Die Autoren bedanken sich bei vielen Dank an Dr. verlängern. Josep Planas und Juan Castillo für ihre berufliche Expertise in der Entwicklung und Anwendung dieser Kultur-Protokoll, um kleine Fische und Amphibien. Dank gebührt auch den zahllosen Menschen, die unermüdlich mit der Dissektion und Dissoziation von Muskelgewebe von vielen Fischen (sowohl in Art und Zahl), darunter Matthew Lade, Delci Christensen, Zachary Fowler, Brooke Franzen, Nathan Froehlich, Kira Marshall unterstützt haben, Ben Meyer, Ethan Remily und Sinibaldo Romero. Diese Arbeit wurde von der University of Alabama in Birmingham Fachbereich Biologie Start-up-Fonds, Zentrum für Protease Forschung NIH # 2P20 RR015566, NIH Grants NIAMS # R03AR055350 NDSU Advance-FORWARD NSF Zuschuss # HRD-0811239 zu PRB unterstützt und. Unterstützung wurde auch von der UAB Nutrition Obesity Research Center Auszeichnung # P30DK056336, NIH NIDDK vorgesehen. Sein Inhalt sind allein in der Verantwortung der Autoren und nicht unbedingtdie offizielle Meinung des NIH.

Ethikerklärung: Alle hier beschriebenen Experimenten mit Wirbeltieren wurde vorab von der Institutional Animal Care und Verwenden Ausschuss der Universität von Alabama in Birmingham zugelassen und steht im Einklang mit den Richtlinien des Amtes für Labortierschutz, National Institutes of Health der USA gegründet Department of Health and Human Services. 1. Vorbereitung für Kultur <ol><li> Bereiten Sie das Basismedium wie folgt: 9 mM NaHCO 3 (1,51 g pro 2 l), 20 mM HEPES (9,53 g pro 2 l) in DMEM (13,48 g / L; 26.96 g pro 2 l). <ol><li> Bestimmen Sie, pH-Wert und anpassen, um 7.40 mit HCl oder NaOH. </li><li> Bestimmen Sie Osmolalität und passen auf ~ 300 mOsm mit NaCl (falls erforderlich). </li><li> Filter mit sterilisieren (2) 1 L Vakuum-Sterilisationssysteme und bei 4 ° C vor Licht für bis zu 2-3 Monate geschützt. HINWEIS: In den Tabellen 1 und 2, für vollständige Reagenz, Werkzeuge, Verbrauchsrungen, und Geräteinformationen. </li></ol></li><li> Vorbereitung Poly-L-Lysin-behandelten Platten durch Auflösen von 5 mg γ-bestrahlt Poly-L-Lysin (&gt; 300.000 MW) in 50 ml ultrareinem Wasser steril. Vorsichtig mischen durch Umdrehen für 10 Minuten bei Raumtemperatur, die Gewährleistung der vollen Auflösung von Lysin Polymere. </li><li> Pipettieren Sie die notwendige Menge an Poly-L-Lysin-Lösung in jede Vertiefung, nach Plattentyp (Tabelle 3). Lassen Platten in Laminarströmungshaube 5 Minuten stehen. </li><li> Dann entfernen Poly-L-Lysin-Lösung und zweimal mit sterilem Wasser. Lassen Platten an der Luft trocknen in Laminarströmungshaube für 20 Minuten. </li><li> Erhalten 1 mg Laminin (Engelbreth-Holm-Swarm-Ursprung) und lösen in 50 ml Basismedium in einer Endkonzentration von 20 ug / ml. Gelten Laminin Lösung von Poly-L-Lysin-behandelten Zellkulturplatten mit 2 &amp;mgr; g / cm 2. (Siehe Tabelle 3 für verschiedene Plattengrößen) </li><li> Schwenken Sie die Lösung zu sorgen full und Berichterstattung. Dichtungsplatten mit Labor Band und in Brutschrank für 24 Stunden. Der Inkubator sollte auf geeignete Temperatur für verwendeten Arten (siehe Tabelle 7) eingestellt werden und keine zusätzlichen Gase müssen mit Inkubator aufgenommen werden. HINWEIS: Laminin erlaubt sein muss, um Platten für 24 Stunden vor der Aussaat Zellen anhaften werden. Nichtbeachtung führt zu schlechter bis gar keine Zellhaftung führen. </li><li> Bereiten Medien, wie in Tabelle 4 beschrieben. Komplette Medien wird am besten vorbereitet den Tag der Nutzung. </li><li> In Vorbereitung für die Gewebe-Isolation, montieren Sie die folgenden Punkte und Autoklaven: 300-500 ml-Becherglas (s); Glaspetrischalen; Skalpell handhabt; Pinzette (fein und grob); Dissektion Schere; und mehrere Blatt wasserabweisend Autoklaven Papier. HINWEIS: Für jede Person, die Unterstützung bei der Dissektion Prozess, (2) Skalpellgriffe, (1) Zange (Typ je nach persönlicher Vorliebe), (1) Sektion Schere, und (5-10) Blatt wasserabweisend Autoklaven Papier sindausreichend. </li><li> Zusätzlich zu den obigen Artikel autoklaviert, zusammen 70% Ethanol, eine Gewichtsbilanz, sterile 50 ml konische Röhrchen (Anzahl ist abhängig von der Größe der Kultur) und Eis. </li></ol> 2. Gewebedissektion <ol><li> Bevor Sie beginnen, zu gewährleisten, dass eine ausreichende Fischbestand vorhanden ist. HINWEIS: Das Alter der Fische verwendet werden, ist von entscheidender Bedeutung. Während Fisch von zwei verschiedenen Arten können mit vergleichbaren Gewichts zu sein, wird ein jüngerer Fische einer Art mehr als eine ältere MPC Fische einer anderen Art zu besitzen. Als allgemeine Regel gilt, jünger Fisch, vor allem bei der Arbeit mit Salmoniden, sind am besten. Für danionins, können die Fische so alt wie 1 Jahr optimal genutzt werden, während Salmoniden Alter von 4-6 Monaten oder jünger (bis 15 g) sind optimal. </li><li> Für jede 5 g Gewebe seziert werden aliquote 25 ml Isolationsmedium in ein steriles 50 ml konischen Röhrchen. </li><li> Wiegen, Plattenmasse und Anzahl der Röhre (n). Zeigen Röhrchen auf Eis. </li><li> Euthanize 2-3 Fischzu einer Zeit, durch Eintauchen in&gt; 300 mg / l Natriumbicarbonat gepufferte Tricainmethansulfonat. Lassen Kiemendeckel Bewegung für&gt; 5 minuten aufhören und dann tauchen Fische in 70% Ethanol (in den sterilen Becher enthalten) für 30 Sekunden. </li><li> Fisch entfernen aus 70% Ethanol und setzen auf wasserabweisend Autoklaven Papier. Direkt hinter dem Kiemendeckel, mit einem Skalpell, um einen oberflächlichen, flachen Schnitt zu machen. Entfernen die Schuppen und die Haut durch Ergreifen der Haut an der oben genannten Einschnitt und ziehen in Richtung Schwanz des Fisches. </li><li> Nach Hautentfernung, die Verbrauchsteuern epaxialen, schnell glykolytische &quot;weißen&quot; Muskel der Fisch von beiden Seiten (die langsame oxidativen &#39;rot&#39; Muskel in der Nähe der Seitenlinie befindet vermeiden) und in Isolationsmedium. Entsorgen Sie den Rest der Fische durch Institution erforderlich. HINWEIS: Während es durchaus zu Kultur MPCs aus rotem Muskel Ursprung ist möglich, fast jede Publikation mit Knochenfisch Mittelmeer-Partnerländern eingesetzt hat Zellen aus der epaxialen m isoliertyotome. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 2,4-2,6, bis eine ausreichende Menge des Muskels erhalten. Während der Präparation, sicherzustellen, dass gepoolte Muskelgewebe bleibt auf Eis, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu erhalten. </li></ol> 3. Mechanische Dissoziation <ol><li> Gießen einer Röhre von 25 ml / 5 g Muskelgewebe in eine Glaspetrischale. Mit zwei Skalpellgriffe in Kombination mit Aufbau # 10 Skalpellklingen, zerkleinern Gewebe zu einem Brei oder Püree Konsistenz. Ein &quot;Hin-und-her&quot;-Bewegung ziehen die Skalpellklingen aneinander vorbei am besten funktioniert. HINWEIS: Während Gewebe Homogenisatoren kann angemessen erscheinen, wird die Anzahl der lebensfähigen Zellen drastisch reduziert werden, wenn nicht abgeschafft. </li><li> Mit einer 25 ml serologische Pipette und serologische Pipette, entfernen Sie die aufgeschlämmt Gewebe und in der Original konischen Rohr ersetzen. