음에 (즉, 무지개 송어, mykiss 앙 코링, 대서양 연어, 살모 살라) 연어과 물고기와 몇 가지 큰 cyprinids (즉, 금붕어, Carassiusauratusauratus)에서 MPC를하고 근육 아세포를 분리하기 위해 개발되었다 . 2000 년 Fauconneau 및 Paboeuf 무지개 송어 (59)에 대한 기본 근원 세포 배양을 최적화하고, minoroptimizations 엄마Danioninae의 clade의 (제브라 피쉬, 다니오의 rerio, 거대한 다니오, Devario aequipinnatus)으로 인해 제브라 피쉬의 작업에 사용할 수있는 다양한 유전 적 도구 (32)와, 따라서 그것의 가까운 친척의 여러 개의 작은 미노의 utilizable 해당 프로토콜 데. 경골 어류로 인해 (적어도 대부분의 종에서) 자신의 분기 성장 전략 연구를위한 매력적인 생물이다. 큰 연어류, 대부분의 물고기처럼, 심지어 나이 60 ~ 62 년 만기에 점근선으로 자유롭게 성장 잠재력 indeterminately 성장. 제브라 피쉬는 달리, 같은 거대한 다니오 (63)와 경골 어류의 일반적인 moustached 다니오 디스플레이 성장 잠재력, 자신의 직접 병렬 MPC 세포 운명의 선택이 비대 대 골격 근육 세포의 증식에 중요한 역할을 담당하고 있는지 이해를위한 이상적인 플랫폼으로 큰 danionins. 마찬가지로, 우리는 상대적으로 높은 세포 수율과 viab으로,이 프로토콜은 마우스와 axolotls와 함께 사용할 수 있다는 것을 증명하고있다ility 지수. 이러한 멕시코 Axolotl의 (Ambystomamexicanum) 등 Urodele 도롱뇽은 전체 사지와 꼬리 64-66 등의 조직을 재생하는 놀라운 능력을 가지고있다. 이 특성은 골격 근육 낭비하고 노화의 이러한 양서류 흥미로운 모델을 만든다. 이러한 연구에도 넓은 비교 컨텍스트를 제공 많은 어종에서 수행 한 바와 같이 아래에 설명 된 프로토콜을 사용하여, 유사한 방식이 수행 될 수있다. 많은 진정으로 비교 생물학 데이터 (여기에서, 전체 척추 동물의 혈통) 넓은 스펙트럼 내에서 분석 할 때 기초 생물학 및 번역 상 생물 의학에서 가장 의미있는 발전 할 수있다, 감사합니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="743">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 1. Detailed Reagent Information</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="42" style="height:43px;width:205px;">Reagent</td>
			<td style="width:217px;">Company (Preferred v. Alternate)</td>
			<td style="width:160px;">Catalog Number (Preferred v. Alternate)</td>
			<td style="width:161px;">Quantity per Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="20" style="height:20px;">&#947;-irradiated poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MP Biomedicals)</td>
			<td>P5899 (ICN19454405)</td>
			<td>5 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">DMEM (high glucose)</td>
			<td>Sigma-Aldrich (cellgro)</td>
			<td>MT-50-003-PB (D7777)</td>
			<td>2 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Laminin</td>
			<td>BD Biosciences (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>CB-40232 (L2020)</td>
			<td>1 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="41" style="height:41px;width:205px;">Sodium Bicarbonate (NaHCO3)</td>
			<td>Fisher Scientific (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>BP328-500 (S5761)</td>
			<td>1.51 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">HEPES (C8H18N2O4S)</td>
			<td>Fisher Scientific (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>BP310-1 (H6147)</td>
			<td>9.53 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Antibiotic/Antimycotic</td>
			<td>Thermo Scientific (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>SV3007901 (A5955)</td>
			<td>17-20 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Gentamicin Sulfate</td>
			<td>Lonza (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>BW17-519Z (G1397)</td>
			<td>2-3 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Donor Equine Sera</td>
			<td>Thermo Scientific (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>SH3007403 (H1270)</td>
			<td>75 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Fetal Bovine Sera</td>
			<td>Thermo Scientific (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>SH3007103 (F2442)</td>
			<td>25 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Collagenase (Type IV)</td>
			<td>Worthington (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>LS004189 (C9891)</td>
			<td>0.44 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Trypsin (from Pancreas)</td>
			<td>MP Biomedicals (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>ICN15357125 (T5266)</td>
			<td>1 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 2. Consumables, Tools and Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="42" style="height:43px;width:239px;">Consumable</td>
			<td style="width:204px;">Tools</td>
			<td style="width:199px;">Equipment</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="28" style="height:28px;">Cell Culture Plates</td>
			<td>Forceps (Coarse)</td>
			<td>Serological Pipettor</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="28" style="height:28px;width:239px;">Sterile 50 mL Conical Tubes</td>
			<td style="width:204px;">Forceps (Fine)</td>
			<td>pH Meter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="28" style="height:28px;width:239px;">Laboratory Tape</td>
			<td style="width:204px;">Scalpel Handles</td>
			<td>Chilling Incubator (Echotherm)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="28" style="height:28px;width:239px;">0.2 &#956;m Vacuum Sterilization Systems</td>
			<td style="width:204px;">Scalpel Blades (#10, #11)</td>
			<td>Laminar Flow Hood</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="28" style="height:28px;width:239px;">Water-repellant Autoclave Paper</td>
			<td style="width:204px;">Surgical Scissors</td>
			<td>Vacuum Manifold</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="28" style="height:28px;width:239px;">Serological Pipettes</td>
			<td>Glass Petri Dishes</td>
			<td>Microosmolality Meter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="28" style="height:28px;width:239px;"></td>
