فإن الكتاب أود أن أعرب العديد بفضل الدكاترة. جوسيب بلاناس وخوان كاستيو للخبرات المهنية في تطوير وتطبيق هذا البروتوكول إلى ثقافة الأسماك الصغيرة والبرمائيات. الشكر أيضا نظرا لعدد لا يحصى من الأفراد الذين ساعدوا بلا كلل مع تشريح والتفكك من الأنسجة العضلية من العديد من الأسماك (سواء في الأنواع والعدد)، بما في ذلك الشحن ماثيو، Delci كريستنسن، زاكاري فاولر، بروك فرانزين، ناثان FROEHLICH، كيرا مارشال، بن ماير، إيثان Remily، وSinibaldo روميرو. وأيد هذا العمل من قبل جامعة ألاباما في برمنغهام قسم البيولوجيا الأموال البدء، مركز البحوث البروتياز المعاهد الوطنية للصحة منح # 2P20 RR015566، المعاهد الوطنية للصحة NIAMS غرانت # R03AR055350، وNDSU تقدم إلى الأمام جبهة الخلاص الوطني جرانت # HRD-0811239 لPRB. وقدم الدعم أيضا من قبل مركز بحوث السمنة UAB التغذية الجائزة # P30DK056336، المعاهد الوطنية للصحة NIDDK. محتوياته هي الجهة الوحيدة المسؤولة عن المؤلفين والقيام ليس بالضرورةتمثل وجهة النظر الرسمية من المعاهد الوطنية للصحة.

ليس هناك شيء في الكشف عنها.

برنامج عضلي، في أيهما الأنواع التي تم فحصها، يمكن دراسة معظم بسهولة من خلال نظام في المختبر. في الواقع، بناء على العزلة، وخلايا السلائف عضلي (البلدان المتوسطية الشريكة) في الأسماك أو خلايا myosatellite (اللجان الدائمة) في الثدييات تدخل بسهولة هذه العملية تنطوي على درج...

