עבודה זו נתמכה על ידי לאומי ללב, ריאות ודם מכון גרנט HL-36,573. אנו מודים למר דוד Sowa לעריכת כתב היד הזה.

כל המחקר על עכברים שנעשה על פי נהלים והנחיות של המכון הלאומי לבריאות, והפרוטוקולים שאושרו על ידי הוועדה המוסדית טיפול בבעלי חיים ושימוש באוניברסיטת טולדו, המכללה לרפואה ומדעי חיים. 1. הכנת מערכת זלוף <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> היום לפני הבידוד, למלא את כל מערכת זלוף (כולל מאגרים) עם תמיסה של חומר ניקוי ללא שאריות אלקליין מהיר. אפשר הפתרון לספוג לתוך המערכת לכמה שעות או למשך לילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת בבוקר, כוון את טמפרטורת thermocycler 37 ° C ולאפשר הפתרון כדי להתחמם. הסר את תמיסת הסבון ולשטוף את המערכת ביסודיות עם מים מזוקקים מעוקרים. אל תשכחו את כל הענפים בצד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למלא את המערכת עם חיץ זלוף באמצעות משאבת peristaltic מתמדת ולצייר כל בועות אוויר יצא מהאולם אב העורקים (מלכודת בועה) עם מזרק צד רכוב כדי להגן עלהלב מחסימה כלילית. קצב הזרימה של משאבת peristaltic צריך להיבדק באופן שיגרתי. </li></ol> 2. הכנת חוצץ, תרבות מדיה, וצלחות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זלוף הצפת: הפוך 500 מיליליטר של חיץ 1x זלוף לפני השימוש. חיץ סידן ללא זה מכיל 113 mM NaCl, 4.7 מ&quot;מ KCl, 0.6 מ&quot;מ KH 2 PO 4, 0.6 מ&quot;מ Na 2 HPO 4, 1.2 מ&quot;מ MgSO 4, 10 מ&quot;מ Na-HEPES, 12 מ&quot;מ NaHCO 3, 10 מ&quot;מ KHCO 3, 0.032 פנול מ&quot;מ אדום, טאורין 30 מ&quot;מ, 10 מ&quot;מ BDM, ו5.5 גלוקוז מ&quot;מ. התאם את ה-pH ל 7.0 עם 2 M HCl ולסנן דרך 0.2 מסנן מיקרומטר, לאחסן ב 4 ° C. הערה: א) פתרון זלוף צריך להיות מוכן באותו היום שבו נעשה בו שימוש. במקרים מסוימים, זה מקובל לאחסן את הפתרון בפחות מ 3 ימים ב 4 ° C. ב) יש חיץ זה ריכוז אשלגן גבוה עד 15.3 מ&quot;מ, אשר יכול לשמור על שריר הלב שקט, להפחית ג ה-ATPonsumption ולהגדיל את Ca 2 + היכולת סובלנית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עיכול חוצץ (300 U / ml, 25-50 מיליליטר / לב): להכין רק לפני זלוף. שוקל 15,000 U של פעילות הכוללת של הסוג II collagenase, מתמוסס ב50 חיץ זלוף מיליליטר במכסת מנוע בתרבית. הוסף 25 μl של 100 מ&quot;מ CaCl 2 (פתרון מניות, מסנן מעוקר) כדי להפוך את ריכוז סידן הסופי 50 מיקרומטר. לחמם את החיץ ל37 מעלות צלזיוס כאשר מוכן לבידוד. שלא כמו טריפסין, collagenase עובד הכי טוב בנוכחות של 50-100 מיקרומטר Ca + 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחנה חוצץ (50 מיליליטר / לב): לפעול במכסת מנוע בתרבית. מערבבים 45 מיליליטר של חיץ זלוף עם 5 מיליליטר FBS סטרילי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Ca 2 + פתרון אני (12.5 מיקרומטר Ca 2 +): הוסף 2.5 μl של 100 מ&quot;מ CaCl 2-20 מיליליטר של חיץ לעצור ולערבב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Ca 2 + הפתרון השני (100 מיקרומטר Ca 2 +): הוסף 10 μl של 100 מ&quot;מ CaCl 2-10 מיליליטר של חיץ לעצור ולערבב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Ca 2 + פתרון III (400 מיקרומטר Ca 2 +): הוסף 40 μl של 100 מ&quot;מ CaCl 2-10 מיליליטר של חיץ לעצור ולערבב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Ca 2 + IV פתרון (900 מיקרומטר Ca 2 +): הוסף 90 μl של 100 מ&quot;מ CaCl 2-10 מיליליטר של חיץ לעצור ולערבב. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ציפוי בינוני (50 מיליליטר / לב): העברה 43 מיליליטר של ממ המכיל 2 מ&quot;מ L-גלוטמין ו1.26 מ&quot;מ CaCl 2 לתוך צינור חרוטי 50 מ&quot;ל סטרילי במכסת מנוע בתרבית ולהוסיף 5 מיליליטר של FBS, 1 מיליליטר של פתרון מניות BDM ( 500 מ&quot;מ, מסנן מעוקר), ו0.5 מיליליטר פניצילין / סטרפטומיצין (10,000 U / ml). לערבב ולאזן במשך 2-3 שעות לפני בידוד myocyte ב2% CO 2, חממת 37 ° C עם כיפות רופפות. ממש לפני ציפוי myocyte, להוסיף 0.5 מיליליטר של 200 מ&quot;מ ATP (pH 7.2, פתרון מניות, מסנן מעוקר) לבינונית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות בינונית (50 מיליליטר / לב): העברה 48 מיליליטר של ממ המכיל 2 מ&quot;מ L-גלוטמין ו1.26 מ&quot;מ CaCl 2 לתוך צינור חרוטי 50 מ&quot;ל סטרילי במכסת מנוע בתרבית ולהוסיף 1 מיליליטר של פתרון מניות BDM (500 מ&quot;מ, filter מעוקר), ו0.5 מיליליטר פניצילין / סטרפטומיצין (10,000 U / ml). לערבב ולאזן ב2% CO 2, חממת 37 מעלות צלזיוס לפני בידוד myocyte. לפני השימוש, מוסיף 0.5 מיליליטר של 100 מ&quot;ג / מיליליטר BSA (מסנן מעוקר) לבינוני. הערה: שימוש בחממה 2 CO 2% מאפשר שמירה על רמת חומציות התרבות בינונית ב6.9-7.0, אשר מסייעת myoctyes לשמור עד 24 שעות המורפולוגיה בצורת המוט שלהם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Laminin מנות (1-2 מיקרוגרם / 2 סנטימטר) מצופים או צלחות: העברה 200 μl של 1 מ&quot;ג / מיליליטר laminin עכבר טבעי ל20 מיליליטר של PBS מעוקר (w / o סידן ומגנזיום) ומערבבים. הוסף 1 מיליליטר למאכלי 35 מ&quot;מ, 2.5 מיליליטר למאכלי 60 מ&quot;מ, או 5 מיליליטר למאכלי 100 מ&quot;מ, לנער כדי לכסות באופן שווה על המשטחים, ומקום ב2% CO 2, חממת 37 מעלות צלזיוס עד לציפוי myocyte. הערה: אם המנות או צלחות לא משמשות ביום המצופה, הם יכולים להיות אטומים עם Parafilm ומאוחסנים על 4 מעלות צלזיוס (ציפוי איטי) למשך הלילה. איטום הוא requIRED כדי למנוע אידוי וזיהום. יכולות להיות כל הזמן צלחות מצופות על 4 מעלות צלזיוס למשך שבוע עד 1. </li></ol> 3. ההסרה מאוס לב וCannulation <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משרים את המספריים ומלקחיים ב70% אתנול ל30 דקות ולתת להם להתייבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול את העכבר כדי 0.1 גרם הקרוב ביותר. הקלט את משקל הגוף שלה, מתח, מין ותאריך לידה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק 200 הפרין μl (100 IU / עכבר) ip 10 דקות לפני הרדמה כדי למנוע קרישת דם בעורקים הכליליים. להרדים את העכבר עם 200 מ&quot;ג / קילוגרם משקל גוף של קטמין ו10 מ&quot;ג / קילוגרם משקל גוף של xylazine ידי הזרקת ה-IP ולחכות 5-10 דקות עד שהעכבר מפסיק להגיב לצובט זנב / הבוהן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאבטח את העכבר במצב שכיבה בעדינות על ידי תיקון הרגליים הקדמיות וhindpaws למשטח עבודת pinnable (קלקר כלומר) על מגש ניתוחים בבעלי חיים או ספסל שולחן ליד מערכת זלוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נגב את החזה והבטן עם 70% אתנול. הפוך עור קו האמצעncision מאמצע הבטן לסרעפת עם מספריים כירורגית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את הסרעפת עם עוד מספריים כירורגית והחזק את עצם החזה עם מלקחיים משוננים מעוקלים. לחתוך בילטרלי וretroflect כלוב בית החזה כדי לחשוף את הלב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרם את הלב מעט באמצעות מלקחיים משוננים וatraumatic מעוגלים עדינים ולנתח את הלב מתוך חלל החזה הקרוב ככל האפשר אל קיר בית החזה הגבי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את הלב לצלחת 100 מ&quot;מ המכילה חיץ זלוף קר. לקצץ בזהירות רקמות חיבור, כגון ריאות, בלוטת התימוס, והסמפונות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהה את אב העורקים וענפי הגולגולת שלה, אשר בדרך כלל מוסתרים על ידי בלוטת התימוס וכרית שומן. חותכים את אב העורקים מתחת סניפה הראשון 13, אחוז בקיר אב העורקים, הרם את הלב, ומעט להחליק אותו לצינורית זלוף מלא נוזל אב העורקים (צינורית הנירוסטה OD 1.0 מ&quot;מ עם קצה קהה / שטוח וחריצי 1 ו -2 מ&quot;מ מעל טיפ, או מחט האכלה לשימוש חוזר G 22) באמצעות שני f עדין קצה אולטרהorceps. הערה: א) נוזל זלוף צריך להיות נוטף במהלך cannulation לב כדי למנוע בועות גז מלהיכנס לעורקים הכליליים; ב) שמור על הקצה של הצינורית בדיוק מעל שסתום אב העורקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצמד את אב העורקים לצינורית ולקשור את אב העורקים לצינורית עם 6-0 משי כירורגית. כל cannulation צריך לקחת פחות מ 120 שניות. </li></ol> 4. לב זלוף ועיכול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Perfuse הלב עם חיץ זלוף ללא סידן בקצב זרימה של 4 מיליליטר / דקה על 4-5 דקות עד השפכים יתבהרו, ולאחר מכן לעבור לחיץ עיכול המכיל 50 מיקרומטר CaCl 2 ותנקבו ל3.5-20 דקות בהתאם לזן עכבר, לחץ זלוף ופעילות collagenase. במידת צורך, להגביר את לחץ אב העורקים ל70-80 מ&quot;מ כספית, כאשר לעכל. בעת צורך, perfusate האנזים יכול להיות ממוחזר לעיכול. בדרך כלל, 300 חיץ U / מיליליטר אנזים יהיה לעכל את לב ב10-12 דקות בקצב זרימה של 4 מיליליטר / דקה;אם הפעלת לחץ afterload ב70 מ&quot;מ כספית, 300 U / ml ייקח רק 3.5-5.5 דקות בקצב זרימה של 4 מיליליטר / דקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תפסיק עיכול כאשר