Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional del Corazón, los Pulmones y la Sangre de subvención HL-36573. Agradecemos al Sr. David Sowa para la edición de este manuscrito.

Todas las investigaciones con ratones se hizo de acuerdo a los procedimientos y directrices de los Institutos Nacionales de Salud, y los protocolos fueron aprobados por el Comité Institucional Cuidado de Animales y el Empleo de la Universidad de Toledo, Facultad de Medicina y Ciencias de la Vida. 1. Perfusión de preparación del sistema <ol><li> El día antes del aislamiento, llenar todo el sistema de perfusión (incluyendo depósitos) con una solución de detergente libre de residuos alcalina rápida. Deje que la solución penetre en el sistema durante unas horas o toda la noche. </li><li> A la mañana siguiente, ajustar la temperatura del termociclador a 37 ° C y deje que la solución se caliente. Retire la solución de detergente y lave el sistema a fondo con agua destilada esterilizada. No se olvide de todas las ramas laterales. </li><li> Llenar el sistema con tampón de perfusión a través de una bomba peristáltica constante y dibujar cualquier burbuja de aire fuera de la cámara de la aorta (trampa de burbujas) con una jeringa de montaje lateral para protegerel corazón de la oclusión coronaria. La velocidad de flujo de la bomba peristáltica se debe comprobar rutinariamente. </li></ol> 2. Preparación de Soluciones, Medios de cultivo, y Platos <ol><li> Tampón de perfusión: Hacer 500 ml de tampón de perfusión 1x antes de su uso. Este tampón libre de calcio contiene NaCl 113 mM, 4,7 mM de KCl, 0,6 mM KH 2 PO 4, 0,6 mM de Na 2 HPO 4, 1,2 mM de MgSO4, 10 mM de Na-HEPES, 12 mM de NaHCO3, 10 mM de KHCO3, 0,032 fenol mM de rojo, taurina 30 mM, 10 mM de BDM, y glucosa 5,5 mM. Ajustar el pH a 7,0 con HCl 2 M y se filtra a través de un filtro de 0,2 micras, se almacenan a 4 ° C. Nota: a) La solución de perfusión debe prepararse en el mismo día cuando se utiliza. En algunos casos, es aceptable para almacenar la solución durante menos de 3 días a 4 ° C. b) Este tampón tiene una concentración elevada de potasio hasta 15,3 mM, que puede mantener a los cardiomiocitos de reposo, reducir ATP consumption y aumentar la Ca 2 +-capacidad tolerante. </li><li> Tampón de digestión (300 U / ml, 25-50 ml / corazón): preparar justo antes de la perfusión. Pesar 15,000 U de la actividad total de la colagenasa tipo II, se disuelven en 50 ml de tampón de perfusión en campana de cultivo. Añadir 25 l de CaCl2 100 mM (solución madre, filtra esterilizada) para hacer que la concentración final de calcio 50 mM. Calentar el tampón a 37 ° C cuando esté listo para el aislamiento. A diferencia de la tripsina, colagenasa funciona mejor en presencia de 50-100 mM Ca 2 +. </li><li> Detener Buffer (50 ml / corazón): Operar en campana de cultivo. Mezclar 45 ml de tampón de perfusión con 5 ml estéril FBS. <ol><li> Ca 2 + solución I (12,5 mM Ca 2 +): Añadir 2,5 l de 100 mM CaCl2 a 20 ml de tampón de parada y mezclar. </li><li> Ca 2 + solución II (100 mM Ca 2 +): Añadir 10 l de 100 mM CaCl 2 y 10 ml de tampón de parada y mezclar. </li><li> Ca 2 + solución III (400 mM Ca 2 +): Añadir 40 l de 100 mM CaCl 2 y 10 ml de tampón de parada y mezclar. </li><li> Ca 2 + solución IV (900 mM Ca 2 +): Añadir 90 l de 100 mM CaCl 2 y 10 ml de tampón de parada y mezclar. </li></ol></li><li> Plating medio (50 ml / corazón): Transferencia de 43 ml de MEM que contiene 2 mM de L-glutamina y 1,26 mM de CaCl2 en un tubo cónico de 50 ml estéril en campana de cultivo y añadir 5 ml de FBS, 1 ml de la solución madre BDM ( 500 mM, esterilizado por filtración), y 0,5 ml de penicilina / estreptomicina (10.000 U / ml). Mezclar y equilibrar durante 2-3 horas antes del aislamiento de miocitos en 2% de CO 2, 37 ° C incubadora con las tapas flojas. Justo antes de chapado de los miocitos, añadir 0,5 ml de 200 mM ATP (pH 7.2, solución madre, filtra esterilizada) en el medio. </li><li> El medio de cultivo (50 ml / corazón): Transferencia 48 ml de MEM que contiene 2 mM de L-glutamina y 1,26 mM de CaCl2 en un tubo cónico de 50 ml estéril en campana de cultivo y añadir 1 ml de solución madre BDM (500 mM, filteR esterilizado), y 0,5 ml de penicilina / estreptomicina (10.000 U / ml). Mezclar y equilibrar en 2% de CO 2, 37 ° C incubadora antes del aislamiento de los miocitos. Antes de usar, añadir 0,5 ml de 100 mg / ml de BSA (esterilizado por filtración) en el medio. Nota: El uso de un 2% de CO 2 incubadora facilita el mantenimiento del medio de cultivo a pH 6,9 a 7,0, lo que ayuda a los myoctyes mantienen su morfología en forma de barra de hasta 24 horas. </li><li> Laminina (1-2 mg / cm 2) platos o placas recubiertas con: Transferencia de 200 l de 1 mg / ml de laminina de ratón natural 20 ml de PBS esterilizado (w / o calcio y magnesio) y mezclar. Añadir 1 ml a los platos de 35 mm, 2,5 ml a 60 mm platos, o 5 ml de platos de 100 mm, agite para cubrir uniformemente la superficie, y el lugar en el 2% de CO2, 37 ° C incubadora hasta chapado miocitos. Nota: Si los platos o placas no se utilizan en el día recubiertos, pueden ser selladas con Parafilm y se almacenan a 4 ° C durante la noche (Coating Lento). El sellado es requIRED para evitar la evaporación y la contaminación. Las placas recubiertas se pueden mantener a 4 ° C durante un máximo de 1 semana. </li></ol> 3. Eliminación del corazón del ratón y Canulación <ol><li> Remoje las tijeras y pinzas en etanol al 70% durante 30 minutos y dejar que se sequen. </li><li> Pesar el ratón para 0,1 gramos. Registre su peso corporal, cepa, sexo y fecha de nacimiento. </li><li> Inyectar 200 l de heparina (100 UI / ratón) ip 10 minutos antes de la anestesia para prevenir la coagulación de la sangre en las arterias coronarias. Anestesiar el ratón con 200 mg / kg de peso corporal de ketamina y 10 mg / kg de peso corporal de xilazina por inyección ip y esperar 5-10 minutos hasta que el ratón deja de responder a pellizcos cola / del dedo del pie. </li><li> Asegure el ratón en la posición supina, fijando suavemente las patas delanteras y las patas traseras a una superficie de trabajo pinnable (es decir, la espuma de poliestireno) en una bandeja de cirugía animal o banco de mesa cerca del sistema de perfusión. </li><li> Limpie el pecho y el abdomen con etanol al 70%. Hacer una i la piel en la línea mediancision desde mediados abdomen para el diafragma con una tijera quirúrgica. </li><li> Cortar el diafragma con otra tijera quirúrgica y mantenga el esternón con pinzas dentadas curvadas. Cortar bilateral y retroflect caja torácica para exponer el corazón. </li><li> Levantar el corazón ligeramente