لقد تم الحصول على فهم كبير من الثدييات تكون العضل من خلال خلاصة هذه العملية في كل من الماوس الأساسي (المصحف العضلة) myoblast الثقافات وخط الخلية المستمدة من الماوس موصوفة وصفا جيدا، C2C12 5. بدأت في 1950s 6، وقد أدت هذه الثقافات إلى الكثير من التقدم في فهم البرنامج murinemyogenic، وبالتالي، تكون العضل في الفقاريات الأخرى. بالإضافة إلى ذلك، زادت خلية واحدة تقنيات ليف عضلي ازدراع من فهم التفاعلات بين الخلايا الأقمار الصناعية وmyofibers المحيطة 7-9. الثقافات الخليوي وجاذبية خاصة للتحقيقات من تكون العضل بسبب الوقت القصير من السلائف لخلايا متمايزة 10، السهولة النسبية لترنسفكأيشن لرني 11-14، 15،16 المعدلة وراثيا و overexpression الدراسات 14،17،18، التوسع في المختبر تليها زرع في الجسم الحي 18-20، وحتى شركاتاريسون الخلايا السلائف عضلي وكلاء ينظم لهم عبر الأصناف 21،22. بينما الاختلافات نظرا للبيئة اصطناعية للنظام الثقافة وقد وصفت 5،23، وقد أثبتت هذه النظم في المختبر ليكون لا غنى عنه لدينا تشريح برنامج معقدة تنظم تشكيل متعددة النوى، mononucleated myofibersfrom متباينة عضال الخلايا الاصلية التكاثري المعروفة باسم myosatellite الخلايا (اللجان الدائمة) بين الثدييات. خارج من فئة الثدييات، ومع ذلك، فهم الحفظ و / أو اختلاف في آليات السيطرة تكون العضل سيئة، إلى حد كبير بسبب صعوبة في زراعة الخلايا السلائف عضلي (البلدان المتوسطية الشريكة) وmyoblasts من مختلف الأصناف. في الواقع، لقد فقط وصفت الثقافات myoblast الأولية في ثلاثة طيور 24-26، واحدة من الزواحف 27، عدد قليل من البرمائيات 28-30، وبعض الأسماك 1،3،4،31-33. خطوط الخلايا عضلي مستمر من هاءrtebrates غيرها من القوارض 34-36، بل هي أكثر نادرة، مع الخط فقط غير الثدييات عضلي خلية مشتق من السمان الياباني (Cortunix تفرضه اليابان)، QM7 37. على الرغم من العديد من المحاولات في تخليد، لا يزال خط خلية عضلي مكتملة العظام بعيد المنال، وبروتوكول للترنسفكأيشن كفاءة هذه الخلايا تم نشره فقط هذا العام 15. وبالتالي، فإن هناك حاجة بروتوكولات واضحة جدا وجيدا الأمثل لزراعة البلدان المتوسطية الشريكة الابتدائية وmyoblasts من مجموعة متنوعة من الفقاريات بكثير ليس فقط لتوسيع معرفتنا لتطور البرنامج عضلي، ولكن لتوظيف قوة علم وظائف الأعضاء المقارن لتحقيق اختراقات في علاج أمراض العضلات والهيكل العظمي البشري والاضطرابات. في حين أن الأدب يحتوي على العديد من التقارير MPC / myoblast العزلة 38-49، فإنه من الشائع للكتاب لوصف بروتوكولات لمثل هذه العزلة في سطور، غالبا ما تكون ناقصة، والأشكال. علاوة على ذلك، معظم بروتوكولات المفيد الريبوrted تم تطويرها للفئران 50-53، وبعض هذه تعتمد على اختيار الأجسام المضادة 54،55 أو 56،57 الجينات المحورة مضان، مما يجعل هذه البروتوكولات غير صالحة للاستعمال أو الأنواع غير القوارض اعمق غير عملي يستخدمها علماء البيولوجيا العضلات. مع المعروفة قليلا عن السمكية، البرمائيات، والزواحف تكون العضل، بروتوكول مفصلة وشاملة، وصفت مع التوجيه السمعي البصري وبكفاءة تظاهروا في الأنواع بعيدة الصلة، ستكون مفيدة للغاية في الميدان. وصف لأول مرة من قبل باول وزملاؤه في عام 1989 58، وقد وضعت البروتوكول التالية في البداية إلى عزل الدول المتوسطية الشريكة وmyoblasts من أسماك السلمون (وهي تراوت قوس قزح، هينوكس mykiss، وسمك السلمون الأطلسي، سالموسالار) وبعض الكارب أكبر (أي ذهبية، Carassiusauratusauratus) . في عام 2000، وFauconneau Paboeuf الأمثل ثقافة myoblast الأولية لتراوت قوس قزح 59، وminoroptimizations أماهدي هذا البروتوكول للاستعمال في عدة البلم أصغر من كليد Danioninae (الزرد، دانيو rerio، ودانيو العملاق، Devario aequipinnatus) 32 وذلك بسبب العديد من الأدوات الجينية المتاحة للعمل الزرد وبالتالي الأقارب المقربين. الأسماك مكتملة العظام هي كائنات جذابة للدراسة نظرا لاستراتيجيتهم النمو المتباينة (على الأقل في معظم الأنواع). السلمون كبيرة، مثل معظم الأسماك، وتنمو indeterminately، مع إمكانات النمو لا يعوقها على الخط المقارب عند الاستحقاق، حتى في سن الشيخوخة 60-62. خلافا الزرد، danionins كبيرة مثل دانيو العملاق 63 وإمكانات النمو العرض دانيو شاربان نموذجية من الأسماك مكتملة العظام، مما يجعل تجاور بهم مباشرة إلى منصة مثالية لفهم ما إذا كان اختيار مصير الخلية لجنة السياسة النقدية تلعب دورا في تضخم العضلات والهيكل العظمي مقابل تضخم. وبالمثل، لقد أثبتنا أن هذا البروتوكول يمكن استخدامها مع الفئران وقنافذ البحر، مع العائد خلية عالية نسبيا وviabمؤشرات ility. السلمندر Urodele، مثل قنفذ البحر المكسيكي (Ambystomamexicanum)، وتمتلك قدرة ملحوظة على تجديد الأنسجة، بما في ذلك الأطراف وذيول 64-66 بأكمله. هذه الخاصية تجعل هذه البرمائيات نماذج مثيرة للاهتمام من تلف العضلات والهيكل العظمي والشيخوخة. باستخدام بروتوكول موضح أدناه، نهجا مماثلا يمكن القيام بها كما حدث في العديد من أنواع الأسماك، وتوفير سياق المقارنة أوسع لمثل هذه الدراسات. كما العديد من علماء الأحياء المقارن حقا نقدر، ويمكن إجراء التقدم الأكثر وضوحا في مجال البيولوجيا الأساسية ومتعدية الطب الحيوي عندما يتم تحليل البيانات ضمن أوسع نطاق (هنا، ونسب الفقاريات بأكمله).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="743">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 1. Detailed Reagent Information</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="42" style="height:43px;width:205px;">Reagent</td>
			<td style="width:217px;">Company (Preferred v. Alternate)</td>
			<td style="width:160px;">Catalog Number (Preferred v. Alternate)</td>
			<td style="width:161px;">Quantity per Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="20" style="height:20px;">&#947;-irradiated poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MP Biomedicals)</td>
			<td>P5899 (ICN19454405)</td>
			<td>5 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">DMEM (high glucose)</td>
			<td>Sigma-Aldrich (cellgro)</td>
			<td>MT-50-003-PB (D7777)</td>
			<td>2 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Laminin</td>
			<td>BD Biosciences (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>CB-40232 (L2020)</td>
			<td>1 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="41" style="height:41px;width:205px;">Sodium Bicarbonate (NaHCO3)</td>
			<td>Fisher Scientific (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>BP328-500 (S5761)</td>
			<td>1.51 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">HEPES (C8H18N2O4S)</td>
			<td>Fisher Scientific (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>BP310-1 (H6147)</td>
			<td>9.53 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Antibiotic/Antimycotic</td>
			<td>Thermo Scientific (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>SV3007901 (A5955)</td>
			<td>17-20 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Gentamicin Sulfate</td>
			<td>Lonza (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>BW17-519Z (G1397)</td>
			<td>2-3 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Donor Equine Sera</td>
			<td>Thermo Scientific (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>SH3007403 (H1270)</td>
			<td>75 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Fetal Bovine Sera</td>
			<td>Thermo Scientific (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>SH3007103 (F2442)</td>
			<td>25 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Collagenase (Type IV)</td>
			<td>Worthington (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>LS004189 (C9891)</td>