הלב הופך מעט חיוור ורפוי. זה צריך להיות ספוגי כאשר צבט בעדינות. </li></ol> 5. ניתוק תאים והשבת סידן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך את אב העורקים מהצינורית עם מלקחיים ספוגי אתנול 70% ולשים הלב לתוך צלחת 60 מ&quot;מ סטרילי המכילה 2.5 חיץ עיכול מיליליטר. לעבור למכסת המנוע בתרבית באמצעות אספקה ​​סטרילית, להישאר מודע לטכניקות סטריליות לכך וצעדי מעקב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את אב העורקים, אטריה, וכלי גדול עם מספריים כירורגיות עדינים. בעדינות להקניט את החדר ל10-12 חתיכות קטנות עם שני מלקחיים עדין קצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות פיפטה חתיכות לב ותאים למעלה ולמטה ~ 10x עם טפטפת העברה 10 מ&quot;ל ולאחר מכן להעביר לצינור חרוטי פוליפרופילן 15 מ&quot;ל. יש לשטוף את הצלחת עם 7.5 מיליליטר תמיסת סידן אני מכיל 12.5 מיקרומטר CaCl 2 והעברהזה לתוך הצינור, וכתוצאה מכך נפח סופי של 10 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות פיפטה ההשעיה התא למעלה ולמטה באמצעות פיפטה העברה עדין קצה לפזר את החתיכות הגדולות של רקמת לב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אז צנטריפוגות במשך 3 דקות ב20 XG להפריד את תאים שאינם קטנים myocyte כגון תאים וfibroblasts אנדותל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את supernatant ו resuspend את כדור myocyte ב10 מיליליטר תמיסת סידן אני עם תוספת של של 200 מ&quot;מ ATP 100 μl (pH 7.2, פתרון מניות, מסנן מעוקר). השאר את השפופרת במכסת המנוע של 3-5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברה לשכפל 10 aliquots μl לhemacytometer לספור myocytes מוט בצורה ועגול. לחשב את המספר הכולל של myocytes ולחשב את אחוז myocytes בצורת המוט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה myocytes במשך 3 דקות ב20 x גרם. הסר את supernatant ו resuspend את כדורים ב10 השני פתרון מיליליטר סידן המכיל 100 מיקרומטר CaCl 2. לפזר את myocytes עם פיפטה ההעברה עדין הקצה על ידי pipettingלמעלה ולמטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על השלב לעיל (5.8) באמצעות פתרון סיד III (400 מיקרומטר CaCl 2) ורביעי (900 מיקרומטר CaCl 2), בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתרבות העיקרית myocyte עכבר, resuspend את כדור myocyte הסופי ב 5 מיליליטר של ציפוי בינוני. לספור את המספר הכולל של myocytes ולחשב את אחוז myocytes בצורת המוט. </li></ol> 6. תרבית תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את הריכוז של myocytes בצורת המוט ל25,000 myocytes / מיליליטר בצורת מוט בצינור 50 מ&quot;ל. בעדינות פיפטה myocytes באמצעות פיפטה 10 מ&quot;ל להשעות אותם היטב. הימנע משקיעת תא בפיפטה והצינור כדי להבטיח צפיפות תאים שווה לכל מנה או צלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר aspirating את פתרון ציפוי laminin, צלחת myocytes לאלה מנות או צלחות. חלק בעדינות את המנות או צלחות קדימה ושלושה עד ארבעה פעמים אחורה ומצד אל צד בתבנית דמוית צלב על פני השטח של מכסה המנוע בתרבית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הכלים או הצלחות בCO 2%2 באינקובטור ב 37 ° C. דגירה של 1-3 שעות כדי לאפשר מצורף myocyte בשיעור של כ -80%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר התקשרות, בעדינות לשאוב את המדיום המכיל myocytes פנוי ופסולת תא. בעדינות להוסיף מדיום תרבות לצדדים של המנות או צלחות. לבצע את זה שינוי בינוני אחד אחד. מייד להחזיר את הכלים או צלחות לאינקובטור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי תרבות O / N, ניתן לשנות myocytes לאותו מדיום ללא BDM לפני הלימודים של תא איתות לטווח קצר. שמור BDM בתרבות לטווח ארוך עבור מבחני hypertrophic או אפופטוזיס. הערה: BDM (monoxime 2,3-butanedione) יכול לעכב את שרירן-ATPase ולמנוע התכווצות. העיכוב של התכווצות מבוססת שרירן שלה הוא הפיך בקלות. הוא דיווח כי BDM יכול להיות כמה תופעות לוואי אפשריות, כגון מתנהג כמו פוספטאז שאינו ספציפי, הגדלת שחרור סידן מSR, ושינוי של ריכוז סידן חופשי ונכס חשמלי סלולאריrties, ולכן לפני הטיפול, יש להסיר BDM. יתר על כן, במקרים מסוימים, Blebbistatin מעכב ספציפי שרירן השני יכול להיות תרופה חלופית לעכב 8,9 התכווצות cardiomyocyte. עם זאת, במקרים שלנו, BDM הוא טוב יותר מאשר Blebbistatin למען האיכות והכמות של שריר הלב. </li></ol>