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 3.1-3.2, bis alle Gewebe in alle Röhrchen wurde mechanisch dissoziiert. </li><li> Zentrifuge Gewebe für 5 Minuten bei 300 × g und 10 ° C. </li><li> Folldurch Zentrifugation, entsorgen Sie die 25 ml Medium Überstand mit einer Pipette 25 ml serologische, Vakuumsauger, oder durch sorgfältige Dekantieren. </li><li> 25 ml Waschmedium in jedes Röhrchen, resuspendieren Gewebe und wie oben zentrifugieren. </li><li> Zweimal waschen mit Waschmedium, das Entfernen der Überstand jeder Zeit. </li></ol> 4. Enzymatische Dissoziation <ol><li> Während Schritt 3.4, bereiten Collagenase-Lösung durch die Kombination von 0,22 g Typ IV Kollagenase und 44 ml Basismedium (oder ausreichender Menge mit 0,11 g/0.22 ml). </li><li> Rühren in einem Becherglas für 10-15 Minuten bei 4 ° C. Filter sterilisieren mit einer 50 ml-Spritze und ein 0,45 &amp;mgr; m-Spritzenfilter. HINWEIS: Mehr als ein Spritzenfilter erforderlich sein, abhängig von der Kollagenase-Zubereitung. Collagenase aus anderen als Worthington Biochemical Anbieter wurden, stellt heute mehr Schwierigkeiten bei der Filtration. Collagenase wird verwendet, um Peptidbindungen in Collagen, die das Endomysium bilden distanzieren. DiesVerdauung wird diese Schutzbarriere der Muskelfasern zu entfernen. </li><li> Für jedes g Muskelgewebe, resuspendieren Gewebe in einem 0,2% Collagenase-Lösung. Für 5 g Muskelgewebe, 10 ml Kollagenase-Lösung und 15 ml Basismedium. </li><li> In 10 ul PSF pro ml Collagenase-Lösung / Basismedium (zB 250 ul bis 25 ml). Sicherzustellen, dass die Gewebe gut suspendiert, da dies die Effizienz der enzymatischen Verdauung beeinflussen. </li><li> Inkubieren Muskelgewebe in Kollagenase für 60 Minuten bei 18 ° C unter leichtem Schütteln. Je nach dem Grad der mechanischen Dissoziation und Arten kann Collagenaseverdau bis 90 Minuten verlängert werden, obwohl dies die Lebensfähigkeit der Zellen zu beeinflussen. </li><li> Nach Collagenaseverdau, Zentrifuge konische Röhrchen bei 300 xg für 5 Minuten bei 12 ° C. Überstand verwerfen und resuspendieren Gewebe in 25 ml Waschmedium. </li><li> Zentrifugieren bei 300 x g für 5 min bei 126; C Wiederholen Sie mit Waschmedium ein zweites Mal. </li><li> Gewebe nach dem Waschen zweimal resuspendieren Muskelgewebe in 25 ml Waschmedium und Verreiben mit 10 ml serologische Pipette bis das Gewebe / Homogenisat Medium gelangt in die und aus der Pipette mit relativer Leichtigkeit. 10.05 Triturationen ist in der Regel ausreichend. <ol><li> Wiederholen Sie mit einer 5 ml Pipette serologischen und dann einer 16-Gauge-Metallkanüle mit einer Spritze befestigt. </li></ol></li><li> Zentrifuge konische Röhrchen bei 300 xg für 5 Minuten bei 12 ° C. Überstand dekantieren. </li><li> Während der über 5-minütige Zentrifugation, bereiten Sie die Trypsinverdau Lösung durch die Kombination von 0,25 g Trypsin mit 5 ml Basismedium. </li><li> Rühren bei 4 º C für 10-15 Minuten und Filter sterilisieren mit einer 20 ml-Spritze und 0,45 &amp;mgr; m-Spritzenfilter. </li><li> Abrufen konische Röhrchen und 100 ul Trypsin-Lösung und 4,9 ml der Dissoziation Medium für jeden 1 g Muskelgewebe zu jedem Rohr. Für example, 500 &amp;mgr; l Trypsin-Lösung und 24,5 ml Dissoziation Medium 5 g von Muskelgewebe. HINWEIS: Trypsin ist eine Serinprotease, die myogene Vorläuferzellen aus der Basalmembran getrennt werden. </li><li> Resuspendieren Gewebe in der Trypsin / Dissoziation Medium auch. Inkubation für 20 Minuten bei 18 ° C. </li><li> Nach der ersten Inkubation Trypsin, Zentrifuge konische Röhrchen bei 300 x g für 1 min bei 12 ° C. </li><li> Trypsin zu neutralisieren, indem die Überstände mit Trennmedium in einer Konzentration von 1 Volumen Überstand in 4 Volumina Isolationsmedium. Lagerung bei 4 ° C in der zweiten Trypsin Verdauung. </li><li> Um die verbleibende Pellet von Gewebe, wiederholen Sie die Schritte von 4,12 bis 4,15, die Kombination der Überstand nach Schritt 4.15 mit dem Überstand / Isolationsmedium von der ersten Trypsin Verdauung. </li><li> Alternativ: Die Collagenase und Trypsin-Verdaus kann kombiniert werden, um die Zellausbeute zu maximieren. &lt;ol&gt; <li> Um dies zu tun, verreiben die Kollagenase verdaut unter Verwendung einer Metallkanüle (6 in der Länge und 16 Gauge am besten) bis zu einer 20 ml-Spritze, bis das Homogenat leicht durch die Kanüle hindurchgeht. </li><li> Zu dem Homogenat, 500 &amp;mgr; l Trypsin-Lösung (hergestellt in Schritt 4.10) und Inkubation bei 18 ° C für 20 Minuten. </li><li> Nach der Inkubation Zentrifuge konische Röhrchen bei 300 × g für 1 Minute bei 12 ° C. </li><li> Trypsin zu neutralisieren, indem die Überstände mit Trennmedium in einer Konzentration von 1 Volumen Überstand in 4 Volumina Isolationsmedium. </li><li> Lagerung bei 4 ° C in der zweiten Trypsin Verdauung. </li><li> Fahren Sie mit Schritt 4.18 als mit dem Standard-Protokoll. </li></ol></li><li> Dispense die endgültige Überstand / Isolationsmedium Mischung in 50 ml konische Röhrchen und bei 300 g zentrifugiert für 10 Minuten bei 12 ° C. </li><li> Entfernen Sie die Überstände kümmert sich die Zelle nicht zu störenPellets. Pipette 2 ml Vollmedium in jedes Röhrchen, Lösen jeder Zellpellet. </li><li> Kombinieren Sie Zellen in Vollmedium in einem 50 ml konischen Röhrchen suspendiert. </li><li> Spülen jedes Röhrchen mit 1 ml vollständigem Medium, kombiniert mit dem Pool von Zellen, die zuvor resuspendiert. </li><li> Man reibt mit einem Metall-Kanüle und Spritze 5-10 mal. </li><li> Filter Zellsuspension durch einen 100 um Zellsieb, Spülen mit Vollmedium. </li><li> Filtern Sie die Zellsuspension durch ein 40 um Zellsieb. </li><li> Ausreichend Vollmedium auf 50 ml und zentrifugiert bei 300 g für 10 Minuten bei 15 ° C. </li></ol> 5. Zählen, Verdünnung und Seeding der Zellen <ol><li> Nach der letzten Zentrifugation in Schritt 4,25, entfernen Überstand durch vorsichtiges Dekantieren oder mit einer serologischen Pipette. Zellpellet in 5 ml Vollmedium. </li><li> Mit Zellen vollständig suspendiert, entfernen 20 ul; Der Zellsuspension und in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> In 5 ul Trypanblau-Farbstoff und 5 Minuten warten. Verwendung eines Hämocytometer, bestimmen die Anzahl der lebensfähigen Zellen. </li><li> Bei Bestimmung, verdünnten Zellen auf die benötigte Konzentration. Teleost MPCs werden am besten bei 150.000-200.000 Zellen pro cm 2 ausgesät. Für einen Sechs-Well-Plattieren Strategie Verdünnen Zellen auf 1,5 x 10 6 bis 2,0 x 10 6 pro ml ausreichend unterstützt Proliferation und Differenzierung. </li><li> Abrufen von Poly-L-Lysin-Behandlung, Laminin-beschichteten Platten und Samenzellen. (Siehe Tabelle 5 für die Plattenspezifischen Verdünnungen und Überzug Bände.) HINWEIS: Tabelle 6 zeigt durchschnittliche Anzahl der Zellen isoliert pro Gramm Muskelgewebe aus verschiedenen Knochenfischarten isoliert. Regenbogenforelle (O. mykiss) weisen weniger MPCs pro Gramm Muskelgewebe als tun Zebrafisch (D. rerio) und wird dadurch benötigen mehr Fisch aus für die richtige Aussaat isolieren. </li><li> Dichtungsplatten mit Labor Band und in Kühlbrutschrank bei der entsprechenden Temperatur. Mittelmeer-Partnerländern von allen hier aufgeführten (außer Mäuse) Spezies unter normalen atmosphärischen Bedingungen ohne Kohlendioxid (CO 2)-Supplementierung inkubiert werden. (Siehe Tabelle 7). </li><li> Alternative: Einige Laboratorien haben ein Protokoll, das für die Mittelmeer-Partnerländern, um so an die Kultur Substrate für 40 Minuten halten ruft angenommen. <ol><li> Dann spülen Platten mit Waschmedien, alle lose befestigt und nicht-adhärenten Zellen zu entfernen. Warnung: Dieser Schritt ist sehr wichtig, um &quot;nicht-spezifische&quot; Haftung von anderen Zellen (z. B. Fibroblasten) zu dem Kultursubstrate zu vermeiden. </li><li> Fügen komplette Medien-und Ortszellen im Brutschrank und pflegen, wie unten beschrieben. </li></ol></li></ol>