			<td>0.44 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Trypsin (from Pancreas)</td>
			<td>MP Biomedicals (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>ICN15357125 (T5266)</td>
			<td>1 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 2. Consumables, Tools and Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="42" style="height:43px;width:239px;">Consumable</td>
			<td style="width:204px;">Tools</td>
			<td style="width:199px;">Equipment</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="28" style="height:28px;">Cell Culture Plates</td>
			<td>Forceps (Coarse)</td>
			<td>Serological Pipettor</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="28" style="height:28px;width:239px;">Sterile 50 mL Conical Tubes</td>
			<td style="width:204px;">Forceps (Fine)</td>
			<td>pH Meter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="28" style="height:28px;width:239px;">Laboratory Tape</td>
			<td style="width:204px;">Scalpel Handles</td>
			<td>Chilling Incubator (Echotherm)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="28" style="height:28px;width:239px;">0.2 &#956;m Vacuum Sterilization Systems</td>
			<td style="width:204px;">Scalpel Blades (#10, #11)</td>
			<td>Laminar Flow Hood</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="28" style="height:28px;width:239px;">Water-repellant Autoclave Paper</td>
			<td style="width:204px;">Surgical Scissors</td>
			<td>Vacuum Manifold</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="28" style="height:28px;width:239px;">Serological Pipettes</td>
			<td>Glass Petri Dishes</td>
			<td>Microosmolality Meter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="28" style="height:28px;width:239px;"></td>
			<td>12-16 G Cannulas with Luer Locks</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 3. Optimized Volumes for Coating Cell Culture Plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="24" style="height:24px;width:167px;">Plate Size</td>
			<td style="width:192px;">cm^2 per Well</td>
			<td style="width:132px;">Poly-L-lysine*</td>
			<td style="width:145px;">Laminin**</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="20" style="height:20px;">6 well</td>
			<td>9.5</td>
			<td>1.6 mL</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:167px;">24 well</td>
			<td>1.9</td>
			<td>0.32</td>
			<td>0.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:167px;">48 well</td>
			<td>0.95</td>
			<td>0.16</td>
			<td>0.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:167px;">96 well</td>
			<td>0.32</td>
			<td>0.06</td>
			<td>0.03</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">*0.1 mg/mL concentration</td>
			<td colspan="2">** 0.020 mg/mL concentration</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 4. Media for Isolation, Dissociation, and Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="24" style="height:24px;width:163px;">Reagent</td>
			<td style="width:155px;">Isolation</td>
			<td style="width:127px;">Wash</td>
			<td style="width:127px;">Dissociation</td>
			<td>Complete</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="20" style="height:20px;">Base Medium</td>
			<td>419.25 mL</td>
			<td>395.40 mL</td>
			<td>297.00 mL</td>
			<td>178.00 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="20" style="height:20px;width:163px;">PSF*</td>
			<td>5.00 mL</td>
			<td>4.00 mL</td>
			<td>3.00 mL</td>
			<td>2.00 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="40" style="height:40px;width:163px;">Gentamicin Sulfate**</td>
			<td>0.75 mL</td>
			<td>0.60 mL</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="40" style="height:40px;width:163px;">Donor Equine Serum</td>
			<td>75.00 mL</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="40" style="height:40px;width:163px;">Fetal Bovine Serum***</td>
			<td style="width:155px;">-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>20.00 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4" height="19" style="height:19px;width:660px;">* PSF: penicillin/streptomycin/fungizone cocktail (100x); ** 50 mg/mL concentration; *** Characterized</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 5. Recommended Dilutions and Plating Volumes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="24" style="height:24px;width:75px;">Plate Size</td>
			<td style="width:103px;">cm^2 per Well</td>
			<td style="width:145px;">Dilution</td>
			<td style="width:111px;">Plating Volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="20" style="height:20px;">6 well</td>
			<td>9.5</td>
			<td>1.5-2.0x10^6 cells/mL</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="20" style="height:20px;width:75px;">24 well</td>
			<td>1.9</td>
			<td>1.5-2.0x10^6 cells/mL</td>
			<td>250 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="20" style="height:20px;width:75px;">48 well</td>
			<td>0.95</td>
			<td>1.5-2.0x10^6 cells/mL</td>
			<td>150 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="20" style="height:20px;width:75px;">96 well</td>
			<td>0.32</td>
			<td>1.5-2.0x10^6 cells/mL</td>
			<td>50-100 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 6. Average number of cells per g tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2" height="24" style="height:24px;width:201px;">Species</td>
			<td colspan="2" style="width:273px;">Average # cells/g tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2" height="20" style="height:20px;">Danio rerio</td>
			<td colspan="2">6,400,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2" height="20" style="height:20px;width:201px;">Danio dangila</td>
			<td colspan="2">1,783,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2" height="20" style="height:20px;width:201px;">Devario aequipinnatus</td>
			<td colspan="2">1,797,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2" height="20" style="height:20px;">Oncorhynchus mykiss</td>
			<td colspan="2">66,800</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 7. Recommended Incubation Temperatures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2" height="24" style="height:24px;width:201px;">Species</td>
			<td colspan="2" style="width:273px;">Temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2" height="20" style="height:20px;">Danio/ Devario spp.</td>
			<td colspan="2">26 - 28 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2" height="20" style="height:20px;width:201px;">Oncorhynchus/Salmo spp.</td>
			<td colspan="2">10* - 18 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2" height="20" style="height:20px;width:201px;">Ambystoma mexicanum</td>
			<td colspan="2">18&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3" height="20" style="height:20px;">* Lower temperatures support lower proliferation rates.</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of primary myogenic precursor cell/myoblast cultures from basal vertebrate lineages