<ol>
	<li>Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+in+cardiomyocyte+isolation,+culture,+and+gene+transfer.">Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer.</a> J. Mol. Cell. 51, 288-298 (2011).</li><li>Gross, D. R., Gross, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Isolated heart preparations, problems, and pitfalls. In: Animal Models in Cardiovascular Research. , 109-130 (2009).</li><li>Schl&#252;ter, K. D., Piper, H. M., Dheim, S., Mohr, F. W., Delmar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+adult+ventricular+cardiomyocytes.">Isolation and culture of adult ventricular cardiomyocytes.</a> Practical Methods in Cardiovascular Research. , 557-567 (2005).</li><li>O&#39;Connell, T. D., Ni, Y. G., Lin, K. M., Han, H. P., Yan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+adult+cardiac+myocytes+for+signaling+studies.">Isolation and culture of adult cardiac myocytes for signaling studies.</a> AfCS research reports. 1 (5), 1-9 (2003).</li><li>O&#39;Connell, T. D., Rodrigo, M. C., Simpon, P. C., Vivanco, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+adult+mouse+cardiac+myocytes.">Isolation and culture of adult mouse cardiac myocytes.</a> Methods in Molecular Biology. 35, 271-296 (2007).</li><li>Nilolskaya, A., Sharma, V., Sigg, D. C., Laizzo, P. S., Xiao, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+culture+models+and+methods.">Cell culture models and methods.</a> Cardiac Electrophysiology Methods and Models. , 213-235 (2010).</li><li>Merx, M. W., Schrader, M., Dhein, S., Mohr, F. W., Delmar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+working+heart.">The working heart.</a> Practical Methods in Cardiovascular Research. , 173-189 (2005).</li><li>Kabaeva, Z., Zhao, M., Michele, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blebbistatin+extends+culture+life+of+adult+mouse+cardiac+myocytes+and+allows+efficient+and+stable+transgene+expression.">Blebbistatin extends culture life of adult mouse cardiac myocytes and allows efficient and stable transgene expression.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 294, 1667-1674 (2008).</li><li>Lou, Q., Li, W., Efimov, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+dynamic+instability+and+wavelength+in+arrhythmia+maintenance+as+revealed+by+panoramic+imaging+with+blebbistatin+vs.+2,3-butanedione+monoxime.">The role of dynamic instability and wavelength in arrhythmia maintenance as revealed by panoramic imaging with blebbistatin vs. 2,3-butanedione monoxime.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 302, 262-269 (2012).</li><li>Liu, C. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+Na/K-ATPase+potentiates+Marinobufagenin-induced+cardiac+dysfunction+and+myocyte+apoptosis.">Reduction of Na/K-ATPase potentiates Marinobufagenin-induced cardiac dysfunction and myocyte apoptosis.</a> J. Biol. Chem. 287 (20), 16390-16398 (2012).</li><li>Bai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+roles+of+the+cardiac+Na+/Ca2+-exchanger+in+ouabain-induced+inotropy,+cell+signaling,+and+hypertrophy.">Different roles of the cardiac Na+/Ca2+-exchanger in ouabain-induced inotropy, cell signaling, and hypertrophy.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 304, 427-435 (2013).</li><li>Liu, L. J., Zhao, X. C., Pierre, S. V., Askari, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+PI3K-AKT+signaling+pathway+with+digitalis-induced+hypertrophy+of+cardiac+myocytes.">Association of PI3K-AKT signaling pathway with digitalis-induced hypertrophy of cardiac myocytes.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 293, 1489-1497 (2007).</li><li>Flynn, J. M., Santana, L. F., Melov, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Cell+Transcriptional+Profiling+of+Adult+Mouse+Cardiomyocytes.">Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes.</a> J. Vis. Exp. (58), (2011).</li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