Es gibt nichts zu offenbaren.

Myogenen Programms in welcher suchten Spezies, kann am einfachsten durch eine in-vitro-System untersucht werden. In der Tat, nach der Isolierung, myogenen Vorläuferzellen (MPCs) in Fisch oder myosatellite Zellen (MSC) in Säugetieren geben Sie einfach dieses stark regulierten Prozess, der die Proliferation, Zellzyklus-Entzug, und die terminale Differenzierung von Myoblasten und die Fusion von Myoblasten in diesen entstehenden Myotuben. Der allgemeine Mangel an transgenen Reportergens Stämme piscine Arten (mit...

Erhebliche Verständnis von Säugetier myogenesis hat durch die Wiederholung dieses Prozesses sowohl in primären Maus (Mus musculus) Myoblasten-Kulturen und die gut beschriebene Maus-abgeleitete Zelllinie gewonnen wurden, C2C12 5. Beginnend in den 1950er Jahren 6, diese Kulturen haben viel Fortschritt im Verständnis der murinemyogenic Programm durch die Erweiterung, myogenesis in anderen Wirbeltieren führte, und. Zusätzlich einzelnen Zelle myofiber Explantat Techniken haben das Verständnis der Wechselwirkungen zwischen Zellen und der umgebenden Satelliten Muskelfasern 7-9 für Untersuchungen myogenesis besonders attraktiv aufgrund der kurzen Zeit von Vorläuferzelle 10 zu unterscheiden, der relativen Leichtigkeit der Transfektion für RNAi erhöht. Zellkulturen 11-14, transgene 15,16 und Überexpression Studien 14,17,18, in-vitro-Expansion, gefolgt von In-vivo-Transplantation 18-20, und sogar Layoutarison myogener Vorläuferzellen und deren Regel Agenten in Taxa 21,22. Während die Unterschiede aufgrund der künstlichen Umgebung des Kultursystems beschrieben worden, 5,23, haben diese in vitro-Systemen nachgewiesen unverzichtbar für unser Dissektion der komplizierten Programm für die Bildung von vielkernigen sein, mononukleären terminal differenzierten myofibersfrom proliferative Vorläuferzellen bekannt myosatellite Zellen (MSC) unter den Säugetieren. Außerhalb der Klasse Mammalia jedoch die Erhaltung und / oder Divergenz der Mechanismen, die myogenesis schlecht verstanden werden, vor allem wegen der Schwierigkeiten bei der Kultivierung von myogenen Vorläuferzellen (MPCs) und Myoblasten aus verschiedenen Taxa. Tatsächlich haben die Grund Myoblastenkulturen nur in drei Vögel 24-26, ein Reptil 27, ein paar Amphibien 28-30, und einige Fische 1,3,4,31-33 beschrieben. Kontinuierliche myogenen Zelllinien aus veandere als Nagetiere 34-36 rtebrates sind noch seltener, nur mit dem Nicht-Säuger myogenen Zelllinie, die aus der japanischen Wachtel (Cortunix japonica) abgeleitet, QM7 37. Trotz vieler Versuche der Verewigung, bleibt ein Knochenfisch myogenen Zelllinie schwer zu fassen und ein Protokoll für die effiziente Transfektion dieser Zellen wurde erst in diesem Jahr 15 veröffentlicht. So sind klar und gut optimierte Protokolle für die Kultivierung von primären Myoblasten MPCs und aus einer Vielzahl von Wirbeltieren sehr notwendig, um nicht nur weiter unser Wissen über die Evolution des myogenen Programm zu erweitern, aber die Macht der vergleichenden Physiologie beschäftigen, um Durchbrüche in machen die Behandlung von menschlichen Skelettmuskelerkrankungen und Störungen. Während die Literatur enthält viele Berichte von MPC / Myoblasten Isolierung 38-49, ist es üblich, dass Autoren, die Protokolle für solche Trennungen in kurzen, oft unvollständig, Formate zu beschreiben. Ferner sind die lehrreichsten Protokolle RepoRTED haben für Mäuse von 50 bis 53 entwickelt, und einige von diesen setzen auf Antikörperselektion 54,55 oder Fluoreszenz Transgene 56,57, so dass diese Protokolle unbrauchbar oder unpraktisch durch Muskel Biologen genutzt innersten Nicht-Nagetieren. Mit wenig über piscine-, Amphibien-, Reptilien-und Myogenese eine detaillierte und gründliche Protokoll, mit audiovisuellen Führung und mit nachgewiesener Effizienz in entfernt verwandten Arten beschrieben, wäre sehr hilfreich, um das Feld ein. Zuerst von Powell und Kollegen im Jahr 1989 58 beschrieben, wurde das folgende Protokoll ursprünglich entwickelt, um PLM und Myoblasten aus Salmonidfischen (nämlich, Regenbogenforelle, Oncorhynchus mykiss und Atlantischer Lachs, Salmo salar) und einigen größeren Karpfenfischen (dh Goldfisch, Carassiusauratusauratus) zu isolieren . Im Jahr 2000 Fauconneau Paboeuf und optimiert eine primäre Myoblastenkultur für Regenbogenforelle 59 und minoroptimizations made dieses Protokoll nutzbar in mehrere kleinere Elritzen der Danioninae Clade (Zebrafisch, Danio rerio, und riesige Danio, Devario aequipinnatus) 32 aufgrund der vielen genetischen Werkzeuge für die Zebrafisch-Arbeit zur Verfügung und damit seine nahen Verwandten. Knochenfische sind attraktiv für Organismen Studie aufgrund ihrer unterschiedlichen Wachstumsstrategie (zumindest in den meisten Arten). Große Salmoniden, wie die meisten Fische, unbestimmt wachsen, mit Wachstumspotenzial durch eine Asymptote bei Fälligkeit uneingeschränkten, auch im Alter 60-62. Anders als Zebrafisch, große danionins wie der riesige Danio 63 und Schnurrbart danio Display Wachstum typisch für Knochenfische Potenziale, die ihre direkten Gegenüberstellung zu einer idealen Plattform für das Verständnis, ob MPC Zellschicksal Wahl spielt eine Rolle im Skelettmuskel-Hypertrophie-Hyperplasie gegenüber. Ebenso haben wir gezeigt, dass dieses Protokoll mit Mäusen und axolotls verwendet werden, wobei relativ hohe Zellausbeute und VIABility Indizes. Urodele Salamander, wie der mexikanische Axolotl (Ambystomamexicanum), besitzen die bemerkenswerte Fähigkeit, Gewebe zu regenerieren, einschließlich ganzer Gliedmaßen und Schwänze 64-66. Diese Eigenschaft macht diese Amphibien interessante Modelle der Skelettmuskelabbau und Alterung. Mit dem unten beschriebenen Protokoll kann ein ähnlicher Ansatz durchgeführt werden, wie es in vielen Fischarten durchgeführt worden, die eine noch breitere Vergleichs Rahmen für solche Studien. Wie viele wirklich Vergleichs Biologen schätzen, die am sinnvollsten Fortschritte in der Grundlagen der Biologie und translationale Biomedizin ist möglich, wenn Daten innerhalb der breitesten Spektrum analysiert (hier der gesamte Wirbel Linie) werden.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="743">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 1. Detailed Reagent Information</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="42" style="height:43px;width:205px;">Reagent</td>
			<td style="width:217px;">Company (Preferred v. Alternate)</td>
			<td style="width:160px;">Catalog Number (Preferred v. Alternate)</td>
			<td style="width:161px;">Quantity per Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="20" style="height:20px;">&#947;-irradiated poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MP Biomedicals)</td>
			<td>P5899 (ICN19454405)</td>
			<td>5 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">DMEM (high glucose)</td>
			<td>Sigma-Aldrich (cellgro)</td>
			<td>MT-50-003-PB (D7777)</td>
			<td>2 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Laminin</td>
			<td>BD Biosciences (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>CB-40232 (L2020)</td>
			<td>1 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="41" style="height:41px;width:205px;">Sodium Bicarbonate (NaHCO3)</td>
			<td>Fisher Scientific (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>BP328-500 (S5761)</td>
			<td>1.51 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">HEPES (C8H18N2O4S)</td>
			<td>Fisher Scientific (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>BP310-1 (H6147)</td>
			<td>9.53 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Antibiotic/Antimycotic</td>
			<td>Thermo Scientific (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>SV3007901 (A5955)</td>