			<td>12-16 G Cannulas with Luer Locks</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 3. Optimized Volumes for Coating Cell Culture Plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="24" style="height:24px;width:167px;">Plate Size</td>
			<td style="width:192px;">cm^2 per Well</td>
			<td style="width:132px;">Poly-L-lysine*</td>
			<td style="width:145px;">Laminin**</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="20" style="height:20px;">6 well</td>
			<td>9.5</td>
			<td>1.6 mL</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:167px;">24 well</td>
			<td>1.9</td>
			<td>0.32</td>
			<td>0.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:167px;">48 well</td>
			<td>0.95</td>
			<td>0.16</td>
			<td>0.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:167px;">96 well</td>
			<td>0.32</td>
			<td>0.06</td>
			<td>0.03</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">*0.1 mg/mL concentration</td>
			<td colspan="2">** 0.020 mg/mL concentration</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 4. Media for Isolation, Dissociation, and Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="24" style="height:24px;width:163px;">Reagent</td>
			<td style="width:155px;">Isolation</td>
			<td style="width:127px;">Wash</td>
			<td style="width:127px;">Dissociation</td>
			<td>Complete</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="20" style="height:20px;">Base Medium</td>
			<td>419.25 mL</td>
			<td>395.40 mL</td>
			<td>297.00 mL</td>
			<td>178.00 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="20" style="height:20px;width:163px;">PSF*</td>
			<td>5.00 mL</td>
			<td>4.00 mL</td>
			<td>3.00 mL</td>
			<td>2.00 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="40" style="height:40px;width:163px;">Gentamicin Sulfate**</td>
			<td>0.75 mL</td>
			<td>0.60 mL</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="40" style="height:40px;width:163px;">Donor Equine Serum</td>
			<td>75.00 mL</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="40" style="height:40px;width:163px;">Fetal Bovine Serum***</td>
			<td style="width:155px;">-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>20.00 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4" height="19" style="height:19px;width:660px;">* PSF: penicillin/streptomycin/fungizone cocktail (100x); ** 50 mg/mL concentration; *** Characterized</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 5. Recommended Dilutions and Plating Volumes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="24" style="height:24px;width:75px;">Plate Size</td>
			<td style="width:103px;">cm^2 per Well</td>
			<td style="width:145px;">Dilution</td>
			<td style="width:111px;">Plating Volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="20" style="height:20px;">6 well</td>
			<td>9.5</td>
			<td>1.5-2.0x10^6 cells/mL</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="20" style="height:20px;width:75px;">24 well</td>
			<td>1.9</td>
			<td>1.5-2.0x10^6 cells/mL</td>
			<td>250 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="20" style="height:20px;width:75px;">48 well</td>
			<td>0.95</td>
			<td>1.5-2.0x10^6 cells/mL</td>
			<td>150 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="20" style="height:20px;width:75px;">96 well</td>
			<td>0.32</td>
			<td>1.5-2.0x10^6 cells/mL</td>
			<td>50-100 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 6. Average number of cells per g tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2" height="24" style="height:24px;width:201px;">Species</td>
			<td colspan="2" style="width:273px;">Average # cells/g tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2" height="20" style="height:20px;">Danio rerio</td>
			<td colspan="2">6,400,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2" height="20" style="height:20px;width:201px;">Danio dangila</td>
			<td colspan="2">1,783,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2" height="20" style="height:20px;width:201px;">Devario aequipinnatus</td>
			<td colspan="2">1,797,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2" height="20" style="height:20px;">Oncorhynchus mykiss</td>
			<td colspan="2">66,800</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 7. Recommended Incubation Temperatures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2" height="24" style="height:24px;width:201px;">Species</td>
			<td colspan="2" style="width:273px;">Temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2" height="20" style="height:20px;">Danio/ Devario spp.</td>
			<td colspan="2">26 - 28 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2" height="20" style="height:20px;width:201px;">Oncorhynchus/Salmo spp.</td>
			<td colspan="2">10* - 18 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2" height="20" style="height:20px;width:201px;">Ambystoma mexicanum</td>
			<td colspan="2">18&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3" height="20" style="height:20px;">* Lower temperatures support lower proliferation rates.</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of primary myogenic precursor cell/myoblast cultures from basal vertebrate lineages