نظرا لصعوبة الكامنة والوقت الذي يتطلبه مع دراسة برنامج عضلي في الجسم الحي، ونظم الثقافة الأولية المستمدة من الخلايا الجذعية البالغة من سكان العضلات والهيكل العظمي، والخلايا السلائف عضلي (البلدان المتوسطية الشريكة)، وقد ثبت لا غنى عنها في فهمنا لتطوير الهيكل العظمي والعضلات في الثدييات و النمو. خاصة بين الأصناف القاعدية من الفقاريات، ولكن، من محدودية البيانات واصفا الآليات الجزيئية التي تتحكم في تجديد الذات، والانتشار، والتفريق بين البلدان المتوسطية الشريكة. ذات أهمية خاصة هي الآليات المحتملة التي تكمن وراء قدرة الفقاريات القاعدية للخضوع كبيرة postlarval الهيكل العظمي ليف عضلي تضخم (أي الأسماك مكتملة العظام) وتجديد كامل بعد فقدان أطرافهم (أي urodele البرمائيات). بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام myoblasts مثقف مساعدة في فهم التجديد وخلاصة البرنامج عضلي والخلافات بينهما. إلىلهذه الغاية، ونحن تصف بالتفصيل بروتوكول قوية وفعالة (والاختلافات فيه) لعزل والمحافظة على البلدان المتوسطية الشريكة وذريتها، وmyoblasts myotubes غير ناضجة، في خلية ثقافة كمنصة لفهم تطور البرنامج عضلي، بدءا من أكثر الفقاريات القاعدية. الاستفادة من الوضع الكائن نموذج من الزرد (دانيو rerio)، ونحن تقريرا عن تطبيق هذا البروتوكول لأسماك صغيرة من كليد الكارب Danioninae. جنبا إلى جنب، وهذا البروتوكول يمكن استخدامها لتحقيق المنهج المقارن أوسع من خلال عزل الدول المتوسطية الشريكة من قنفذ البحر المكسيكي (Ambystomamexicanum) وحتى القوارض المختبر. والآن تستخدم على نطاق واسع في دراسة هذا البروتوكول تكون العضل في العديد من أنواع الأسماك، بما في ذلك سمك السلمون المرقط قوس قزح، والسلمون، والشبوط 1-4.