			<td>17-20 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Gentamicin Sulfate</td>
			<td>Lonza (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>BW17-519Z (G1397)</td>
			<td>2-3 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Donor Equine Sera</td>
			<td>Thermo Scientific (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>SH3007403 (H1270)</td>
			<td>75 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Fetal Bovine Sera</td>
			<td>Thermo Scientific (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>SH3007103 (F2442)</td>
			<td>25 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Collagenase (Type IV)</td>
			<td>Worthington (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>LS004189 (C9891)</td>
			<td>0.44 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Trypsin (from Pancreas)</td>
			<td>MP Biomedicals (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>ICN15357125 (T5266)</td>
			<td>1 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 2. Consumables, Tools and Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="42" style="height:43px;width:239px;">Consumable</td>
			<td style="width:204px;">Tools</td>
			<td style="width:199px;">Equipment</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="28" style="height:28px;">Cell Culture Plates</td>
			<td>Forceps (Coarse)</td>
			<td>Serological Pipettor</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="28" style="height:28px;width:239px;">Sterile 50 mL Conical Tubes</td>
			<td style="width:204px;">Forceps (Fine)</td>
			<td>pH Meter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="28" style="height:28px;width:239px;">Laboratory Tape</td>
			<td style="width:204px;">Scalpel Handles</td>
			<td>Chilling Incubator (Echotherm)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="28" style="height:28px;width:239px;">0.2 &#956;m Vacuum Sterilization Systems</td>
			<td style="width:204px;">Scalpel Blades (#10, #11)</td>
			<td>Laminar Flow Hood</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="28" style="height:28px;width:239px;">Water-repellant Autoclave Paper</td>
			<td style="width:204px;">Surgical Scissors</td>
			<td>Vacuum Manifold</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="28" style="height:28px;width:239px;">Serological Pipettes</td>
			<td>Glass Petri Dishes</td>
			<td>Microosmolality Meter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="28" style="height:28px;width:239px;"></td>
			<td>12-16 G Cannulas with Luer Locks</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 3. Optimized Volumes for Coating Cell Culture Plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="24" style="height:24px;width:167px;">Plate Size</td>
			<td style="width:192px;">cm^2 per Well</td>
			<td style="width:132px;">Poly-L-lysine*</td>
			<td style="width:145px;">Laminin**</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="20" style="height:20px;">6 well</td>
			<td>9.5</td>
			<td>1.6 mL</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:167px;">24 well</td>
			<td>1.9</td>
			<td>0.32</td>
			<td>0.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:167px;">48 well</td>
			<td>0.95</td>
			<td>0.16</td>
			<td>0.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:167px;">96 well</td>
			<td>0.32</td>
			<td>0.06</td>
			<td>0.03</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">*0.1 mg/mL concentration</td>
			<td colspan="2">** 0.020 mg/mL concentration</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 4. Media for Isolation, Dissociation, and Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="24" style="height:24px;width:163px;">Reagent</td>
			<td style="width:155px;">Isolation</td>
			<td style="width:127px;">Wash</td>
			<td style="width:127px;">Dissociation</td>
			<td>Complete</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="20" style="height:20px;">Base Medium</td>
			<td>419.25 mL</td>
			<td>395.40 mL</td>
			<td>297.00 mL</td>
			<td>178.00 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="20" style="height:20px;width:163px;">PSF*</td>
			<td>5.00 mL</td>
			<td>4.00 mL</td>
			<td>3.00 mL</td>
			<td>2.00 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="40" style="height:40px;width:163px;">Gentamicin Sulfate**</td>
			<td>0.75 mL</td>
			<td>0.60 mL</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="40" style="height:40px;width:163px;">Donor Equine Serum</td>
			<td>75.00 mL</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="40" style="height:40px;width:163px;">Fetal Bovine Serum***</td>
			<td style="width:155px;">-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>20.00 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4" height="19" style="height:19px;width:660px;">* PSF: penicillin/streptomycin/fungizone cocktail (100x); ** 50 mg/mL concentration; *** Characterized</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 5. Recommended Dilutions and Plating Volumes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="24" style="height:24px;width:75px;">Plate Size</td>
			<td style="width:103px;">cm^2 per Well</td>
			<td style="width:145px;">Dilution</td>
			<td style="width:111px;">Plating Volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="20" style="height:20px;">6 well</td>
			<td>9.5</td>
			<td>1.5-2.0x10^6 cells/mL</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="20" style="height:20px;width:75px;">24 well</td>
			<td>1.9</td>
			<td>1.5-2.0x10^6 cells/mL</td>
			<td>250 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="20" style="height:20px;width:75px;">48 well</td>
			<td>0.95</td>
			<td>1.5-2.0x10^6 cells/mL</td>
			<td>150 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="20" style="height:20px;width:75px;">96 well</td>
			<td>0.32</td>
			<td>1.5-2.0x10^6 cells/mL</td>
			<td>50-100 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 6. Average number of cells per g tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2" height="24" style="height:24px;width:201px;">Species</td>
			<td colspan="2" style="width:273px;">Average # cells/g tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2" height="20" style="height:20px;">Danio rerio</td>
			<td colspan="2">6,400,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2" height="20" style="height:20px;width:201px;">Danio dangila</td>
			<td colspan="2">1,783,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2" height="20" style="height:20px;width:201px;">Devario aequipinnatus</td>
			<td colspan="2">1,797,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2" height="20" style="height:20px;">Oncorhynchus mykiss</td>
			<td colspan="2">66,800</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 7. Recommended Incubation Temperatures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2" height="24" style="height:24px;width:201px;">Species</td>
			<td colspan="2" style="width:273px;">Temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2" height="20" style="height:20px;">Danio/ Devario spp.</td>
			<td colspan="2">26 - 28 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2" height="20" style="height:20px;width:201px;">Oncorhynchus/Salmo spp.</td>
			<td colspan="2">10* - 18 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2" height="20" style="height:20px;width:201px;">Ambystoma mexicanum</td>
			<td colspan="2">18&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3" height="20" style="height:20px;">* Lower temperatures support lower proliferation rates.</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of primary myogenic precursor cell/myoblast cultures from basal vertebrate lineages