לעריכה הטובה ביותר, השלבים הקריטיים ביותר הם: 1) מייד משדלת את לב העכבר לצינורית לאחר כריתה; 2) זלוף לב המתאים. כמו כן, שימו לב כי איכות מים, טמפרטורת זלוף, ה-pH של חיץ, עיקור, טוהר כימי, וצינורות נקיים, שאינו מזוהם ותאים הם גם גורמים חשובים. 18.2 mΩ H כיתה ביולוגיה המולקולרי 2 O מומלץ ?...

שריר לב הוא לא שגשוג. יש כמה שורות תאי cardiomyocyte פרוזדורים, כמו HL-1 ו-AT-1 תאים שמקורם בגידולי פרוזדורי עכבר; עם זאת, אין קווים סלולריים cardiomyocyte חדרית המבוגר זמינים למחקר. תרביות תאים ראשוניות של שריר לב עכבר מבוגר לספק מודל רב עוצמה למחקר לב ברמה התאית ומולקולרית. עד כה, הם היו בשימוש נרחב למחקר ביוכימי, פיסיולוגי, ותרופתי 1. בנוסף, השימוש התכוף בעכברים מהונדסים גנטי יש חייבת שיטות יעילות של בידוד cardiomyocyte. תרבות טהורה מאפשרת לתנאים חופשיים מאינטראקציה עם איברים אחרים ומחזור המערכתי, כגון באמצעות גורמי neurohormonal ודמוי הורמון אנדוגני 2,3. עם זאת, בידוד מוצלח של שריר לב יכול להיות מאתגר. הפרוטוקול אנחנו מציגים כאן מבוסס על החוויות שלנו עם cardiomyocyt חולדה הבוגרתes ואת השיטה שתוארה על ידי או &#39;קונל ואח&#39; 4,5. במיוחד ב2007 5, הם תיארו טכניקות מפורטות מהכנות חיץ לתרבית תאים וassay הפונקציונלי. מאז myocytes העכבר רגישים מאוד להתכווצות שריר הלב בהשוואה לעכברים, המאגרים או מדיה המשמשים לזלוף, עיכול, Ca 2 + סובלנות, ציפוי והתרבות בפרוטוקול העכבר הם השלימו עם מעכב ספציפי עירור התכווצות צימוד, 2, monoxime 3-Butanedione (BDM) לעכב ההתכווצות הספונטנית שלהם, ומכאן את יכולת הקיום והתשואה של myocytes בצורת המוט לשפר באופן משמעותי. בפרוטוקול הציג כאן, myocytes מופרד בחיץ אשלגן גבוה מהלב המבודד על ידי זלוף Langendorff שונה עם הסוג II collagenase. Collagenase השני שובר בצורה יעילה את המטריצה ​​הבינה תאית ותאים משחרר. פתרון זלוף גם שומר חילוף חומרים תאיים ברמה נמוכה 6. בadditiב, מערכת הלב המבודדת מהרווארד Apparatus אנחנו משמשים כאן היא מעוצבים היטב לטמפרטורה מדויקת ושליטה בלחץ קבועה 7. גישה זו מספקת הכנות לשחזור מאוד ואוכלוסיות אחידות מסוג התא בודד, שניתן להשתמש בם בתרבות הלילה למדידת חלבוני איתות או תרבות 2-3 יום למבחני hypertrophic לב.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="774">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="41" rowspan="2" style="height:41px;width:257px;">Isolated heart system for small rodent</td>
			<td style="width:131px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:99px;">IHSR-mouse 73-4019</td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:257px;">Aortic Cannula, OD 1.0 mm</td>
			<td style="width:131px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:99px;">73-2816</td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:257px;">Dumont #4 Forceps</td>
			<td style="width:131px;">Fine science tools</td>
			<td style="width:99px;">11294-00</td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:257px;">Straight sharp serrated scissors</td>
			<td style="width:131px;">Fine science tools</td>
			<td style="width:99px;">14070-12</td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:257px;">Serrated Graefe forceps</td>
			<td style="width:131px;">Fine science tools</td>
			<td style="width:99px;">11050-10</td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:257px;">Curved, serrated Graefe forceps</td>
			<td style="width:131px;">Fine science tools</td>
			<td style="width:99px;">11052-10</td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:257px;">Straight Mini Serrefines clamps</td>
			<td style="width:131px;">Fine science tools</td>
			<td style="width:99px;">18054-28</td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:257px;">MEM</td>
			<td style="width:131px;">Gibco</td>
			<td style="width:99px;">11575-032</td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:257px;">Collagenase II</td>
			<td style="width:131px;">Worthington</td>
			<td style="width:99px;">4176</td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mucosal universal detergent</td>
			<td style="width:131px;">Sigma</td>
			<td style="width:99px;">Z637181</td>
			<td>Mucasol is a fast alkaline residue-free detergent.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and culture of adult mouse cardiomyocytes for cell signaling and in vitro cardiac hypertrophy

התקדמות טכנולוגית הפכו את העכברים מהונדסים גנטי, בם מהונדס ועכברים בנוקאאוט הגן, כלי חיוני בתחומי מחקר רבים. cardiomyocytes מבוגרים מקובלים מאוד כמודל טוב לפיזיולוגיה הסלולר לב ופתופיזיולוגיה, כמו גם להתערבות תרופתית. עכברים מהונדסים גנטי מונעים את הצורך בתהליכי זיהום cardiomyocyte מסובכים כדי ליצור את הגנוטיפ הרצוי, שאינם יעילים בשל בידול המסוף &#39;שריר הלב. בידוד והתרבות של שריר לב פונקציונלי גבוהה כמות ובאיכות באופן דרמטי ייהנו מחקר לב וכלי דם ולספק כלי חשוב למחקר התמרה תא איתות ופיתוח תרופות. כאן, אנו מתארים שיטה מבוססת היטב לבידוד של שריר לב עכבר בוגר שיכול להיות מיושם עם קצת אימון. לב העכבר הוא נכרת וcannulated למערכת לב מבודדת, אז perfused עם p-סידן חופשי וגבוהotassium חיץ ואחריו סוג II עיכול collagenase במצב זלוף המדרדר Langendorff. פרוטוקול זה מניב תוצאה עקבית עבור האוסף של שריר לב עכבר בוגר מתפקד ממגוון רחב של עכברים מהונדסים גנטי.

1. כימות בידוד מוצלחת שני קריטריונים משמשים לכמת את ההצלחה של הבידוד: ראשון, המספר הכולל של שריר לב מבודד, ושנית, היחס של myocytes שאינו סובלני בסידן סובלני לעגל בצורת המוט. באופן כללי פרוטוקול זה לוקח בערך 75-90 דקות מהסרת לב לציפוי myocyte ות...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy at JoVE.com

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

אנו מתארים שיטה אמינה לבידוד של שריר לב עכבר בוגר. פרוטוקול זה מניב תוצאה עקבית לתרבות של שריר לב בוגר מתפקד ממגוון רחב של עכברים מהונדסים גנטי.