يجب أربع وعشرين ساعة بعد البذر، وخلايا السلائف عضلي (البلدان المتوسطية الشريكة) تكون مرئية تعلق على قوام laminin (انظر الأرقام 1a و 1D). بعد البذر، وخلايا (البلدان المتوسطية الشريكة) اعتماد مثل مغزل الشكل، مما يدل على هذا النوع من الخلايا (الشكل 1)، وهي MyoD1 +...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Primary Myogenic Precursor Cell/Myoblast Cultures from Basal Vertebrate Lineages at JoVE.com

Preparation of Primary Myogenic Precursor Cell/Myoblast Cultures from Basal Vertebrate Lineages

في الثقافة المختبر أثبتت أنظمة لا غنى عنها في فهمنا لتكون العضل الفقاريات. ومع ذلك، لا يزال هناك الكثير الذي يمكن تعلمه عن تنمية العضلات والهيكل العظمي nonmammalian والنمو، لا سيما في الأصناف القاعدية. بروتوكول كفاءة وقوية لعزل الخلايا الجذعية البالغة من هذا النسيج، والخلايا السلائف عضلي (البلدان المتوسطية الشريكة)، والحفاظ على التجديد الذاتي، والانتشار، وتمايز في إطار الثقافة الأولية يسمح لتحديد آليات تنظيمية والحفظ في جميع أنحاء متباينة الأنساب الفقاريات.

إعداد الابتدائية عضلي السلائف الخلية / ثقافات Myoblast من بصل الفقارية الأنساب

Due to the inherent difficulty and time involved with studying the myogenic program in vivo, primary culture systems derived from the resident adult stem ...

preparation-primary-myogenic-precursor-cellmyoblast-cultures-from

Research

JoVE Journal

Biology

20.2K Views.  University of Alabama at Birmingham.  في الثقافة المختبر أثبتت أنظمة لا غنى عنها في فهمنا لتكون العضل الفقاريات. ومع ذلك، لا يزال هناك الكثير الذي يمكن تعلمه عن تنمية العضلات والهيكل العظمي nonmammalian والنمو، لا سيما في الأصناف القاعدية. بروتوكول كفاءة وقوية لعزل الخلاي?...

Video: Preparation of Primary Myogenic Precursor Cell/Myoblast Cultures from Basal Vertebrate Lineages

Primary Neuronal Cultures from the Brains of Late Stage Drosophila Pupae

In this video, we demonstrate the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. The procedure begins with the removal of brains from animals at 70-78 hrs after puparium formation. The isolated brains are shown after brief incubation in papain followed by several washes in serum-free growth medium. The process of mechanical dissociation of each brain in a 5 ul drop of media on a coverslip is illustrated. The axons and dendrites of the post-mitotic neurons are sheered off near the soma during dissociation but the neurons begin to regenerate processes within a few hours of plating. Images show live cultures at 2 days. Neurons continue to elaborate processes during the first week in culture. Specific neuronal populations can be identified in culture using GAL4 lines to drive tissue specific expression of fluorescent markers such as  GFP or RFP. Whole cell recordings have demonstrated the cultured neurons form functional, spontaneously active cholinergic and GABAergic synapses. A short video segment illustrates calcium dynamics in the cultured neurons using Fura-2 as a calcium indicator dye to monitor spontaneous calcium transients and nicotine evoked calcium responses in a dish of cultured neurons. These pupal brain cultures are a useful model system in which genetic and pharmacological tools can be used to identify intrinsic and extrinsic factors that influence formation and function of central synapses.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. Views of live cultures show neurite outgrowth and imaging of calcium levels using Fura-2.