usando pinzas finas dentadas y atraumáticas curvadas y diseccionar el corazón fuera de la cavidad torácica lo más cerca posible a la pared torácica dorsal. </li><li> Transferir el corazón a un plato de 100 mm que contiene tampón de perfusión fría. Con cuidado y quitar los tejidos conectivos, como los pulmones, el timo y los bronquios. </li><li> Identificar la aorta y sus ramas craneales, que generalmente se oculta por el timo y la almohadilla de grasa. Cortar la aorta por debajo de su primera sucursal 13, agarre la pared aórtica, levantar el corazón, y un poco meterlo en la cánula aórtica lleno de líquido de perfusión (1,0 mm de diámetro exterior de la cánula de acero inoxidable con punta roma y muescas / apartamento 1 y 2 mm por encima la punta, o una aguja de alimentación reutilizable 22) utilizando dos ultrafino-tip forceps. Nota: a) El líquido de perfusión debe gotear durante la canulación cardíaca para evitar las burbujas de gas entren en las arterias coronarias; b) Mantenga la punta de la cánula justo por encima de la válvula aórtica. </li><li> Abrazadera de la aorta a la cánula y se liga la aorta a la cánula con 6-0 seda quirúrgica. Toda la canalización debe tener menos de 120 seg. </li></ol> 4. Corazón de perfusión y la digestión <ol><li> Perfusión el corazón con tampón de perfusión libre de calcio a un caudal de 4 ml / min 4-5 min hasta que los efluentes se aclaran, y luego cambiar a un tampón de digestión que contiene 50 mM de CaCl2 y perfundir durante 3,5 a 20 min dependiendo de la cepa de ratón, la presión de perfusión y la actividad de colagenasa. En su caso, aumentar la presión de la aorta hasta 70-80 mmHg durante la digestión. Cuando sea necesario, la enzima perfundido se puede recircular para la digestión. Típicamente, 300 tampón U / ml de enzima se digerir un corazón en 10-12 min a una velocidad de flujo de 4 ml / min;Si la aplicación de presión poscarga a 70 mmHg, 300 U / ml se llevarán a sólo 3.5 a 5.5 minutos a una velocidad de flujo de 4 ml / min. </li><li> Detener la digestión cuando el corazón se vuelve un poco pálida y flácida. Debe ser esponjoso cuando se pellizca suavemente. </li></ol> 5. Las células de disociación y la reintroducción de calcio <ol><li> Tire de la aorta de la cánula con un 70% de etanol fórceps empapada y poner el corazón en un plato de 60 mm estéril que contiene 2,5 ml de tampón de digestión. Mover a la campana de cultivo usando suministros estériles, permaneciendo atentos a las técnicas estériles para esto y medidas de seguimiento. </li><li> Retire aorta, aurículas y los grandes vasos con tijeras quirúrgicas finas. Burlarse suavemente el ventrículo hacia 10-12 pedazos pequeños con dos pinzas de punta fina. </li><li> Pipetear suavemente las piezas del corazón y las células arriba y abajo ~ 10 veces con una pipeta de transferencia de 10 ml y luego se transfieren a un tubo cónico de polipropileno de 15 ml. Enjuague el recipiente con solución de 7,5 ml de calcio que contiene 12,5 mM CaCl2 y transferenciaesta en el tubo, lo que resulta en un volumen final de 10 ml. </li><li> Pipetear suavemente la suspensión celular arriba y abajo con una pipeta de transferencia de punta fina para dispersar a los grandes trozos de tejido del corazón. </li><li> Centrifugar a continuación durante 3 min a 20 xg para separar pequeñas células no miocitos, tales como células endoteliales y fibroblastos. </li><li> Aspirar el sobrenadante y resuspender el sedimento de los miocitos en 10 ml de solución de calcio que con un suplemento de 100 l de ATP 200 mM (pH 7,2, solución madre, filtra esterilizada). Deje el tubo en la campana durante 3-5 minutos. </li><li> Transferencia duplicar 10 alícuotas de un hemocitómetro contar miocitos y redondo en forma de barra. Calcular el número total de miocitos y calcular el porcentaje de miocitos en forma de varilla. </li><li> Centrifugar los miocitos durante 3 min a 20 x g. Eliminar el sobrenadante y volver a suspender los sedimentos en 10 ml de solución de calcio II que contiene 100 mM de CaCl2. Dispersar los miocitos con la transferencia de pipeta de punta fina con la pipetaarriba y abajo. </li><li> Repetir el paso anterior (5.8) utilizando solución de calcio III (400 mM de CaCl 2) y IV (900 mM de CaCl 2), respectivamente. </li><li> Para el cultivo primario de miocitos ratón, resuspender el precipitado miocitos final en 5 ml de medio de baño. Contar el número total de miocitos y calcular el porcentaje de miocitos en forma de varilla. </li></ol> 6. Cultivo Celular <ol><li> Ajustar la concentración de los miocitos en forma de varilla a 25.000 en forma de varilla miocitos / ml en un tubo de 50 ml. Pipetear suavemente los miocitos con una pipeta de 10 ml de suspender bien. Evitar la sedimentación celular en la pipeta y el tubo para asegurar la densidad de células iguales para cada plato o plato. </li><li> Después de aspirar fuera de la solución de revestimiento de la laminina, la placa de los miocitos en esos platos o placas. Deslice con cuidado los platos o placas adelante y hacia atrás y de lado a lado en un patrón de cruz tres a cuatro veces en la superficie de la campana de cultivo. </li><li> Coloque los platos o placas en un CO 2%2 incubadora a 37 ° C. Incubar durante 1-3 horas para permitir la fijación de los miocitos a una velocidad de alrededor de 80%. </li><li> Después de la unión, aspirar suavemente el medio que contenía miocitos solteras y restos celulares. Añadir suavemente medio de cultivo a los lados de los platos o placas. Lleve a cabo este cambio de medio, uno por uno. Inmediatamente devolver los platos o placas a la incubadora. </li><li> Después de cultivo O / N, los miocitos se pueden cambiar para el mismo medio sin BDM antes de los estudios de la señalización celular a corto plazo. Mantenga la BDM en cultivo a largo plazo para los ensayos hipertróficas o apoptosis. Nota: BDM (2,3-butanodiona monoxima) puede inhibir la miosina-ATPasa y evitar la contracción. Su inhibición de la contracción basado en la miosina es fácilmente reversible. Se informa que BDM puede tener algunos efectos secundarios potenciales, tales como actuar como una fosfatasa no específica, aumentando la liberación de calcio de los SR, y la alteración de la concentración de calcio libre y prope eléctrica celularrtes, por lo que antes del tratamiento, la BDM se debe quitar. Por otra parte, en algunos casos, un inhibidor específico Blebbistatin miosina II podría ser un medicamento alternativo para inhibir la contracción de los cardiomiocitos 8,9. Sin embargo, en nuestros casos, BDM es mejor que Blebbistatin por el bien de la calidad y cantidad de los cardiomiocitos. </li></ol>