בידוד והתרבות של שריר לב מאוס למבוגרים לתא איתות ו<em&gt; במבחנה</em&gt; לב היפרטרופיה

Technological advances have made genetically modified mice, including transgenic and gene knockout mice, an essential tool in many research fields. Adult ...

isolation-culture-adult-mouse-cardiomyocytes-for-cell-signaling-vitro

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

47.3K Views.  University of Toledo College of Medicine and Life Sciences.  אנו מתארים שיטה אמינה לבידוד של שריר לב עכבר בוגר. פרוטוקול זה מניב תוצאה עקבית לתרבות של שריר לב בוגר מתפקד ממגוון רחב של עכברים מהונדסים גנטי. 

Video: Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

Isolation and Genetic Manipulation of Adult Cardiac Myocytes for Confocal Imaging

Cardiac myocytes isolated from adult hearts are widely accepted as a model somewhere half way between embryonic and neonatal muscle cells on one side and a working heart on the other. Thus, cardiomyocytes serve as good models for cardiac cellular physiology and pathophysiology, for pharmaceutical investigations as well as for the exploration of transgenic animal models. Here we describe a method of isolating the cells from the heart. Furthermore we show how a genetic manipulation on cardiac myocytes can be performed without breeding a transgenic animal: This is the combination of long term culture (1 week) and adenoviral gene transfer. The latter one is described from the construction of the virus to the transduction of the cells. It can be used for the expression of genetically encoded biosensors (GEBs), fluorescent fusion proteins, but also for protein over expression and down regulation, e.g. using RNAi. Here we provide an example for the expression of a fusion protein staining a subcellular structure (Golgi). Such protein expression can be visualized by confocal imaging of z-stacks for a 3D-reconstruction of subcellular structures. The protocol comprises state-of-the-art in cell culture, molecular biology and biophysics and thus provides an approach for exploring new horizons in cellular cardiology.

Adult cardiac myocytes are primary cells that can be isolated from animal hearts and cultured for several days. Within this culture period adenoviral gene transfer can be used to express genetically encoded biosensors (GEBs) or fluorescent fusion proteins. Both approaches allow cellular investigations by means of confocal microscopy.

בידוד מניפולציה גנטית של Myocytes לב למבוגרים הדמיה confocal

Cardiac myocytes isolated from adult hearts are widely accepted as a model somewhere half way between embryonic and neonatal muscle cells on one side and ...

Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation between cells within a tissue. Isolation of pure cardiomyocyte populations through a collagenase perfusion of mouse hearts facilitates the generation of single cell microarrays for whole transcriptome gene expression, or qPCR of specific targets using nanofluidic arrays. We describe here a procedure to examine single cell gene expression profiles of cardiomyocytes isolated from the heart. This paradigm allows for the evaluation of metrics of interest which are not reliant on the mean (for example variance between cells within a tissue) which is not possible when using conventional whole tissue workflows for the evaluation of gene expression (Figure 1). We have achieved robust amplification of the single cell transcriptome yielding micrograms of double stranded cDNA that facilitates the use of microarrays on individual cells. In the procedure we describe the use of NimbleGen arrays which were selected for their ease of use and ability to customize their design. Alternatively, a reverse transcriptase - specific target amplification (RT-STA) reaction, allows for qPCR of hundreds of targets by nanofluidic PCR. Using either of these approaches, it is possible to examine the variability of expression between cells, as well as examining expression profiles of rare cell types from within a tissue. Overall, the single cell gene expression approach allows for the generation of data that can potentially identify idiosyncratic expression profiles that are typically averaged out when examining expression of millions of cells from typical homogenates generated from whole tissues.

Single cell expression profiling allows the detailed gene expression analysis of individual cells. We describe methods for the isolation of cardiomyocytes, and preparing the resulting lysates for either whole transcriptome microarray or qPCR of specific targets.

פרופיל תא יחיד תעתיק של cardiomyocytes עכבר למבוגרים

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Muscle regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite cells. Satellite cells are defined by their position between the basal lamina and the sarcolemma of each myofiber. Current knowledge of their behavior heavily relies on the use of the single myofiber isolation protocol. In 1985, Bischoff described a protocol to isolate single live fibers from the Flexor Digitorum Brevis (FDB) of adult rats with the goal to create an in vitro system in which the physical association between the myofiber and its stem cells is preserved 1. In 1995, Rosenblattmodified the Bischoff protocol such that myofibers are singly picked and handled separately after collagenase digestion instead of being isolated by gravity sedimentation 2, 3. The Rosenblatt or Bischoff protocol has since been adapted to different muscles, age or conditions 3-6. The single myofiber isolation technique is an indispensable tool due its unique advantages. First, in the single myofiber protocol, satellite cells are maintained beneath the basal lamina. This is a unique feature of the protocol as other techniques such as Fluorescence Activated Cell Sorting require chemical and mechanical tissue dissociation 7. Although the myofiber culture system cannot substitute for in vivo studies, it does offer an excellent platform to address relevant biological properties of muscle stem cells. Single myofibers can be cultured in standard plating conditions or in floating conditions. Satellite cells on floating myofibers are subjected to virtually no other influence than the myofiber environment. Substrate stiffness and coating have been shown to influence satellite cells' ability to regenerate muscles 8, 9 so being able to control each of these factors independently allows discrimination between niche-dependent and -independent responses. Different concentrations of serum have also been shown to have an effect on the transition from quiescence to activation. To preserve the quiescence state of its associated satellite cells, fibers should be kept in low serum medium 1-3. This is particularly useful when studying genes involved in the quiescence state. In serum rich medium, satellite cells quickly activate, proliferate, migrate and differentiate, thus mimicking the in vivo regenerative process 1-3. The system can be used to perform a variety of assays such as the testing of chemical inhibitors; ectopic expression of genes by virus delivery; oligonucleotide based gene knock-down or live imaging. This video article describes the protocol currently used in our laboratory to isolate single myofibers from the Extensor Digitorum Longus (EDL) muscle of adult mice (6-8 weeks old).