متعلق بالخلايا العصبية الثقافات الأساسي من الأمخاخ في وقت متأخر من المرحلة ذبابة الفاكهة شرانق

In this video, we demonstrate the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. The procedure begins with the ...

Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos and their dechorionation using bleach are demonstrated. Using a glass pipet attached to a mouth suction tube, we illustrate the removal of all cells from single embryos. The method for dispersing cells from each embyro into a small (5 l) drop of medium on an uncoated glass coverslip is demonstrated. A view through the microscope at 1 hour after plating illustrates the preferred cell density. Most of the cells that survive when grown in defined medium are neuroblasts that divide one or more times in culture before extending neuritic processes by 12-24 hours. A view through the microscope illustrates the level of neurite outgrowth and branching expected in a healthy culture at 2 days in vitro. The cultures are grown in a simple bicarbonate based defined medium, in a 5% CO2 incubator at 22-24&deg;C. Neuritic processes continue to elaborate over the first week in culture and when they make contact with neurites from neighboring cells they often form functional synaptic connections. Neurons in these cultures express voltage-gated sodium, calcium, and potassium channels and are electrically excitable. This culture system is useful for studying molecular genetic and environmental factors that regulate neuronal differentiation, excitability, and synapse formation/function.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. Views of live cultures show cells 1 hour after plating and differentiated neurons after 2 days of growth in a bicarbonate-based defined medium. The neurons are electrically excitable and form synaptic connections.

التحضير للثقافات متعلق بالخلايا العصبية من أجنة ذبابة الفاكهة المرحلة Midgastrula

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos ...

Preparation of Dissociated Mouse Cortical Neuron Cultures

This video will guide you through the process for generating cortical neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse brain. These cultures can be used for a variety of applications including immunocytochemistry, biochemistry, electrophysiology, calcium and sodium imaging, protein and/or RNA isolation. These cultures also provide a platform to study the neuronal development of transgenic animals that carry a late embryonic or postnatal lethal gene mutation. The procedure is relatively straight forward, requires some experience in tissue culture technique and should not take longer than two to three hours if you are properly prepared. Careful separation of the cortical rind from the thalamo-cortical fiber tract will reduce the number of unwanted non-neuronal cells. To increase yields of neuronal cells triturate the pieces of the cortical tissue gently after the enzyme incubation step. This is imperative as it prevents unnecessary injury to cells and premature neuronal cell death. Since these cultures are maintained in the absence of glia feeder cells, they also offer an added advantage of growing cultures enriched in neurons.

This video shows a procedure for generating neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse cortex. These cultures can be used for immunocytochemistry, biochemistry, electrophysiology, calcium and sodium imaging and provide a platform to study the neuronal development of transgenic animals that carry a postnatal lethal gene mutation.

التحضير للثقافات ماوس العصبية القشرية نأت

This video will guide you through the process for generating cortical neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse brain. These cultures ...

Primary Dissociated Midbrain Dopamine Cell Cultures from Rodent Neonates

The ability to create primary cell cultures of dopamine neurons allows for the study of the presynaptic characteristics of dopamine neurons in isolation from systemic input from elsewhere in the brain. In our lab, we use these neurons to assess dopamine release kinetics using carbon fiber amperometry, as well as expression levels of dopamine related genes and proteins using quantitative PCR and immunocytochemistry. In this video, we show you how we generate these cultures from rodent neonates.
The process involves several steps, including the plating of cortical glial astrocytes, the conditioning of neuronal cell culture media by the glial substrate, the dissection of the midbrain in neonates, the digestion, extraction and plating of dopamine neurons and the addition of neurotrophic factors to ensure cell survival.
The applications suitable for such a preparation include electrophysiology, immunocytochemistry, quantitative PCR, video microscopy (i.e., of real-time vesicular fusion with the plasma membrane), cell viability assays and other toxicological screens.

Primary dissociated midbrain dopamine cell cultures allow for the study of presynaptic characteristics of dopamine neurons. They can be used to monitor real-time dopamine release kinetics and protein/mRNA levels of regulators of dopamine exocytosis. Here, we show you how to generate these cultures from rodent neonates.