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Chem. 287 (20), 16390-16398 (2012).</li><li>Bai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+roles+of+the+cardiac+Na+/Ca2+-exchanger+in+ouabain-induced+inotropy,+cell+signaling,+and+hypertrophy.">Different roles of the cardiac Na+/Ca2+-exchanger in ouabain-induced inotropy, cell signaling, and hypertrophy.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 304, 427-435 (2013).</li><li>Liu, L. J., Zhao, X. C., Pierre, S. V., Askari, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+PI3K-AKT+signaling+pathway+with+digitalis-induced+hypertrophy+of+cardiac+myocytes.">Association of PI3K-AKT signaling pathway with digitalis-induced hypertrophy of cardiac myocytes.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 293, 1489-1497 (2007).</li><li>Flynn, J. M., Santana, L. F., Melov, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Cell+Transcriptional+Profiling+of+Adult+Mouse+Cardiomyocytes.">Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes.</a> J. Vis. Exp. (58), (2011).</li></ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Para la mejor preparación, los pasos más importantes son: 1) conectar rápidamente hasta el corazón del ratón a la cánula después de la escisión; 2) la perfusión del corazón apropiado. Además, tenga en cuenta que la calidad del agua, la temperatura de perfusión, el pH del tampón, la esterilización, la pureza química y limpia tubos y cámaras, no contaminados son también factores importantes. 18.2 mΩ biología molecular de grado H 2 O es muy recomendable para la preparación de buffer. El pH de la solución madre 2...