때문에 생체 내에서 근육 조직 프로그램을 공부와 관련된 고유의 어려움과 시간, 골격 근육의 주민 성체 줄기 세포에서 파생 된 주 문화 시스템은 근육 조직 전구 세포 (MPC를)은 포유 동물의 골격 근육 발달에 대한 우리의 이해에 필수적인 입증했다 성장. 특히 척추 동물의 기초 분류군 사이에서, 그러나, 데이터는 자기 갱신, 확산 및 MPC와의 분화를 조절하는 분자 메커니즘을 설명하는 제한됩니다. 특히 관심을 부속 기관 손실 (즉, urodele 양서류) 다음과 같은 상당한 치하의 골격 근섬유 세포의 증식 (즉, 경골 어류) 및 완전 재생을 받아야하는 기초 척추 동물의 능력을 기초 잠재적 인 메커니즘이다. 또한, 배양 된 근육 아세포의 사용은 재생 및 근육 조직 프로그램 재현부와 그들 사이의 차이의 이해를 도울 수있다. 에이 말은, 우리는 세부 사항에 강력하고 효율적인 프로토콜을 설명 (및 유사 안에) 더 많은 시작, 근육 조직 프로그램의 진화를 이해하기위한 플랫폼으로 세포 배양에서, MPC는 그들의 자손, 근원 세포와 미성숙 myotubes을 분리하고 유지 기초 척추 동물. 제브라 피쉬 (다니오 rerio)의 모델 생물의 상태를 대문자로, 우리는 잉어 clade의 Danioninae의 작은 물고기에이 프로토콜의 응용 프로그램에보고합니다. 탠덤,이 프로토콜은 멕시코 Axolotl의 (Ambystomamexicanum)에서도 실험실 설치류에서 MPC를 분리하여 넓은 비교 방법을 실현하는데 사용된다. 이 프로토콜은 현재 널리 무지개 송어, 연어, 도미 1-4 등 여러 물고기 종에 근육 생성을 연구하는 데 사용됩니다.