الدماغ المتوسط ​​الدوبامين الابتدائي الثقافات خلية ينفصل عن الولدان القوارض

The ability to create primary cell cultures of dopamine neurons allows for the study of the presynaptic characteristics of dopamine neurons in isolation ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

التحضير لزراعة الخلايا المكونة للدم الابتدائية من نخاع عظام الفئران لElectroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Fabrication of Myogenic Engineered Tissue Constructs

Despite the fact that electronic pacemakers are life-saving medical devices, their long-term performance in pediatric patients can be problematic owing to the restrictions imposed by a child's small size and their inevitable growth. Consequently, there is a genuine need for innovative therapies designed specifically for pediatric patients with cardiac rhythm disorders. We propose that a conductive biological alternative consisting of a collagen-based matrix containing autologously-derived cells could better adapt to growth, reduce the need for recurrent surgeries, and greatly improve the quality of life for these patients. In the present study, we describe a procedure for incorporating primary skeletal myoblast cell cultures within a hydrogel matrix to fashion a surgically-implantable tissue construct that will serve as an electrical conduit between the upper and lower chambers of the heart. Ultimately, we anticipate using this type of engineered tissue to restore atrioventricular electrical conduction in children with complete heart block. In view of that, we isolate myoblasts from the skeletal muscles of neonatal Lewis rats and plate them onto laminin-coated tissue culture dishes using a modified version of established protocols[2, 3]. After one to two days, cultured cells are collected and mixed with antibiotics, type 1 collagen, Matrigel&trade;, and NaHCO3. The result is a viscous, uniform solution that can be cast into a mold of nearly any shape and size[1, 4, 5]. For our tissue constructs, we employ type 1 collagen isolated from fetal lamb skin using standard procedures[6]. Once the tissue has solidified at 37&deg;C, culture media is carefully added to the plate until the construct is submerged. The engineered tissue is then allowed to further condense through dehydration for 2 more days, at which point it is ready for in vitro assessment or surgical-implantation.

Here, we demonstrate fabrication of collagen-based, tissue constructs containing skeletal myoblasts. These 3-D engineered constructs may be used to replace or repair tissues in vivo. For our purposes, we have designed these as an atrioventricular electrical conduit for the repair of complete heart block[1].

تلفيق عضلي يبني الأنسجة المهندسة

Despite the fact that electronic pacemakers are life-saving medical devices, their long-term performance in pediatric patients can be problematic owing to ...

Establishing Primary Adult Fibroblast Cultures From Rodents

The importance of using primary cells, rather than cancer cell lines, for biological studies is becoming widely recognized. Primary cells are preferred in studies of cell cycle control, apoptosis, and DNA repair, as cancer cells carry mutations in genes involved in these processes. Primary cells cannot be cultured indefinitely due to the onset of replicative senescence or aneuploidization. Hence, new cultures need to be established regularly. The procedure for isolation of rodent embryonic fibroblasts is well established, but isolating adult fibroblast cultures often presents a challenge. Adult rodent fibroblasts isolated from mouse models of human disease may be a preferred control when comparing them to fibroblasts from human patients. Furthermore, adult fibroblasts are the only available material when working with wild rodents where pregnant females cannot be easily obtained. Here we provide a protocol for isolation and culture of adult fibroblasts from rodent skin and lungs. We used this procedure successfully to isolate fibroblasts from over twenty rodent species from laboratory mice and rats to wild rodents such as beaver, porcupine, and squirrel.

This article describes a protocol for isolation and maintenance of primary fibroblast cultures from skin and lung tissue of wild rodents.

إنشاء الابتدائية الثقافات الليفية الكبار من القوارض

The importance of using primary cells, rather than cancer cell lines, for biological studies is becoming widely recognized.  Primary cells are preferred ...

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos. In brief, a large amount of staged embryos from young and healthy flies are collected, sterilized, and then physically dissociated into a single cell suspension using a glass homogenizer. After being plated on culture plates or chamber slides at an appropriate density in culture medium, these cells can further differentiate into several morphologically-distinct cell types, which can be identified by their specific cell markers. Furthermore, we present conditions for treating these cells with double stranded (ds) RNAs to elicit gene knockdown. Efficient RNAi in Drosophila primary cells is accomplished by simply bathing the cells in dsRNA-containing culture medium. The ability to carry out effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical, cell imaging analyses, will allow a variety of questions to be answered in Drosophila primary cells, especially those related to differentiated muscle and neuronal cells.

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

We provide a detailed protocol for preparing primary cells dissociated from Drosophila embryos. The ability to carry out the effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical and cell imaging methods will allow a variety of questions to be addressed in Drosophila primary cells.