Los cardiomiocitos no son proliferativa. Hay algunas líneas celulares de cardiomiocitos auriculares, como HL-1 y las células AT-1 derivadas de tumores de ratón auricular; Sin embargo, no hay ventriculares adultos líneas celulares de cardiomiocitos disponibles para la investigación. Cultivos celulares primarios de cardiomiocitos de ratón adulto proporcionan un poderoso modelo para la investigación del corazón en los niveles celulares y moleculares. Hasta la fecha, se han utilizado ampliamente para la bioquímica, fisiológica, farmacológica y la investigación 1. Además, el uso frecuente de ratones modificados genéticamente ha requerido métodos eficaces de aislamiento de cardiomiocitos. Cultivo puro permite condiciones libres de la interacción con otros órganos y la circulación sistémica, tales como a través de factores neurohormonales y similares a las hormonas endógenas 2,3. Sin embargo, el aislamiento exitoso de los cardiomiocitos puede ser un reto. El protocolo introducimos en este documento se basa en nuestras experiencias con adultos cardiomyocyt rataES y el método descrito por O&#39;Connell et al 4,5. Especialmente en 2007 5, se describen técnicas detalladas a partir de preparaciones de amortiguamiento a cultivo celular y ensayo funcional. Desde los miocitos del ratón son altamente susceptibles a la contractura en comparación con los cardiomiocitos de rata, los tampones o medios utilizados para la perfusión, la digestión, Ca 2 + la tolerancia, la galvanoplastia y la cultura en el protocolo de ratón se complementan con un inhibidor de acoplamiento excitación-contracción no específica, 2, 3-Butanedione monoxima (BDM) para inhibir su contracción espontánea, por lo tanto, la viabilidad y el rendimiento de los miocitos en forma de varilla mejorar significativamente. En el protocolo presentado aquí, los miocitos se separan en un tampón de alto contenido de potasio desde el corazón aislado por perfusión de Langendorff modificada con colagenasa tipo II. La colagenasa II rompe con eficacia por la matriz intercelular y de las células libera. La solución de perfusión también mantiene el metabolismo celular en un nivel bajo 6. En additiencendido, el sistema del corazón aislado de Harvard Apparatus utilizamos aquí está bien diseñado para la temperatura precisa y control de presión constante 7. Este enfoque proporciona preparaciones altamente reproducibles y poblaciones uniformes de solo tipo de células, que se puede utilizar en cultivo durante la noche para la medición de las proteínas de señalización o de cultivo de 2-3 días para los ensayos de hipertróficas cardíacos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="774">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="41" rowspan="2" style="height:41px;width:257px;">Isolated heart system for small rodent</td>
			<td style="width:131px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:99px;">IHSR-mouse 73-4019</td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:257px;">Aortic Cannula, OD 1.0 mm</td>
			<td style="width:131px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:99px;">73-2816</td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:257px;">Dumont #4 Forceps</td>
			<td style="width:131px;">Fine science tools</td>
			<td style="width:99px;">11294-00</td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:257px;">Straight sharp serrated scissors</td>
			<td style="width:131px;">Fine science tools</td>
			<td style="width:99px;">14070-12</td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:257px;">Serrated Graefe forceps</td>
			<td style="width:131px;">Fine science tools</td>
			<td style="width:99px;">11050-10</td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:257px;">Curved, serrated Graefe forceps</td>
			<td style="width:131px;">Fine science tools</td>
			<td style="width:99px;">11052-10</td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:257px;">Straight Mini Serrefines clamps</td>
			<td style="width:131px;">Fine science tools</td>
			<td style="width:99px;">18054-28</td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:257px;">MEM</td>
			<td style="width:131px;">Gibco</td>
			<td style="width:99px;">11575-032</td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:257px;">Collagenase II</td>
			<td style="width:131px;">Worthington</td>
			<td style="width:99px;">4176</td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mucosal universal detergent</td>
			<td style="width:131px;">Sigma</td>
			<td style="width:99px;">Z637181</td>
			<td>Mucasol is a fast alkaline residue-free detergent.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and culture of adult mouse cardiomyocytes for cell signaling and in vitro cardiac hypertrophy