Isolation and culture of myofibers is the gold standard in vitro system to study the transition of satellite cells through quiescence, activation and differentiation. Importantly, the single myofiber culture system preserves the myofiber/stem cell association, which is an essential component of the muscle stem cell niche.

בידוד ותרבות של Myofibers פרט ותאי הלווין שלהם משרירי שלד למבוגרים

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow for easy investigation and manipulation of biochemical pathways, and their effect on the biomechanical properties of spontaneously beating cardiomyocytes.	
The following 2-day protocol describes the isolation and culture of neonatal mouse cardiomyocytes. We show how to easily dissect hearts from neonates, dissociate the cardiac tissue and enrich cardiomyocytes from the cardiac cell-population. We discuss the usage of different enzyme mixes for cell-dissociation, and their effects on cell-viability. The isolated cardiomyocytes can be subsequently used for a variety of morphological, electrophysiological, biochemical, cell-biological or biomechanical assays. We optimized the protocol for robustness and reproducibility, by using only commercially available solutions and enzyme mixes that show little lot-to-lot variability. We also address common problems associated with the isolation and culture of cardiomyocytes, and offer a variety of options for the optimization of isolation and culture conditions.

Primary mouse cardiomyocyte cultures are one of the pivotal tools for the investigation of myofibrillar organization and function. The following protocol describes the isolation and culture of primary cardiomyocytes from neonatal mouse hearts. The resulting cardiomyocyte cultures may be subsequently used for a variety of biomechanical, biochemical and cell-biological assays.

בידוד והתרבות של שריר לב עכבר בילוד

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study  myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow  for easy ...

Isolation, Culture, and Functional Characterization of Adult Mouse Cardiomyoctyes

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of heart disease. In particular, the ability to study ion homeostasis, ion channel function, cellular excitability and excitation-contraction coupling and their alterations in diseased conditions and by disease-causing mutations have led to significant insights into cardiac diseases. Furthermore, the lack of an adequate immortalized cell line to mimic adult CMs, and the limitations of neonatal CMs (which lack many of the structural and functional biomechanics characteristic of adult CMs) in culture have hampered our understanding of the complex interplay between signaling pathways, ion channels and contractile properties in the adult heart strengthening the importance of studying adult isolated cardiomyocytes. Here, we present methods for the isolation, culture, manipulation of gene expression by adenoviral-expressed proteins, and subsequent functional analysis of cardiomyocytes from the adult mouse. The use of these techniques will help to develop mechanistic insight into signaling pathways that regulate cellular excitability, Ca2+ dynamics and contractility and provide a much more physiologically relevant characterization of cardiovascular disease.

Here we describe the isolation of adult mouse cardiomyoctyes using a Langendorff perfusion system. The resulting cells are Ca2+-tolerant, electrically quiescent and can be cultured and transfected with adeno- or lentiviruses to manipulate gene expression. Their functionality can also be analyzed using the MMSYS system and patch clamp techniques.

בידוד, תרבות ואפיון פונקציונלי של Cardiomyoctyes מאוס למבוגרים

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of ...

Isolation and Physiological Analysis of Mouse Cardiomyocytes

Cardiomyocytes, the workhorse cell of the heart, contain exquisitely organized cytoskeletal and contractile elements that generate the contractile force used to pump blood. Individual cardiomyocytes were first isolated over 40 years ago in order to better study the physiology and structure of heart muscle. Techniques have rapidly improved to include enzymatic digestion via coronary perfusion. More recently, analyzing the contractility and calcium flux of isolated myocytes has provided a vital tool in the cellular and sub-cellular analysis of heart failure. Echocardiography and EKGs provide information about the heart at an organ level only. Cardiomyocyte cell culture systems exist, but cells lack physiologically essential structures such as organized sarcomeres and t-tubules required for myocyte function within the heart. In the protocol presented here, cardiomyocytes are isolated via Langendorff perfusion. The heart is removed from the mouse, mounted via the aorta to a cannula, perfused with digestion enzymes, and cells are introduced to increasing calcium concentrations. Edge and sarcomere detection software is used to analyze contractility, and a calcium binding fluorescent dye is used to visualize calcium transients of electrically paced cardiomyocytes; increasing understanding of the role cellular changes play in heart dysfunction. Traditionally used to test drug effects on cardiomyocytes, we employ this system to compare myocytes from WT mice and mice with a mutation that causes dilated cardiomyopathy. This protocol is unique in its comparison of live cells from mice with known heart function and known genetics. Many experimental conditions are reliably compared, including genetic or environmental manipulation, infection, drug treatment, and more. Beyond physiologic data, isolated cardiomyocytes are easily fixed and stained for cytoskeletal elements. Isolating cardiomyocytes via perfusion is an extremely versatile method, useful in studying cellular changes that accompany or lead to heart failure in a variety of experimental conditions.

Individual cardiomyocytes from wild type and mutant mice can be isolated from the heart in order to study their contractility and calcium transients. This allows characterization of the contribution of cellular dysfunction to heart dysfunction from any cause.