주야 후 파종, 근육 조직 전구 세포 (MPC를)는 (그림 1A와 1D 참조) 라미닌의 기질에 부착 볼 수 있어야합니다. 파종 후, 세포 (MPC를)이 세포 유형을 나타내는 스핀들 형상 (그림 1)를 채택하고 MyoD1 + (그림 2)이다. 다니오 종에서 MPC는이 앙 코링 및 살모 종 MPC를하는 것보다 작은 바이폴라 프로세스와보다 컴팩트 한 것으로 나타납니다. 그러나, ?...

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Preparation of Primary Myogenic Precursor Cell/Myoblast Cultures from Basal Vertebrate Lineages

체외 배양 시스템은 척추 근육 생성에 대한 우리의 이해에 필수적인 입증했다. 그러나, 많은, 특히 기초 분류군, nonmammalian 골격 근육 발달과 성장에 대해 배웠 겠죠. 이 조직, 근육 조직 전구 세포 (MPC를)의 성체 줄기 세포를 분리하고, 차 문화 속에서 자신의 자기 갱신, 증식 및 분화를 유지하기위한 효율적이고 강력한 프로토콜에 걸쳐 보존 및 분기 규제 메커니즘의 식별 가능 척추 동물의 계통.

기초 척추 계통의 주요 근원 성 전구 세포 / 근원 세포 배양의 준비

Due to the inherent difficulty and time involved with studying the myogenic program in vivo, primary culture systems derived from the resident adult stem ...

preparation-primary-myogenic-precursor-cellmyoblast-cultures-from

Research

JoVE Journal

Biology

20.2K 조회수.  University of Alabama at Birmingham.  체외 배양 시스템은 척추 근육 생성에 대한 우리의 이해에 필수적인 입증했다. 그러나, 많은, 특히 기초 분류군, nonmammalian 골격 근육 발달과 성장에 대해 배웠 겠죠. 이 조직, 근육 조직 전구 세포 (MPC를)의 성체 줄기 세포를 분리하고, 차 문화 속에서 자신의 자기 갱신, 증식 및 분화를 유지하기위한 효율적이고 강력한 프로토콜에 걸쳐 보존 및 분기 규?...

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Primary Neuronal Cultures from the Brains of Late Stage Drosophila Pupae

In this video, we demonstrate the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. The procedure begins with the removal of brains from animals at 70-78 hrs after puparium formation. The isolated brains are shown after brief incubation in papain followed by several washes in serum-free growth medium. The process of mechanical dissociation of each brain in a 5 ul drop of media on a coverslip is illustrated. The axons and dendrites of the post-mitotic neurons are sheered off near the soma during dissociation but the neurons begin to regenerate processes within a few hours of plating. Images show live cultures at 2 days. Neurons continue to elaborate processes during the first week in culture. Specific neuronal populations can be identified in culture using GAL4 lines to drive tissue specific expression of fluorescent markers such as  GFP or RFP. Whole cell recordings have demonstrated the cultured neurons form functional, spontaneously active cholinergic and GABAergic synapses. A short video segment illustrates calcium dynamics in the cultured neurons using Fura-2 as a calcium indicator dye to monitor spontaneous calcium transients and nicotine evoked calcium responses in a dish of cultured neurons. These pupal brain cultures are a useful model system in which genetic and pharmacological tools can be used to identify intrinsic and extrinsic factors that influence formation and function of central synapses.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. Views of live cultures show neurite outgrowth and imaging of calcium levels using Fura-2.

늦은 단계 Drosophila Pupae의 두뇌에서 기본의 연결을 문화

In this video, we demonstrate the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. The procedure begins with the ...