Los avances tecnológicos han hecho que los ratones modificados genéticamente, incluidos los ratones transgénicos y knockout de genes, una herramienta esencial en muchos campos de investigación. Cardiomiocitos adultos son ampliamente aceptados como un buen modelo para la fisiología celular cardiaca y la fisiopatología, así como para la intervención farmacéutica. Ratones genéticamente modificados se oponen a la necesidad de complicados procesos de infección de cardiomiocitos para generar el genotipo deseado, que son ineficientes debido a la diferenciación terminal de los cardiomiocitos. Aislamiento y cultivo de alta cantidad y calidad de los cardiomiocitos funcionales se beneficiarán de manera espectacular la investigación cardiovascular y proporcionar una herramienta importante para la señalización celular investigación transducción y desarrollo de fármacos. Aquí se describe un método bien establecido para el aislamiento de cardiomiocitos adultos de ratón que se pueden implementar con poco entrenamiento. El corazón de ratón se escinde y se canuló a un sistema de corazón aislado, perfundido a continuación, con un p-calcio libre y de altootassium tampón seguido por digestión con colagenasa tipo II en el modo de perfusión retrógrada de Langendorff. Este protocolo produce un resultado coherente para la recogida de los cardiomiocitos de ratón adulto funcionales de una variedad de ratones modificados genéticamente.

1. El éxito de cuantificación Aislamiento Dos criterios se utilizan para cuantificar el éxito del aislamiento: en primer lugar, el número total de cardiomiocitos aislados, y en segundo lugar, la relación de los miocitos no tolerantes al calcio tolerantes a redondear con forma de bastón. Generalmente, este protocolo tiene alrededor de 75 a 90 min de la extirpación del corazón a la chapa de los miocitos y los rendimientos de alrededor de 1 millón de cardiomiocitos en forma de varilla (70...

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Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

Se describe un método fiable para el aislamiento de cardiomiocitos de ratón adulto. Este protocolo se obtiene un resultado coherente para el cultivo de cardiomiocitos adultos funcionales a partir de una variedad de ratones modificados genéticamente.

Aislamiento y cultivo de ratón adulto cardiomiocitos de Señalización Celular y<em&gt; In vitro</em&gt; Hipertrofia Cardíaca

Technological advances have made genetically modified mice, including transgenic and gene knockout mice, an essential tool in many research fields. Adult ...

isolation-culture-adult-mouse-cardiomyocytes-for-cell-signaling-vitro

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

47.3K vistas.  University of Toledo College of Medicine and Life Sciences.  Se describe un método fiable para el aislamiento de cardiomiocitos de ratón adulto. Este protocolo se obtiene un resultado coherente para el cultivo de cardiomiocitos adultos funcionales a partir de una variedad de ratones modificados genéticamente. 

Video: Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

Isolation and Genetic Manipulation of Adult Cardiac Myocytes for Confocal Imaging

Cardiac myocytes isolated from adult hearts are widely accepted as a model somewhere half way between embryonic and neonatal muscle cells on one side and a working heart on the other. Thus, cardiomyocytes serve as good models for cardiac cellular physiology and pathophysiology, for pharmaceutical investigations as well as for the exploration of transgenic animal models. Here we describe a method of isolating the cells from the heart. Furthermore we show how a genetic manipulation on cardiac myocytes can be performed without breeding a transgenic animal: This is the combination of long term culture (1 week) and adenoviral gene transfer. The latter one is described from the construction of the virus to the transduction of the cells. It can be used for the expression of genetically encoded biosensors (GEBs), fluorescent fusion proteins, but also for protein over expression and down regulation, e.g. using RNAi. Here we provide an example for the expression of a fusion protein staining a subcellular structure (Golgi). Such protein expression can be visualized by confocal imaging of z-stacks for a 3D-reconstruction of subcellular structures. The protocol comprises state-of-the-art in cell culture, molecular biology and biophysics and thus provides an approach for exploring new horizons in cellular cardiology.