Aufgrund der inhärenten Schwierigkeiten und Zeit mit dem Studium der myogenen Programm in vivo beteiligt, Primärkultursysteme von den ansässigen adulten Stammzellen der Skelettmuskulatur abgeleitet, die myogenen Vorläuferzellen (MPCs) sind unverzichtbar für unser Verständnis von Säugetierskelettmuskelentwicklung bewährt und Wachstum. Besonders bei den basalen Taxa der Wirbeltiere sind jedoch begrenzt, die molekularen Mechanismen, die die Selbsterneuerung, Proliferation und Differenzierung von MPC Beschreibung von Daten. Von besonderem Interesse sind mögliche Mechanismen, die die Fähigkeit der basalen Wirbeltieren zu erheblichen postlarvalen Skelett myofiber Hyperplasie (dh Knochenfische) und die vollständige Regeneration nach Anhängsel Verlust (dh urodele Amphibien) zu unterziehen zugrunde liegen. Zusätzlich könnte die Verwendung von kultivierten Myoblasten im Verständnis der Regeneration und der Wiederholung des myogenen Programm und die Unterschiede zwischen ihnen zu unterstützen. ZuZu diesem Zweck beschreiben wir im Detail ein robustes und effizientes Protokoll (und Variationen) für die Isolierung und die Aufrechterhaltung MPCs und ihre Nachkommen, Myoblasten und Myotuben unreifen, in der Zellkultur als Plattform für das Verständnis der Evolution des myogenen Programm, beginnend mit dem mehr basalen Wirbeltieren. Aufbauend auf der Modellorganismus Status der Zebrafisch (Danio rerio) berichten wir über die Anwendung dieses Protokolls auf kleine Fische des Cyprinidengewässer Clade Danioninae. Parallel kann dieses Protokoll genutzt werden, um eine breitere vergleichenden Ansatz durch Isolierung MPCs aus dem mexikanischen Axolotl (Ambystomamexicanum) und sogar Labornagern zu verwirklichen. Dieses Protokoll wird heute weitgehend in Studium myogenesis in mehreren Fischarten, darunter die Regenbogenforelle, Lachs und Meerbrassen 4.1 verwendet.