연구

생물학

Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos and their dechorionation using bleach are demonstrated. Using a glass pipet attached to a mouth suction tube, we illustrate the removal of all cells from single embryos. The method for dispersing cells from each embyro into a small (5 l) drop of medium on an uncoated glass coverslip is demonstrated. A view through the microscope at 1 hour after plating illustrates the preferred cell density. Most of the cells that survive when grown in defined medium are neuroblasts that divide one or more times in culture before extending neuritic processes by 12-24 hours. A view through the microscope illustrates the level of neurite outgrowth and branching expected in a healthy culture at 2 days in vitro. The cultures are grown in a simple bicarbonate based defined medium, in a 5% CO2 incubator at 22-24&deg;C. Neuritic processes continue to elaborate over the first week in culture and when they make contact with neurites from neighboring cells they often form functional synaptic connections. Neurons in these cultures express voltage-gated sodium, calcium, and potassium channels and are electrically excitable. This culture system is useful for studying molecular genetic and environmental factors that regulate neuronal differentiation, excitability, and synapse formation/function.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. Views of live cultures show cells 1 hour after plating and differentiated neurons after 2 days of growth in a bicarbonate-based defined medium. The neurons are electrically excitable and form synaptic connections.

Midgastrula 스테이지 Drosophila의 태아에서 문화의 연결 준비

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos ...

Preparation of Dissociated Mouse Cortical Neuron Cultures

This video will guide you through the process for generating cortical neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse brain. These cultures can be used for a variety of applications including immunocytochemistry, biochemistry, electrophysiology, calcium and sodium imaging, protein and/or RNA isolation. These cultures also provide a platform to study the neuronal development of transgenic animals that carry a late embryonic or postnatal lethal gene mutation. The procedure is relatively straight forward, requires some experience in tissue culture technique and should not take longer than two to three hours if you are properly prepared. Careful separation of the cortical rind from the thalamo-cortical fiber tract will reduce the number of unwanted non-neuronal cells. To increase yields of neuronal cells triturate the pieces of the cortical tissue gently after the enzyme incubation step. This is imperative as it prevents unnecessary injury to cells and premature neuronal cell death. Since these cultures are maintained in the absence of glia feeder cells, they also offer an added advantage of growing cultures enriched in neurons.

This video shows a procedure for generating neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse cortex. These cultures can be used for immunocytochemistry, biochemistry, electrophysiology, calcium and sodium imaging and provide a platform to study the neuronal development of transgenic animals that carry a postnatal lethal gene mutation.

Dissociated 마우스 두피 신경 세포 배양의 준비

This video will guide you through the process for generating cortical neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse brain. These cultures ...

Primary Dissociated Midbrain Dopamine Cell Cultures from Rodent Neonates

The ability to create primary cell cultures of dopamine neurons allows for the study of the presynaptic characteristics of dopamine neurons in isolation from systemic input from elsewhere in the brain. In our lab, we use these neurons to assess dopamine release kinetics using carbon fiber amperometry, as well as expression levels of dopamine related genes and proteins using quantitative PCR and immunocytochemistry. In this video, we show you how we generate these cultures from rodent neonates.
The process involves several steps, including the plating of cortical glial astrocytes, the conditioning of neuronal cell culture media by the glial substrate, the dissection of the midbrain in neonates, the digestion, extraction and plating of dopamine neurons and the addition of neurotrophic factors to ensure cell survival.
The applications suitable for such a preparation include electrophysiology, immunocytochemistry, quantitative PCR, video microscopy (i.e., of real-time vesicular fusion with the plasma membrane), cell viability assays and other toxicological screens.

Primary dissociated midbrain dopamine cell cultures allow for the study of presynaptic characteristics of dopamine neurons. They can be used to monitor real-time dopamine release kinetics and protein/mRNA levels of regulators of dopamine exocytosis. Here, we show you how to generate these cultures from rodent neonates.

쥐 Neonates에서 기본 Dissociated Midbrain의 도파민 세포 문화

The ability to create primary cell cultures of dopamine neurons allows for the study of the presynaptic characteristics of dopamine neurons in isolation ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

Electroporation에 대한 Murine 골수에서 조혈 세포 차 문화의 준비

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Fabrication of Myogenic Engineered Tissue Constructs