Adult cardiac myocytes are primary cells that can be isolated from animal hearts and cultured for several days. Within this culture period adenoviral gene transfer can be used to express genetically encoded biosensors (GEBs) or fluorescent fusion proteins. Both approaches allow cellular investigations by means of confocal microscopy.

El aislamiento y la manipulación genética de los miocitos cardiacos adultos de microscopía confocal

Cardiac myocytes isolated from adult hearts are widely accepted as a model somewhere half way between embryonic and neonatal muscle cells on one side and ...

Investigación

Biología

Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation between cells within a tissue. Isolation of pure cardiomyocyte populations through a collagenase perfusion of mouse hearts facilitates the generation of single cell microarrays for whole transcriptome gene expression, or qPCR of specific targets using nanofluidic arrays. We describe here a procedure to examine single cell gene expression profiles of cardiomyocytes isolated from the heart. This paradigm allows for the evaluation of metrics of interest which are not reliant on the mean (for example variance between cells within a tissue) which is not possible when using conventional whole tissue workflows for the evaluation of gene expression (Figure 1). We have achieved robust amplification of the single cell transcriptome yielding micrograms of double stranded cDNA that facilitates the use of microarrays on individual cells. In the procedure we describe the use of NimbleGen arrays which were selected for their ease of use and ability to customize their design. Alternatively, a reverse transcriptase - specific target amplification (RT-STA) reaction, allows for qPCR of hundreds of targets by nanofluidic PCR. Using either of these approaches, it is possible to examine the variability of expression between cells, as well as examining expression profiles of rare cell types from within a tissue. Overall, the single cell gene expression approach allows for the generation of data that can potentially identify idiosyncratic expression profiles that are typically averaged out when examining expression of millions of cells from typical homogenates generated from whole tissues.

Single cell expression profiling allows the detailed gene expression analysis of individual cells. We describe methods for the isolation of cardiomyocytes, and preparing the resulting lysates for either whole transcriptome microarray or qPCR of specific targets.

Perfiles de transcripción de los organismos unicelulares de los cardiomiocitos de ratón adulto

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Muscle regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite cells. Satellite cells are defined by their position between the basal lamina and the sarcolemma of each myofiber. Current knowledge of their behavior heavily relies on the use of the single myofiber isolation protocol. In 1985, Bischoff described a protocol to isolate single live fibers from the Flexor Digitorum Brevis (FDB) of adult rats with the goal to create an in vitro system in which the physical association between the myofiber and its stem cells is preserved 1. In 1995, Rosenblattmodified the Bischoff protocol such that myofibers are singly picked and handled separately after collagenase digestion instead of being isolated by gravity sedimentation 2, 3. The Rosenblatt or Bischoff protocol has since been adapted to different muscles, age or conditions 3-6. The single myofiber isolation technique is an indispensable tool due its unique advantages. First, in the single myofiber protocol, satellite cells are maintained beneath the basal lamina. This is a unique feature of the protocol as other techniques such as Fluorescence Activated Cell Sorting require chemical and mechanical tissue dissociation 7. Although the myofiber culture system cannot substitute for in vivo studies, it does offer an excellent platform to address relevant biological properties of muscle stem cells. Single myofibers can be cultured in standard plating conditions or in floating conditions. Satellite cells on floating myofibers are subjected to virtually no other influence than the myofiber environment. Substrate stiffness and coating have been shown to influence satellite cells' ability to regenerate muscles 8, 9 so being able to control each of these factors independently allows discrimination between niche-dependent and -independent responses. Different concentrations of serum have also been shown to have an effect on the transition from quiescence to activation. To preserve the quiescence state of its associated satellite cells, fibers should be kept in low serum medium 1-3. This is particularly useful when studying genes involved in the quiescence state. In serum rich medium, satellite cells quickly activate, proliferate, migrate and differentiate, thus mimicking the in vivo regenerative process 1-3. The system can be used to perform a variety of assays such as the testing of chemical inhibitors; ectopic expression of genes by virus delivery; oligonucleotide based gene knock-down or live imaging. This video article describes the protocol currently used in our laboratory to isolate single myofibers from the Extensor Digitorum Longus (EDL) muscle of adult mice (6-8 weeks old).

Isolation and culture of myofibers is the gold standard in vitro system to study the transition of satellite cells through quiescence, activation and differentiation. Importantly, the single myofiber culture system preserves the myofiber/stem cell association, which is an essential component of the muscle stem cell niche.

Aislamiento y cultivo de fibras individuales y sus células satélite del músculo esquelético adulto

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow for easy investigation and manipulation of biochemical pathways, and their effect on the biomechanical properties of spontaneously beating cardiomyocytes.	
The following 2-day protocol describes the isolation and culture of neonatal mouse cardiomyocytes. We show how to easily dissect hearts from neonates, dissociate the cardiac tissue and enrich cardiomyocytes from the cardiac cell-population. We discuss the usage of different enzyme mixes for cell-dissociation, and their effects on cell-viability. The isolated cardiomyocytes can be subsequently used for a variety of morphological, electrophysiological, biochemical, cell-biological or biomechanical assays. We optimized the protocol for robustness and reproducibility, by using only commercially available solutions and enzyme mixes that show little lot-to-lot variability. We also address common problems associated with the isolation and culture of cardiomyocytes, and offer a variety of options for the optimization of isolation and culture conditions.