Vierundzwanzig Stunden nach der Aussaat, myogenen Vorläuferzellen (MPCs) sollte sichtbar für das Laminin Substrat befestigt werden (siehe Abbildungen 1a und 1d). Nach der Aussaat, Zellen (MPCs) trifft eine spindelartige Form, bezeichnend für diesen Zelltyp (Abbildung 1) und sind MyoD1 + (Abbildung 2). In Danio Arten, erscheinen MPCs kompakter mit kleineren bipolaren Prozesse als tun MPCs von Oncorhynchus und Salmo-Arten. Do...

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Preparation of Primary Myogenic Precursor Cell/Myoblast Cultures from Basal Vertebrate Lineages

In-vitro-Kultur haben Systeme unerlässlich, um unser Verständnis von Wirbel myogenesis bewährt. Allerdings bleibt noch viel zu über Nicht-Säuger-Skelettmuskel-Entwicklung und das Wachstum gelernt werden, vor allem in den basalen Taxa. Eine effiziente und robuste Protokoll für die Isolierung der adulten Stammzellen aus diesem Gewebe, die myogene Vorläuferzellen (MPCs) und Erhaltung ihrer Selbsterneuerung, Proliferation und Differenzierung in einer Primärkultur Einstellung ermöglicht die Identifizierung von konservierten und unterschiedliche Regulationsmechanismen ganzen die Wirbellinien.

Herstellung von primären Myogenic Vorläuferzelle / Myoblastenkulturen von Basal Wirbelstammbaum

Due to the inherent difficulty and time involved with studying the myogenic program in vivo, primary culture systems derived from the resident adult stem ...

preparation-primary-myogenic-precursor-cellmyoblast-cultures-from

Research

JoVE Journal

Biology

20.2K Aufrufe.  University of Alabama at Birmingham.  In-vitro-Kultur haben Systeme unerlässlich, um unser Verständnis von Wirbel myogenesis bewährt. Allerdings bleibt noch viel zu über Nicht-Säuger-Skelettmuskel-Entwicklung und das Wachstum gelernt werden, vor allem in den basalen Taxa. Eine effiziente und robuste Protokoll für die Isolierung der adulten Stammzellen aus diesem Gewebe, die myogene Vorläuferzellen (MPCs) und Erhaltung ihrer Selbsterneuerung, Proliferation und Differenzierung in einer Primärk...

Serie: Preparation of Primary Myogenic Precursor Cell/Myoblast Cultures from Basal Vertebrate Lineages

Primary Neuronal Cultures from the Brains of Late Stage Drosophila Pupae

In this video, we demonstrate the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. The procedure begins with the removal of brains from animals at 70-78 hrs after puparium formation. The isolated brains are shown after brief incubation in papain followed by several washes in serum-free growth medium. The process of mechanical dissociation of each brain in a 5 ul drop of media on a coverslip is illustrated. The axons and dendrites of the post-mitotic neurons are sheered off near the soma during dissociation but the neurons begin to regenerate processes within a few hours of plating. Images show live cultures at 2 days. Neurons continue to elaborate processes during the first week in culture. Specific neuronal populations can be identified in culture using GAL4 lines to drive tissue specific expression of fluorescent markers such as  GFP or RFP. Whole cell recordings have demonstrated the cultured neurons form functional, spontaneously active cholinergic and GABAergic synapses. A short video segment illustrates calcium dynamics in the cultured neurons using Fura-2 as a calcium indicator dye to monitor spontaneous calcium transients and nicotine evoked calcium responses in a dish of cultured neurons. These pupal brain cultures are a useful model system in which genetic and pharmacological tools can be used to identify intrinsic and extrinsic factors that influence formation and function of central synapses.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. Views of live cultures show neurite outgrowth and imaging of calcium levels using Fura-2.

Primäre neuronale Kulturen aus den Gehirnen von Late Stage Drosophila Puppen

In this video, we demonstrate the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. The procedure begins with the ...

Forschung

Biologie

Preparation of Dissociated Mouse Cortical Neuron Cultures

This video will guide you through the process for generating cortical neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse brain. These cultures can be used for a variety of applications including immunocytochemistry, biochemistry, electrophysiology, calcium and sodium imaging, protein and/or RNA isolation. These cultures also provide a platform to study the neuronal development of transgenic animals that carry a late embryonic or postnatal lethal gene mutation. The procedure is relatively straight forward, requires some experience in tissue culture technique and should not take longer than two to three hours if you are properly prepared. Careful separation of the cortical rind from the thalamo-cortical fiber tract will reduce the number of unwanted non-neuronal cells. To increase yields of neuronal cells triturate the pieces of the cortical tissue gently after the enzyme incubation step. This is imperative as it prevents unnecessary injury to cells and premature neuronal cell death. Since these cultures are maintained in the absence of glia feeder cells, they also offer an added advantage of growing cultures enriched in neurons.

This video shows a procedure for generating neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse cortex. These cultures can be used for immunocytochemistry, biochemistry, electrophysiology, calcium and sodium imaging and provide a platform to study the neuronal development of transgenic animals that carry a postnatal lethal gene mutation.

Vorbereitung von dissoziierten Maus kortikale Neuron Kulturen

This video will guide you through the process for generating cortical neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse brain. These cultures ...