Despite the fact that electronic pacemakers are life-saving medical devices, their long-term performance in pediatric patients can be problematic owing to the restrictions imposed by a child's small size and their inevitable growth. Consequently, there is a genuine need for innovative therapies designed specifically for pediatric patients with cardiac rhythm disorders. We propose that a conductive biological alternative consisting of a collagen-based matrix containing autologously-derived cells could better adapt to growth, reduce the need for recurrent surgeries, and greatly improve the quality of life for these patients. In the present study, we describe a procedure for incorporating primary skeletal myoblast cell cultures within a hydrogel matrix to fashion a surgically-implantable tissue construct that will serve as an electrical conduit between the upper and lower chambers of the heart. Ultimately, we anticipate using this type of engineered tissue to restore atrioventricular electrical conduction in children with complete heart block. In view of that, we isolate myoblasts from the skeletal muscles of neonatal Lewis rats and plate them onto laminin-coated tissue culture dishes using a modified version of established protocols[2, 3]. After one to two days, cultured cells are collected and mixed with antibiotics, type 1 collagen, Matrigel&trade;, and NaHCO3. The result is a viscous, uniform solution that can be cast into a mold of nearly any shape and size[1, 4, 5]. For our tissue constructs, we employ type 1 collagen isolated from fetal lamb skin using standard procedures[6]. Once the tissue has solidified at 37&deg;C, culture media is carefully added to the plate until the construct is submerged. The engineered tissue is then allowed to further condense through dehydration for 2 more days, at which point it is ready for in vitro assessment or surgical-implantation.

Here, we demonstrate fabrication of collagen-based, tissue constructs containing skeletal myoblasts. These 3-D engineered constructs may be used to replace or repair tissues in vivo. For our purposes, we have designed these as an atrioventricular electrical conduit for the repair of complete heart block[1].

Myogenic 엔지니어링된 조직 구조의 제작

Despite the fact that electronic pacemakers are life-saving medical devices, their long-term performance in pediatric patients can be problematic owing to ...

Establishing Primary Adult Fibroblast Cultures From Rodents

The importance of using primary cells, rather than cancer cell lines, for biological studies is becoming widely recognized. Primary cells are preferred in studies of cell cycle control, apoptosis, and DNA repair, as cancer cells carry mutations in genes involved in these processes. Primary cells cannot be cultured indefinitely due to the onset of replicative senescence or aneuploidization. Hence, new cultures need to be established regularly. The procedure for isolation of rodent embryonic fibroblasts is well established, but isolating adult fibroblast cultures often presents a challenge. Adult rodent fibroblasts isolated from mouse models of human disease may be a preferred control when comparing them to fibroblasts from human patients. Furthermore, adult fibroblasts are the only available material when working with wild rodents where pregnant females cannot be easily obtained. Here we provide a protocol for isolation and culture of adult fibroblasts from rodent skin and lungs. We used this procedure successfully to isolate fibroblasts from over twenty rodent species from laboratory mice and rats to wild rodents such as beaver, porcupine, and squirrel.

This article describes a protocol for isolation and maintenance of primary fibroblast cultures from skin and lung tissue of wild rodents.

설치류에서 기본 성인 Fibroblast 문화를 구축

The importance of using primary cells, rather than cancer cell lines, for biological studies is becoming widely recognized.  Primary cells are preferred ...

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos. In brief, a large amount of staged embryos from young and healthy flies are collected, sterilized, and then physically dissociated into a single cell suspension using a glass homogenizer. After being plated on culture plates or chamber slides at an appropriate density in culture medium, these cells can further differentiate into several morphologically-distinct cell types, which can be identified by their specific cell markers. Furthermore, we present conditions for treating these cells with double stranded (ds) RNAs to elicit gene knockdown. Efficient RNAi in Drosophila primary cells is accomplished by simply bathing the cells in dsRNA-containing culture medium. The ability to carry out effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical, cell imaging analyses, will allow a variety of questions to be answered in Drosophila primary cells, especially those related to differentiated muscle and neuronal cells.

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

We provide a detailed protocol for preparing primary cells dissociated from Drosophila embryos. The ability to carry out the effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical and cell imaging methods will allow a variety of questions to be addressed in Drosophila primary cells.

에서 기본 셀 문화 Drosophila Gastrula의 태아

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos.   In brief, a large amount of staged ...