Primary mouse cardiomyocyte cultures are one of the pivotal tools for the investigation of myofibrillar organization and function. The following protocol describes the isolation and culture of primary cardiomyocytes from neonatal mouse hearts. The resulting cardiomyocyte cultures may be subsequently used for a variety of biomechanical, biochemical and cell-biological assays.

Aislamiento y cultivo de cardiomiocitos neonatales Ratón

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study  myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow  for easy ...

Isolation, Culture, and Functional Characterization of Adult Mouse Cardiomyoctyes

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of heart disease. In particular, the ability to study ion homeostasis, ion channel function, cellular excitability and excitation-contraction coupling and their alterations in diseased conditions and by disease-causing mutations have led to significant insights into cardiac diseases. Furthermore, the lack of an adequate immortalized cell line to mimic adult CMs, and the limitations of neonatal CMs (which lack many of the structural and functional biomechanics characteristic of adult CMs) in culture have hampered our understanding of the complex interplay between signaling pathways, ion channels and contractile properties in the adult heart strengthening the importance of studying adult isolated cardiomyocytes. Here, we present methods for the isolation, culture, manipulation of gene expression by adenoviral-expressed proteins, and subsequent functional analysis of cardiomyocytes from the adult mouse. The use of these techniques will help to develop mechanistic insight into signaling pathways that regulate cellular excitability, Ca2+ dynamics and contractility and provide a much more physiologically relevant characterization of cardiovascular disease.

Here we describe the isolation of adult mouse cardiomyoctyes using a Langendorff perfusion system. The resulting cells are Ca2+-tolerant, electrically quiescent and can be cultured and transfected with adeno- or lentiviruses to manipulate gene expression. Their functionality can also be analyzed using the MMSYS system and patch clamp techniques.

Aislamiento, cultivo y caracterización funcional de ratón adulto Cardiomyoctyes

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of ...

Isolation and Physiological Analysis of Mouse Cardiomyocytes

Cardiomyocytes, the workhorse cell of the heart, contain exquisitely organized cytoskeletal and contractile elements that generate the contractile force used to pump blood. Individual cardiomyocytes were first isolated over 40 years ago in order to better study the physiology and structure of heart muscle. Techniques have rapidly improved to include enzymatic digestion via coronary perfusion. More recently, analyzing the contractility and calcium flux of isolated myocytes has provided a vital tool in the cellular and sub-cellular analysis of heart failure. Echocardiography and EKGs provide information about the heart at an organ level only. Cardiomyocyte cell culture systems exist, but cells lack physiologically essential structures such as organized sarcomeres and t-tubules required for myocyte function within the heart. In the protocol presented here, cardiomyocytes are isolated via Langendorff perfusion. The heart is removed from the mouse, mounted via the aorta to a cannula, perfused with digestion enzymes, and cells are introduced to increasing calcium concentrations. Edge and sarcomere detection software is used to analyze contractility, and a calcium binding fluorescent dye is used to visualize calcium transients of electrically paced cardiomyocytes; increasing understanding of the role cellular changes play in heart dysfunction. Traditionally used to test drug effects on cardiomyocytes, we employ this system to compare myocytes from WT mice and mice with a mutation that causes dilated cardiomyopathy. This protocol is unique in its comparison of live cells from mice with known heart function and known genetics. Many experimental conditions are reliably compared, including genetic or environmental manipulation, infection, drug treatment, and more. Beyond physiologic data, isolated cardiomyocytes are easily fixed and stained for cytoskeletal elements. Isolating cardiomyocytes via perfusion is an extremely versatile method, useful in studying cellular changes that accompany or lead to heart failure in a variety of experimental conditions.

Individual cardiomyocytes from wild type and mutant mice can be isolated from the heart in order to study their contractility and calcium transients. This allows characterization of the contribution of cellular dysfunction to heart dysfunction from any cause.

Aislamiento y fisiológica Análisis de Ratón cardiomiocitos

Cardiomyocytes, the workhorse cell of the heart, contain exquisitely organized cytoskeletal and contractile elements that generate the contractile force ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse incisor provides a model for these processes. This remarkable organ grows continuously throughout the animal&#39;s life and generates all the necessary cell types from active pools of adult stem cells housed in the labial (toward the lip) and lingual (toward the tongue) cervical loop (CL) regions. Only the dental stem cells from the labial CL give rise to ameloblasts that generate enamel, the outer covering of teeth, on the labial surface. This asymmetric enamel formation allows abrasion at the incisor tip, and progenitors and stem cells in the proximal incisor ensure that the dental tissues are constantly replenished. The ability to isolate and grow these progenitor or stem cells in vitro allows their expansion and opens doors to numerous experiments not achievable in vivo, such as high throughput testing of potential stem cell regulatory factors. Here, we describe and demonstrate a reliable and consistent method to culture cells from the labial CL of the mouse incisor.