Primary Dissociated Midbrain Dopamine Cell Cultures from Rodent Neonates

The ability to create primary cell cultures of dopamine neurons allows for the study of the presynaptic characteristics of dopamine neurons in isolation from systemic input from elsewhere in the brain. In our lab, we use these neurons to assess dopamine release kinetics using carbon fiber amperometry, as well as expression levels of dopamine related genes and proteins using quantitative PCR and immunocytochemistry. In this video, we show you how we generate these cultures from rodent neonates.
The process involves several steps, including the plating of cortical glial astrocytes, the conditioning of neuronal cell culture media by the glial substrate, the dissection of the midbrain in neonates, the digestion, extraction and plating of dopamine neurons and the addition of neurotrophic factors to ensure cell survival.
The applications suitable for such a preparation include electrophysiology, immunocytochemistry, quantitative PCR, video microscopy (i.e., of real-time vesicular fusion with the plasma membrane), cell viability assays and other toxicological screens.

Primary dissociated midbrain dopamine cell cultures allow for the study of presynaptic characteristics of dopamine neurons. They can be used to monitor real-time dopamine release kinetics and protein/mRNA levels of regulators of dopamine exocytosis. Here, we show you how to generate these cultures from rodent neonates.

Primäre Dissoziierte Mittelhirn Dopamin Zellkulturen aus Nager Neugeborene

The ability to create primary cell cultures of dopamine neurons allows for the study of the presynaptic characteristics of dopamine neurons in isolation ...

Preparation of 2-dGuo-Treated Thymus Organ Cultures

In the thymus, interactions between developing T-cell precursors and stromal cells that include cortical and medullary epithelial cells are known to play a key role in the development of a functionally competent T-cell pool. However, the complexity of T-cell development in the thymus in vivo can limit analysis of individual cellular components and particular stages of development. In vitro culture systems provide a readily accessible means to study multiple complex cellular processes. Thymus organ culture systems represent a widely used approach to study intrathymic development of T-cells under defined conditions in vitro. Here we describe a system in which mouse embryonic thymus lobes can be depleted of endogenous haemopoeitic elements by prior organ culture in 2-deoxyguanosine, a compound that is selectively toxic to haemopoeitic cells. As well as providing a readily accessible source of thymic stromal cells to investigate the role of thymic microenvironments in the development and selection of T-cells, this technique also underpins further experimental approaches that include the reconstitution of alymphoid thymus lobes in vitro with defined haemopoietic elements, the transplantation of alymphoid thymuses into recipient mice, and the formation of reaggregate thymus organ cultures. (This article is based on work first reported Methods in Molecular Biology 2007, Vol. 380 pages 185-196).

This video demonstrates the dissection and removal of the fetal thymus as well the preparation of ex vivo cultures of 2-dGuo-treated thymus.

Herstellung von 2-dGuo-Behandelte Thymus Organkulturen

In the thymus, interactions between developing T-cell precursors and stromal cells that include cortical and medullary epithelial cells are known to play ...

Preparation and Maintenance of Dorsal Root Ganglia Neurons in Compartmented Cultures

Neurons extend axonal processes that are far removed from the cell body to innervate target tissues, where target-derived growth factors are required for neuronal survival and function. Neurotrophins are specifically required to maintain the survival and differentiation of innervating sensory neurons but the question of how these target-derived neurotrophins communicate to the cell body of innervating neurons has been an area of active research for over 30 years. The most commonly accepted model of how neurotrophin signals reach the cell body proposes that signaling endosomes carry this signal retrogradely along the axon. In order to study retrograde transport, a culture system was originally devised by Robert Campenot, in which cell bodies are isolated from their axons. The technique of preparing these compartmented chambers for culturing sensory neurons recapitulates the selective stimulation of neuron terminals that occurs in vivo following release of target-derived neurotrophins. Retrograde signaling events that require long-range microtubule dependent retrograde transport have important implications for the treatment of neurodegenerative disorders.

Here we describe the technique of preparing and maintaining compartmented chambers for culturing sensory neurons of the dorsal root ganglia.

Erstellung und Pflege von Spinalganglien Neuronen in Compartmented Kulturen

Neurons extend axonal processes that are far removed from the cell body to innervate target tissues, where target-derived growth factors are required for ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

Die Herstellung von primären hämatopoetischen Zellkulturen aus Knochenmark der Maus für die Elektroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Fabrication of Myogenic Engineered Tissue Constructs

Despite the fact that electronic pacemakers are life-saving medical devices, their long-term performance in pediatric patients can be problematic owing to the restrictions imposed by a child's small size and their inevitable growth. Consequently, there is a genuine need for innovative therapies designed specifically for pediatric patients with cardiac rhythm disorders. We propose that a conductive biological alternative consisting of a collagen-based matrix containing autologously-derived cells could better adapt to growth, reduce the need for recurrent surgeries, and greatly improve the quality of life for these patients. In the present study, we describe a procedure for incorporating primary skeletal myoblast cell cultures within a hydrogel matrix to fashion a surgically-implantable tissue construct that will serve as an electrical conduit between the upper and lower chambers of the heart. Ultimately, we anticipate using this type of engineered tissue to restore atrioventricular electrical conduction in children with complete heart block. In view of that, we isolate myoblasts from the skeletal muscles of neonatal Lewis rats and plate them onto laminin-coated tissue culture dishes using a modified version of established protocols[2, 3]. After one to two days, cultured cells are collected and mixed with antibiotics, type 1 collagen, Matrigel&trade;, and NaHCO3. The result is a viscous, uniform solution that can be cast into a mold of nearly any shape and size[1, 4, 5]. For our tissue constructs, we employ type 1 collagen isolated from fetal lamb skin using standard procedures[6]. Once the tissue has solidified at 37&deg;C, culture media is carefully added to the plate until the construct is submerged. The engineered tissue is then allowed to further condense through dehydration for 2 more days, at which point it is ready for in vitro assessment or surgical-implantation.

Here, we demonstrate fabrication of collagen-based, tissue constructs containing skeletal myoblasts. These 3-D engineered constructs may be used to replace or repair tissues in vivo. For our purposes, we have designed these as an atrioventricular electrical conduit for the repair of complete heart block[1].

Herstellung von Myogenic Engineered Tissue Konstrukte

Despite the fact that electronic pacemakers are life-saving medical devices, their long-term performance in pediatric patients can be problematic owing to ...