Isolation of Basal Cells and Submucosal Gland Duct Cells from Mouse Trachea

The large airways are directly in contact with the environment and therefore susceptible to injury from toxins and infectious agents that we breath in 1. The large airways therefore require an efficient repair mechanism to protect our bodies. This repair process occurs from stem cells in the airways and isolating these stem cells from the airways is important for understanding the mechanisms of repair and regeneration. It is also important for understanding abnormal repair that can lead to airway diseases 2. The goal of this method is to isolate a novel stem cell population from the mouse tracheal submucosal gland ducts and to place these cells in in vitro and in vivo model systems to identify the mechanisms of repair and regeneration of the submucosal glands 3. This production shows methods that can be used to isolate and assay the duct and basal stem cells from the large airways 3.This will allow us to study diseases of the airway, such as cystic fibrosis, asthma and chronic obstructive pulmonary disease. Currently, there are no methods for isolation of submucosal gland duct cells and there are no in vivo models to study the regeneration of submucosal glands.

Here we demonstrate our protocol for isolation of basal and submucosal gland duct cells from mouse tracheas. We also demonstrate the method of injecting stem cells into the dorsal mouse fat pad to create an in vivo model of submucosal gland regeneration.

마우스 기관에서 자연적으로 흐르는 것과 셀 및 Submucosal 글 랜드 덕트 세포의 분리

The large airways are directly in contact with the environment and therefore susceptible to injury from toxins and infectious agents that we breath in 1. ...

Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it is not easy to establish an effective system for culturing these cells. Since the culture conditions can influence gene expression that confers pluripotency in hESCs and hiPSCs, the optimization and standardization of the culture method is crucial.
The establishment of hESC lines was first described by using MEFs as feeder cells and fetal bovine serum (FBS)-containing culture medium2. Next, FBS was replaced with knockout serum replacement (KSR) and FGF2, which enhances proliferation of hESCs3. Finally, feeder-free culture systems enable culturing cells on Matrigel-coated plates in KSR-containing conditioned medium (medium conditioned by MEFs)4. Subsequently, hESCs culture conditions have moved towards feeder-free culture in chemically defined conditions5-7. Moreover, to avoid the potential contamination by pathogens and animal proteins culture methods using xeno-free components have been established8.
To obtain improved conditions mouse feeder cells have been replaced with human cell lines (e.g. fetal muscle and skin cells9, adult skin cells10, foreskin fibroblasts11-12, amniotic mesenchymal cells13). However, the efficiency of maintaining undifferentiated hESCs using human foreskin fibroblast-derived feeder layers is not as high as that from mouse feeder cells due to the lower level of secretion of Activin A14. Obviously, there is an evident difference in growth factor production by mouse and human feeder cells.
Analyses of the transcriptomes of mouse and human feeder cells revealed significant differences between supportive and non-supportive cells. Exogenous FGF2 is crucial for maintaining self-renewal of hESCs and hiPSCs, and has been identified as a key factor regulating the expression of Tgf&beta;1, Activin A and Gremlin (a BMP antagonist) in feeder cells. Activin A has been shown to induce the expression of OCT4, SOX2, and NANOG in hESCs15-16.
For long-term culture, hESCs and hiPSCs can be grown on mitotically inactivated MEFs or under feeder-free conditions in MEF-CM (MEF-Conditioned Medium) on Matrigel-coated plates to maintain their undifferentiated state. Success of both culture conditions fully depends on the quality of the feeder cells, since they directly affect the growth of hESCs.
Here, we present an optimized method for the isolation and culture of mouse embryonic fibroblasts (MEFs), preparation of conditioned medium (CM) and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) to assess the levels of Activin A within the media.

The quality of mouse embryonic fibroblasts (MEFs) is dictated by the right strain of mouse such as CF-1. Pluripotency-supportive MEFs and conditioned media (CM) obtained from these should contain optimal concentrations of Activin A, Gremlin and Tgf&beta;1 needed for the Activin/Nodal and FGF pathways to co-operatively maintain self-renewal and pluripotency.

Culturing 인간의 배아와 유도 Pluripotent 줄기 세포에 적합 마우스 배아 Fibroblast 세포의 준비

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it ...