The continuously growing mouse incisor provides a model for studying renewal of dental tissues from dental epithelial stem cells (DESCs). A robust system for consistently and reliably obtaining these cells from the incisor and expanding them in vitro is reported here.

Aislamiento y cultivo de células madre epiteliales dental del adulto Ratón Incisivo

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes

Cultured cardiomyocytes can be used to study cardiomyocyte biology using techniques that are complementary to in vivo systems. For example, the purity and accessibility of in vitro culture enables fine control over biochemical analyses, live imaging, and electrophysiology. Long-term culture of cardiomyocytes offers access to additional experimental approaches that cannot be completed in short term cultures. For example, the in vitro investigation of dedifferentiation, cell cycle re-entry, and cell division has thus far largely been restricted to rat cardiomyocytes, which appear to be more robust in long-term culture. However, the availability of a rich toolset of transgenic mouse lines and well-developed disease models make mouse systems attractive for cardiac research. Although several reports exist of adult mouse cardiomyocyte isolation, few studies demonstrate their long-term culture. Presented here, is a step-by-step method for the isolation and long-term culture of adult mouse cardiomyocytes. First, retrograde Langendorff perfusion is used to efficiently digest the heart with proteases, followed by gravity sedimentation purification. After a period of dedifferentiation following isolation, the cells gradually attach to the culture and can be cultured for weeks. Adenovirus cell lysate is used to efficiently transduce the isolated cardiomyocytes. These methods provide a simple, yet powerful model system to study cardiac biology.

This protocol describes a step-by-step method for the reproducible isolation and long-term culture of adult mouse cardiomyocytes with high yield, purity, and viability.

Aislamiento, cultivo y la transducción de cardiomiocitos de ratones adultos

Cultured cardiomyocytes can be used to study cardiomyocyte biology using techniques that are complementary to in vivo systems. For example, the purity and ...

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin defense by forming an intact skin barrier against environmental insults, such as UVB irradiation or pathogens, and also by initiating an inflammatory response upon those insults. Here we describe methods to isolate KCs from neonatal mouse skin and from adult mouse tail skin. We also describe culturing conditions using defined growth supplements (dGS) in comparison to chelexed fetal bovine serum (cFBS). Functionally, we show that both neonatal and adult KCs are highly responsive to high calcium-induced terminal differentiation, tight junction formation and stratification. Additionally, cultured adult KCs are susceptible to UVB-triggered cell death and can release large amounts of TNF upon UVB irradiation. Together, the methods described here will be useful to researchers for the setup of in vitro models to study epidermal biology in the neonatal mouse and/or the adult mouse.

Epidermal keratinocytes form a functional skin barrier and are positioned at the front line of host defense against external environmental insults. Here we describe methods for isolation and primary culture of epidermal keratinocytes from neonatal and adult mouse skin, and induction of terminal differentiation and UVB-triggered inflammatory response from keratinocytes.

Aislamiento y cultivo de queratinocitos de ratón primario de piel de ratón neonatal y adulto

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...

Isolation of Mouse Epidermal Keratinocytes and Their In Vitro Clonogenic Culture

The protocol described here is a reliable method of harvesting primary keratinocytes from adult female mice (54 &#177; 2 days old) yielding approximately 30 x 106 viable cells per mouse. Primary adult mouse keratinocytes are harvested from the dorsal skin of female mice. Male mice (~6 weeks old) can be used for keratinocyte harvesting depending on the requirements of the experiment. Euthanized mice are shaved and sterilized with serial washes in povidone iodine and ethanol solutions (70% alcohol). After disinfecting the mice, the dorsal skin is removed and the subcutaneous fat and muscle are removed with a scalpel and discarded. The skins are cut into small pieces and treated with a mild, low temperature trypsinization to detach the lower dermis from the epidermis. The scraped epidermises are stirred at low speed, filtered to remove the hairs, counted, and re-suspended in culture medium. This method provides an excellent single cell suspension of highly culturable cells for many downstream applications.

The goal of this protocol is to isolate epidermal keratinocytes from the dorsal skin of adult mice for a variety of downstream applications such as molecular biology, biochemistry, fluorescence activated cell sorting, and primary in vitro uses (e.g., clonogenic keratinocytes).

Aislamiento de los queratinocitos epidérmicos de ratón y su cultivo clonogénico In Vitro

The protocol described here is a reliable method of harvesting primary keratinocytes from adult female mice (54 &#177; 2 days old) yielding approximately ...