Preparation of Aplysia Sensory-motor Neuronal Cell Cultures

The nervous system of the marine mollusk Aplysia californica is relatively simple, consisting of approximately 20,000 neurons. The neurons are large (up to 1 mm in diameter) and identifiable, with distinct sizes, shapes, positions and pigmentations, and the cell bodies are externally exposed in five paired ganglia distributed throughout the body of the animal. These properties have allowed investigators to delineate the circuitry underlying specific behaviors in the animal1. The monosynaptic connection between sensory and motor neurons is a central component of the gill-withdrawal reflex in the animal, a simple defensive reflex in which the animal withdraws its gill in response to tactile stimulation of the siphon. This reflex undergoes forms of non-associative and associative learning, including sensitization, habituation and classical conditioning. Of particular benefit to the study of synaptic plasticity, the sensory-motor synapse can be reconstituted in culture, where well-characterized stimuli elicit forms of plasticity that have direct correlates in the behavior of the animal2,3. Specifically, application of serotonin produces a synaptic strengthening that, depending on the application protocol, lasts for minutes (short-term facilitation), hours (intermediate-term facilitation) or days (long-term facilitation). In contrast, application of the peptide transmitter FMRFamide produces a synaptic weakening or depression that, depending on the application protocol, can last from minutes to days (long-term depression). The large size of the neurons allows for repeated sharp electrode recording of synaptic strength over periods of days together with microinjection of expression vectors, siRNAs and other compounds to target specific signaling cascades and molecules and thereby identify the molecular and cell biological steps that underlie the changes in synaptic efficacy.
An additional advantage of the Aplysia culture system comes from the fact that the neurons demonstrate synapse-specificity in culture4,5. Thus, sensory neurons do not form synapses with themselves (autapses) or with other sensory neurons, nor do they form synapses with non-target identified motor neurons in culture. The varicosities, sites of synaptic contact between sensory and motor neurons, are large enough (2-7 microns in diameter) to allow synapse formation (as well as changes in synaptic morphology) with target motor neurons to be studied at the light microscopic level.
In this video, we demonstrate each step of preparing sensory-motor neuron cultures, including anesthetizing adult and juvenile Aplysia, dissecting their ganglia, protease digestion of the ganglia, removal of the connective tissue by microdissection, identification of both sensory and motor neurons and removal of each cell type by microdissection, plating of the motor neuron, addition of the sensory neuron and manipulation of the sensory neurite to form contact with the cultured motor neuron.

Preparation of Aplysia Sensory-motor Neuronal Cell Cultures

Primary cultures of Aplysia sensory-motor neurons provide a model preparation for studying synapse formation and synaptic plasticity in vitro. This video demonstrates the identification and microdissection of sensory and motor neurons from Aplysia ganglia as well as the methods for establishing and maintaining sensory-motor neurons in culture.

Vorbereitung der Aplysia Sensory-Motor neuronalen Zellkulturen

The nervous system of the marine mollusk Aplysia californica is relatively simple, consisting of approximately 20,000 neurons.  The neurons are large (up ...

Isolation of Basal Cells and Submucosal Gland Duct Cells from Mouse Trachea

The large airways are directly in contact with the environment and therefore susceptible to injury from toxins and infectious agents that we breath in 1. The large airways therefore require an efficient repair mechanism to protect our bodies. This repair process occurs from stem cells in the airways and isolating these stem cells from the airways is important for understanding the mechanisms of repair and regeneration. It is also important for understanding abnormal repair that can lead to airway diseases 2. The goal of this method is to isolate a novel stem cell population from the mouse tracheal submucosal gland ducts and to place these cells in in vitro and in vivo model systems to identify the mechanisms of repair and regeneration of the submucosal glands 3. This production shows methods that can be used to isolate and assay the duct and basal stem cells from the large airways 3.This will allow us to study diseases of the airway, such as cystic fibrosis, asthma and chronic obstructive pulmonary disease. Currently, there are no methods for isolation of submucosal gland duct cells and there are no in vivo models to study the regeneration of submucosal glands.

Here we demonstrate our protocol for isolation of basal and submucosal gland duct cells from mouse tracheas. We also demonstrate the method of injecting stem cells into the dorsal mouse fat pad to create an in vivo model of submucosal gland regeneration.

Isolierung von Basalzellen und Submuköse Gland Duct Zellen aus Maus Trachea

The large airways are directly in contact with the environment and therefore susceptible to injury from toxins and infectious agents that we breath in 1. ...

Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it is not easy to establish an effective system for culturing these cells. Since the culture conditions can influence gene expression that confers pluripotency in hESCs and hiPSCs, the optimization and standardization of the culture method is crucial.
The establishment of hESC lines was first described by using MEFs as feeder cells and fetal bovine serum (FBS)-containing culture medium2. Next, FBS was replaced with knockout serum replacement (KSR) and FGF2, which enhances proliferation of hESCs3. Finally, feeder-free culture systems enable culturing cells on Matrigel-coated plates in KSR-containing conditioned medium (medium conditioned by MEFs)4. Subsequently, hESCs culture conditions have moved towards feeder-free culture in chemically defined conditions5-7. Moreover, to avoid the potential contamination by pathogens and animal proteins culture methods using xeno-free components have been established8.
To obtain improved conditions mouse feeder cells have been replaced with human cell lines (e.g. fetal muscle and skin cells9, adult skin cells10, foreskin fibroblasts11-12, amniotic mesenchymal cells13). However, the efficiency of maintaining undifferentiated hESCs using human foreskin fibroblast-derived feeder layers is not as high as that from mouse feeder cells due to the lower level of secretion of Activin A14. Obviously, there is an evident difference in growth factor production by mouse and human feeder cells.
Analyses of the transcriptomes of mouse and human feeder cells revealed significant differences between supportive and non-supportive cells. Exogenous FGF2 is crucial for maintaining self-renewal of hESCs and hiPSCs, and has been identified as a key factor regulating the expression of Tgf&beta;1, Activin A and Gremlin (a BMP antagonist) in feeder cells. Activin A has been shown to induce the expression of OCT4, SOX2, and NANOG in hESCs15-16.
For long-term culture, hESCs and hiPSCs can be grown on mitotically inactivated MEFs or under feeder-free conditions in MEF-CM (MEF-Conditioned Medium) on Matrigel-coated plates to maintain their undifferentiated state. Success of both culture conditions fully depends on the quality of the feeder cells, since they directly affect the growth of hESCs.
Here, we present an optimized method for the isolation and culture of mouse embryonic fibroblasts (MEFs), preparation of conditioned medium (CM) and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) to assess the levels of Activin A within the media.

The quality of mouse embryonic fibroblasts (MEFs) is dictated by the right strain of mouse such as CF-1. Pluripotency-supportive MEFs and conditioned media (CM) obtained from these should contain optimal concentrations of Activin A, Gremlin and Tgf&beta;1 needed for the Activin/Nodal and FGF pathways to co-operatively maintain self-renewal and pluripotency.

Vorbereitung von embryonalen Maus-Fibroblasten-Zellen zum Kultivieren von humanen embryonalen und induzierten pluripotenten Stammzellen

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it ...