בידוד ופיזיולוגי ניתוח של שריר לב העכבר

Cardiomyocytes, the workhorse cell of the heart, contain exquisitely organized cytoskeletal and contractile elements that generate the contractile force ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse incisor provides a model for these processes. This remarkable organ grows continuously throughout the animal&#39;s life and generates all the necessary cell types from active pools of adult stem cells housed in the labial (toward the lip) and lingual (toward the tongue) cervical loop (CL) regions. Only the dental stem cells from the labial CL give rise to ameloblasts that generate enamel, the outer covering of teeth, on the labial surface. This asymmetric enamel formation allows abrasion at the incisor tip, and progenitors and stem cells in the proximal incisor ensure that the dental tissues are constantly replenished. The ability to isolate and grow these progenitor or stem cells in vitro allows their expansion and opens doors to numerous experiments not achievable in vivo, such as high throughput testing of potential stem cell regulatory factors. Here, we describe and demonstrate a reliable and consistent method to culture cells from the labial CL of the mouse incisor.

The continuously growing mouse incisor provides a model for studying renewal of dental tissues from dental epithelial stem cells (DESCs). A robust system for consistently and reliably obtaining these cells from the incisor and expanding them in vitro is reported here.

בידוד והתרבות של תאי גזע השיניים אפיתל ממבוגרי העכבר הארקטיק

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes

Cultured cardiomyocytes can be used to study cardiomyocyte biology using techniques that are complementary to in vivo systems. For example, the purity and accessibility of in vitro culture enables fine control over biochemical analyses, live imaging, and electrophysiology. Long-term culture of cardiomyocytes offers access to additional experimental approaches that cannot be completed in short term cultures. For example, the in vitro investigation of dedifferentiation, cell cycle re-entry, and cell division has thus far largely been restricted to rat cardiomyocytes, which appear to be more robust in long-term culture. However, the availability of a rich toolset of transgenic mouse lines and well-developed disease models make mouse systems attractive for cardiac research. Although several reports exist of adult mouse cardiomyocyte isolation, few studies demonstrate their long-term culture. Presented here, is a step-by-step method for the isolation and long-term culture of adult mouse cardiomyocytes. First, retrograde Langendorff perfusion is used to efficiently digest the heart with proteases, followed by gravity sedimentation purification. After a period of dedifferentiation following isolation, the cells gradually attach to the culture and can be cultured for weeks. Adenovirus cell lysate is used to efficiently transduce the isolated cardiomyocytes. These methods provide a simple, yet powerful model system to study cardiac biology.

This protocol describes a step-by-step method for the reproducible isolation and long-term culture of adult mouse cardiomyocytes with high yield, purity, and viability.

בידוד, תרבות התמרה של cardiomyocytes עכבר למבוגרים

Cultured cardiomyocytes can be used to study cardiomyocyte biology using techniques that are complementary to in vivo systems. For example, the purity and ...

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin defense by forming an intact skin barrier against environmental insults, such as UVB irradiation or pathogens, and also by initiating an inflammatory response upon those insults. Here we describe methods to isolate KCs from neonatal mouse skin and from adult mouse tail skin. We also describe culturing conditions using defined growth supplements (dGS) in comparison to chelexed fetal bovine serum (cFBS). Functionally, we show that both neonatal and adult KCs are highly responsive to high calcium-induced terminal differentiation, tight junction formation and stratification. Additionally, cultured adult KCs are susceptible to UVB-triggered cell death and can release large amounts of TNF upon UVB irradiation. Together, the methods described here will be useful to researchers for the setup of in vitro models to study epidermal biology in the neonatal mouse and/or the adult mouse.

Epidermal keratinocytes form a functional skin barrier and are positioned at the front line of host defense against external environmental insults. Here we describe methods for isolation and primary culture of epidermal keratinocytes from neonatal and adult mouse skin, and induction of terminal differentiation and UVB-triggered inflammatory response from keratinocytes.

בידוד ותרבות של עכברים ראשיים Keratinocytes מ neonatal ומבוגרים עור עכבר

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...

Isolation of Mouse Epidermal Keratinocytes and Their In Vitro Clonogenic Culture

The protocol described here is a reliable method of harvesting primary keratinocytes from adult female mice (54 &#177; 2 days old) yielding approximately 30 x 106 viable cells per mouse. Primary adult mouse keratinocytes are harvested from the dorsal skin of female mice. Male mice (~6 weeks old) can be used for keratinocyte harvesting depending on the requirements of the experiment. Euthanized mice are shaved and sterilized with serial washes in povidone iodine and ethanol solutions (70% alcohol). After disinfecting the mice, the dorsal skin is removed and the subcutaneous fat and muscle are removed with a scalpel and discarded. The skins are cut into small pieces and treated with a mild, low temperature trypsinization to detach the lower dermis from the epidermis. The scraped epidermises are stirred at low speed, filtered to remove the hairs, counted, and re-suspended in culture medium. This method provides an excellent single cell suspension of highly culturable cells for many downstream applications.

The goal of this protocol is to isolate epidermal keratinocytes from the dorsal skin of adult mice for a variety of downstream applications such as molecular biology, biochemistry, fluorescence activated cell sorting, and primary in vitro uses (e.g., clonogenic keratinocytes).

בידוד של העכבר Keratinocytes באפידרמיס ושלהם בתרבות הclonogenic של מבחנה

The protocol described here is a reliable method of harvesting primary keratinocytes from adult female mice (54 &#177; 2 days old) yielding approximately ...