الخلية الأولية من الثقافات ذبابة الفاكهة الأجنة المعيدة

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos.   In brief, a large amount of staged ...

Isolation of Basal Cells and Submucosal Gland Duct Cells from Mouse Trachea

The large airways are directly in contact with the environment and therefore susceptible to injury from toxins and infectious agents that we breath in 1. The large airways therefore require an efficient repair mechanism to protect our bodies. This repair process occurs from stem cells in the airways and isolating these stem cells from the airways is important for understanding the mechanisms of repair and regeneration. It is also important for understanding abnormal repair that can lead to airway diseases 2. The goal of this method is to isolate a novel stem cell population from the mouse tracheal submucosal gland ducts and to place these cells in in vitro and in vivo model systems to identify the mechanisms of repair and regeneration of the submucosal glands 3. This production shows methods that can be used to isolate and assay the duct and basal stem cells from the large airways 3.This will allow us to study diseases of the airway, such as cystic fibrosis, asthma and chronic obstructive pulmonary disease. Currently, there are no methods for isolation of submucosal gland duct cells and there are no in vivo models to study the regeneration of submucosal glands.

Here we demonstrate our protocol for isolation of basal and submucosal gland duct cells from mouse tracheas. We also demonstrate the method of injecting stem cells into the dorsal mouse fat pad to create an in vivo model of submucosal gland regeneration.

عزل الخلايا القاعدية والخلايا تحت المخاطية قناة الغدة من القصبة الهوائية ماوس

The large airways are directly in contact with the environment and therefore susceptible to injury from toxins and infectious agents that we breath in 1. ...

Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it is not easy to establish an effective system for culturing these cells. Since the culture conditions can influence gene expression that confers pluripotency in hESCs and hiPSCs, the optimization and standardization of the culture method is crucial.
The establishment of hESC lines was first described by using MEFs as feeder cells and fetal bovine serum (FBS)-containing culture medium2. Next, FBS was replaced with knockout serum replacement (KSR) and FGF2, which enhances proliferation of hESCs3. Finally, feeder-free culture systems enable culturing cells on Matrigel-coated plates in KSR-containing conditioned medium (medium conditioned by MEFs)4. Subsequently, hESCs culture conditions have moved towards feeder-free culture in chemically defined conditions5-7. Moreover, to avoid the potential contamination by pathogens and animal proteins culture methods using xeno-free components have been established8.
To obtain improved conditions mouse feeder cells have been replaced with human cell lines (e.g. fetal muscle and skin cells9, adult skin cells10, foreskin fibroblasts11-12, amniotic mesenchymal cells13). However, the efficiency of maintaining undifferentiated hESCs using human foreskin fibroblast-derived feeder layers is not as high as that from mouse feeder cells due to the lower level of secretion of Activin A14. Obviously, there is an evident difference in growth factor production by mouse and human feeder cells.
Analyses of the transcriptomes of mouse and human feeder cells revealed significant differences between supportive and non-supportive cells. Exogenous FGF2 is crucial for maintaining self-renewal of hESCs and hiPSCs, and has been identified as a key factor regulating the expression of Tgf&beta;1, Activin A and Gremlin (a BMP antagonist) in feeder cells. Activin A has been shown to induce the expression of OCT4, SOX2, and NANOG in hESCs15-16.
For long-term culture, hESCs and hiPSCs can be grown on mitotically inactivated MEFs or under feeder-free conditions in MEF-CM (MEF-Conditioned Medium) on Matrigel-coated plates to maintain their undifferentiated state. Success of both culture conditions fully depends on the quality of the feeder cells, since they directly affect the growth of hESCs.
Here, we present an optimized method for the isolation and culture of mouse embryonic fibroblasts (MEFs), preparation of conditioned medium (CM) and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) to assess the levels of Activin A within the media.

The quality of mouse embryonic fibroblasts (MEFs) is dictated by the right strain of mouse such as CF-1. Pluripotency-supportive MEFs and conditioned media (CM) obtained from these should contain optimal concentrations of Activin A, Gremlin and Tgf&beta;1 needed for the Activin/Nodal and FGF pathways to co-operatively maintain self-renewal and pluripotency.

إعداد خلايا الفأر الجنينية الخلايا الليفية مناسبة للالإنسان التثقيف الجنينية والتي يسببها الخلايا الجذعية المحفزة

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it ...